Extracción, purificación y amplificación por PCR de ADN de papa criolla Solanum

phureja

Andrés F. Acosta *(1), Laura D. Celis *(2), Luis F. Lancheros *(3), Sergio A. Herrera*(4), Tania L. Lopez *(5).

*
Estudiante Ingeniería Agronómica, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de
Colombia - Sede Bogotá.
(1) afacostao@unal.edu.co; (2) ldcelisg@unal.edu.co; (3) lflancherosj@unal.edu.co; (4)
saherreraj@unal.edu.co; (5) tllopezr@unal.edu.co

Resumen.
En la actualidad, los estudios genéticos y moleculares, tienen una gran importancia ya que tratan de
explicar la variación genética entre individuos, poblaciones y especies, como también de entender
procesos metabólicos, fisiológicos y bioquímicos, entre otros fenómenos para su posterior aplicación.
Esto ha sido posible desde el descubrimiento del ADN como “la molécula de la vida” por ser aquella
molécula que guarda la información genética de todo ser vivo, por lo tanto, la extracción de ADN se ha
convertido en un primer y fundamental paso de estudios moleculares que emplean múltiples técnicas
como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), generación de marcadores moleculares, el
secuenciamiento, entre otras. En este trabajo se presenta la extracción de ADN de papa diploide
Solanum phureja empleando un kit de extracción QIAGEN y la amplificación por PCR de un fragmento
de ADN de la misma especie, para realizar una revisión de la metodología.

Palabras Clave: Extracción de ADN, QIAGEN, PCR, Solanum phureja.

Introducción

Toda la información genética esencial para la vida se encuentra en una molécula de ácido
desoxirribonucleico (ADN), cuyas caracteristicas fisiologicas y bioquimicas son comunes a todo ser
vivo. El ADN posee una estructura química constituida por nucleótidos que están compuestos por un
azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina)
organizados de manera lineal y unidos mediante enlaces fosfodiéster, generando secuencias que
contienen la información que codifica para los diferentes fenotipos. La purificación de ácidos nucleicos
es posible por las características propias de la molécula y es un requisito imprescindible para realizar
diversas técnicas de biología molecular (Moreno, 2003).

Existen múltiples protocolos de para la extraccion y purificacion del ADN, que tienen como finalidad
la obtención de ADN de calidad y cantidad adecuados, sin embargo, todos ellos consisten de cinco
pasos principalmente: homogeneización del tejido, la ruptura de tejidos, paredes y membranas celulares
para liberar el ADN, la separación de proteínas y lípidos (extracción de contaminantes), la precipitación
y redilucion del ADN puro (Amagliani, C., et al, 2007). Estos métodos requieren la preparación de
soluciones y la extracción puede tardar horas hasta varios días debido a la cantidad de pasos que deben
realizarse, por esta razón la implementación de kits de extracción, es una de las mejores opciones, ya
que, reduce el tiempo necesario debido a que los reactivos necesarios ya se encuentran en mezclas
preparadas y reducen la complejidad de los procedimientos.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica molecular, utilizada para realizar copias
de regiones particulares de ADN, por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de
la región blanco, para poder utilizar este amplificado en posteriores pruebas tales como cortes con
enzimas de restricción o secuenciación entre otras (Amagliani, C., et al, 2007). La PCR es una técnica
muy utilizada en diferentes áreas de la investigación como la medicina, la biología e incluso algunas
ramas de la ecología y agronomía.

La PCR tiene como principio la replicación natural del ADN de un organismo, para realizar la reacción
es necesario el uso de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante
cadenas existentes como molde. La polimerasa utilizada normalmente en esta técnica es extraída de una
bacteria tolerante al calor llamada Thermus aquaticus (innis, M., Myambo, K., et al, 1998), la cual vive
en aguas termales y fuentes hidrotérmicas, su ADN polimerasa es muy termoestable, por esta razón en
ideal ya que la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN
separando sus cadenas. El inicio de las reacciones de la polimerasa, necesita secuencias cortas de
nucleótidos que proporcionen un punto de partida para la síntesis de ADN, estas regiones son llamadas
primers o cebadores.

La reacción en cadena polimerasa consta de tres pasos generalmente, el primero es la desnaturalización

de la doble hebra de ADN que se realiza por medio de la elevación de la temperatura, lo que proporciona
moldes de cadena sencilla, el segundo denominado templado, consta de una disminución en la
temperatura para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de
ADN de cadena sencilla, por último la extensión en donde la temperatura se eleva a un óptimo en donde
la Taq polimerasa extiende los cebadores y comienza la síntesis de las nuevas cadenas de ADN.

