INSTITUTO DE ENSINO SUPERIOR – FANORTE

Amanda Karoline alves Zangarine

Anderson Camiloto da Silva
Jaqueline Sovete Vicente
Robson Carlos Anadao
Thauana S. Bremen Camp
ThiagoAbrantes

CONTROLE DE QUALIDADE DE ENSAIOS

MICROBIOLOGICOS

CACOAL-RO
2019
 Amanda Karoline alves Zangarine
Anderson Camiloto da Silva
Jaqueline Sovete Vicente
Robson Carlos Anadao
Thauana S. Bremen Camp
ThiagoAbrantes

CONTROLE DE QUALIDADE DE ENSAIOS

MICROBIOLOGICOS

Trabalho apresentado para fins

avaliativo na disciplina de
Produtividade e controle de
quaidade no 7º período do curso
de Farmácia ministrado pelo prof.
Maximiliano Faria Brito.

Cacoal - RO
2019
INTRODUÇÃO

A evolução tecnológica no desenvolvimento e produção de

medicamentos, cosméticos e fitoterápicos exige o cumprimento de diretrizes
regulamentadas para evitar e prevenir os riscos na qualidade e segurança dos
produtos. A garantia da qualidade é um importante aspecto a ser considerado
desde o projeto até a liberação do produto ao consumidor. A qualidade
microbiológica de produtos constitui um dos atributos essenciais para o seu
desempenho adequado, principalmente em relação à segurança, eficácia e
aceitabilidade destes produtos. Falha nas medidas preventivas e de controle do
processo de fabricação pode resultar em produtos inadequados ao consumo.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) exige que as
empresas produtoras tenham implantado as normas de boas práticas de
fabricação, conforme as normas técnicas oficialmente estabelecidas. Dentre as
exigências presentes nas normas, está a necessidade da realização de ensaios
de controle de qualidade em todas as fases do processo de fabricação. Estas
normas são dinâmicas e devem ser atualizadas para acompanhar a evolução
tecnológica dos processos, novos equipamentos e gerenciamento da
qualidade.

Controle de Qualidade Microbiológico de Produtos

Farmacêuticos, Cosméticos e Fitoterápicos

Relatos publicados em periódicos de grande circulação e abrangência

demonstram como resultado de falha no controle do processo de fabricação de
várias empresas produtoras de medicamentos e cosméticos graves
consequências à saúde do consumidor, pelo uso de produtos em desacordo
com suas características de qualidade estabelecidas, ocasionando casos de
morte dos pacientes. Nos últimos anos, medicamentos administrados por via
parenteral em pacientes hospitalizados foram relatados. Os processos de
fabricação devem ser documentados a cada lote de produção, constando do
histórico do produto todas as ações de controle de qualidade em todas as
etapas do processo de fabricação consideradas críticas. Para o controle do
processo e do produto terminado, padrões de qualidade são estabelecidos na
fase de desenvolvimento do produto e validação dos processos. Todos os lotes
produzidos devem apresentar conformidade com estes padrões de qualidade.
A qualidade microbiológica de medicamentos, cosméticos e fitoterápicos
é definida por padrões microbianos descritos em compêndios oficiais e normas
regulamentadoras. Limites máximos de presença de microrganismos no
produto e dentre estes, ausência de patógenos estão estipulados. Os produtos
com composição complexa como medicamentos e cosméticos constituem fonte
rica em nutrientes para o crescimento de microrganismos. Da mesma forma,
produtos com maior atividade de água comparados com amostras com baixo
teor de água também favorecem o crescimento. Matérias-primas, água e
pessoal são fontes importantes de contaminação microbiana e devem ser
controlados. As matérias-primas de origem natural incluem grupos de produtos
obtidos de plantas, partes de plantas ou mesmo extratos e óleos essenciais
extraídos por processos químicos bem como aqueles oriundos de minerais ou
animais. Tradicionalmente, acredita-se que produtos formulados com estas
matérias-primas, especialmente plantas, produzem ação desejada causando
menos efeitos tóxicos que as de origem sintética, levando ao emprego
crescente dos mesmos como terapêuticos ou cosméticos. Nas farmácias de
manipulação, prescrições com fórmulas contendo matérias-primas de origem
vegetal ou animal têm sido cada vez mais frequentes. A diferença que existe
entre a farmácia de manipulação e a indústria farmacêutica ou cosmética é a
característica de formulação magistral individualizada. Portanto, a quantidade
de matéria-prima a ser adquirida pela farmácia é menor quando comparada à
produção industrial. Em função disso, as matérias-primas são fracionadas
pelas empresas fornecedoras para atender pedidos com quantidades
específicas. Neste processo de fracionamento, podem ser carreados para as
matérias-primas partículas viáveis e não viáveis aumentando a carga
microbiana contaminante.
A contaminação microbiana pode levar ao comprometimento do
desempenho do produto devido à quebra da estabilidade da formulação,
alteração das características físicas e aparência e levar a inativação dos
princípios ativos e excipientes da formulação e ainda, causar a perda de
confiança na empresa. Além disso, a administração de produtos contaminados
pode agravar quadros clínicos de pacientes já debilitados pela doença.
Ressalta se ainda, a necessidade de investigar o sistema conservante visto
que muitos fabricantes utilizam-no na tentativa de manter a carga microbiana
dentro do limite estipulado, contudo, desconsiderando a toxicidade decorrente
do uso desse sistema. Para pequenas empresas produtoras e farmácias de
manipulação, a implantação de laboratório de controle de qualidade
microbiológico limitada pelo investimento necessário para a infraestrutura e
pessoal requeridos. Assim, a realização das análises por laboratórios de
prestação de serviços possibilita o atendimento às exigências da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária.

