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Per verificare questa ipotesi, abbiamo prima determinato l'effetto dell'infezione da reovirus in vivo
su cellule dendritiche di mLN (DC). Il sottogruppo CD103 + CD11b - DC ha il più alto potenziale
tollerogenico ( 18 , 19 ), ma guida anche le risposte T H 1 alle infezioni intestinali ( 20 - 22 ). T1L ha
indotto più IL-12p40 rispetto a T3D-RV in CD103 + CD11b - CD8α + DC ( Figura 1B ), che era il
sottoinsieme che mostrava il più alto livello di captazione di ovalbumina (OVA) dopo
somministrazione orale, indipendentemente dal virus usato ( figura S5, A e B ). Tuttavia, entrambi i
virus hanno indotto livelli simili di IL-12p40 nel CD103 residente - CD11b - CD8α + DC ( figura
S5C ), mentre nessuna sovraregolazione di IL-12p40 era rilevabile negli altri sottogruppi di mLN
DC ( figura S5D ). Inoltre, T1L ha regolato più in alto la molecola di costimolazione CD86 e le
trascrizioni dell'interleuchina-27 (IL-27), una citochina prodotta da cellule presentanti l'antigene
(APC) che promuovono l'immunità T H 1 ( figura S5, E e F ) ( 23 , 24 ).
Avendo scoperto che T1L, ma non T3D-RV, induce un fenotipo proinfiammatorio nelle DC che
assorbono OVA, abbiamo poi studiato l'effetto dei due reovirus sulla risposta delle cellule T
all'antigene alimentare utilizzando un test di conversione delle cellule T in vivo ( fig. S6A ). In base
alla sua capacità di modificare il fenotipo tollerogenico di CD103 + CD11b - DC, l'infezione da T1L
ha significativamente inibito la conversione di cellule OT-II CD4 + specifiche OVA in reg di pT e
invece ha promosso la loro differenziazione in T-bet + e IFNγ + Celle CD4 + T in mLN e Lp,
rispettivamente ( Fig. 1, C e D , e fig. S6, da B a D ). Al contrario, il T3D-RV non ha nettamente
bloccato l'induzione di regimi pT né ha indotto risposte immunitarie T H 1 contro l'OVA alimentare
( Figura 1, C e D , e Figura S6, da B a D ). Sebbene T1L e T3D-RV differissero nella loro capacità
di interferire con le risposte agli antigeni alimentari, hanno indotto risposte T H 1 host simili a
infezioni virali in mLN e Lp ( figura S7, da A a D ).
La tolleranza orale è definita come l'instaurazione della tolleranza immunitaria periferica attraverso
la somministrazione orale di antigene e si ritiene dipenda dall'induzione dei reg di pT ( 6 ). Come
previsto, T1L ma non T3D-RV ha impedito l'induzione della tolleranza periferica dopo
somministrazione orale di OVA ( figura S7, da E a G ). Collettivamente, questi risultati
suggeriscono che come conseguenza delle interazioni T1L-ospite, la risposta tollerogenica agli
antigeni alimentari è abrogata e, invece, viene indotta l'immunità T H 1 agli antigeni alimentari.