La visualización del ADN extraído típicamente se realiza por electroforesis en gel de agarosa, que es
una de las técnicas más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucléicos. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así,
moléculas de ADN cargadas negativamente van a emigrar de forma distinta por su tamaño, a través de
la matriz hacia una carga positiva, el uso de marcadores de peso molecular, puede dar a conocer el
tamaño aproximado del ADN a evaluado (Ünlü, M., et al 1997)

Este informe busca realizar la evaluación de la extracción de ADN de solanum phureja implementando
un kit de extracción Qiagen y la amplificación de un fragmento de ADN de la misma especie por la
técnica de PCR implementando la visualización por electroforesis en gel de agarosa como indicador.

Materiales y Métodos

- Preparación de la muestra.
La muestra empleada para la realización de la extracción de ADN (cromosómico) fue obtenida de
Solanum phureja (diploide) extraída de una muestra vegetal (foliar) esterilizada y empacada para su
uso. Para evaluar la eficiencia de los métodos de extracción, se realiza la visualización en gel de
electroforesis.

- Extracción de ADN
Se realiza el procedimiento descrito en DNeasy® Plant Handbook, usando una serie de buffer
seleccionados para su purificación y mini spin. Como primer paso se maceró tejido vegetal con el uso
de un mortero y un pistilo, agregando nitrógeno líquido hasta obtener material en polvo fino. Se
recolectó en un tubo de 2mL. Luego de esto se añadió 400µL de buffer AP1 y 4µL de ADNasa A, luego
se da vortex y se incuba por 10 minutos a 65ºC. En este paso se realiza la lisis celular. Luego para
precipitar las proteínas, detergentes y polisacáridos se añade 130µL de buffer AP2, mezclandolo e
incubando por 5 minutos en hielo. Después de esto, se centrifuga a 14000 rpm durante 5 minutos para
extraer el sobrenadante y pasarlo por un mini spin QIAshredder en un tubo de 2 mL; realizando otra
centrifugación de 2 minutos a 14000 rpm. La mezcla que pasó por el mini spin se lleva a un nuevo tubo
de 2 mL y se añade 1.5 de volumen de buffer AP3, para luego mezclarlo inmediatamente por pipeteo.
Seguidamente se transfiere 650µL de la mezcla a un tubo de 2 mL con un mini spin DNAeasy y se
centrifuga a 8000 rpm durante un minuto. Luego se reutiliza la columna con el resto de la mezcla
descartando el flow-through. Se ubica la columna en un nuevo tubo de 2mL, se añade 500 µL de buffer
AW y se centrifuga a 8000 rpm por un minuto. Después se añade 500µL de buffer AW y se centrifuga
a 8000 rpm por 2 minutos para secar la membrana de alcohol. Finalmente se transfiere la columna a un
nuevo tubo de 1.5 mL y se pipetea 100µL de buffer AE directamente en la membrana, para luego
incubar por 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugando a 8000 rpm durante un minuto; en este
paso ya se tiene el ADN eluido.

- Preparación de la muestra (PCR):

Se realizó una amplificación por PCR de ADN de Solanum phureja. El ADN de las muestras se
encontraba en preservación a -20°C, la muestra de ADN se amplifico en una concentración desconocida.
Luego se observó la calidad de la amplificación mediante la corrida en un gel de electroforesis al 1%
de agarosa.

Se preparó una mezcla maestra con todos los componentes necesarios para la amplificación PCR,
dejando como último reactivo adicionar la Taq polimerasa y la muestra de ADN, para llegar a un
volumen final 20 uL para cada tubo de PCR según la tabla 1, se preparó el volumen necesario para ocho
tubos (40 uL más del requerido para el número total de reacciones que se realizaron por grupo), la
programación de los ciclos de la reacción en el termociclador se realizó como se muestra en la tabla 2,
para un volumen final de 20 uL y un tiempo total estimado de una hora y treinta minutos.

Tabla 1. Concentraciones de la mezcla de reacción para un volumen final de 20 𝜇 L empleadas para la

amplificación de las diferentes muestras de ADN.

Tabla 2. Programación del termociclador para la reacción PCR.