DESENVOLVIMENTO

A constante observação das normas e atualização de procedimentos

adequadamente registrados por todos os envolvidos no processo de análise
microbiológica é um forte indício de que os resultados positivos na rotina de um
laboratório vão se manter, à medida que os controles, as análises de tendência
e os resultados encontram-se dentro dos limites estabelecidos na validação.
Os métodos mais comuns e frequentes de ensaios microbiológicos na rotina de
uma empresa estão entre as contagens de bactérias e pesquisa de bolores e
leveduras, de coliformes e identificação de patógenos e fungos. Para
certificação da eficácia na ação de desinfetantes ou esterilizantes, que deve
garantir a qualidade de um ambiente controlado microbiologicamente.
O responsável pelo laboratório microbiológico, em sinergia com a
garantia da qualidade, pela obtenção de resultados microbiológicos
satisfatoriamente controlados, deve perseguir e garantir:

- A utilização de insumos e embalagens de fornecedores qualificados, que

comprovem documentalmente a realização do controle microbiológico dos seus
produtos, desde a produção, acondicionamento, transporte e entrega, através
de análises microbiológicas para controle dos pontos críticos e do insumo
entregue;

- A atribuição e utilização de uma área produtiva que não ofereça pontos

críticos com risco de contaminação cruzada durante o processo produtivo, com
áreas controladas para estoque, expurgo, material recolhido no mercado e área
de embalagem. Toda essa área, contemplando o ar ambiente, as mãos dos
profissionais e as superfícies de equipamentos e utensílios podem e devem ser
monitoradas através de amostragens e análises periódicas.

- Que o pessoal de produção e limpeza (todos) receba treinamentos periódicos

relativos às Boas Praticas de Higiene, através de palestras apostiladas, e que a
eficácia destes treinamentos seja evidenciada através de testes pontuáveis que
irão apontar a necessidade, ou não, de um reforço ao grupo, ou indivíduo, que
possam colocar em risco, parte ou o todo, o controle microbiológico do
processo produtivo e influenciar negativamente na qualidade do produto.

- Que as águas a serem consumidas em produção e a potável sejam

controladas e analisadas com freqüência, e que o profissional do controle e
manutenção destes sistemas conheça a fundo as instalações, a sua operação
e a qualidade da água que trata e utiliza, levando em consideração que um
sistema purificador da água de produção, indispensavelmente, seja validado, a
começar pela Qualificação da Instalação (IQ), seguida pela Qualificação da
Operação, Manutenção, Limpeza e Sanitização (OQ) e, por final, a Qualificação
da Performance deste sistema (PQ). Este processo de validação demanda,
pelo menos, 12 meses de trabalho, análises físico-químicas e microbiológicas e
muita documentação.

