Cortisol saliva

KAPDB290
 Cortisol saliva
Para la determinación cuantitativa de cortisol por inmunoensayo enzimático en saliva humana.
KAPDB290
DIAGNÓSTICO IN VITRO
USO
Determinación cuantitativa de cortisol mediante inmunoensayo enzimático en saliva
humana.
Únicamente para diagnóstico in vitro.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El principio de la siguiente prueba de inmunoensayo enzimático sigue el típico caso
de enlace competitivo.La competencia se produce entre un antígeno no marcado
(presente en los calibradores, muestras control y de paciente) y un antígeno marcado
con enzima (conjugado) durante un número limitado de sitios de unión de anticuerpos en
la placa de micropocillos. Los procedimientos de lavado y decantación eliminan los
materiales no ligados. Después del lavado, se añade el sustrato de la enzima. La
reacción enzimática se termina mediante la adición de la solución de parada. La
absorbancia se mide en un lector de microplacas. La intensidad del color formado
es inversamente proporcional a la concentración de cortisol en la muestra. Se utiliza
un conjunto de calibradores para trazar una curva de calibración de la cual se puede
leer directamente la cantidad de cortisol en muestras de pacientes y controles.
APLICACIONES CLÍNICAS
El cortisol es el esteroide de circulación más abundante y la mayoría de los
glucocorticoides principales secretadas por la corteza suprarrenal. El cortisol es
fisiológicamente eficaz para el mantenimiento de la presión arterial y la actividad anti-
inflamatoria.También participa en la absorción de calcio, la gluconeogénesis, así
como en la secreción de ácido gástrico y pepsina. Éste se aumenta en situaciones de
estrés, ejercicio físico y administración externa de ACTH. La medición de los niveles
de cortisol, en general, se puede utilizar como un indicador de la función adrenal y el
diagnóstico diferencial de las enfermedades de Addison y Cushing, así como la
hiperplasia suprarrenal y carcinoma.
La mayoría de cortisol circulante se une a la globulina de cortisol o transcortina y
albúmina. El cortisol libre, considerado como la parte activa de la sangre, es
aproximadamente 1 - 2%. En ausencia de cantidades apreciables de proteínas de
cortisol en saliva, el cortisol en saliva se considera libre y presenta un ritmo diurno
con niveles más altos en la mañana y niveles más bajos durante la noche.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS DE PROCEDIMIENTO
1. Los usuarios deben tener un conocimiento profundo de este protocolo para el
correcto uso de este kit. Solo se logra un rendimiento fiable mediante el estricto y
cuidadoso cumplimiento de las instrucciones proporcionadas.
2. Los materiales de control deben incluirse en cada ejecución a un nivel alto y bajo
con el fin de evaluar la fiabilidad de los resultados.
3. Cuando se especifica el uso de agua para la dilución o reconstitución, utilice
desionizada o agua destilada.
4. Con el fin de reducir la exposición a sustancias potencialmente nocivas, se deben
utilizar guantes durante el manejo del kit de reactivos y muestras humanas.
5. Todos los reactivos del kit y las muestras deben estar a temperatura ambiente.
Estos se deben mezclar por completo y suavemente antes de su uso. Evite el
continuo congelado y descongelado de reactivos y muestras.
6. Se debe establecer una curva de calibración para cada ejecución.
7.El control se debe incluir en cada ejecución y debe mantenerse dentro de los
límites establecidos de confianza.
8. Las técnicas inadecuadas de procedimiento, pipeteado impreciso, lavado
incompleto así como el inadecuado almacenamiento de reactivos pueden
presentarse cuando los valores de ensayo para el control no reflejan los rangos
establecidos.
9. Al leer la microplaca, la presencia de burbujas en los pocillos
afecta la densidad óptica (OD). Retire con cuidado las burbujas antes de
continuar con la lectura.
10. La solución de sustrato (TMB) es sensible a la luz y debe permanecer incolora si
se almacena correctamente. La inestabilidad o la contaminación se pueden indicar
mediante el desarrollo de un color azul, en cuyo caso no deben ser utilizados.
11. Al suministrar el sustrato y solución de parada, no use pipetas en
que los líquidos entren en contacto con las piezas metálicas.
12. Para evitar la contaminación de los reactivos, use una nueva punta desechable
para dispensar cada reactivo, muestra, calibrador y control.
13. No mezcle varios números de lote de componentes del kit dentro de una prueba y
no utilice los componentes más allá de la fecha de vencimiento impresa en la
etiqueta.
14. Los reactivos del kit deben considerarse como residuos peligrosos y deben ser
eliminados de acuerdo a las normativas nacionales.
LIMITACIONES
1. Todos los reactivos en el kit están calibrados para la determinación directa de
cortisol en la saliva humana. El kit no se encuentra calibrado para la determinación
de cortisol en suero, plasma u otras muestras de origen humano o animal.
2. Todas las muestras o sueros que contienen azida de control o timerosal no son
compatibles con este equipo, ya que pueden conducir a resultados erróneos.
3. Únicamente el calibrador 0 puede ser utilizado para diluir las muestras de altas de
saliva. El uso de cualquier otro reactivo puede conducir a resultados erróneos.
4.Los resultados obtenidos con este equipo nunca debe utilizarse como la única base
para una diagnóstico clínico. Por ejemplo, la aparición de anticuerpos heterófilos en
pacientes expuestos regularmente a animales o productos de origen animal tiene el
potencial de causar interferencias en las pruebas inmunológicas. De este modo, el
diagnóstico clínico debe incluir todos los aspectos de fondo de un paciente,
incluyendo la frecuencia de exposición a animales o productos si se sospecha de
resultados falsos.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS DE SEGURIDAD
MATERIAL BIOLÓGICO POTENCIALMENTE DAÑINO
El suero humano que se puede utilizar en la preparación de los calibradores y control
ha sido analizado y se comprobó que no es reactivo frente al antígeno de superficie
de hepatitis B y también ha sido analizado para determinar la presencia de
anticuerpos contra el VHC y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), y se
encontró negativo. Sin embargo, ningún método de prueba puede ofrecer la completa
seguridad de la ausencia de VIH, VHC y virus de la hepatitis B o de cualquier agente
infeccioso. Los reactivos deben ser considerados un peligro biológico potencial y
manipularse con las mismas precauciones que se aplican a cualquier muestra de
sangre.
RIESGOS QUÍMICOS
