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La celiachia (CeD) è una malattia immunitaria complessa con una componente autoimmune in cui

individui geneticamente suscettibili che esprimono le molecole DQ2 o DQ8 dell'antigene


leucocitario umano (HLA) mostrano una risposta immunitaria infiammatoria T helper 1 (T H 1)
contro il glutine alimentare presente nel grano ( 1 - 3 ). La risposta T H 1 ristretta da HLA-DQ2- o
HLA-DQ8 contro il glutine è centrale nella patogenesi del CeD e pensata per precedere lo sviluppo
dell'atrofia dei villi ( 4 ).Tuttavia, le osservazioni epidemiologiche e immunologiche supportano un
ruolo per ulteriori fattori genetici e ambientali nella patogenesi del CeD. Livelli simili di consumo
di grano ed espressione di molecole HLA predisponenti al CeD possono essere accompagnati da
notevoli differenze nella prevalenza di CeD ( 1 ). Un esempio notevole a sostegno del ruolo dei
fattori ambientali è l'alta frequenza del CeD nella Carelia finlandese (> 2%), che contrasta con la
bassa incidenza del CeD nell'adiacente repubblica russa della Carelia (0,2%), due regioni limitrofe
che ospitano geneticamente simili popolazioni. Inoltre, la digestione incompleta del glutine da parte
degli enzimi intestinali ( 2 , 5 ) spiega perché il glutine potrebbe favorire l'induzione delle risposte
delle cellule T intestinali. Tuttavia, non spiega perché i pazienti CeD sviluppino una risposta T H 1
glutine-specifica invece di una risposta immunitaria regolatrice, la reazione immunitaria intestinale
predefinita alle proteine oralmente ingerite, caratterizzata dall'induzione di cellule T regolatorie
periferiche (reg. casella di forkhead fattore di trascrizione P3 (Foxp3) ( 6 ).

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Modello sperimentale di infezione virale utilizzando reovirus geneticamente


modificati
Nonostante l'evidenza epidemiologica delle associazioni tra infezioni virali e l'inizio del CeD ( 1 ),
mancano prove sperimentali. Studi precedenti hanno implicato adenovirus, enterovirus, virus
dell'epatite C e rotavirus come trigger di CeD ( 7 , 8 ). Tuttavia, poco si sa sui meccanismi con cui i
virus evocano la malattia. I virus della famiglia Reoviridae sono virus segmentali a doppio
filamento di RNA (dsRNA) che infettano gli esseri umani frequentemente nel corso della loro vita
( 9 ). I ceppi di Orthoreovirus (reovirus) dei mammiferi isolati dall'uomo possono infettare i topi per
via orale e attivare vie immunitarie innate simili al rotavirus correlato ( 10 , 11 ). Due isolati di
reovirus umano, tipo 1 Lang (T1L) e tipo 3 Dearing (T3D), differiscono nella biologia di
replicazione, nell'induzione dell'apoptosi, nell'attivazione della risposta immunitaria innata, nel
tropismo cellulare e nella patogenesi ( 11 ). Inoltre, il T1L infetta l'intestino e perturba l'omeostasi
immune intestinale ( 11 , 12 ), mentre il T3D non è in grado di infettare l'intestino ( 11 ). Sulla base
delle differenze fondamentali tra T1L e T3D, abbiamo ipotizzato che l'ingegneria di un virus
riassortitore T3D capace di infezione intestinale produrrebbe due virus con effetti potenzialmente
diversi sulla tolleranza all'antigene alimentare. Pertanto, abbiamo recuperato un virus del
riassortimento T3D chiamato T3D-RV introducendo i segmenti del gene S1 e L2 del T1L in uno
sfondo genetico T3D, consentendo così al virus di infettare l'intestino ( figura S1A ) ( 13 ). Tali
riassortitori si presentano naturalmente ( 10 , 11 ) e possono essere prontamente recuperati in
laboratorio usando la genetica inversa ( 11 ). In primo luogo abbiamo stabilito che i due virus sono
simili nella loro capacità di replicarsi ( figura S1B ) e infettare l'intestino ( figura S1, C e
D ). Inoltre, entrambi i virus vengono eliminati ( figura S1E ) senza indurre danni intestinali ( figura
S1F ). Sebbene entrambi i virus inducessero titoli di anticorpi antireovirus elevati, i livelli di
anticorpi osservati dopo l'infezione da T1L erano significativamente più alti di quelli dopo
l'infezione da T3D-RV ( figura S1G ). Tuttavia, il confronto della risposta delle cellule T ospite in
topi infetti da virus e sham ha rivelato che T1L e T3D-RV hanno indotto risposte T H 1 simili nei
patch di Peyer (PP) ( figura S1H ), il sito in cui l'immunità protettiva al reovirus è indotto ( 12 ).
