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ALIMENTACION, NUTRICION Y SALUD
Copyright © 2006 INSTITUTO DANONE
Probióticos: aspectos microbiológicos y tecnológicos
D. Ramón Vidal
DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA, CIENCIA DE LOS ALIMENTOS,
TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL. FACULTAD DE FARMACIA. UNIVERSITAT DE VALENCIA
BURJASSOT, VALENCIA. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA. INSTITUTO DE AGROQUÍMICA Y
TECNOLOGÍA DE ALIMENTO-CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS.
DEPARTAMENTO DE I+D, BIÓPOLIS S.L. VALENCIA
RESUMEN
D urante los últimos años las ventas de probióticos
han aumentado notoriamente en muchos países. Su pro-
ducción industrial exige la búsqueda del microorganismo y
su validación científica, la optimización de su producción
industrial, la formulación del alimento adicionado del pro-
biótico y su validación clínica. El futuro de la investigación
con probióticos vendrá marcado por el empleo de las nue-
vas tecnologías “ómicas”.
Palabras clave: Probiótico. Validación. Producción.
¿QUÉ ES UN PROBIÓTICO?
Durante siglos las bacterias ácido lácticas se han
usado empíricamente como forma de preservar y
mejorar la calidad de los alimentos fermentados.
Desde hace unos pocos años se acumulan muchas
evidencias científicas que indican que el consumo
sistemático de algunas de ellas afecta a la composi-
ción de la microflora del tracto gastrointestinal del
individuo que las ingiere. Como consecuencia se
produce un efecto beneficioso en su salud. Durante
más tiempo del deseable muchas de estas afirmacio-
nes se basaban en evidencias in vitro o estudios pre-
clínicos con animales de experimentación, pero en
los últimos años se han acumulado evidencias cientí-
ficas en experimentación clínica con voluntarios hu-
manos (Tabla I) que nos permiten afirmar que algu-
nas de estas bacterias tienen un efecto positivo
sobre algunas patologías clínicas en humanos (1). En
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ALIM. NUTRI. SALUD
Vol. 13, N.º 2, pp. 48-52, 2006
ABSTRACT
D uring the last few years, sales of probiotics have
been increased in many countries. The industrial produc-
tion of these microorganisms includes the search for the
probiotic and its scientific validation, the optimization of
its industrial production, the formulation of the probiotic
food or beverage and finally its clinical validation. Future
trends in probiotic research will be based on the use of the
new “omic” technologies.
Key words: Probiotic. Validation. Production.
muchos países desarrollados se ha disparado el con-
sumo de alimentos adicionados con estos microor-
ganismos como una forma de prevenir la aparición
de determinadas enfermedades o mejorar el estado
general de salud del consumidor. A este tipo de mi-
croorganismos los denominamos probióticos.
Existen muchas definiciones de probiótico. En ge-
neral, considerando lo propuesto en su día por ILSI,
FAO y OMS podemos entender por probiótico “un
suplemento alimentario compuesto por microorga-
nismos viables que tienen una influencia beneficiosa
sobre la salud del consumidor”. En esta definición se
hace preciso considerar que dicha influencia es es-
pecífica de cepa, debe producirse con la ingesta en
cantidad usual del alimento y debe ser demostrada
por medio de una experimentación científica riguro-
sa. Aunque ateniéndose a este concepto de probióti-
co hay muchos microorganismos que pueden serlo,
los que se comercializan son fundamentalmente bac-
terias ácido lácticas (Tabla II). De hecho, casi todos
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Vol. 13, N.º 2, 2006 PROBIÓTICOS: ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS Y TECNOLÓGICOS

TABLA I los probióticos comerciales están compuestos por

ALGUNAS PATOLOGÍAS EN LAS QUE SE DISPONE DE células viables de bacterias ácido lácticas pertene-
ALGÚN ENSAYO CLÍNICO CON PROBIÓTICOS CON cientes a los géneros Bifidobacterium y Lactobaci-
EFECTO POSITIVO llus. Las bacterias utilizadas con mayor frecuencia
como probióticos son distintas cepas de las especies
Patología
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infan-
Colitis ulcerosa tis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus aci-
Dermatitis atópica dophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasse-
Diarrea asociada a Clostridium difficile ri, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus
Diarrea asociada al consumo de antibióticos rhamnosus. Aunque existe mucha confusión sobre
Diarrea infantil la taxonomía de algunas de estas cepas, como suce-
Diarrea de los viajeros de en otros procesos industriales, dicha confusión
obedece en más ocasiones a intereses comerciales
Enfermedad de Crohn
que a cuestiones científicas.
