INTRODUCCIÓN

El ADN que constituye el material genetico de los seres vivos y que ha

sido punto de investigación desde hace ya tiempo, ahora es posible ser
observada y anlizada atraves de distintos procesos.
En este presente informe explicaremos los procesos realizados en el
laboratorio que sirvieron para poder observar las bandas finales del ADN
(muestra). Para poder hacer esto posible se debe llevar a cabo tres
procedimientos fundamentales, que son:

 Extracción de ADN (muestra).

 Proceso de PCR.
 Electroforesis.

La extracción de ADN es una metodologia mediante la cual podemos

obtener material genetico que nos permite la manipulación del producto
obtenido. Es un metodo por el cual podemos estudiar mutaciones que esten
involucradas con diferentes potologias humanas, mapeos y secuenciación de
genes con fines terapeuticos.

El proceso de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) es una tecnica

utilizada para obtener un gran numero de copias de un fragmento de ADN
en una amplificación in vitro, ademas de ser una amplificación selectiva la
cual se basa en una capacidad de la enzima ADN polimerasa para fabricar
una cadena ADN complementaria a la existente.

La electroforesis es una tecnica utilizada para observar la concentración

e integridad del ADN, proteinas y otras biomoleculas. Ya que permite las
separación de las proteinas y acidos nucleicos a traves de una matriz
tamponada de pH 8.

Estos procedimientos hacen posible una amplificación del ADN para asi
poder detectar o determinar ciertas patologias como errores geneticos,
además de la determinación de paternidad; esto nos permite tener un mejor
conocimiento acerca de la aplicación de estos metodos en el campo de la
medicina y asi poder ponerlos en practica en el momento adecuado.
OBJETIVOS

1. EXTRACCION DE ADN
 Extraer el material genético (ADN) a partir de muestras biológicas.
 Conocer las propiedades de ciertas sustancias lo que ocasionan estas,
para lograr obtener ADN.
 Conocer algunos factores que afectan el rendimiento, calidad pureza
del ADN.

2. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

 Conoce los fundamentos en lo que se basa la técnica de PCR.

 Conoce la importancia del uso de la técnica de PCR para el
diagnóstico de enfermedades en los seres humanos.
 Explica cómo se genera un fragmento especifico de ADN genómico
humano utilizando la técnica de PCR.

3. ELECTROFORESIS

 Aprecia la técnica de electroforesis en gel.

 Comprende los conceptos que están involucrados en la separación
de ácidos nucleicos en una corrida electroforética.
 1. MARCO TEORICO
1.1 EXTRACCION DE ADN
1.1.1. COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA:
La molécula de ADN es una larga doble hélice enrollada sobre sí misma, en
ella, dos ramales compuesto de moléculas de azúcar (desoxirribosa) y fosfatos,
se conectan gracias a la unión de cuatro moléculas denominadas bases
formando los eslabones de la cadena. Estas cadenas están formadas por
cuatro nucleótidos diferentes, compuestos además por un azúcar, un ácido
fosfórico y una base nitrogenada. En dichos eslabones, la adenina se une a la
timina y la guanina a la citosina. Un gen es un segmento de ADN que tiene una
función específica y está constituido por una secuencia determinada de bases
nitrogenadas.
El ácido desoxirribonucleico forma los cromosomas del núcleo de las células y
es portador de la información genética del individuo.

1.1.2. TIPOS DE ADN

 ADN recombinante: Es un fragmento de ADN transferido artificialmente
a una célula. Esta es formada de manera artificial o in-vitro por la unión
de secuencias de ADN proveniente de dos organismos distintos que
normalmente no se encuentran juntos.
 ADN no codificante: Secuencia de nucleótidos de una molécula que no
codifica y cuya información es desconocida. Este no codifica para
aminoácidos y se encuentra entre los genes en el cromosoma sin alguna
función conocida. Otros, llamados intrones, se encuentran dentro de los
genes.