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L'infezione da Reovirus T1L promuove l'immunità infiammatoria agli antigeni
alimentari
Avendo accertato che i due ceppi infettano e inducono immunità protettiva in PP, abbiamo
esaminato in seguito se influenzano le risposte immunitarie agli antigeni alimentari a siti induttivi
ed effettori di linfonodi mesenterici tolleranti alla tolleranza (mLN) e lamina propria (Lp)
( 14 , 15 ), rispettivamente.Abbiamo adottato un approccio imparziale, utilizzando la profilazione
trascrizionale per confrontare e confrontare le dinamiche dell'interazione virus-ospite in più siti
dell'intestino. L'applicazione di un approccio senza supervisione che includeva la spanning trees
minima (MST) ( 16 , 17 ) e l'ordinamento multidimensionale di scaling (MDS) ( Fig. 1A ) ha
rivelato cluster di profili trascrizionali fortemente motivati dalle differenze di posizione (epitelio,
Lp, PP e mLN) e sono stati influenzati dall'infezione da reovirus in modo localizzato e dipendente
dal tempo, che è coerente con la nostra comprensione dell'immunità mucosa e della struttura e
funzione intestinale. Questo forte effetto di posizione era direttamente evidente e prevalentemente
catturato dalla dimensione 1 nell'operazione di scalatura MDS, che insieme alla dimensione 2
catturava anche le differenze dipendenti dal virus. All'inizio (6 ore), entrambi i virus hanno effetti
simili principalmente su PP e compartimento epiteliale (siti primari di infezione) ( 12 ) e nessun
effetto su mLN ( Figura 1A ). Al contrario, a 48 ore, i virus hanno alterato il profilo trascrizionale di
mLN e Lp (siti induttivi ed effettori delle risposte immunitarie agli antigeni alimentari) ( 14 , 15 ) e
sono emerse le differenze di risposta tra i due virus ( Figura 1A ). Pertanto, abbiamo seguito questa
osservazione con analisi fattoriali (FDA) in profondità ( figura S2 ) per identificare i geni ospiti
espressi in modo differenziale in risposta ai due virus, caratterizzandone l'espressione in un modo
dipendente dal tempo e dalla posizione. Sia in Lp che in mLN a 48 ore, abbiamo osservato un forte
arricchimento di vie di risposta immunitarie, di difesa e antivirali, inclusa la segnalazione di
interferone di tipo 1 (IFN), tra geni che erano differenzialmente espressi dopo infezione da T1L o
T3D-RV ( fig. S3 ).Inoltre, in mLN, la risposta differenziale ai virus è stata anche caratterizzata da
una sovrarappresentazione delle citochine e delle vie di segnalazione della chinasi della proteina
attivata dal mitogeno (MAP), nonché delle vie associate alla risposta dei nutrienti, allo stress e al
trasporto mediato dalla vescicola ( fig. S3 ). La scoperta che T1L ha indotto cambiamenti
trascrizionali più estesi (nel numero e nel livello di geni indotti) in mLN e Lp a 48 ore rispetto a
quella di T3D-RV ( Fig. 1A e fig. Da S2 a S4 ) ha sollevato la possibilità che T1L potesse alterare
la risposta all'antigene alimentare.
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Fig. 1
T1L blocca la differenziazione dei reg di pT e promuove l'immunità di T H 1 verso l'antigene dietetico
nei siti induttivi ed effettori dell'intestino
( A ) Per ogni punto temporale, i topi WT sono stati inoculati peroralmente con 10 10 unità formanti placca
(PFU) di T1L ( n = 3 topi, cerchi rossi), 10 10 PFU di T3D-RV ( n = 3 topi, cerchi blu) , o soluzione salina
tamponata con fosfato (PBS) (sham, n = 3 topi, cerchi aperti) ed eutanizzata 6 o 48 ore dopo
l'inoculazione.L'RNA di mLN, PP, epitelio e Lp sono stati isolati e analizzati mediante microarray. L'MST è
rappresentato sull'ordinazione di ridimensionamento multidimensionale. L'MST traccia un percorso di peso
minimo attraverso ogni vertice o nodo che rappresenta il profilo di geni differenzialmente espressi per ogni
stato campione mostrato. Le lunghezze dei bordi (o percorsi di collegamento) indicano il livello di
dissomiglianza tra i campioni. Ogni stato campione e le distanze tra loro sono rappresentati nello spazio
bidimensionale. Le coordinate di ciascun campione lungo ciascuna dimensione sono indicate dai due
assi. ( B ) I topi sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 6 topi), 10 8 PFU di T3D-RV
( n = 6 topi), o PBS (sham, n = 5 topi) per 2 giorni. L'espressione di IL-12p40 su MHC-II + gated
CD11c + CD103 + CD11b - CD8α + mLN DC è stata valutata mediante citometria a flusso. I grafici dei punti
rappresentativi e le percentuali di IL-12p40 nel mLN sono mostrati nel sottoinsieme CD103 + CD11b -
CD8α + DC. ( C e D ) Le cellule OT-II + CD45.1 +CD4 + sono state trasferite nei topi WT CD45.2 + . Un
giorno dopo il trasferimento, i topi sono stati inoculati peroralmente con 10 10 PFU di T1L ( n = 4 a 16 topi),
10 10 PFU di T3D-RV ( n = 5 a 14 topi) o PBS (sham, n= 6 a 15 topi) e hanno alimentato l'1,5% di OVA
nell'acqua potabile (cerchi pieni) o una dieta contenente OVA (cerchi aperti) per 6 giorni. L'espressione
intracellulare di Foxp3 e T-bet nelle cellule OT-II + CD45 + T CD4 +trasferite nel mLN e nel Lp è stata
valutata mediante citometria a flusso. I grafici a punti rappresentativi e le percentuali delle celle Foxp3 + T-
bet - e T-bet + Foxp3 - sono mostrati rispettivamente in mLN (C) e in Lp (D).I grafici da [(B) a (D)] illustrano
almeno due esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001; analisi della
varianza a una via (ANOVA) / confronto multiplo di Tukey.