Pouchitis
Hay muchos productos alimentarios que contie-
Síndrome de colon irritable
nen probióticos y están autorizados para la comer-
Vaginitis
cialización. Para tener una idea del potencial de
Confeccionada con los datos descritos en 1. mercado de estos productos, baste recordar que en
el año 1998 se manejaban datos de ventas elevados
en Alemania (60 millones de dólares), Holanda (30
millones de dólares), Francia (28 millones de dóla-
res), España (24 millones de dólares) y Reino Unido
(14 millones de dólares) y que sólo en el último de
estos países, en el año 2002 esta cifra había aumen-
TABLA II
tado hasta 676 millones de dólares (2,3). En alimen-
ALGUNOS MICROORGANISMOS IDENTIFICADOS tación convencional los derivados lácteos como el
COMO PROBIÓTICOS yogur, el queso, los helados o la mantequilla son el
vehículo más utilizado para comercializar probióticos
Grupo microbiano Especie aunque existen otros como las leches de soja, mayo-
nesa, zumos e incluso carnes, cacahuetes o sopas.
Bifidobacterias Bifidobacterium adolescentis
Aun así se hace necesario recordar que buena parte
Bifidobacterium animalis subsp. lactis de la producción mundial de probióticos se vende en
Bifidobacterium bifidum forma de suplementos nutricionales, particularmente
Bifidobacterium brevis en Estados Unidos.
Bifidobacterium infantis
Bifidobacterium longum
Enterococos Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium ¿CÓMO PRODUCIR UN ALIMENTO CON
UN PROBIÓTICO?
Lactobacilos Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus amylovorus
Lactobacillus casei Aunque a todos nos parece familiar el consumo
Lactobacillus crispatus de este tipo de productos, con frecuencia descono-
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cemos todos los pasos de investigación y desarrollo
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis que hay que llevar a cabo para poder formular el ali-
mento adicionado del probiótico. Estos pasos inclu-
Lactobacillus fermentum
yen la búsqueda del microorganismo y su validación
Lactobacillus gallinarum científica, la optimización de su producción indus-
Lactobacillus gasseri trial, la formulación del alimento adicionado del pro-
Lactobacillus helveticus biótico y su validación clínica. Dado el elevado coste
Lactobacillus johnsonii de los ensayos clínicos en humanos, ninguna empre-
Lactobacillus paracasei sa del sector asume este tipo de investigación hasta
Lactobacillus plantarum estar seguros de ser capaces de disponer de un mi-
croorganismo que tenga unas determinadas propie-
Lactobacillus reuteri dades funcionales in vitro se pueda producir de for-
Lactobacillus rhamnosus ma estable y sea viable en la matriz alimentaria a la
Lactobacillus salivarius que se va a añadir.