1.1.3. FUNCIÓN PRINCIPAL:

La función principal del ADN consiste en transmitir los genes, es decir, los
caracteres biológicos de un individuo determinado, en dicho genes está
grabada la instrucción necesaria para la construcción de cada individuo
completo. Siguiendo dichas instrucciones, cada célula es capaz de sintetizar
sus proteínas y de adoptar la forma y función que le corresponde a cada
organismo
1.1.4. LOCALIZACIÓN DEL ADN
El ADN se encuentra en todas las células de los seres vivos. Si la célula es
eucariota se encuentra en el núcleo, en cambio, si es procariota, encontramos
dicha información genética dispersa en todo el citoplasma. En las células
eucariotas encontramos el nucléolo y la cromatina, el nucléolo está formado
por ARN y proteínas, éstos intervienen en la formación de ribosomas, la
cromatina está formada por ADN y también proteínas, estos, originan los
cromosomas.

1.2.6. FUNCIONES
La sangre como todos los tejidos del cuerpo cumple múltiples funciones
necesarias para la vida como la defensa ante infecciones, los intercambios
gaseosos y la distribución de nutrientes. Para éstas funciones cuenta con
diferentes células que se encuentran en el plasma, todas éstas células se
fabrican en la médula ósea, ésta se encuentra en el tejido esponjoso de los
huesos planos, es decir, cráneo, vertebras, esternón, crestas ilíacas, y en los
canales medulares de los huesos largos como el fémur y el húmero.

1.2.7. COMPOSICIÓN SANGUÍNEA:

 Glóbulos rojos: Transportan el oxígeno de los pulmones hacia los tejidos
y captan el anhídrido carbónico producido en los tejidos que es
eliminado por las vías respiratorias.
 Glóbulos blancos: Defienden al organismo contra las infecciones
bacterianas y virales.
 Plaquetas: Impiden hemorragias, favoreciendo la coagulación en la
sangre.
 Plasma: Permite el transporte de nutrientes, contiene diversas
proteínas que son de utilidad en la terapia transfusional.

Existen diferentes grupos sanguíneos A, B, AB y O y el sistema Rhesus,

conocido como el factor Rh, (Positivo o negativo), éstos se encuentran
presentes simultáneamente en los seres vivos. Cuando se habla de grupo y
factor nos referimos al sistema ABO y Rh.
 1.2 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio
común utilizada para hacer muchas copias de una región particular de ADN.

1.2.1 LA TAQ POLIMERASA

Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una
enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el
uso de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que
normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria
tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN
polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de
los 70°C (temperatura a la que la ADN polimerasa de ser humano o de E.
coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta
estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas
repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.

1.2.2. CEBADORES PARA PCR

Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla,
generalmente de unos 202020 nucleótidos de longitud. En cada reacción de
PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región
blanco (la región que debe ser copiada). Es decir, les agregan secuencias
que harán que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los
extremos de la región a copiar. Los cebadores se unen al molde mediante
complementariedad de bases.
1.2.3. PASOS DE LA PCR
1.2.3.1. Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para
separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes
de cadena sencilla para el siguiente paso.
1.2.3.2. Templado (555555 - 656565°C): la reacción se enfría para que los
cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de
ADN de cadena sencilla.
1.2.3.3. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que
la Taqpolimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de
ADN.