- Com uma matéria-prima confiável, área produtiva adequada, pessoal

competente e dedicado, processo validado e a qualidade da água de
assegurada, as chances de se ter contaminação sob controle se conclui no
controle microbiológico dos lotes do produto acabado.

Como parte do Sistema da Qualidade o laboratório deve dispor de um

programa documentado para a manutenção, calibração e verificação de
desempenho dos equipamentos, os quais devem ser realizados de acordo com
o uso e histórico do equipamento e serão baseadas na necessidade, tipo e
desempenho anterior de cada equipamento.

ENSAIOS MICROBIOLÓGICOS DO CONTROLE DE QUALIDADE

Medem-se, diretamente, as doses de cada preparação (padrão e
amostra) necessárias para produzir respostas pré-determinadas em cada
unidade experimental. Assegurar a qualidade microbiológica dos produtos é um
desafio que deve se iniciar na fase de pesquisa e desenvolvimento. Os
profissionais formuladores geralmente dão pouca importância para o fato de
que certas fórmulas são mais facilmente preservadas da contaminação por
microrganismos do que outras. Observar os aspectos contaminantes destas
fórmulas e identificar os fatores que as tornam menos susceptíveis à
sobrevivência e ao crescimento de fungos e bactérias pode determinar uma
nova técnica de formular o sistema de controle de qualidade do produto; pode
transformar o jeito de se gerir os meios de ensaios microbiológicos. A seguir
veremos os principais meios de ensaios microbiológicos, suas estrutura, suas
funções e monitoramento. A detecção de contaminação microbiológica no
ambiente da indústria farmacêutica é um evento raro e aleatório que requer a
análise de um grande número de amostras, mas por vezes pode ocorrer. Os
métodos padrões para detecção dessa contaminação se baseiam nas
características morfológicas e nas provas bioquímicas das colônias isoladas na
análise (JIMENEZ, 2000).

PIROGENIOS
Pirogênios são produtos do metabolismo de organismos,
como bactérias e fungos, que podem causar febre. São lipídeos associados a
moléculas transportadoras que podem ser polissacarídeos ou peptídeos.
Existem Pirogênios endógenos (citocinas), geralmente produzidas
pelos leucócitos, ou exógenos (produtos bacterianos) estimulam a síntese de
prostaglandinas PGE2 nas células vasculares e perivasculares do
hipotálamo.Esse ensaio fundamenta-se na medida do aumento da temperatura
corporal da cobaia, após injeção intravenosa da solução estéril em análise.
Para produtos bem tolerados pelos animais, utilizar uma dose que não exceda
10 mL/kg, injetada em tempo não superior a 10 minutos.
Para os produtos que necessitem preparação preliminar ou
condições especiais de administração, seguir as recomendações estabelecidas
na monografia. Condições gerais Usar coelhos do mesmo sexo, adultos,
sadios, preferencialmente da mesma raça, pesando, no mínimo, 1,5 kg.
Após a seleção, manter os animais em gaiolas individuais em sala
com temperatura uniforme entre 20 e 23 ºC livre de perturbações que possam
estressá-los.
A temperatura selecionada pode variar até ± 3 ºC. Realizar
condicionamento para determinação da temperatura dos animais, pelo menos
uma vez, até sete dias antes de iniciar o teste. Os animais deverão ser
condicionados segundo o mesmo procedimento do teste apenas sem
inoculação do produto. Animais que apresentarem elevação de temperatura
igual ou superior a 0,5 ºC, em relação à temperatura inicial, não deverão ser
utilizados no teste.
Procedimento - Para o teste de pirogênios de materiais de uso
hospitalar lavar, com solução fisiológica estéril, as superfícies do material que
entram em contato com o produto, local de injeção ou tecido interno do
paciente. Efetuar os procedimentos assegurando que a solução não seja
contaminada. Injetar pela veia marginal da orelha de três coelhos não menos
do que 0,5 mL nem mais que 10 mL da solução por kg de peso corporal ou a
quantidade indicada na monografia. A injeção não deve durar mais que 10
minutos, a menos que na monografia se especifique tempo diferente. Registrar
a temperatura de cada animal em intervalos de 30 minutos durante 3 horas
após a injeção.
Executar o teste em área especialmente destinada para o teste, sob
condições ambientais controladas, livre de perturbações que possam estressar
os coelhos. Nas duas horas precedentes e durante o teste, suprimir a
alimentação. O acesso à água é permitido, mas pode ser restringido durante o
teste. No máximo 40 minutos antes da injeção da dose do produto a ser
testado, registrar a temperatura de cada animal mediante duas leituras
efetuadas com intervalo de 30 minutos. A média das duas leituras será adotada
como temperatura de controle necessária para avaliar qualquer aumento
individual de temperatura subsequente à injeção da amostra.