- Preparación de la electroforesis (Agarosa):
La preparación de la matriz de agarosa se realizó en un erlenmeyer depositando en un volumen de TAE
1X, un 1% de este volumen en gramos de agarosa (el volumen final fue calculado para generar un gel
para la corrida de la extracción de ADN y otro para la amplificación PCR), posteriormente la mezcla
fue calentada en un horno microondas hasta que la solución quedó completamente translúcida, luego se
esperó a que se enfriara y se agregó 2 uL de bromuro de etidio, por último se sirvió el gel, y se ubicó
un peine para generar los pozos en donde fueron depositadas las muestras a visualizar.

Para la migración de las muestras en los geles, estos fueron expuestos a 80 v durante 45 minutos. La
visualización de los resultados se realizó con un sistema de documentación de gel automático Bio-Rad
el cual permite generar una imagen digital del gel bajo luz UV lo que permite distinguir las bandas
generadas tanto de la extracción de ADN como de los amplicones realizados.

Resultados y Discusión

- Extracción de ADN mediante Qiagen

La ruptura de tejidos, paredes y membranas celulares, los tejidos implementados fueron hojas jóvenes
que según Sanjuan-Badillo et al, (2014), poseen una mayor cantidad de ADN y se recomiendan más
que tejidos viejos, para realizar extracciones de calidad. Debido a que no se especifican los componentes
de cada buffer del kit de extracción qiagen, se puede hipotetizar su contenido teniendo en cuenta los
pasos de una extracción sin el uso de kits, en donde el primer buffer AP1, puede estar constituido por
una solución tampón que mantiene el pH, para que el ADN no sea degradado en ninguna forma, puede
contener también algún detergente (SDS, triton) que mejore la ruptura de membranas, algún agente
químico que permita la inhibición de ADNasas como ETDA, fenol, cloroformo, B-mercaptoetanol,
entre otros (Elkins, 2013). El periodo de incubación durante 10 minutos a 65º C, permite también la
inactivación de estas ADNasas por denaturación mediante calor, además también permite una mejor
lisis celular por la acción del calor en la bicapa lipídica (Elkins, 2013). En casa este primer paso para la
extracción puede hacerse adicionando un detergente para liberar los ácidos nucleicos y las proteínas en
una solución salina, ya que, los iones de sodio cargados positivamente en la sal ayudan a proteger los
grupos de fosfato con carga negativa que se encuentran a lo largo del ADN ( Malajovich, s.f. , Cseke y
Herdy, 2012).

La solución AP2 genera una separación de la solución, en primera instancia una separación de los
organelos y moléculas grandes e insolubles por la acción de la centrifugación, otras moléculas como las
proteinas, los lipidos y los polisacáridos son separados por la acción de una sustancia en donde no sean
solubles y centrifugación, entonces, en este paso los reactivos del buffer AP2 debe poseer detergentes
como CTAB (Porebski, S., et al, 1997), para la extracción de polisacáridos, lipasas, cloroformo, alcohol
isoamílico o detergentes para la extracción de lípidos y grasas, proteasas y el uso de fenol y cloroformo
para la extracción de proteínas (Elkins, 2013), se puede usar etanol frío en casa para precipitar el ADN
y para purificarlo se puede añadir proteasas y filtrar la muestra ( Malajovich, s.f. , Cseke y Herdy, 2012).

Por último se deben purificar el ADN de todos los posibles reactivos que están en la solución para esto
fue necesario el uso de una tercer buffer AP3, en las extracciones se utiliza el isopropanol en la
extracción, ya que precipita el ADN y se realizan lavados de algunos compuestos con el uso de etanol,
es muy posible que se utilizara en AP3 reactivos similares que permitieran que se separará el ADN de
la solución y este quedará retenido en la columna DNAeasy Mini spin, posteriormente se utilizó el
buffer AW para retirar los alcoholes de la membrana de la columna, sin embargo esto mismo se podría
hacer por evaporación a temperatura ambiente y de esta forma dejar el ADN puro en la columna (Rogers
y Bendich, 1998; Quintero et al., 2015). Para recuperar el ADN puro se utilizó un buffer AE para
resuspender el ADN en una solución, para esto mismo podría utilizarse agua MQ (Quintero et al., 2015).