Per verificare questa ipotesi, abbiamo prima determinato l'effetto dell'infezione da reovirus in vivo
su cellule dendritiche di mLN (DC). Il sottogruppo CD103 + CD11b - DC ha il più alto potenziale
tollerogenico ( 18 , 19 ), ma guida anche le risposte T H 1 alle infezioni intestinali ( 20 - 22 ). T1L ha
indotto più IL-12p40 rispetto a T3D-RV in CD103 + CD11b - CD8α + DC ( Figura 1B ), che era il
sottoinsieme che mostrava il più alto livello di captazione di ovalbumina (OVA) dopo
somministrazione orale, indipendentemente dal virus usato ( figura S5, A e B ). Tuttavia, entrambi i
virus hanno indotto livelli simili di IL-12p40 nel CD103 residente - CD11b - CD8α + DC ( figura
S5C ), mentre nessuna sovraregolazione di IL-12p40 era rilevabile negli altri sottogruppi di mLN
DC ( figura S5D ). Inoltre, T1L ha regolato più in alto la molecola di costimolazione CD86 e le
trascrizioni dell'interleuchina-27 (IL-27), una citochina prodotta da cellule presentanti l'antigene
(APC) che promuovono l'immunità T H 1 ( figura S5, E e F ) ( 23 , 24 ).
Avendo scoperto che T1L, ma non T3D-RV, induce un fenotipo proinfiammatorio nelle DC che
assorbono OVA, abbiamo poi studiato l'effetto dei due reovirus sulla risposta delle cellule T
all'antigene alimentare utilizzando un test di conversione delle cellule T in vivo ( fig. S6A ). In base
alla sua capacità di modificare il fenotipo tollerogenico di CD103 + CD11b - DC, l'infezione da T1L
ha significativamente inibito la conversione di cellule OT-II CD4 + specifiche OVA in reg di pT e
invece ha promosso la loro differenziazione in T-bet + e IFNγ + Celle CD4 + T in mLN e Lp,
rispettivamente ( Fig. 1, C e D , e fig. S6, da B a D ). Al contrario, il T3D-RV non ha nettamente
bloccato l'induzione di regimi pT né ha indotto risposte immunitarie T H 1 contro l'OVA alimentare
( Figura 1, C e D , e Figura S6, da B a D ). Sebbene T1L e T3D-RV differissero nella loro capacità
di interferire con le risposte agli antigeni alimentari, hanno indotto risposte T H 1 host simili a
infezioni virali in mLN e Lp ( figura S7, da A a D ).
La tolleranza orale è definita come l'instaurazione della tolleranza immunitaria periferica attraverso
la somministrazione orale di antigene e si ritiene dipenda dall'induzione dei reg di pT ( 6 ). Come
previsto, T1L ma non T3D-RV ha impedito l'induzione della tolleranza periferica dopo
somministrazione orale di OVA ( figura S7, da E a G ). Collettivamente, questi risultati
suggeriscono che come conseguenza delle interazioni T1L-ospite, la risposta tollerogenica agli
antigeni alimentari è abrogata e, invece, viene indotta l'immunità T H 1 agli antigeni alimentari.
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Distinti percorsi dell'ospite bloccano l'induzione dei regimi di pT e inducono
l'immunità di T H 1 all'antigene alimentare
Successivamente abbiamo cercato di determinare la base meccanicistica per l'effetto differenziale
dell'infezione da T1L e T3D-RV sulla risposta all'antigene alimentare. Gli IFN di tipo 1 sono
regolati in eccesso in CeD e sono stati suggeriti per spiegare lo sviluppo dell'immunità di T H 1
contro il glutine dietetico ( 25 ). L'analisi del sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) di mLN da topi
e topi wild-type (WT) in cui il recettore IFN di tipo 1 è stato eliminato (IFNAR - / - ) 48 ore dopo
l'infezione da T1L e T3D-RV ha rivelato che tra 285 geni trovati per essere differenzialmente
espressi tra topi infetti T1L e T3D-RV, 200 geni sono stati regolati in modo IFN di tipo 1 ( fig. S8 ),
58 erano parzialmente IFN-dipendenti di tipo 1 e 27 erano indipendente dal tipo 1 IFN, valutata con
la FDA per esaminare le differenze nella risposta di espressione. Ulteriori analisi in mLN hanno
confermato che T1L ha indotto livelli più elevati di geni inducibili IFN di tipo 1 canonico
come Mx1 e Isg15 rispetto a T3D-RV ( Figura 2A e Figura S9A ). Questo risultato era contrario ai
dati in vitro ( figura S9, da B a D ) e la capacità riportata di T1L ma non T3D di interferire con la
segnalazione IFN di tipo 1 ( 26 ), suggerendo che differenze ancora da determinare in le interazioni
virus-ospite visualizzate da T1L e T3D-RV possono portare a esiti alternativi in mLN in vivo e
l'IFN di tipo 1 può essere responsabile dell'avvio dell'immunità T H 1 contro l'antigene dietetico nel
topo infetto da T1L. Per valutare questa possibilità-ma per evitare i fattori confondanti associati alla
replicazione incontrollata di T1L in assenza di segnalazione IFN di tipo 1 ( 27 ) - abbiamo
analizzato le DC e la conversione delle cellule T specifiche OVA a 48 ore, un punto temporale in
cui i titoli virali l'ileo è simile nei topi WT e IFNAR - / - ( figura S9E ). Sorprendentemente, anche se
CD86 non è stato indotto in IFNAR - / - CD103 + CD11b - CD8α + DC ( figura S9F ), up-regulation di
IL-12p40 in DCs ( Fig. 2B e fig. S9G ) e Il27 mRNA in mLN ( fig S9H ) si è verificato dopo
l'infezione da T1L, suggerendo che gli IFN di tipo 1 non sono richiesti per l'acquisizione di un
fenotipo infiammatorio da parte degli APC di mLN.Coerentemente con questi risultati, l'infezione
da T1L ha indotto un'espressione T-bet comparabile in cellule T CD4 + specifiche per OVA in topi
WT e IFNAR - / - ( Figura 2C e figura S9I ). In questo momento iniziale, né Foxp3 né IFN-γ possono
essere rilevati in celle T specifiche per OVA nel mLN. Per valutare il ruolo dell'IFN di tipo 1 nella
conversione del reg di pT, è stato eseguito un test di conversione di cellule T OT-II in vivo in topi WT
e IFNAR - / - iniettati per via intraperitoneale con l'acido polininsinico analogico dsRNA: acido
policitidilico [poli (I: C )]. Come mostrato in Fig. 2, D ed E , e fig. S10, da A a B , dsRNA è stato
sufficiente per bloccare la conversione del reg di pT in modo IFN dipendente di tipo 1.Inoltre, gli IFN
di tipo 1 hanno bloccato la conversione del reg di pT paragonabile all'infezione con T1L ( figura
S10C ). Al contrario, poly (I: C) ( Fig. 2, F e G , e fig. S10D ) e IFN di tipo 1 ( figura S10C ) non
sono stati in grado di promuovere l'immunità T H 1.