Evite el contacto con reactivos que contengan TMB, peróxido de hidrógeno y ácido
sulfúrico. Si entra en contacto con cualquiera de estos reactivos, lave con abundante
agua. TMB es un carcinógeno potencial.
RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE ESPECÍMENES
Aproximadamente 1 ml de saliva es necesaria para la determinación por duplicado.
Recoger 4-5 ml de saliva en un tubo de vidrio limpio (se puede utilizar Salivette por
Sarstedt) sin necesidad de fuerza o inducción y antes de comer, beber o lavarse los
dientes. Simplemente enjuague la boca con agua antes de la recolección.No utilice
muestras contaminadas con sangre. Almacene las muestras a 4°C durante un
máximo de 24 horas o a -10 ° C o menos si el análisis se realiza en una fecha
posterior. Considere todas las muestras humanas como posible material de riesgo
biológico y tome las debidas precauciones al manipularlas.
PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA
Los tubos de muestras se colocan en un congelador y se dejan congelar. Cuando
estén listos para su uso, las muestras deben ser descongeladas y centrifugadas. Los
sobrenadantes se recogen y se vierte en tubos recién etiquetados.
REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIO PERO NO PROPORCIONADO
1. Pipetas de precisión para dispensar 50, 100, 150 y 300 µl µl
2. Puntas desechables para pipetas
3. Agua destilada o desionizada
4. Agitador de placas (200 rpm)
5. Centrífuga de mesa
6. Lector de microplacas con un grupo de filtros a 450 nm y un límite superior de OD
de 3.0 o mayor * (véase procedimiento de ensayo paso 10).
REACTIVOS SUMINISTRADOS
Pocillos separables - Placas de micropocillos recubiertos de anticuerpos de
conejo anti-cortisol - Listo para Usar.
Contenido: Una microplaca recubierta con anticuerpo policlonal de 96 pocillos (12x8)
en una bolsa resellable con desecante.
Conservación: Refrigerar a 2-8 ° C
Estabilidad: 12 meses o según lo indicado en la etiqueta.
Ag HRP CONC
Concentrado de conjugado peroxidasa (HRP) rábano de cortisol - X50 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Contenido: Conjugado de cortisol-HRP en un tampón con base en proteína con Pretratamiento de muestras:
conservante sin mercurio Congelación y centrifugación.
Volumen: 300 µl / vlal Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Los
Conservación: Refrigerar a 2-8 ° C calibradores, controles y muestras de especímenes deben ser analizados por
Estabilidad: 12 meses o según lo indicado en la etiqueta. duplicado.Una vez que el procedimiento se ha iniciado, se deben cumplir todos los
Preparación: Diluya 1:50 en tampón de ensayo antes de su uso (ej.:, 40 µl de PRH pasos sin interrupción.
en 2 ml de búfer de ensayo). Si toda la placa se va a utilizar diluir 240 µl de HRP en 1. Prepare las soluciones de trabajo del conjugado HRP-cortisol y tampón de
12 ml de búfer de ensayo. Deseche lo que quede. lavado.
2. Retire el número necesario de tiras para microplacas. Vuelva a sellar la bolsa y
regrese las tiras no utilizadas al refrigerador.
CAL N
3. Pipetee 50 µl de cada calibrador, control y muestra de espécimen en duplicados
Calibradores cortisol saliva- Listo para Usar. N = 0 a 5 dentro del pocillo debidamente etiquetado.
Contenido: Seis frascos que contienen cortisol en un búfer basado en una proteína 4. Pipetee 100 µl de solución de conjugado en cada pocillo de trabajo (le
con un conservante que no contenga mercurio. Preparado mediante la adición de recomendamos utilizando una pipeta multicanal).
tampón con una cantidad definida de cortisol. 5. Incube en un agitador de placas (aproximadamente a 200 rpm) durante 45
* A continuación se mencionan concentraciones aproximadas, por favor, consulte las minutos a temperatura ambiente.
etiquetas de los viales para conocer las concentraciones exactas. 6. Lave los pocillos 3 veces con 300 µl de tampón de lavado diluido por pocillo y tape
sacuda la placa firmemente contra papel absorbente para asegurarse de que esté
Calibrador Concentración Volumen / Vial seca (se recomienda el uso de un sistema de lavado).
Calibrador 0 0 ng / ml 2,0 ml 7. Pipetee 150 µl de substrato TMB en cada pocillo a intervalos cronometrados.
Calibrador 1 1 ng / ml 0,6 ml 8. Incube en un agitador de placas durante 15-20 minutos a temperatura ambiente (o
Calibrador 2 3 ng / ml 0,6 ml hasta que el calibrador cero alcance un color azul oscuro para la densidad óptica
deseada).
Calibrador 3 10 ng / ml 0,6 ml
9. Pipetee 50 µl de solución de parada en cada pocillo a los mismos intervalos
Calibrador 4 30 ng / ml 0,6 ml cronometrados del paso 7.
Calibrador 5 100 ng / ml 0,6 ml 10. Lea la placa con un lector de microplacas a 450 nm dentro de los 20 minutos
Conservación: Refrigerar a 2-8 ° C después de adicionar la solución de parada.
Estabilidad: 12 meses en frascos sin abrir o según lo indicado en la etiqueta. Una vez
abiertos, los calibradores deben utilizarse dentro de 14 días o de manera alícuota y * Si la densidad óptica excede el límite superior de detección o si no se dispone de
almacenarlos congelados. Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación. un filtro de 450 nm, se puede sustituir con un filtro de 405 o 415 nm. Las densidades
ópticas serán menor, sin embargo, esto no afectará los resultados de las muestras de
control o pacientes.
CONTROL
CÁLCULOS
Control - Listo para Usar. 1. Calcule la media de densidad óptica para cada duplicado de calibrador.
2. Dibuje una curva de calibración en papel semi-logarítmico con las densidades
Contenido: Un frasco con cortisol en tampón con base proteínica con contenido de óptica promedio en el eje Y y las concentraciones de calibración en el eje X. Si se
conservante sin mercurio. Preparado mediante la adición de tampón con una está utilizando un programa de inmunoensayo, se recomienda una curva de 4
cantidad definida de cortisol. Consulte en la etiqueta del frasco el valor esperado y el parámetros.
rango aceptable. Volumen: 0,6 ml / vial 3. Calcule la media de densidad óptica de cada duplicado de muestra desconocida.
Almacenamiento: Refrigerar a 2-8 ° C 4. Lea los valores de las muestras desconocidas directamente de la curva de
Estabilidad: 12 meses en envase cerrado o según se indique en la etiqueta. Una vez calibración.
abierto, el control debe ser utilizado dentro de los 14 días o mantenido en alícuotas y 5. Si la muestra presenta más de 100 ng/ml entonces dilúyala con calibrador 0 en un
almacenado de manera congelada. Se deben evitar los múltiples ciclos de dilución de no más de 1:8. El resultado obtenido debe ser multiplicado por el
congelación y descongelación. factor de dilución.