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Distinti percorsi dell'ospite bloccano l'induzione dei regimi di pT e inducono
l'immunità di T H 1 all'antigene alimentare
Successivamente abbiamo cercato di determinare la base meccanicistica per l'effetto differenziale
dell'infezione da T1L e T3D-RV sulla risposta all'antigene alimentare. Gli IFN di tipo 1 sono
regolati in eccesso in CeD e sono stati suggeriti per spiegare lo sviluppo dell'immunità di T H 1
contro il glutine dietetico ( 25 ). L'analisi del sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) di mLN da topi
e topi wild-type (WT) in cui il recettore IFN di tipo 1 è stato eliminato (IFNAR - / - ) 48 ore dopo
l'infezione da T1L e T3D-RV ha rivelato che tra 285 geni trovati per essere differenzialmente
espressi tra topi infetti T1L e T3D-RV, 200 geni sono stati regolati in modo IFN di tipo 1 ( fig. S8 ),
58 erano parzialmente IFN-dipendenti di tipo 1 e 27 erano indipendente dal tipo 1 IFN, valutata con
la FDA per esaminare le differenze nella risposta di espressione. Ulteriori analisi in mLN hanno
confermato che T1L ha indotto livelli più elevati di geni inducibili IFN di tipo 1 canonico
come Mx1 e Isg15 rispetto a T3D-RV ( Figura 2A e Figura S9A ). Questo risultato era contrario ai
dati in vitro ( figura S9, da B a D ) e la capacità riportata di T1L ma non T3D di interferire con la
segnalazione IFN di tipo 1 ( 26 ), suggerendo che differenze ancora da determinare in le interazioni
virus-ospite visualizzate da T1L e T3D-RV possono portare a esiti alternativi in mLN in vivo e
l'IFN di tipo 1 può essere responsabile dell'avvio dell'immunità T H 1 contro l'antigene dietetico nel
topo infetto da T1L. Per valutare questa possibilità-ma per evitare i fattori confondanti associati alla
replicazione incontrollata di T1L in assenza di segnalazione IFN di tipo 1 ( 27 ) - abbiamo
analizzato le DC e la conversione delle cellule T specifiche OVA a 48 ore, un punto temporale in
cui i titoli virali l'ileo è simile nei topi WT e IFNAR - / - ( figura S9E ). Sorprendentemente, anche se
CD86 non è stato indotto in IFNAR - / - CD103 + CD11b - CD8α + DC ( figura S9F ), up-regulation di
IL-12p40 in DCs ( Fig. 2B e fig. S9G ) e Il27 mRNA in mLN ( fig S9H ) si è verificato dopo
l'infezione da T1L, suggerendo che gli IFN di tipo 1 non sono richiesti per l'acquisizione di un
fenotipo infiammatorio da parte degli APC di mLN.Coerentemente con questi risultati, l'infezione
da T1L ha indotto un'espressione T-bet comparabile in cellule T CD4 + specifiche per OVA in topi
WT e IFNAR - / - ( Figura 2C e figura S9I ). In questo momento iniziale, né Foxp3 né IFN-γ possono
essere rilevati in celle T specifiche per OVA nel mLN. Per valutare il ruolo dell'IFN di tipo 1 nella
conversione del reg di pT, è stato eseguito un test di conversione di cellule T OT-II in vivo in topi WT
e IFNAR - / - iniettati per via intraperitoneale con l'acido polininsinico analogico dsRNA: acido
policitidilico [poli (I: C )]. Come mostrato in Fig. 2, D ed E , e fig. S10, da A a B , dsRNA è stato
sufficiente per bloccare la conversione del reg di pT in modo IFN dipendente di tipo 1.Inoltre, gli IFN
di tipo 1 hanno bloccato la conversione del reg di pT paragonabile all'infezione con T1L ( figura
S10C ). Al contrario, poly (I: C) ( Fig. 2, F e G , e fig. S10D ) e IFN di tipo 1 ( figura S10C ) non
sono stati in grado di promuovere l'immunità T H 1.
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Fig. 2
L'IFN di tipo 1 è richiesto per il blocco della conversione del reg di pT ma non per l'induzione
dell'immunità di T H 1 all'antigene alimentare
( A ) I topi WT e IFNAR - / - sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 6 topi), 10 8 PFU di
T3D-RV ( n = 6 topi) o PBS (sham, n = 6 topi) per 2 giorni. L' espressione di Mx1 nel mLN è stata analizzata
mediante reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR). ( B e C ) Le cellule OT-
II +CD45.1 + CD4 + sono state trasferite nei topi WT CD45.2 + o IFNAR - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il
trasferimento, i topi sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 6 topi) o PBS (sham, n = 4 o
5 topi) e alimentato 1,5% OVA nell'acqua da bere per 2 giorni. L'espressione di IL-12p40 su MHC-II + gated
CD11c + CD103 + CD11b - CD8α + mLN DCs (B) e T-bet in OT-II + CD45.1 + CD4 + cellule T (C) nel mLN è
stata valutata mediante citometria a flusso. (Da D a G ) Le cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + sono state
trasferite nei topi WT CD45.2 + o IFNAR - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il trasferimento, i topi sono stati
inoculati con PBS ( n = 7 topi) o 50 mg di poli (I: C) ( n = 7 topi) per via intraperitoneale o 10 10 PFU di T1L
( n = 5 topi) per via orale e nutriti con un OVA -alimentazione alimentare per 6 giorni. L'espressione
intracellulare di Foxp3 e IFN-γ in cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + T nel mLN è stata valutata mediante
citometria a flusso. Vengono visualizzate le percentuali e i numeri assoluti di Foxp3 [(D) e (E)] e IFN-γ [(F)
e (G)]. I grafici da [(A) a (G)] illustrano almeno due esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01,