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Fig. 2
L'IFN di tipo 1 è richiesto per il blocco della conversione del reg di pT ma non per l'induzione
dell'immunità di T H 1 all'antigene alimentare
( A ) I topi WT e IFNAR - / - sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 6 topi), 10 8 PFU di
T3D-RV ( n = 6 topi) o PBS (sham, n = 6 topi) per 2 giorni. L' espressione di Mx1 nel mLN è stata analizzata
mediante reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR). ( B e C ) Le cellule OT-
II +CD45.1 + CD4 + sono state trasferite nei topi WT CD45.2 + o IFNAR - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il
trasferimento, i topi sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 6 topi) o PBS (sham, n = 4 o
5 topi) e alimentato 1,5% OVA nell'acqua da bere per 2 giorni. L'espressione di IL-12p40 su MHC-II + gated
CD11c + CD103 + CD11b - CD8α + mLN DCs (B) e T-bet in OT-II + CD45.1 + CD4 + cellule T (C) nel mLN è
stata valutata mediante citometria a flusso. (Da D a G ) Le cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + sono state
trasferite nei topi WT CD45.2 + o IFNAR - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il trasferimento, i topi sono stati
inoculati con PBS ( n = 7 topi) o 50 mg di poli (I: C) ( n = 7 topi) per via intraperitoneale o 10 10 PFU di T1L
( n = 5 topi) per via orale e nutriti con un OVA -alimentazione alimentare per 6 giorni. L'espressione
intracellulare di Foxp3 e IFN-γ in cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + T nel mLN è stata valutata mediante
citometria a flusso. Vengono visualizzate le percentuali e i numeri assoluti di Foxp3 [(D) e (E)] e IFN-γ [(F)
e (G)]. I grafici da [(A) a (G)] illustrano almeno due esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01,
*** P <0,001, **** P <0,0001;Confronto multiplo ANOVA / Tukey unidirezionale.

Per definire il meccanismo alla base dell'immunità T1L-T H1 indotta all'antigene alimentare,
abbiamo interrogato i dati mLN RNA-seq dai topi WT e IFNAR - / - T1L e T3D-RV-infettati più
profondamente al fine di identificare geni che erano differenzialmente espresso in modo IFN di tipo
1 indipendente, utilizzando la FDA ( figura S11A ). IL-15, precedentemente dimostrato per
prevenire la conversione del reg di pT e indurre l'immunità T H 1 agli antigeni alimentari ( 28 ), non
era sovraregolato dopo l'infezione da T1L in mLN di topi IFNAR - / - ( figura S11B ). Al contrario,
fattore di regolazione interferone 1 (IRF1) - un fattore di trascrizione regolato a livello
trascrizionale ( 29 ) e implicato nella regolazione multistadio delle risposte immunitarie T H 1 ( 30 )
- è stato significativamente up-regolato dopo l'infezione da T1L in WT e IFNAR - / - topi ( figura
3A e figura S11A ). L'IRF1 era un candidato particolarmente intrigante perché è up-regolato nella
mucosa dei bambini con CeD ( 31 ). Per determinare se IRF1 è richiesto nell'immunopatologia
mediata da T1L, abbiamo analizzato DC e la conversione di cellule T OT-II in topi IRF1 - / - . I titoli
virali erano simili a 48 ore e 6 giorni dopo l'infezione nei topi WT e IRF1 - / - ( figura S11, C e D ),
permettendoci di analizzare la risposta all'antigene alimentare dopo somministrazione orale di OVA
in questi due momenti. Abbiamo scoperto che IL-12p40 ( figura 3B e figura S11E ) e in misura
minore CD86 ( figura S11F ) mostravano un'induzione significativamente inferiore nei topi IRF1 - / -
rispetto ai topi WT. Inoltre, l'induzione di I l12b e dell'espressione di mRNA di Il27 era
significativamente compromessa nei topi IRF1 - / - ( figura S11, G e H ). Coerentemente con l'up-
regulation IFN conservato di tipo 1 dopo l'infezione da T1L nei topi IRF1 - / - ( figura S11, I e J ),
l'assenza di IRF1 non è riuscita a ripristinare la conversione del reg di pT ( Fig. 3, C e D , e fig.
