Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Promotores
Regulación traslacional
Por lo tanto, muchos vectores de expresión de E. coli se han diseñado para garantizar
que el ARNm de un gen clonado contenga un fuerte sitio de unión a ribosoma. La
inclusión de un sitio de unión al ribosoma de E. coli justo corriente arriba del marco de
lectura abierto que codifica la proteína garantiza que los genes procarióticos y
eucarióticos heterólogos se puedan traducir fácilmente en E. coli. Sin embargo, ciertas
condiciones deben cumplirse para que este enfoque funcione correctamente. Primero,
la secuencia de unión al ribosoma debe ubicarse a una corta distancia (generalmente
de 2 a 20 nucleótidos) del codón de inicio de la traducción del gen clonado. A nivel de
ARN, el codón de traducción suele ser AUG (adenosina, uridina y guanidina). En el
ADN, la cadena codificante contiene la secuencia ATG (donde T es timidina) que
funciona como un codón de inicio, y la cadena complementaria no codificadora es una
plantilla para la transcripción. En segundo lugar, la secuencia de ADN que incluye el
sitio de unión al ribosoma a través de los primeros codones del gen de interés no debe
contener secuencias de nucleótidos que tengan regiones de complementariedad y
puedan replegarse (formando bucles intrastrand) después de la transcripción (Fig. 6.3),
por lo tanto Bloqueando la interacción del mRNA con el ribosoma. La estructura
secundaria local del ARNm, que puede proteger o exponer el sitio de unión al
ribosoma, determina el grado en que el ARNm puede unirse a la secuencia apropiada
en el ribosoma e iniciar la traducción. Por lo tanto, para cada gen clonado, es
importante asegurarse de que el ARNm contenga un fuerte sitio de unión al ribosoma
y que la estructura secundaria del ARNm no impida su acceso al ribosoma. Sin
embargo, dado que las secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos en la
región N-terminal de la proteína objetivo varían de un gen a otro, no es posible diseñar
un vector que elimine la posibilidad de repliegue del ARNm en todos los casos. Por lo
tanto, ninguna región de iniciación traduccional optimizada puede garantizar una alta
tasa de iniciación de traducción para todos los genes clonados. En consecuencia, la
optimización de la iniciación de la traducción debe realizarse sobre una base de gen
por gen.
Figura 6.3 Ejemplo de estructura secundaria del extremo 5 'de un ARNm que evitaría
una traducción eficiente. En este ejemplo, el sitio de unión al ribosoma es GGGGG, el
codón iniciador es AUG (se muestra en rojo) y los primeros codones son CAG-CAU-
GAU-UUA-UUU. El ARNm está orientado con su extremo 5 'a la izquierda y su extremo
3' a la derecha. Tenga en cuenta que además de los tradicionales pares de bases A⋅U y
G⋅C en el ARNm, G también puede emparejarse en cierta medida con U. doi: 10.1128 /
9781555818890.ch6.f6.3
Uso del codón
Estabilidad de la proteína
La expresión de algunas proteínas extrañas en cepas hospedadoras de E. coli, que
típicamente se cultivan a 37 ° C, a menudo resulta en la formación de cuerpos de
inclusión de proteínas inactivas. Esto ocurre porque la proteína extraña se pliega mal
cuando no puede alcanzar su conformación activa nativa. Se han desarrollado diversas
estrategias, aunque con un éxito limitado, para sortear este problema. El cultivo de
cepas recombinantes a temperaturas más bajas a veces facilita un plegamiento de
proteínas más lento y, por lo tanto, adecuado, lo que a menudo aumenta
significativamente la cantidad de proteína activa recuperable. Sin embargo, las
bacterias mesófilas como la E. coli crecen extremadamente lentamente a bajas
temperaturas. En un estudio, el gen chaperonin 60 (cpn60) y el gen cochaperonin 10
(cpn10) de la bacteria psicrofílica Oleispira antarctica se introdujeron en una cepa
huésped de E. coli, con el resultado de que la cepa de E. coli ganó la capacidad de
crecer y para expresar proteínas extrañas a una tasa alta a temperaturas de 4 a 10 ° C
(Fig. 6.5). Se ha sugerido que a temperaturas por debajo de los 20 ° C, las células de E.