*** P <0,001, **** P <0,0001;Confronto multiplo ANOVA / Tukey unidirezionale.
Per definire il meccanismo alla base dell'immunità T1L-T H1 indotta all'antigene alimentare,
abbiamo interrogato i dati mLN RNA-seq dai topi WT e IFNAR - / - T1L e T3D-RV-infettati più
profondamente al fine di identificare geni che erano differenzialmente espresso in modo IFN di tipo
1 indipendente, utilizzando la FDA ( figura S11A ). IL-15, precedentemente dimostrato per
prevenire la conversione del reg di pT e indurre l'immunità T H 1 agli antigeni alimentari ( 28 ), non
era sovraregolato dopo l'infezione da T1L in mLN di topi IFNAR - / - ( figura S11B ). Al contrario,
fattore di regolazione interferone 1 (IRF1) - un fattore di trascrizione regolato a livello
trascrizionale ( 29 ) e implicato nella regolazione multistadio delle risposte immunitarie T H 1 ( 30 )
- è stato significativamente up-regolato dopo l'infezione da T1L in WT e IFNAR - / - topi ( figura
3A e figura S11A ). L'IRF1 era un candidato particolarmente intrigante perché è up-regolato nella
mucosa dei bambini con CeD ( 31 ). Per determinare se IRF1 è richiesto nell'immunopatologia
mediata da T1L, abbiamo analizzato DC e la conversione di cellule T OT-II in topi IRF1 - / - . I titoli
virali erano simili a 48 ore e 6 giorni dopo l'infezione nei topi WT e IRF1 - / - ( figura S11, C e D ),
permettendoci di analizzare la risposta all'antigene alimentare dopo somministrazione orale di OVA
in questi due momenti. Abbiamo scoperto che IL-12p40 ( figura 3B e figura S11E ) e in misura
minore CD86 ( figura S11F ) mostravano un'induzione significativamente inferiore nei topi IRF1 - / -
rispetto ai topi WT. Inoltre, l'induzione di I l12b e dell'espressione di mRNA di Il27 era
significativamente compromessa nei topi IRF1 - / - ( figura S11, G e H ). Coerentemente con l'up-
regulation IFN conservato di tipo 1 dopo l'infezione da T1L nei topi IRF1 - / - ( figura S11, I e J ),
l'assenza di IRF1 non è riuscita a ripristinare la conversione del reg di pT ( Fig. 3, C e D , e fig.
S11K ).Tuttavia, mentre il tipo-1 IFN segnalazione era superfluo a 48 ore ( Fig. 2C ), IRF1 era
necessario per T1L mediata T H 1 immunità all'antigene orale 48 ore ( fig. S11, L a N ) e 6 giorni
( Fig. 3, E ed F , e fig. S11O ) dopo l'alimentazione OVA. Questo risultato è coerente con il ruolo di
IL-12 e IL-27 nell'immunità T H 1 ( 23 , 30 , 32 ) e l'abrogazione del loro up-regulation nei topi
IRF1 - / - ( Figura 3B e figura S11, G e H). Sapendo che gli esperimenti di conversione delle cellule
T sono stati eseguiti utilizzando cellule T OT-II con capacità IRF1, abbiamo esaminato un ruolo per
IRF1 in DC eseguendo saggi di conversione in vitro T con DC mLN isolati 48 ore dopo l'infezione
da T1L di WT e IRF1 - / - topi. Poiché la deficienza di IRF1 altera la differenziazione dei sottogruppi
DC ( 33 ), abbiamo aggiustato la proporzione relativa dei principali sottogruppi di mLN DC dei topi
IRF1 - / - per approssimare quello dei topi WT ( figura S12, A e B ). In linea con un ruolo
fondamentale per IRF1 in DCs, abbiamo scoperto che mLN DC da topi infetti da T1L non
riuscivano a promuovere la differenziazione delle cellule T H 1 in assenza di espressione IRF1
( figura S12, C e D). I nostri studi non possono eliminare una potenziale funzione intrinseca delle
cellule T dell'IRF1 nel blocco del reg di pT mediata da virus ( 34 ). Inoltre, e in accordo con il difetto
di induzione di IL-12 osservato in vivo ( figura 3B e figura S11G ), la produzione di IL-12 è stata
ridotta in IRF1 - / - mLN DC rispetto a quella in WT mLN DC ( figura S12E) ). Infine, a sostegno di
un ruolo diretto per IL-12 in T1L-mediata T H 1 immunità all'antigene orale, abbiamo scoperto che
il blocco di IL-12 in vitro compromessa la capacità di T1L infettate WT MLN DC per convertire
cellule OT-II T nelle celle T H 1 ( figura S12, C e D). Questi risultati sono in accordo con gli studi
che riportano che IRF1 funziona nell'immunità T H 1 e nell'induzione di IL-12 ( 32 , 35 ). Infine,
oltre a IL-12, IRF1 è richiesto per l'up-regulation di IL-27 in vivo ( figura S11H ), suggerendo che
esso può anche partecipare all'induzione dell'immunità T H 1 all'antigene alimentare su infezione
T1L.