S11K ).Tuttavia, mentre il tipo-1 IFN segnalazione era superfluo a 48 ore ( Fig. 2C ), IRF1 era
necessario per T1L mediata T H 1 immunità all'antigene orale 48 ore ( fig. S11, L a N ) e 6 giorni
( Fig. 3, E ed F , e fig. S11O ) dopo l'alimentazione OVA. Questo risultato è coerente con il ruolo di
IL-12 e IL-27 nell'immunità T H 1 ( 23 , 30 , 32 ) e l'abrogazione del loro up-regulation nei topi
IRF1 - / - ( Figura 3B e figura S11, G e H). Sapendo che gli esperimenti di conversione delle cellule
T sono stati eseguiti utilizzando cellule T OT-II con capacità IRF1, abbiamo esaminato un ruolo per
IRF1 in DC eseguendo saggi di conversione in vitro T con DC mLN isolati 48 ore dopo l'infezione
da T1L di WT e IRF1 - / - topi. Poiché la deficienza di IRF1 altera la differenziazione dei sottogruppi
DC ( 33 ), abbiamo aggiustato la proporzione relativa dei principali sottogruppi di mLN DC dei topi
IRF1 - / - per approssimare quello dei topi WT ( figura S12, A e B ). In linea con un ruolo
fondamentale per IRF1 in DCs, abbiamo scoperto che mLN DC da topi infetti da T1L non
riuscivano a promuovere la differenziazione delle cellule T H 1 in assenza di espressione IRF1
( figura S12, C e D). I nostri studi non possono eliminare una potenziale funzione intrinseca delle
cellule T dell'IRF1 nel blocco del reg di pT mediata da virus ( 34 ). Inoltre, e in accordo con il difetto
di induzione di IL-12 osservato in vivo ( figura 3B e figura S11G ), la produzione di IL-12 è stata
ridotta in IRF1 - / - mLN DC rispetto a quella in WT mLN DC ( figura S12E) ). Infine, a sostegno di
un ruolo diretto per IL-12 in T1L-mediata T H 1 immunità all'antigene orale, abbiamo scoperto che
il blocco di IL-12 in vitro compromessa la capacità di T1L infettate WT MLN DC per convertire
cellule OT-II T nelle celle T H 1 ( figura S12, C e D). Questi risultati sono in accordo con gli studi
che riportano che IRF1 funziona nell'immunità T H 1 e nell'induzione di IL-12 ( 32 , 35 ). Infine,
oltre a IL-12, IRF1 è richiesto per l'up-regulation di IL-27 in vivo ( figura S11H ), suggerendo che
esso può anche partecipare all'induzione dell'immunità T H 1 all'antigene alimentare su infezione
T1L.
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Fig. 3
Un ruolo centrale per IRF1 nell'immunità T H 1 mediata da reovirus per l'antigene dietetico
( A ) I topi WT e IFNAR - / - sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 6 topi), 10 8 PFU di
T3D-RV ( n = 6 topi) o PBS (sham, n = 6 topi) per 2 giorni. L' espressione di Irf1 nel mLN è stata analizzata
mediante RT-PCR. ( B ) Le cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + sono state trasferite nei topi WT CD45.2 + o
IRF1 - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il trasferimento, i topi sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di
T1L ( n= 4 a 6 topi) o PBS (sham, n = 4 a 6 topi) e alimentato 1,5% OVA nell'acqua da bere per 2 giorni.
L'espressione di IL-12p40 su MHC-II + gated CD11c + CD103 + CD11b - CD8α + mLN DC è stata valutata
mediante citometria a flusso. (Da C a F ) Le cellule OT-II + CD45.1 + CD4 + sono state trasferite nei topi WT
CD45.2 + o IRF1 - / - CD45.2 + . Un giorno dopo il trasferimento, i topi sono stati inoculati peroralmente con
10 10 PFU di T1L ( n= 5 o 6 topi) o PBS (sham, n = 4 a 6 topi) e alimentato 1,5% OVA nell'acqua da bere per
6 giorni. L'espressione intracellulare di Foxp3 e IFN-γ è stata valutata mediante citometria a flusso.
Diagrammi di punti rappresentativi (C), percentuali di Foxp3 (D), grafici a punti rappresentativi (E) e
percentuali di IFN-γ (F) sono mostrati nelle cellule OT-II + CD4 + trasferite nel mLN. I grafici da [(A) a (F)]
illustrano due esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001; Confronto
multiplo ANOVA / Tukey unidirezionale.

Presi insieme, i nostri studi che analizzano l'effetto di T1L sulla risposta all'antigene alimentare
usando l'OVA come antigene modello ( figura S13 ) suggeriscono che due ceppi di reovirus
possono indurre reazioni T H 1 antivirali simili in PP e mostrare tuttavia proprietà
immunopatologiche distinte. Mostriamo che T1L, ma non T3D-RV, promuove un fenotipo
infiammatorio in DCs assumendo antigene alimentare. Inoltre, i nostri risultati indicano che il
segnale di tipo 1 IFN e l'up-regulation IRF1 sono implicati in modo differenziale nel bloccare
la conversione del reg di pT e promuovere l' immunità di T H 1 nell'antigene alimentare dopo
l'infezione da T1L. IRF1 funziona in T H indotto da T1L1 immunità all'antigene alimentare
promuovendo IL-12 e IL-27 in DC. Sebbene gli IFN di tipo 1 non siano richiesti ( figura 3A ),
probabilmente contribuiscono all'up-regulation IRF1 ( 36 ) dopo l'infezione da reovirus nei topi
WT.