Lactococos Lactococcus lactis subsp. lactis En cuanto a la búsqueda del probiótico, se reco-
Levaduras Saccharomyces boulardii mienda partir de muestras biológicas humanas (funda-
mentalmente heces) provenientes de individuos sa-

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nos. Se suelen seguir estrategias de enriquecimiento
haciendo cultivos en medios a pH ácido adicionados
de sales biliares. De esta forma se seleccionan cepas
que posteriormente sean capaces de resistir las condi-
ciones extremas del tracto digestivo y puedan por lo
tanto ejercer una acción positiva sobre la salud del
consumidor. Las cepas seleccionadas se someten a
una caracterización taxonómica exhaustiva, combi-
nando propiedades fenotípicas con características ge-
néticas. Es importante definir una huella genética de
la cepa que permita posteriormente identificarla a ob-
jeto de protección jurídica. Además se evalúa la resis-
tencia al pH ácido y a las sales biliares y también se
estudia su capacidad de adherencia a mucus intesti-
nal, se analiza su perfil de resistencia a antibióticos y
la posible producción de determinados metabolitos in-
deseados. A todo ello se suman estudios bioquímicos
y fisiológicos in vitro e in vivo con animales de expe-
rimentación que permitan definir las bases molecula-
res de la actuación del probiótico en la patología o
función fisiológica objeto de estudio. Este hecho es
uno de los requisitos de la nueva reglamentación so-
bre alegaciones funcionales.
Optimizar la producción industrial de un probióti-
co no es tarea fácil. Cada cepa tiene un compor-
tamiento diferencial, lo que obliga a definir los
parámetros de crecimiento (medio de cultivo, tem-
peratura, agitación, oxigenación, fase de crecimien-
to) y conservación (fase de cultivo para la recogida,
tipo de secado, crioprotector, temperatura de alma-
cenamiento) para cada nuevo probiótico. A pesar
de su precio, se suelen utilizar medios complejos
como los denominados BFM, MRS o TPY (4). En el
caso de las bifidobacterias y Lb. acidophilus, dada
su baja actividad proteolítica se suelen añadir al me-
dio aminoácidos, extracto de levadura o hidroliza-
dos de caseína (5,6). Se optimiza el inóculo inicial,
la temperatura y, si se trabaja en feed-batch, el ré-
gimen de alimentación del nutriente limitante. Suele
ser crítica la aireación y en consecuencia el poten-
cial redox, por lo que se suele crecer el microorga-
nismo en un ambiente anaerobio. En ocasiones es
adecuado añadir algunos compuestos con actividad
antioxidante como el ácido ascórbico o la L-cisteína
(7,8). En cualquier caso, esta fase de producción del
probiótico debe ir ligada a la siguiente que se refiere
a su conservación. En este sentido, la liofilización
suele ser el método más conveniente. Para optimi-
zar esta fase se analiza la fase de cultivo en la que
recoger la biomasa (fase logarítmica versus fase es-
tacionaria), se ensayan diferentes crioprotectores y
su efecto sobre la viabilidad del microorganismo, la
textura del probiótico desecado y su influencia orga-
noléptica en el alimento final. Con todo ello se estu-
dian distintas temperaturas de almacenamiento y se
define la vida útil del probiótico como ingrediente
alimentario en las condiciones subóptimas de alma-
cenamiento.
Finalmente hay que escoger la matriz alimentaria a
la que añadir el probiótico. Una vez seleccionada hay
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que asegurar la dispersión homogénea del mismo en el
seno del alimento. Este trabajo es más sencillo al traba-
jar con bebidas que con alimentos sólidos donde se ha-
ce necesario afinar las operaciones unitarias de mez-
cla. Sin duda, en esta fase lo más importante es definir
la concentración del probiótico en el alimento o bebida
final. Dicha concentración debe ser un compromiso
entre la dosis efectiva diaria de probiótico y la ingesta
usual diaria del alimento. A título orientativo, la Fede-
ración Internacional de Lechería o la Asociación Japo-
nesa para los Derivados Lácteos recomiendan 107
ufc/ml en matrices líquidas. En el caso de alimentos
sólidos los expertos sugieren cifras en torno a las 109
ufc/g. El problema es que las distintas matrices alimen-
tarias pueden afectar diferencialmente a la viabilidad
de un mismo probiótico. Para conocer este efecto se
analiza la supervivencia del probiótico almacenando el
alimento en las condiciones de venta. En estos trabajos
hay que considerar entre otros la influencia del pH, el
oxígeno o el tipo de envase. Se han descrito casos de
grandes pérdidas de viabilidad (menos de 103 ufc/ml o
106 ufc/g en el alimento final) que invalidarían el efec-
to funcional (9). Es un problema especialmente grave
en el caso de alimentos con larga vida útil (papillas in-
fantiles) y también con determinados probióticos (bifi-
dobacterias). Una de las formas de evitarlo es acudir a
la microencapsulación del probiótico. En este sentido
se ha descrito la microencapsulación en lípidos como
una estrategia de mejora de la vida útil tras tratamien-
tos térmicos y también el empleo de gelatina, gomas
vegetales o geles de alginato como materiales de en-
capsulación que podrían incluso proteger al probiótico
de las condiciones extremas de acidez del tracto diges-
tivo tras la ingesta (10,11).