ESTERELIDADE
Os testes de esterilidade aplicam-se a insumos farmacêuticos,
medicamentos e produtos para saúde que, de acordo com a Farmacopeia,
devem ser estéreis, sendo adequados para revelar a presença de bactérias e
fungos. Contudo, um resultado satisfatório indica que não foi encontrado micro-
organismo contaminante somente na amostra examinada. A extensão desse
resultado ao restante do lote requer a segurança de que todas as unidades do
mesmo lote tenham sido preparadas de modo a garantir grande probabilidade
de que todo o lote passaria pelo teste. Obviamente, isso depende das
precauções tomadas durante os processos operacionais de fabricação, de
acordo com as Boas Práticas de Fabricação.
Para a realização do teste de esterilidade é importante que as
pessoas sejam adequadamente treinadas e qualificadas. Os testes devem ser
realizados sob condições assépticas, utilizando, por exemplo, capela de fluxo
laminar classe II tipo A (máximo 3520 partículas ≥ 0,5 μm/m3 ), que deve estar
instalada em sala limpa classe B - ISO 7 (máximo 352 000 partículas ≥ 0,5
μm/m3 ). Para testes de esterilidade de fármacos oncogênicos, mutagênicos,
antibióticos, hormônios, esteroides e outros, os testes devem ser realizados na
capela classe II tipo B2, que possui sistema de exaustão externo ao ambiente
do laboratório. Não devem ser realizados testes sob exposição direta de luz
ultravioleta ou em áreas sob tratamento com aerossóis. As condições devem
ser adequadas de forma a evitar contaminação acidental da amostra durante o
teste e, também, não afetar a detecção de possíveis contaminantes. Controles
ambientais das áreas de trabalho devem ser realizados regularmente (controle
do ar e de superfícies, contagens de partículas, determinação de velocidade e
direção do fluxo de ar, entre outros).
Procedimento - Usando alça de cultivo, transferir o crescimento do
microorganismo específico para tubo de ensaio contendo ágar inclinado
indicado para o seu crescimento. Semear a cultura sobre a superfície do ágar
inclinado, de modo a obter película uniforme de crescimento. Incubar nas
condições ótimas de crescimento do micro-organismo teste. Como sugestão de
diluições para o inóculo, após o período de incubação lavar o crescimento do
micro-organismo com 1 mL de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% (p/v)
ou água peptonada 0,1% (p/v) estéril e transferir para frasco contendo 99 mL
de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% (p/v) ou água peptonada 0,1%
(p/v) estéril - (suspensão estoque). Homogeneizar a suspensão manualmente
ou em agitador de tubos do tipo vórtex. Preparar diluições em série (1:100,
1:10000 e 1:1000000) a partir da suspensão estoque utilizando solução estéril
de cloreto de sódio a 0,9% (p/v) ou água peptonada 0,1% (p/v) estéril como
diluente. Incorporar 1 mL de cada diluição em meio sólido adequado para o
micro-organismo, previamente fundido e resfriado a aproximadamente 45 ºC.
Homogeneizar e incubar. Proceder à contagem do número de colônias que se
desenvolveram no meio sólido e escolher, a partir dos resultados, a diluição a
ser utilizada para obter-se, no máximo, 100 UFC por frasco de meio de cultura.
Repetir o procedimento para cada micro-organismo utilizado. Para o preparo de
suspensão fúngica, a solução de cloreto de sódio a 0,9% (p/v) estéril pode ser
substituida por água purificada estéril.