WASH SOLN CONC DATOS TABULADOS

Solución de lavado concentrada - X10
Calibrador DO 1 DO 2 DO Valor
Contenido: Una botella de tampón con un detergente no iónico y un conservante sin
media (ng / ml)
mercurio.
Volumen: 50 ml / botella 0 2.241 2.133 2.187 0
Almacenamiento: Refrigerar a 2-8°C 1 1.965 1.914 1.940 1
Estabilidad: 12 meses o según lo indicado en la etiqueta. 2 1.757 1.799 1.778 3
Preparación: Diluya 1:10 en agua destilada o desionizada antes de su uso. Si se va a 3 1.221 1.254 1.238 10
utilizar toda la placa diluya 50 ml de concentrado tampón de lavado en 450 ml de
agua. 4 0.540 0.502 0.521 30
5 0.222 0.216 0.219 100
Desconocido 0.287 0.283 0.285 63
ASS BUF
Tampón de ensayo - Listo para Usar.
Contenido: Un vial que contiene un tampón con base en proteína con conservante sin CURVA DE CALIBRACIÓN
mercurio. Únicamente ejemplo de curva. NO utilice para calcular los resultados.
Volumen: 15 ml / vial
Conservación: Refrigerar a 2-8 ° C
Estabilidad: 12 meses o según lo indicado en la etiqueta.