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L'infezione da T1L interrompe la tolleranza orale al glutine e induce l'attivazione


di TG2 nei topi DQ8tg
Per determinare la rilevanza di questi risultati per CeD, abbiamo analizzato l'effetto dell'infezione
da T1L in topi transgenici che esprimono la molecola HLA DQ8 predisponente CeD (topi DQ8tg)
( 28 ). In primo luogo, abbiamo confermato che Irf1 era up-regolato nei topi DQ8tg dopo l'infezione
da T1L ( Figura 4A ). Successivamente, abbiamo verificato che, come i topi WT alimentati con
OVA ( Figura 1B e Figura S5B ), i peptidi del glutine erano preferenzialmente presenti in
CD103 + CD11b - CD8α + DC dopo la gavagine di topi DQ8tg infetti da T1L o sham- ( Figura S14,
Dalla A alla C ). Questo sottoinsieme DC IL-12p40 regolato verso l'alto ( figura 4B e figura S14D)
e CD86 ( figura S14E ). Il pattern dell'espressione di IL-12p40 negli altri sottogruppi di mLN DC di
topi DQ8tg era simile a quello nei topi WT ( figura S14F ). Inoltre, Il27 era sovraregolato ( figura
S14G ). In accordo con mLN DCs acquisendo un fenotipo proinfiammatorio, l'infezione da T1L ha
indotto la perdita della tolleranza orale al glutine nei topi DQ8tg come valutato dalla presenza di
anticorpi IgG2c anti-gliadina ( Fig. 4C ) e lo sviluppo di una reazione di ipersensibilità
ritardata T H 1 ( Fig. 4D e fig. S14H ). Oltre alle condizioni ambientali intestinali favorevoli a T H1
immunità contro gli antigeni alimentari, l'attivazione della transglutaminasi 2 (TG2) è pensata per
promuovere la patogenesi del CeD aumentando l'affinità dei peptidi del glutine per le molecole
HLA-DQ2 e HLA-DQ8 ( 1 - 3 ) attraverso le modificazioni post-traduzionali. L'infezione da T1L
induce l'attivazione del TG2, quantificata dall'incorporazione di 5- (biotinamido) -pentilammina
(5BP), una sonda di attività TG2 a piccola molecola, in più del 60% dei topi DQ8tg infetti ( Fig.
4E ) senza indurre danni intestinali rilevabili. Pertanto, in un modello murino rilevante per il CeD,
l'infezione da T1L rompe la tolleranza orale al glutine e promuove l'attivazione del TG2,
supportando l'ipotesi che l'infezione da reovirus, nonostante sia clinicamente silente, possa avviare
eventi critici che preparano il terreno per lo sviluppo del CeD.
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Fig. 4
Ruolo dell'infezione da reovirus nella perdita di tolleranza orale al glutine e attivazione del TG2
( A e B ) I topi DQ8tg sono stati inoculati peroralmente con 10 8 PFU di T1L ( n = 5 topi) o PBS (sham, n =
5 topi) per 2 giorni. (A) I livelli di espressione di Irf1 nel mLN sono stati analizzati mediante RT-PCR. (B)
L'espressione di IL-12p40 su gating CD11c + CD103 + CD11b - CD8α + mLN DC è stata valutata mediante
citometria a flusso. ( C e D ) I topi DQ8tg sono stati inoculati peroralmente con 10 10PFU di T1L all'inizio
del protocollo di ipersensibilità di tipo orale tollerato / ritardato. I topi sono stati nutriti per via orale con
gliadina (Glia) per 2 giorni e poi immunizzati per via sottocutanea con un'emulsione CFA-Glia. (C) Livelli di
anticorpi IgG2c specifici per Glia nel siero sono stati quantificati al giorno 18 mediante saggio di
immunoassorbimento enzimatico (ELISA). (D) Il giorno 28, i topi sono stati sfidati per via sottocutanea con
Glia e il grado di rigonfiamento dell'orecchio è stato determinato 24 ore dopo la prova. Sham, n = 4 o 5 topi;
Glia, n = 6 topi; e Glia + T1L, n = 5 topi. ( E ) I topi DQ8tg sono stati inoculati peroralmente con 10 10 PFU
di T1L ( n = 8 topi) o PBS (sham, n = 4 topi). TG2- / - i topi sono stati inoculati peroralmente con 10 10 PFU di
T1L ( n= 2 topi) e usato come controllo negativo. I topi sono stati sottoposti a eutanasia a 18 ore
dall'infezione e l'intestino tenue è stato raccolto e congelato in un composto a temperatura di taglio ottimale.
Vengono mostrate immagini rappresentative da sezioni congelate colorate dell'intestino tenue prossimale.
Barre scala, 100 mm. La colorazione con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) è mostrata in blu, la proteina
TG2 è mostrata in verde e l'attività enzimatica TG2 valutata mediante reticolazione 5BP è mostrata
nell'attività enzimatica del rosso.TG2 normalizzata a Livelli di proteine TG2 sono stati quantificati per
ciascun villi. Viene mostrata l'attività enzimatica media nell'intestino tenue prossimale per topo. Il grafico da
[(A) a (E)] raffigura due esperimenti indipendenti. (A), (B) e (E), ** P <0,01, *** P <0,001; non
abbinato ttest. (C) e (D), ** P <0,01; Confronto multiplo ANOVA / Tukey unidirezionale.