IDENTIFICAÇAO
Os ensaios de identificação possibilitam verificar, com um nível de
certeza aceitável, que a identidade do material sob exame está de acordo com
o rótulo de sua embalagem. Quando perante a presença de contaminação em
produtos estéreis, na detecção de presumíveis microrganismos específicos nas
análises a produtos não estéreis e no aparecimento de microrganismos nas
placas de áreas de classe A, nas monitorizações ambientais, é necessária a
sua identificação. Nos laboratórios é feita a identificação de bactérias, onde
após repicagem e isolamento das colónias, é feita a coloração de Gram,
seguida pela identificação do género ou até à espécie , por análise via Vitek® 2
Compact, um sistema automatizado de identificação, que utiliza cartas
colorimétricas com 64 poços, contendo substratos para testes individuais, que
são incubadas e interpretadas automaticamente. (Pincus, 2006) A execução
dos testes de identificação permitiu aperfeiçoar a análise à coloração de Gram
efectuada aquando da observação ao microscópio, e o contacto e
familiarização com uma nova tecnologia para identificação de microrganismos.
Embora específicos, eles não são, necessariamente, suficientes
para estabelecer prova absoluta de identidade. Entretanto, o não cumprimento
dos requerimentos de um ensaio de identificação pode significar erro de
rotulagem do material. Outros testes e especificações na monografia
contribuem para a confirmação da identidade do artigo sob exame. Alguns
ensaios de identificação devem ser considerados conclusivos como;
infravermelho; espectrofotometria com absorção específica e cromatografia a
líquido de alta eficiência acoplada a espectrofotometria. Esses ensaios devem
ser realizados em complemento ao ensaio do contra íon, quando aplicável.
Estrutura das monografias
As monografias de matérias-primas são identificadas por suas
denominações comuns Brasileiras (DCB), grafadas em caixa alta e
centralizadas. Além disso, são incluídos, também: sempre que possível, a
denominação em latim proposta pelo INN – Nomes genéricos internacionais da
Organização Mundial da Saúde; a fórmula estrutural da substância; fórmula
molecular seguida da massa molar; Denominação Comum Brasileira e seu
respectivo número; nome químico, segundo a ACS – American Chemical
Society; registro CAS – Chemical Abstracts Service.
As monografias das preparações farmacêuticas são identificadas
pelo nome da matéria-prima correspondente, seguido do nome da forma
farmacêutica.
Considerando que o fármaco é o principio ativo do medicamento,
sua identificação é um quesito básico para eficácia e segurança do produto.
Uma vez que existe ainda o risco de adulteração de matérias-primas e
excipientes por outros de menor custo que, embora de características
semelhantes, poderão acarretar em problemas potenciais de formulação.
Independente do método utilizado, um ensaio de identificação deve ser
específico e confiável, de baixo custo e de fácil realização.
Podem ser classificados em físicos ou químicos, ou ainda como
métodos instrumentais ou clássicos.
A validade desses ensaios depende, basicamente, da sua
especificidade ou seletividade.
São métodos analíticos de natureza qualitativa, destinados à
confirmação da identidade da matéria prima ou de determinado componente
(ex. princípio ativo) de um produto.
Métodos de Identificação - As reações químicas úteis em ensaios
clássicos de identificação devem ser perceptíveis a olho nú, sejam com
mudança de cor (formação de produto colorido ou desaparecimento de cor do
analito ou reagente), formação de precipitado ou produção de gás. Como
desvantagem apresentam menor sensibilidade e o fato de que não são
aplicáveis a misturas de fármacos com grupos comuns. Apresentam como
vantagem imediata a redução do custo com instrumentação.
Esses ensaios não são confirmatórios, mas sim eliminatórios, já que
várias substâncias podem apresentar grupos funcionais em comum.
Apresentam como principal vantagem a possibilidade de, dependendo da
seletividade da reação, serem aplicados à identificação de fármacos, tanto
matérias-primas, quanto em medicamentos (produto acabado).
 Os métodos clássicos de identificação são baseados em reações
químicas de grupos funcionais importantes em insumos farmacêuticos.

