VII Simpósio de Pós-Graduação e Pesquisa em Nutrição e Produção Animal – VNP – FMVZ – USP – 2013

IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA DE MICRORGANISMOS CAUSADORES DE MASTITE

POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
(ju_barreiro@yahoo.com.br)
Juliana Regina Barreiro1; Patrícia Aparecida Campos Braga2; Tiago Tomazi1; Juliano Leonel
Gonçalves1; Christina Ramires Ferreira2; Marcos Nogueira Eberlin3; Marcos Veiga dos Santos4
1
Pós-graduandos do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP.
2
Pós-doutoranda do departamento de Química Orgânica – UNICAMP, Campinas –SP.
3
Professor Doutor do Departamento de Química Orgânica – UNICAMP, Campinas-SP.
4
Professor Doutor do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP.

Introdução: O objetivo do estudo foi avaliar a identificação de bactérias causadoras de mastite a

partir de amostras de leite sem cultivo microbiológico por espectrometria de massas através da
matriz assistida por dessorção e ionização por tempo de vôo (MALDI-TOF MS).

Material e Métodos: Para a contaminação experimental do leite foram utilizadas cepas de Sta-
phylococcus aureus (ATCC 29213), Streptococcus uberis (ATCC 20569), Streptococcus agalac-
tiae (ATCC 13813), Streptococcus dysgalactiae (ATCC 20662) e Escherichia coli (ATCC
25922). Todas as amostras foram incubadas a 37ºC em ágar-sangue em condições aeróbias para
crescimento. O protocolo de identificação foi desenvolvido e otimizado utilizando-se leite em pó
suspenso em água destilada, e em seguida autoclavado. Todas as etapas de centrifugação foram
realizadas à velocidade de 13.000 X g por 2 minutos. Após 24 horas de incubação, as cepas bac-
terianas foram diluídas em água destilada. A concentração bacteriana em água destilada foi de-
terminada pela escala nefelométrica de Mc Farland. Após a padronização de turvação com água
destilada, obteve-se um volume correspondente a 108 ufc/mL ou 109 ufc/mL de bactérias suspen-
sas, em seguida foram feitas diluições seriadas de 1:10 a fim de obter amostras contendo de 103
a 109 bactérias mL-1 . Os tubos contendo as diluições foram centrifugados e os pellets foram
transferidos para um microtubo de 2,0 mL. Em seguida 1 mL de leite, previamente preparado, foi
adicionado no microtubo contendo o pellet bacteriano, de modo a obter a concentração de 103 a
109 bactérias mL-1 de leite. Para cada cepa padrão, os procedimentos foram repetidos 3 vezes,
resultando em 15 amostras iniciais, que após as diluições obteve-se um total de 105 amostras
analisadas. A metodologia usada para recuperação de bactérias causadoras de mastite no leite
para identificação por MALDI-TOF MS sem necessidade de cultivo microbiológico foi baseada
no método de identificação de bactérias em amostras de sangue. A extração de bactérias foi rea-
lizada a partir de 1,0 mL de amostra de leite e com o uso do kit Maldi Sepsityper® (Bruker Dal-
tonics). Após a extração de bactérias foi utilizado o protocolo de lise bacteriana para análise por
MALDI-TOF MS.

Resultados e Discussão: Foi possível recuperar bactérias (E. coli, S. agalactiae, S. dysgalactiae,
S. uberis e S. aureus) diretamente do leite, ou seja, sem cultura in vitro, para identificação por
MALDI-TOF MS. Foram identificados corretamente amostras de leite superior a 106 ufc/mL
para S. aureus, 107 ufc/mL para E. coli, e 108 ufc/mL para S. agalactiae, S. dysgalactiae e
S.uberis na amostra de leite. A concentração de bactérias na amostragem é um fator que interfere
na identificação dos patógenos causadores de mastite, assim como interfere na detecção de mi-
crorganismos no sangue.

Conclusões: O método para recuperação de bactérias experimentalmente inoculadas em amos-

tras de leite e identificação por MALDI-TOF MS sem necessidade de cultivo para isolamento de
colônias, foi possível em contagem de 106 ufc/mL para S. aureus, 107 ufc/mL para E. coli, e 108
ufc/mL para S. agalactiae, S.dysgalactiae e S. uberis.