ÚLTIMOS PASOS: EVALUACIÓN CLÍNICA
Y REQUISITOS LEGALES
Como antes se indicó, el nuevo reglamento eu-
ropeo sobre alegaciones funcionales exigirá cono-
cer las bases moleculares de la alegación funcional
asociada al probiótico, pero también obligará a de-
mostrar su efecto en al menos dos ensayos clínicos
en hospitales diferentes. Para llevar a cabo este ti-
po de experimentación clínica se recomienda se-
guir las directrices del grupo de expertos
FAO/OMS que en el año 2001 se reunieron en la
ciudad argentina de Córdoba (12). En esencia, es-
tas recomendaciones sugieren una dinámica de
evaluación comparable a la que se lleva a cabo con
fármacos aunque con una exigencia menor. Es im-
portante destacar que las evaluaciones clínicas
siempre se deben llevar a cabo con el alimento fi-
nal adicionado con el probiótico y no con el pro-
biótico aislado. Como en el caso de las evaluacio-
nes de fármacos se habla de distintas fases.
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Vol. 13, N.º 2, 2006 PROBIÓTICOS: ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS Y TECNOLÓGICOS
La llamada fase I, o fase de evaluación de la seguri-
dad, implica un trabajo previo de determinación del
perfil de resistencia a antibióticos del probiótico, la au-
sencia de producción de compuestos indeseados y, a
ser posible, su estatus GRAS. Si el desarrollo del pro-
ducto se ha llevado a cabo de forma racional, buena
parte de este trabajo ya habrá sido abordado durante
la selección del probiótico (vide supra). La fase II, o fa-
se de evaluación de la eficacia, conlleva los ensayos en
voluntarios humanos informados. Deben ser ensayos
al azar a doble ciego y con un control de placebo. Co-
mo antes indicamos, se recomienda llevar a cabo al
menos dos ensayos en centros clínicos independien-
tes. La fase III o fase de evaluación de la efectividad es
opcional. Consiste en comparar la efectividad del pro-
biótico con la ejercida por un producto comparable
(otro probiótico previamente comercializado o un fár-
maco). En la medida de lo posible conviene llevar a ca-
bo estas evaluaciones en poblaciones sanas. Como an-
tes se indicó, el coste de este tipo de evaluaciones
implica que las empresas del sector no abordan su eje-
cución hasta tener una completa seguridad de la vali-
dez tecnológica del probiótico.