CONTAGEM
Com esse ensaio é possível determinar o número total de bactérias
mesófilas e fungos em produtos e matérias-primas não estéreis e é aplicado
para determinar se o produto satisfaz às exigências microbiológicas
farmacopeicas.
Quando usado para esse propósito, deve-se seguir as indicações
dadas, incluindo o número de amostras tomadas e interpretação dos
resultados. O teste não é aplicado para produtos que contêm micro-organismos
viáveis como ingrediente ativo. Esse teste consiste na contagem da população
de microorganismos que apresentam crescimento visível, em até 5 dias, em
Ágar caseína-soja a 32,5 o C ± 2,5 o C e em até 7 dias, em Ágar Sabouraud-
dextrose a 22,5 o C ± 2,5 o C. Métodos microbiológicos alternativos, inclusive
os automatizados, podem ser utilizados desde que sua equivalência com o
método farmacopeico tenha sido devidamente validada.
Procedimento - A determinação pode ser efetuada pelo Método de
filtração por membrana, Método em placa ou Método dos Tubos Múltiplos
(MNP). Esse último é reservado para as determinações bacterianas que não
possam ser realizadas por um dos outros métodos e quando se espera que o
produto apresente baixa densidade bacteriana. A escolha do método é
determinada por fatores tais como a natureza do produto e o número esperado
de micro-organismos. Qualquer método escolhido deve ser devidamente
validado. Filtração por membrana Utilizar equipamento de filtração que
possibilite a transferência da membrana para os meios de cultura. As
membranas de nitrato de celulose, por exemplo, podem ser utilizadas para
soluções aquosas, oleosas ou fracamente alcoólicas e as membranas de
acetato de celulose para soluções fortemente alcoólicas.
Preparar a amostra usando método mais adequado previamente
determinado. Preparar a amostra conforme procedimentos de adequação do
produto. Preparar diluições 1:10; 1:100; 1:1000. Transferir 1 mL de cada uma
das diluições, para 3 tubos, contendo cada um, 9 mL de caldo caseína-soja.
Incubar todos os tubos a 32,5 ºC ± 2,5 °C durante 3 - 5 dias. Anotar o número
de tubos positivos e o número de tubos negativos. Se a natureza da amostra
tornar a leitura difícil, como, por exemplo, uma suspensão, efetuar subcultura
para o mesmo caldo ou para ágar caseína-soja por 2 dias na mesma
temperatura. Determinar o número mais provável de micro-organismos viáveis
por grama ou mililitro do produto.

CONCLUSÃO

É importante ressaltar que existe no mercado grande diversidade de

matérias-primas e produtos em várias formas de apresentação evidenciando, a
necessidade de um controle de qualidade rigoroso, principalmente quando
ocorre a dificuldade na identificação ou conhecimento da procedência dos
mesmos. Para as empresas produtoras de medicamentos, cosméticos e
fitoterápicos, as pesquisas feitas pelo grupo permitiram o entendimento às
exigências da Vigilância Sanitária presente no Regulamento Técnico de Boas
Práticas de Fabricação e Manipulação relacionadas com o controle de
qualidade de produtos. Os resultados de análises possibilitam detectar falha
no processo de fabricação, avaliar os procedimentos operacionais
padronizados, analisar a ficha de fabricação e estabelecer medidas corretivas e
preventivas adequando e melhorando os procedimentos através de
treinamento de pessoal. Com isto, obtendo melhoria da qualidade, maior
produtividade e desenvolvimento da empresa e de seus funcionários. A
implantação das normas de boas práticas possibilita a padronização dos
procedimentos nos setores produtivos, organização e otimização de processos.

REFERENCIAS

DISPONIVEL :https://www.ufmg.br/congrext/Desen/Desen7.pdf
.CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLOGICO,Acesso em:13/05/2019

Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Informes técnicos.

Subsídios à discussão sobre a proposta de regulação para as farmácias
magistrais. Rev Saúde Pública. 2005;39(4):691-4.

https://engdealimentos.blogspot.com/2008/03/tipos-de-ensaios-microbiolgicos-
e.html
ANVISA. AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Farmacopeia Brasileira, Volume
1. 5ª Ed. Brasilia,2010b.

JIMENEZ, L. Uso de análise de PCR para detectar baixos níveis de bactérias e contaminação
de mofo em amostras farmacêuticas. Jornal de Métodos Microbiológicos, v.41, p. 259–265,
2000