1.2.4. APLICACIONES DE LA PCR

Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar
millones o miles de millones de veces y producirá suficientes copias de ADN
para que se analicen mediante otras técnicas. Por ejemplo, el ADN se puede
visualizar por electroforesis en gel, enviar a secuenciar o digerir con
enzimas de restricción y clonar en un plásmido.
La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene
aplicaciones prácticas en medicina forense, pruebas genéticas y
diagnósticas. Por ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes asociados
con trastornos genéticos a partir del ADN de los pacientes (o de ADN fetal,
en el caso de pruebas prenatales). La PCR también puede utilizarse para
detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente: si
el patógeno está presente, es posible amplificar regiones de su ADN de una
muestra de sangre o tejido.
 1.3. ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u
otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La
electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene
las moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se
desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades, con
lo que se separan unas de otras.
Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa.
Debido a esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN
únicamente por su tamaño. La electroforesis nos permite ver cuántos
fragmentos diferentes de ADN están presentes en una muestra y cuán grandes
son unos con respecto a otros. También podemos determinar el tamaño
absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto a una "escala" estándar
de fragmentos de tamaño conocido.
 2. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO
2.1 EXTRACCION DE ADN
2.1.1 MATERIALES EXTRACCIÓN DEL ADN
 1 Kit de extracción de ADN
 Micropipetas de 20 – 100, 100 - 1000 µl.
 1 caja de puntas de 10 -100 µl y de 100 -1 000 µl
 16 tubos ependorf de 1,5 mL Microcentrífuga16000 rpm Vortex.

2.1.2. PROCEDIMIENTO
 EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE TOTAL.
1. A un tubo ependorff, adicionar una muestra de 20 µl de sangre fresca o
congelada.
2. Transferir 20 µl de células o sangre a un tubo que contiene 20 µl proteinasa
K.
3. Añadir 20 µl de RNasa a la muestra. Someter a vórtex por 15 segundos e
incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
4. Añadir 100 µl de Buffer lisis y homogenizar utilizando vórtex por 15 s.
5. Incubar a 55 ° C durante 10 min.
6. Añadir 100 µl de etanol 96-100%. Mezclar en el vórtex por 15 segundos.
7. Incubar la lisis por 5 min a temperatura ambiente.
 PROCESO DE PURIFICACIÓN:
1. Colocar la lisis (260 µl) en la columna de extracción.
2. Centrifugar la columna a 8500 rpm por 1 min, descartar el filtrado por la
columna y colocar la columna en un nuevo tubo de lavado.
3. Lavar la columna con 200ul de buffer de lavado, centrifugar a 8500 rpm por
1 min y eliminar el filtrado.
4. Colocar la columna en un nuevo tubo de lavado, adicionar 200ul de buffer
de lavado y centrifugar la columna a velocidad máxima por 3 min para poder
filtrar cualquier residuo del buffer de lavado.
5. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección (1,5ml).
6. Añadir 100 µl de Buffer de elución a la columna.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar la columna a
velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente.
8. Para recuperar más ADN, realizar una segunda etapa de elución utilizando
el mismo volumen de buffer de elución (opcional)
9. Incubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar a velocidad máxima
por 1 min (opcional)
10. El tubo contiene ADN genómico purificado.
11. Almacenar el ADN purificado a -80ºC para otras aplicaciones.

 EXTRACCIÓN DEL ADN MEDIANTE RESINA CHELEX - 100

1. Colectar una muestra de tejido, sangre o raspado bucal en un tubo ependorf
de 1,5 ml conteniendo 500 μl de buffer TE, dejar reposar por 2 min.
2. Resuspender las células con toque de vortex por 3 min.
3. Al pellet celular obtenido se le adiciona 500 μl de una solución de resina
Chelex- 100 al 10%. Se agite en un vortex por 3 min.
4. Dejar incubando a 55ºC en agitación continua durante 30 min.
5. A continuación, la mezcla se introduce durante 10 min a 100ºC para
intensificar la desnaturalización de las proteínas.
6. Agitar en el vórtex por 30 seg y se centrifuga a 10000 rpm durante 5 min.
7. Extraer el sobrenadante donde se encuentra el ADN (fase acuosa) y
trasladarlo a otro tubo ependorf, en la parte inferior se encontrará la resina
Chelex-100, las proteínas desnaturalizadas y otros elementos.
8. El tubo ependorf conteniendo el sobrenadante se guardará en un
congelador a -20ºC.
 2.2. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
2.2.1. MATERIALES
 Micropipetas de 20 – 100, 100 - 1000 µl.
 50 puntas de 10 -100 µl y de 100 -1 000 µl
 16 tubos ependorf de 1,5 mL
 1 Microcentrífuga16000 rpm
 1 Termociclador
 1,5 ml de Agua estéril
 4 Muestras de ADN
 1 kit - Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs, primer, Mg, agua)
 1 kit (Primers Alfa tubiluna y Beta actina).