Para la evaluación de la calidad y cantidad de ADN extraído en esta práctica, se debió realizar una
medición con ayuda de un Nanodrop, el cual nos indica la concentración del ADN extraído, la
contaminación de los reactivos residuales como el fenol es observada por la relación A260/A230 y la
contaminación con proteínas por la relación A260/A280, estas relaciones indican la calidad de las
extracciones debido a que contemplan la longitud de onda en la cual contaminantes como las proteínas
y fenoles, en donde un valor entre 1,8 - 2,0 que indica que no hay un daño o contaminación sustancial
en las bandas. Un valor mayor indica una buena pureza del ADN, mientras que valores más bajos
indican la contaminación por estas moléculas (Healey, A,. et al, 2014).

La figura 1 muestra las bandas observadas después de la electroforesis de las preparaciones de las
diferentes extracciones de ADN, en donde se aprecia que en los únicos pozos en los cuales se visualiza
una extracción de ADN son el P7, P8 y P9, sin embargo en el momento en que se sirvieron los pozos
se produjo un error, ya que dos extracciones se sirvieron en un solo pozo, lo que pasó debido a la demora
en el tiempo de preparación de la mezcla a servir, ya que el color visible en el gel dura un corto tiempo
hasta tomar una apariencia transparente en donde no se diferencia si el pozo está vacío o no y la falta
de experiencia al no llevar un correcto conteo de los pozos ya utilizados.

Los errores en las extracciones de ADN muchas veces se producen en los momentos críticos de las
separaciones por fases, en donde se pueden producir pérdida del ADN por errores al recolectar el
sobrenadante o por el contrario la no remoción de los contaminantes por esta misma razón, otra posible
causa de estos resultados, puede ser que en el momento de la adición del buffer AP1, se tardó demasiado
en realizarse y por esta razón se permitió que el ADN fuera expuesto a condiciones en las cuales es
degradado o también que en el momento de re diluir el ADN no se genero un correcto lavado y este
quedó retenido en la columna (Espinosa, 2007 y Bolívar et al., 2014).
Fig 1. Electroforesis de extracciones de ADN de Solanum phureja. Descripción de Pozos (Izquierda a derecha): Réplicas de
cada estudiante.

- Amplificación por PCR

La amplificación por PCR concluyó en los resultados mostrados en la Figura 2, en la cual se evidencia
que para el caso de las réplicas hechas por el grupo 1, no se generó ninguna reacción, de estos resultados
se puede inferir que la razón por la cual no se produjo la amplificación debe estar en la preparación de
la master mix, en la cual, cualquiera de los componentes esenciales (todos excepto BSA) o no se agregó
o se agregó de manera incorrecta esto de acuerdo con lo reportado por Espinosa (2007) y Bolívar et al.,
(2014); se descarta un fallo de la polimerasa debido a que se utilizó la misma para los dos grupos y en
el grupo dos si se observaron amplificaciones en los pozos 1,2,4,6 y 7, por esta misma razón se descarta
una falla en la programación de los ciclos del termociclador y la posible falla en el ADN amplificado.
En el caso de los pozos restantes del grupo 2, que estos no se visualizarán en el gel, se cree está más
relacionado con la forma en que se sirvió en el gel, debido a que cada pozo fue servido por un alumno
diferente, en algunos casos en el momento de realizar la mezcla a servir, se realizó con mucha dificultad
en el manejo de la pipeta, lo que pudo incurrir en malas mezclas o que no se depositara correctamente
en los pozos (Espinosa, 2007).

Fig 2. Electroforesis de la amplificación PCR de muestras de ADN de Solanum phureja. Descripción de Pozos (Izquierda a
derecha): MM Marcador de peso molecular 1Kb; Réplicas de P1-P6 grupo 1; P7 G1: control negativo grupo 1; Réplicas de
P1-P6 grupo 2; P7 G2: control negativo grupo 2.

Conclusiones
Los resultados evidencian que son muchas las posibles razones por las cuales la extracción de ADN y
la PCR puede fallar, ya que son una alta cantidad de pasos a seguir y cada uno de estos pasos es esencial
en la extracción debido a esto el procedimiento es altamente susceptible a errores y por esta razón es
necesario que este se realice con el mayor cuidado posible.

Son varios aspectos que se deben tener en cuenta en el momento de hacer la PCR conocer las
características sobre la eficiencia de la Taq polimerasa, como afectan las concentraciones de ADN
molde y de los distintos componentes de mezcla de reacción para realizar la amplificación del producto
deseado de manera correcta. Es de vital importancia realizar correctamente los cálculos para la
realización de las concentraciones de la mezcla de reacción y la correcta preparación de la misma.

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