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Prove per un ruolo dell'infezione da reovirus nella malattia celiaca


Per indagare direttamente un ruolo di reovirus in CeD, abbiamo confrontato i titoli di anticorpi anti-
reovirus in individui di controllo con quelli con pazienti attivi CeD e CeD in una dieta priva di
glutine (GFD). I pazienti affetti da CeD tendevano ad avere titoli di anticorpi anti-reovirus più
elevati ( P = 0,06) ( Fig. 5A ) ed erano significativamente sovrarappresentati tra i pazienti con titoli
molto alti ( Figura 5B ). Inoltre, i pazienti CeD su un GFD con elevati titoli anti-reovirus (sopra la
mediana dei nostri campioni) hanno livelli IRF1 significativamente più alti nella mucosa intestinale
piccola rispetto a quelli di individui con bassi titoli anti-reovirus ( Fig. 5C ). Tuttavia, non vi era
alcuna correlazione diretta tra i titoli degli anticorpi anti-reovirus e il livello diEspressione IRF1 ,
che indica che non esiste una relazione lineare tra titoli di anticorpi e livelli di IRF1 . Insieme,
questi risultati suggeriscono che la presenza di titoli di anticorpi anti-reovirus al di sopra di una
certa soglia indica una interazione antecedente virus-ospite che ha causato cambiamenti duraturi
nell'omeostasi immunitaria associata ad alta espressione di IRF1. Questa ipotesi è in accordo con il
concetto che i virus possono lasciare un segno permanente sul programma trascrizionale dell'ospite
( 37 ) ed è coerente con la nostra osservazione che i topi infettati con T1L hanno titoli anticorpali
più alti di quelli dei topi infettati con T3D-RV ( fig. S1G), che non interrompe la tolleranza agli
antigeni alimentari, a differenza del T1L. Un collegamento tra infezione da rotavirus e sviluppo di
CeD è stato suggerito in uno studio longitudinale su bambini ( 8 ). Tuttavia, il nostro studio non è
riuscito a mostrare una tale associazione ( Fig. 5, da D a F ). I nostri risultati non escludono un ruolo
per il rotavirus nella patogenesi del CeD e potrebbero essere spiegati dalle interazioni immunitarie
del rotavirus-ospite che differiscono da quelle osservate con il reovirus e quindi non portano alle
stesse firme immunitarie. Infine, i titoli anticorpali anti-reovirus alti nei pazienti con CeD non erano
correlati né con i titoli anticorpali anti-rotavirus ( Fig. 5G ) né con i titoli anticorpali di tipo 1 (HSV-
1) antieropes simplex ( Fig. 5H)), indicando che i pazienti con ceD che mostrano elevati titoli
anticorpali anti-reovirus non montano risposte anticorpali generalmente elevate contro i virus. Presi
insieme, questi risultati suggeriscono che l'infezione da reovirus può innescare l'insorgenza di CeD
in un sottogruppo di pazienti CeD.
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Fig. 5
Ruolo delle infezioni da reovirus umano nella patogenesi della malattia celiaca
( A e D ) Boxplot che mostrano i livelli dei titoli degli anticorpi di reovirus (A) e degli anticorpi del rotavirus
(D) nei pazienti di controllo ( n = 73) e CeD ( n = 160). ( B ed E) Percentuale di pazienti di controllo
(grigio), pazienti con CeD attivi (blu), pazienti con ceD su diete prive di glutine (GFD) (arancione) e pazienti
attivi con ceD e GFD combinati (rosso) con reovirus (B) o rotavirus ( E) titoli anticorpali al di sopra di un
cutoff sempre più elevato (da sinistra a destra). I valori limite sono stati determinati definendo i decili della
distribuzione di titoli di anticorpi di reovirus (B) o rotavirus (E) osservati nei campioni dei pazienti
analizzati. I gruppi di pazienti GFD e CeD (Active + GFD) sono significativamente sovrarappresentati tra
individui con titoli di reovirus sopra un PRNT60 = 156 (sesto decile) e PRNT60 = 1597 (9o decile),
rispettivamente. ( C e F ) espressione di IRF1 in piccole biopsie intestinali di pazienti con GFD ( n= 38) è
stato analizzato mediante RT-PCR. Per evitare qualsiasi fattore confondente associato ad un'aumentata
infiammazione, l'analisi dell'espressione di IRF1 è stata eseguita in pazienti affetti da CeD su un GFD che, a
differenza dei pazienti con CeD attivi, mostra livelli normali di IFN-γ. Viene mostrato il livello di
espressione relativa dell'IRF1 nei pazienti con GFD con livelli bassi (a sinistra) e alti (a destra) di titoli di
anticorpi di reovirus (C) o rotavirus (F). (C) Reovirus basso e reovirus alto sono stati rispettivamente definiti
come individui con titoli anticorpali al di sotto e al di sopra della mediana PRNT60 = 47 [(B), 5 ° decile]. (F)
Rotavirus basso e rotavirus alto sono stati rispettivamente definiti come individui con titoli anticorpali al di
sotto e al di sopra della mediana PRNT60 = 53 [(E), 5 ° decile]. ( G e H) I titoli anticorpali di reovirus e
rotavirus nel siero di pazienti sono stati determinati mediante saggio di neutralizzazione a riduzione della
placca. I livelli dei titoli di anticorpi HSV-1 sono stati determinati mediante ELISA. Vengono mostrate le
correlazioni tra i livelli di titoli di anticorpi di reovirus e titoli di anticorpi del rotavirus (G) o titoli di
anticorpi HSV-1 (H) nei pazienti con GFD. r , correlazione di Pearson. (A) a (F), * P <0,05; Mann-
Whitney U test.

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Conclusione
Questo studio fornisce supporto per il concetto che i virus possono interferire con l'omeostasi
immunitaria intestinale e iniziare la perdita della tolleranza orale e dell'immunità T H 1 all'antigene
alimentare. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che un agente patogeno avirulente, come il
reovirus, che viene eliminato con successo dall'ospite infetto, può comunque promuovere
l'immunopatologia. A sostegno di questa idea, le infezioni da norovirus clinicamente silenti
aumentano la suscettibilità allo sviluppo della colite ( 38). I nostri dati indicano anche che due virus
appartenenti alla stessa specie possono avere effetti immunopatologici sostanzialmente diversi.