2.2.2. PROCEDIMIENTO
1. En un tubo de PCR colocar 25 µl de solución de reacción final (mix de PCR):

2. Centrifugar brevemente para mezclar bien los componentes.

3. Colocar los ependorf con la solución de mix de PCR en el termociclador, el
cual ya debe tener programado las condiciones de amplificación.

 Desnaturalización 94°C por 1 min

 Hibridación 52°C por 1 min
 Elongación 72°C 30 seg
 N° de ciclos 30
 Mantener a 4°C
4. Finalizada el proceso de amplificación, retirar los ependorf del
termociclador y guardar las muestras a 4°C si el amplificado se llegara a utilizar
en un lapso de poco tiempo. Si no fuese el caso mantener a – 20°C.
 2.3. ELECTROFORESIS

2.3.1. MATERIALES
 Muestra de ADN obtenida de la práctica anterior.
 5 µl Marcador de peso molecular.
 1 Cámara de electroforesis y accesorios (peines, soporte, tabla
niveladora, etc).
 1 Fuente de poder.
 Micropipetas para volúmenes de 0,5 - 20 μl.
 4 juegos de guantes.
 4 gradillas para tubos de 1,5 mL.
 50 puntas para volúmenes de 0,5 - 20 μl.
 40 ml de agarosa al 2 %. 1 L de Buffer Tris – borato – EDTA 1X (TBE)
pH 8-8.3.
 1,5 ml de Buffer carga para ADN. 40 µl Colorante Sybr green
 1 Transiluminador de luz UV.

2.3.2. PROCEDIMIENTO
• Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las muestras, los
reactivos y el equipo.
• Preparar 50 ml de agarosa al 2% y adicionar 20 μl de colorante Sybr green,
dejar polimerizar por 10 min aproximadamente. Sumergir el sistema
conteniendo los geles polimerizados en su tanque (cámara electroforética)
con el buffer TBE 1X para ADN. Al momento de sumergir los geles en el tanque,
asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.
• Sobre un pedazo de lámina extensible de parafilm, preparar una mezcla de
5 μl ADN con 1μl de buffer carga repartida en alícuotas de acuerdo al número
de muestras que se colocarán en los pocillos (considerar el uso de un marcador
de peso molecular estándar de ADN).
• Con el uso de puntas de 20 μl proceder a cargar cuidadosamente la muestra
en los pocillos del gel de agarosa evitando la contaminación del pocillo
contiguo.
• Finalizada la colocación de las muestras ADN en los pocillos, cubrir el tanque
con la tapa y conectar los cables de los electrodos en la fuente de poder.
Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado
(puede estar comprendido entre 75 a 120 voltios).
• Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la
electroforesis. Durante el proceso se evidenciarán dos frentes de corrida de
diferente color y distancia de migración. Ambos colores, azul oscuro y azul
claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilenecianol, que
conforman el buffer de la muestra. El xilenecianol en geles de agarosa al 2 %
migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pares de base (pb),
mientras que el azul de bromofenol a esta misma concentración de agarosa es
equivalente a un fragmento de 45 pb.
• Transcurrido el tiempo de corrida de la electroforesis, proceder al
desmontaje del equipo empezando con la desconexión de los electrodos de la
fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.
• Remover el gel del soporte, para realizar este proceso se requiere tener
mucho cuidado, pues el gel es muy frágil y puede romperse con facilidad.
• Desplazar el gel hacia el transiluminador para el revelado, encender el
equipo y verificar que este a una longitud de onda de 420 nm.
• Dejar hasta que empiecen a aparecer las bandas y registrar el resultado final.
• Observar los resultados obtenidos y discutir.