Toda la información genética esencial son útiles para su adaptación al

para la vida de la bacteria está crecimiento en determinados

contenida en una única molécula de ambiente, en otros casos, los
ácido desoxirribonucleico (ADN) de plásmidos contienen genes que
doble cadena y circular, cerrado por codifican enzimas capaces de
enlace covalente, dicha molécula se degradar algunos antibióticos,
denomina cromosoma bacteriano, por permitiendo que la bacteria sobreviva
otro lado, muchas bacterias poseen a la acción de los mismos (Murray,
además ADN extracromosómico 2005).
denominado ADN plasmídico o
Los plásmidos son una herramienta
plásmidos, al ser moléculas pequeñas
fundamental en Biología Molecular e
en relación al ADN cromosómico
Ingeniería Genética ya que se pueden
(Nelson & Cox, 2015). Dichos
usar como vectores para introducir en
plásmidos son moléculas circulares de
ellos cualquier fragmento de ADN de
ADN de doble cadena que constituyen
interés y de esta forma amplificarlo de
una unidad de replicación
forma natural dentro de la bacteria en
independiente del cromosoma. Por
la que el plásmido se replica, a esto
esto puede encontrarse más de una
último se le llama clonación de genes,
copia del mismo plásmido dentro de la
existen muchos plásmidos disponibles
célula bacteriana. En general los
que son utilizados con este fin y la
plásmidos de mayor tamaño se
mayoría contienen por lo menos un
encuentran en una o unas pocas
origen de replicación autónomo que
copias, mientras que los más
permite la replicación autónoma en la
pequeños pueden estar en hasta cien
bacteria u organismo hospedero, un
copias por célula (plásmidos
gen que confiere a la bacteria
multicopia) (Watson, 2008).
portadora del plásmido resistencia a
Aunque el ADN plasmídico no porta algún antibiótico, generalmente
información genética esencial para la ampicilina y un sitio de clonación
vida de la bacteria, sí porta genes que múltiple en el que se encuentra dianas
le confieren nuevas propiedades únicas para varias enzimas de
fenotípicas y que en algunos casos le restricción y que permite la
introducción del segmento de ADN o
gen a clonar (Klug, 2007).
Existen diferentes técnicas para aislar
el ADN plasmídico y uno de los
métodos más usado es el método de
extracción por lisis alcalina. Este
método aprovecha las diferencias en
el tamaño y la superhelicidad que es el
grado de torsión que sufre el ADN
plasmídico en contraste con
cromosomal. La mayoría de
cromosomas bacterianos,
moléculas circulares extremadamente
grandes que no se encuentran
superenrollados, mientras que los
plásmidos son moléculas pequeñas y
superenrolladas. Durante el proceso
de extracción, se busca desnaturalizar
el ADN plasmídico y el cromosomal y
posteriormente renaturalizarlo, con el
fin de que el ADN cromosomal, no se
aparee rápidamente y pueda ser
atrapado por complejos proteicos, los
cuales precipitaran; a diferencia del
ADN plasmídico que rápidamente se
renaturalizan y adquirirá
conformación natural (Rojas, 2017).
Para poder verificar la obtención de
ADN plasmídico se recurre a la
electroforesis en geles de agarosa el
cual es el método estándar para
separar y purificar fragmentos de ADN
cuando no se requiere un poder de
resolución o tamizaje molecular muy
específico, volviendo visible los
diferentes fragmentos de ADN
obtenidos (Garfin, 1990).
Metodología
Se trasladó 1 mL de cultivo bacteriano
el
de E. coli de la línea celular TOP10
los
inoculado en medio LB con ampicilina
son
a un tubo eppendorf de 1.7 mL y se
centrifugó a 13000 RPM por 2
minutos, se descartó el sobrenadante
y el protocolo se repitió tomando 0.5
mL de cultivo, el pellet formado se lavó
con solución I de Birnboim fría
(glucosa 50mM, Tris-HCl 25mM y
EDTA 10 mM pH 8), se resuspendió el
pellet en 100 uL de solución I de
Birnboim y se incubo a temperatura
ambiente por 10 minutos, terminado
este lapso se le agrego 200 uL de
solución II de Birnboim al tubo (NaOH
0.2N, SDS 1%) y se mezcló por
su
inversión 6 veces, se incubo en frio por
5 minutos, después se le agrego 150
uL de solución III de Birnboim (Acetato
potásico 5M, ácido acético glacial pH
4.8), se mezcló por inversión y se dejó
incubar 15 minutos en hielo para ser
centrifugado a 13000 RPM por 10
minutos, 350 uL del sobrenadante se
trasladaron a otro tubo y se le agregó
1 mL de etanol absoluto frio, se dejó
incubar por 30 minutos y se volvió a
centrifugar a 13000 RPM por 10 min,
se descartó el sobrenadante y se
enjuago con 500 uL de etanol al 70%,
se mezcló por inversión y se volvió a
centrifugar a 13000 RPM por 10 min,
se dejó secar el pellet formado, una
vez seco, se resuspendió el pellet en
50 uL de buffer TE. Para evaluar la
calidad de la extracción se pesó 1 g de
agarosa y se diluyo en calor en 100 mL
de buffer TBE, se llevó hasta 1L y se
le agregaron 2 uL de EtBr, se vertió el
líquido en los moldes y se colocaron
los peines que forman los pocillos, una
vez solidificado se colocaron los geles
en cámaras llenas con buffer TBE y se
agregó 15 ul de muestra en el cuarto
carril de la fila superior del gel, se dejó
correr el gel a 80V por 45 min.
Resultados
Se obtuvo un extracto de ADN
plasmídico el cual se evaluó mediante
electroforesis para observar las
bandas formadas (Figura 1) donde se
puede observar la formación de dos
bandas significativas, la primera
cercana a los 5 kb y la segunda
cercana 0.5 y 1 kb, en este caso, la
primera corresponde al genoma
bacteriano y la segunda banda a ADN
plasmídico con ARN no degradado.
Discusión
Conclusión
Referencias bibliográficas
Garfin, D. (1990). One dimensional gel
electrophoresis. Methods in
enzymology. Vol 182. Academic
Press.
Klug, W. (2007). Conceptos de genetica.
Madrid: Pearson educación.
Murray, P. (2005). Manual of clinical
microbiology, 6th ed. Washington :
American Society for Microbiology.
Nelson, D., & Cox, M. (2015). Principios de
Bioquimica 6ta Edicion. Barcelona:
Omega.
Rojas, A. (2017). Extraccion de plasmidos por
metodo de lisis alcalina modificada.
Conogasi.
Watson, J. (2008). Introduccion a la
ingenieria genetica: ADN
recombinante. Washington: Ed Labor
1988.
Borst, P. (1997). The gel electrophoresis of
DNA. Biochimica and Biophysica
Acta. 269:: 192-200.

Garfin, D. (1990). One dimensional gel

electrophoresis. Methods in
enzymology. Vol 182. Academic
Press.

Klug, W. (2007). Conceptos de genetica.

Madrid: Pearson educación.

Murray, P. (2005). Manual of clinical

microbiology, 6th ed. Washington :
American Society for Microbiology.

Nelson, D., & Cox, M. (2015). Principios de

Bioquimica 6ta Edicion. Barcelona:
Omega.

Rojas, A. (2017). Extraccion de plasmidos por

metodo de lisis alcalina modificada.
Conogasi.

Sambrook, J. (2009). Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. Cold spring
harbor laboratory press, 63-69.

Watson, J. (2008). Introduccion a la

ingenieria genetica: ADN
recombinante. Washington: Ed Labor
1988.