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Fig. 3
Un ruolo centrale per IRF1 nell'immunità T H 1 mediata da reovirus per l'antigene dietetico
( A ) I topi WT e IFNAR - / - sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 6 topi), 10 8 PFU di
T3D-RV ( n = 6 topi) o PBS (sham, n = 6 topi) per 2 giorni. L' espressione di Irf1 nel mLN è stata analizzata
mediante RT-PCR. ( B ) Le cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + sono state trasferite nei topi WT CD45.2 + o
IRF1 - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il trasferimento, i topi sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di
T1L ( n= 4 a 6 topi) o PBS (sham, n = 4 a 6 topi) e alimentato 1,5% OVA nell'acqua da bere per 2 giorni.
L'espressione di IL-12p40 su MHC-II + gated CD11c + CD103 + CD11b - CD8α + mLN DC è stata valutata
mediante citometria a flusso. (Da C a F ) Le cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + sono state trasferite nei topi WT
CD45.2 + o IRF1 - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il trasferimento, i topi sono stati inoculati peroralmente con
10 10 PFU di T1L ( n= 5 o 6 topi) o PBS (sham, n = 4 a 6 topi) e alimentato 1,5% OVA nell'acqua da bere per
6 giorni. L'espressione intracellulare di Foxp3 e IFN-γ è stata valutata mediante citometria a flusso.
Diagrammi di punti rappresentativi (C), percentuali di Foxp3 (D), grafici a punti rappresentativi (E) e
percentuali di IFN-γ (F) sono mostrati nelle cellule OT-II + CD4 + trasferite nel mLN. I grafici da [(A) a (F)]
illustrano due esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001; Confronto
multiplo ANOVA / Tukey unidirezionale.
Presi insieme, i nostri studi che analizzano l'effetto di T1L sulla risposta all'antigene alimentare
usando l'OVA come antigene modello ( figura S13 ) suggeriscono che due ceppi di reovirus
possono indurre reazioni T H 1 antivirali simili in PP e mostrare tuttavia proprietà
immunopatologiche distinte. Mostriamo che T1L, ma non T3D-RV, promuove un fenotipo
infiammatorio in DCs assumendo antigene alimentare. Inoltre, i nostri risultati indicano che il
segnale di tipo 1 IFN e l'up-regulation IRF1 sono implicati in modo differenziale nel bloccare
la conversione del reg di pT e promuovere l' immunità di T H 1 nell'antigene alimentare dopo
l'infezione da T1L. IRF1 funziona in T H indotto da T1L1 immunità all'antigene alimentare
promuovendo IL-12 e IL-27 in DC. Sebbene gli IFN di tipo 1 non siano richiesti ( figura 3A ),
probabilmente contribuiscono all'up-regulation IRF1 ( 36 ) dopo l'infezione da reovirus nei topi
WT.
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Conclusione
Questo studio fornisce supporto per il concetto che i virus possono interferire con l'omeostasi
immunitaria intestinale e iniziare la perdita della tolleranza orale e dell'immunità T H 1 all'antigene
alimentare. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che un agente patogeno avirulente, come il
reovirus, che viene eliminato con successo dall'ospite infetto, può comunque promuovere
l'immunopatologia. A sostegno di questa idea, le infezioni da norovirus clinicamente silenti
aumentano la suscettibilità allo sviluppo della colite ( 38). I nostri dati indicano anche che due virus
appartenenti alla stessa specie possono avere effetti immunopatologici sostanzialmente diversi.