CHROM TMB
Sustrato TMB - Listo para Usar.
Contenido: Una botella que contiene tetrametilbenzidina y peróxido de hidrógeno en
un tampón con contenido sin DMF o con DMSO.
Volumen: 16 ml / botella
Conservación: Refrigerar a 2-8 ° C
Estabilidad: 12 meses o según lo indicado en la etiqueta.

STOP SOLN
Solución de parada - Listo para Usar.
Contenido: Un vial que contiene ácido sulfúrico a 1M.
Volumen: 6 mL / vial
Conservación: Refrigerar a 2-8 ° C
Estabilidad: 12 meses o según lo indicado en la etiqueta.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
LINEALIDAD
SENSIBILIDAD Se diluyeron tres muestras de saliva de paciente con calibrador 0. Los resultados (en
El límite de detección se calcula a partir de la curva de calibración, mediante la ng/ml) se tabulan a continuación:
determinación de la concentración resultante de la DO media del calibrador 0
(basado en 10 análisis repetidos) menos SD 2. Por lo tanto, la sensibilidad del kit Muestra Resultado Result Esperado % de
DIAsource Cortisol Saliva de ELISA es de 1,0 ng / ml. Observado. recuperación
ESPECIFICIDAD (REACTIVIDAD CRUZADA) 1 18,18
Los siguientes compuestos fueron probados frente a la reactividad cruzada con el kit 1:2 10,32 9.09 113.5
Cortisol Saliva de ELISA con reacción cruzada de cortisol al 100%. 1:4 5,09 4.55 112.1
:8 2,20 2.27 96.7
Esteroides % de reactividad cruzada 2 49,89
Cortisol 100 1:2 28,03 24.95 112.3
Prednisolona 13.6 1:4 13,29 12.47 106.6
Corticosterona 7.6 1:8 7,97 7.24 110.1
Desoxicorticosterona 7.2 3 68,53
Progesterona 7.2 1:2 34,27 31.49 91.9
1:4 17,13 13.81 80.6
Cortisona 6.2 1:8 8,57 7.48 87.3
Desoxicortisol 5.6
Pednisone 5.6 VALORES NORMALES ESPERADOS
Dexametasona 1.6 En cuanto a todos los ensayos clínicos, cada laboratorio debe recoger datos y
No se detectó ninguna reacción cruzada con DHEAS y Tetrahydrocortisone. establecer su propio rango de valores normales esperados.
Tenga en cuenta que se observa una reactividad cruzada de 13,6% con
prednisolona. Ya que la prednisona se convierte en prednisolona in vivo, se debe Muestras al azar de hombres y mujeres fueron tomadas en la madrugada y
tener precaución al analizar los niveles de cortisol de pacientes que están recibiendo presentaron un rango absoluto de:
terapia.
5 - 21,6 ng / ml
PRECISIÓN INTRAENSAYO
Se analizaron tres muestras diez veces cada una en la misma curva de calibración.
Los resultados (en ng / ml) se tabulan a continuación:

Ejemplo: Media SD CV%

1 6.6 0.68 10.3
2 24.8 1.98 8.0
3 52.4 3.40 6.5

PRECISIÓN INTER-ENSAYO
Se analizaron tres muestras diez veces durante un período de cuatro semanas. Los
resultados (en ng / ml) se tabulan a continuación:

Ejemplo: Media SD CV%

1 6.3 0.63 9.8
2 23.7 2.06 8.7
3 51.8 3.37 6.5

RECUPERACIÓN
Se prepararon muestras sobrecargadas adicionando cantidades definidas de cortisol
a tres muestras de saliva de paciente (1:1). Los resultados (en ng / ml) se tabulan a
continuación:

Muestra Resultado Result % de

Observado. Esperado recuperación
1 no cargada 6.28 - -
+ 1.0 4.14 3.64 113.7
+ 10 9.05 8.14 111.2
+ 100 61.85 53.14 116.4
2 no cargada 8.03 - -
+ 3.0 6.05 5.52 109.6
+ 30 20.64 19.02 108.5
+ 100 52.20 54.02 96.6
3 no cargada 6.98
+ 3.0 5.38 4.99 107.8
+ 10 8.76 8.49 103.2
+ 30 19.00 18.49 102.8