L'analisi dei profili trascrizionali indotta in risposta a T1L e T3D-RV suggerisce che la capacità di
un virus di innescare la perdita di tolleranza orale è associata alla sua capacità di interrompere
l'omeostasi immunitaria nei siti in cui sono iniziate le risposte agli antigeni orali ( figura S13). ).
Oltre al reovirus, è probabile che altri virus enterici, compresi i virus appartenenti a famiglie
rilevate da diversi sensori immunitari e che coinvolgono diverse vie di segnalazione, attivino anche
la perdita di tolleranza per l'antigene dietetico. Espandendo il concetto di virotipi ( 37 ), proponiamo
che i virus che inducono risposte immunitarie proinfiammatorie all'antigene alimentare alterino
l'omeostasi immunitaria e in particolare le DC con proprietà proinfiammatorie nei siti in cui viene
indotta tolleranza orale ( figura S13).). L'identificazione di altri virus e la definizione delle
principali caratteristiche comuni delle interazioni virus-ospite che portano all'abrogazione della
tolleranza orale aiuteranno a progettare strategie di vaccinazione per prevenire il CeD e
possibilmente altri disordini autoimmuni nelle popolazioni a rischio. Sulla base delle nostre
scoperte, anche i virus che non conducono ad una patologia clinica conclamata potrebbero essere
candidati per tale intervento profilattico.
Il CeD è un disturbo complesso che probabilmente richiede diverse perturbazioni ambientali per
interrompere in modo permanente la tolleranza al glutine. Infatti, studi epidemiologici che
monitorano longitudinalmente i bambini a rischio genetico segnalano risposte immunitarie
transitorie anti-glutina prima dello sviluppo di CeD completamente sviluppato ( 39 , 40 ) e
suggeriscono che gli anticorpi anti-glutine precedano gli anticorpi anti-TG2 ( 41 ). Inoltre,
l'induzione dell'immunità di T H 1 al glutine, sebbene richiesta, è insufficiente a causare atrofia dei
villi, sia negli uomini che nei modelli murini di CeD ( 42 - 44 ). Il nostro studio indica che anche se
le infezioni da reovirus possono innescare lo sviluppo di T H1 immunità al glutine e attivazione del
TG2, saranno necessari ulteriori eventi per l'induzione di anticorpi anti-TG2 e atrofia dei
villi. Inoltre, i trigger non virali, come i membri patogeni del microbiota ( 45 , 46 ), possono avere
proprietà patologiche simili a reovirus, e la combinazione di diversi tipi di fattori ambientali
probabilmente porterà alla formazione di un pool di memoria di T H 1 Cellule T anti-glutone di
grandezza sufficiente a causare un CeD persistente con atrofia dei villi.
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Materiale supplementare
Bouziat-SM
Clicca qui per vedere. (4.8M, pdf)
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Ringraziamenti
La generazione e il sequenziamento della biblioteca sono stati eseguiti dalla Genomics Facility
dell'Università di Chicago ( http://genomics.bsd.uchicago.edu). I dati riportati in questo documento
sono stati depositati nel database Omnibus del Centro nazionale per le informazioni sulle
biotecnologie Omnibus sotto il record SuperSeries GSE94604 contenente i seguenti record
Sottoserie: GSE94602 (dati RNA-seq) e GSE94517 (dati Microarray). Le diapositive istologiche
sono state generate dalla risorsa condivisa di patologia traslazionale di Vanderbilt supportata
dall'Istituto nazionale per il cancro / Istituto nazionale di assistenza sanitaria per il cancro al cancro
Grant P30 CA068485 e dal centro di fenotipizzazione metabolica del mouse Vanderbilt Grant U24
DK059637. L'imaging a diapositiva intera e la quantificazione dell'immunocolorazione sono state
eseguite nella Risorsa condivisa di istologia digitale presso il Vanderbilt University Medical Center
( www.mc.vanderbilt.edu/dhsr). Ringraziamo P. Savage (Università di Chicago) per aver fornito
topi OT-II. Ringraziamo D. Mucida e D. Esterhazy (The Rockefeller University) per esperienza e
reagenti. Ringraziamo B. Xiang per l'assistenza tecnica. Ringraziamo T. Golovkina per
suggerimenti e discussioni utili. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti concessioni dal
NIH: R01DK098435 a BJ, TSD e RJX; R01DK100619 e R01DK067180 a BJ; Da R01AI038296 a
TSD; Da R01DK43351 a RJX; Da F31DK108562 a JJB; Da R01DK063158 a CK; e R01AI113333
e da R01DK068181 a H.-CR Il supporto aggiuntivo include un sussidio per il supporto al Cancer
Center P30CA014599 e il Core Center P30 DK42086 per la ricerca sulle malattie digestive presso
l'Università di Chicago a BJ; un fondo Start-up per gli investigatori, Dipartimento di Medicina,
MGH per AN; un premio dalla Bettencourt Schueller Foundation alla RB;una borsa di ricerca della
Sophia Research Foundation olandese a LMMC; e l'Austrian Science Fund (FWF) J3408-B13 a RH
L'analisi dei campioni dei pazienti in questo lavoro è stata approvata dall'Institutional Review Board
dell'Università di Chicago (protocollo 12623B) e Vanderbilt University (protocollo 151358). Infine,
ringraziamo i pazienti CeD, i loro familiari e il Centro per le malattie celiache dell'Università di
Chicago p