L'analisi dei profili trascrizionali indotta in risposta a T1L e T3D-RV suggerisce che la capacità di
un virus di innescare la perdita di tolleranza orale è associata alla sua capacità di interrompere
l'omeostasi immunitaria nei siti in cui sono iniziate le risposte agli antigeni orali ( figura S13). ).
Oltre al reovirus, è probabile che altri virus enterici, compresi i virus appartenenti a famiglie
rilevate da diversi sensori immunitari e che coinvolgono diverse vie di segnalazione, attivino anche
la perdita di tolleranza per l'antigene dietetico. Espandendo il concetto di virotipi ( 37 ), proponiamo
che i virus che inducono risposte immunitarie proinfiammatorie all'antigene alimentare alterino
l'omeostasi immunitaria e in particolare le DC con proprietà proinfiammatorie nei siti in cui viene
indotta tolleranza orale ( figura S13).). L'identificazione di altri virus e la definizione delle
principali caratteristiche comuni delle interazioni virus-ospite che portano all'abrogazione della
tolleranza orale aiuteranno a progettare strategie di vaccinazione per prevenire il CeD e
possibilmente altri disordini autoimmuni nelle popolazioni a rischio. Sulla base delle nostre
scoperte, anche i virus che non conducono ad una patologia clinica conclamata potrebbero essere
candidati per tale intervento profilattico.
Il CeD è un disturbo complesso che probabilmente richiede diverse perturbazioni ambientali per
interrompere in modo permanente la tolleranza al glutine. Infatti, studi epidemiologici che
monitorano longitudinalmente i bambini a rischio genetico segnalano risposte immunitarie
transitorie anti-glutina prima dello sviluppo di CeD completamente sviluppato ( 39 , 40 ) e
suggeriscono che gli anticorpi anti-glutine precedano gli anticorpi anti-TG2 ( 41 ). Inoltre,
l'induzione dell'immunità di T H 1 al glutine, sebbene richiesta, è insufficiente a causare atrofia dei
villi, sia negli uomini che nei modelli murini di CeD ( 42 - 44 ). Il nostro studio indica che anche se
le infezioni da reovirus possono innescare lo sviluppo di T H1 immunità al glutine e attivazione del
TG2, saranno necessari ulteriori eventi per l'induzione di anticorpi anti-TG2 e atrofia dei
villi. Inoltre, i trigger non virali, come i membri patogeni del microbiota ( 45 , 46 ), possono avere
proprietà patologiche simili a reovirus, e la combinazione di diversi tipi di fattori ambientali
probabilmente porterà alla formazione di un pool di memoria di T H 1 Cellule T anti-glutone di
grandezza sufficiente a causare un CeD persistente con atrofia dei villi.
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La generazione e il sequenziamento della biblioteca sono stati eseguiti dalla Genomics Facility
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sono stati depositati nel database Omnibus del Centro nazionale per le informazioni sulle
biotecnologie Omnibus sotto il record SuperSeries GSE94604 contenente i seguenti record
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sono state generate dalla risorsa condivisa di patologia traslazionale di Vanderbilt supportata
dall'Istituto nazionale per il cancro / Istituto nazionale di assistenza sanitaria per il cancro al cancro
Grant P30 CA068485 e dal centro di fenotipizzazione metabolica del mouse Vanderbilt Grant U24
DK059637. L'imaging a diapositiva intera e la quantificazione dell'immunocolorazione sono state
eseguite nella Risorsa condivisa di istologia digitale presso il Vanderbilt University Medical Center
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topi OT-II. Ringraziamo D. Mucida e D. Esterhazy (The Rockefeller University) per esperienza e
reagenti. Ringraziamo B. Xiang per l'assistenza tecnica. Ringraziamo T. Golovkina per
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NIH: R01DK098435 a BJ, TSD e RJX; R01DK100619 e R01DK067180 a BJ; Da R01AI038296 a
TSD; Da R01DK43351 a RJX; Da F31DK108562 a JJB; Da R01DK063158 a CK; e R01AI113333
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MGH per AN; un premio dalla Bettencourt Schueller Foundation alla RB;una borsa di ricerca della
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L'analisi dei campioni dei pazienti in questo lavoro è stata approvata dall'Institutional Review Board
dell'Università di Chicago (protocollo 12623B) e Vanderbilt University (protocollo 151358). Infine,
ringraziamo i pazienti CeD, i loro familiari e il Centro per le malattie celiache dell'Università di
Chicago p