Superadas todas estas evaluaciones se llega a la co-
mercialización del alimento adicionado con el probióti-
co. En la actualidad en la Unión Europea (UE) se co-
mercializan muchos productos con probióticos. Con
más frecuencia de la deseada en su publicidad existe
un marketing demasiado agresivo y se hace uso de
alegaciones funcionales que no se corresponden con la
experimentación preclínica y clínica abordada para esa
cepa concreta. En la UE no existe una definición legal
ni una legislación sobre probióticos pero existe una se-
rie de legislaciones horizontales que las empresas pro-
ductoras deben tomar en consideración (13). La pri-
mera de ellas es el reglamento de nuevos alimentos. El
listado de categorías de nuevos alimentos incluidos en
esta reglamentación incluye un apartado para ingre-
dientes alimentarios que sean o consistan en microor-
ganismos. Una interpretación razonada de este requi-
sito implicaría reconocer como nuevo alimento
cualquier nuevo probiótico. Sin embargo, a pesar de
haberse presentado desde el año 1997 un total de 53
aplicaciones de nuevo alimento, ninguna ha hecho re-
ferencia a un nuevo probiótico. La segunda es la regu-
lación sobre producción orgánica que limita el empleo
del término “bio” o “eco” para los productos de la
agricultura ecológica. La falta de base científica para
ción y etiquetado de los alimentos con probióticos, so-
bre todo el primero de ellos que pretende que: a) la
evaluación científica sea el único motor del desarrollo
de alimentos funcionales; b) las alegaciones funciona-
les se basen en pruebas fundadas, objetivas y apropia-
das; c) las pruebas se sustenten en exigencias científi-
cas en vigor; y d) las alegaciones sean verdaderas y no
induzcan al error al consumidor.
EL FUTURO
El futuro de la investigación en probióticos vendrá
de la mano de las nuevas tecnologías “ómicas”. Debe-
mos incrementar nuestro conocimiento sobre la ecolo-
gía microbiana del tracto gastrointestinal para, de esa
forma, desarrollar probióticos más eficaces. En este
sentido es interesante destacar el comienzo de algunos
proyectos de metagenómica de bacterias de la cavidad
bucal y el tracto gastrointestinal (14). A ello habrá que
sumar los estudios de secuenciación de genomas de
probióticos. En la fecha de redacción de este artículo
hay secuencia pública del genoma de tres cepas pro-
bióticas (B. longum NCC2705, Lb. johnsonii
NCC533 y Lb. plantarum WCFS1) aunque existen
proyectos en marcha de otras muchas más (15). La in-
formación que de ellas obtengamos, unida a estudios
de transcriptómica y proteómica, será la base de los
probióticos de la próxima década.
Llegados a este punto conviene recordar que ya se
han desarrollado los primeros probióticos transgéni-
cos. Se han diseñado cepas transgénicas de Lactococ-
cus lactis que expresan el gen de la subunidad B de la
toxina tetánica (16) o genes de interleuquinas (17) y
también cepas transgénicas de Lactobacillus que pro-
ducen antígenos capsulares de rotavirus (18). La poca
receptividad de los consumidores europeos a este tipo
de productos dificulta su desarrollo aunque nadie duda
de su valor en algunos países en vías de desarrollo.
Desde la UE, con la barriga llena, es fácil decir no a es-
tos desarrollos que solventan problemas sanitarios que
no afectan a nuestra sociedad. La pregunta clave es:
¿aceptaría un consumidor europeo un probiótico
transgénico eficaz contra la enfermedad celiaca? Qui-
zás en este caso la respuesta fuera otra. Lo que es pro-
bable es que ese desarrollo marcaría un antes y un des-
tal decisión sólo puede ser explicada por los intereses pués de la investigación con probióticos
económicos y las presiones políticas que la promovie-
ron. Lo bien cierto es que un producto que contenga
un probiótico no podrá usar esta terminología a me- CORRESPONDENCIA:
nos que se haya elaborado siguiendo las directrices de Daniel Ramón Vidal
Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública,
la agricultura ecológica. El resto de normativas hori- Ciencia de los Alimentos, Toxicología y Medicina Legal
zontales que afectarán a la comercialización de probió- Facultad de Farmacia
ticos en la UE aún no están en vigor. Son el anterior- Universitat de Valencia
mente mencionado reglamento sobre alegaciones Avda. Vicent Andrés Estellés, s/n
funcionales y la propuesta de la Comisión para la regu- 46100 Burjassot, Valencia
e-mail: daniel.ramon@uv.es
lación del yogur y los productos similares al yogur. Sin
duda, su aprobación marcará pautas de comercializa-

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D. RAMÓN VIDAL
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