coli no pueden crecer en una medida apreciable como consecuencia de la inactividad
inducida por el frío de varias chaperoninas de E. coli que normalmente facilitan el
plegamiento de proteínas en esta bacteria. . Por lo tanto, transformar E. coli con
chaperoninas de una bacteria tolerante al frío permitió que las proteínas introducidas
desempeñaran las funciones a baja temperatura que las proteínas de E. coli realizan a
temperaturas más altas. Aunque no se alcanzaron niveles muy altos de expresión del
gen clonado, este trabajo es un primer paso importante en el desarrollo de sistemas
de expresión para proteínas que son sensibles a altas temperaturas y que de otro
modo podrían ser difíciles de producir. El siguiente paso lógico en el desarrollo de este
sistema probablemente sería la construcción de una célula huésped de E. coli que
contenga copias integradas de forma estable de estos genes de chaperonina en el
cromosoma. Figura 6.4 Representación esquemática de dos plásmidos disponibles en
el comercio que pueden usarse para aumentar el conjunto de ciertos ARNt raros en E.
coli. El plásmido pSJS1244 porta 3 y el plásmido pRARE porta 10 genes de ARNt de E.
coli raros. p15A representa los orígenes de replicación de estos plásmidos. La
espectinomicina y el cloranfenicol son los antibióticos por los cuales los genes de
resistencia se transportan dentro de estos plásmidos (A). También se muestra la
expresión de proteínas extrañas en una célula huésped de E. coli típica; la
concentración de ARNt raros se muestra esquemáticamente (B) y en una célula
huésped de E. coli que se ha diseñado (mediante la introducción de uno de los
plásmidos que se muestra en el panel A) para sobreexpresar varios ARNt raros
Proteínas de fusión
Ocasionalmente, las proteínas extrañas se encuentran en cantidades más pequeñas de
lo esperado cuando se producen en células huésped heterólogas. Este aparente bajo
nivel de expresión puede deberse a la degradación de la proteína extraña dentro de la
célula huésped. Una solución es diseñar una construcción de ADN que codifique una
proteína diana en un marco con ADN que codifique una proteína huésped estable (Fig.
6.6). La proteína única combinada que se produce se denomina proteína de fusión y
protege el producto genético extraño clonado del ataque de las proteínas de la célula
huésped. En general, las proteínas de fusión son estables porque las proteínas diana se
fusionan con proteínas que no son especialmente susceptibles a la proteólisis.
Las proteínas de fusión se construyen ligando una porción de las regiones codificantes
de ADN de dos o más genes. En su forma más simple, un sistema de vector de fusión
conlleva la inserción de un gen diana en la región de codificación de un gen huésped
clonado o compañero de fusión (Fig. 6.6). La pareja de fusión puede colocarse en el
extremo N o C-terminal del gen objetivo. El conocimiento de las secuencias de
nucleótidos de los diversos segmentos de codificación unidos al nivel de ADN es
esencial para garantizar que el producto de ligadura mantenga el marco de lectura
correcto. Si el ADN combinado tiene un marco de lectura alterado, es decir, una
secuencia de codones sucesivos que produce un producto de traducción incompleto o
incorrecto, no se producirá una versión funcional de la proteína codificada por el gen
diana clonado.
Cuando la proteína codificada por el gen clonado se destina al uso humano,
generalmente es necesario eliminar la pareja de fusión del producto final. Esto se debe
a que las proteínas de fusión requieren pruebas más exhaustivas antes de ser
aprobadas por agencias reguladoras, como la Administración de Alimentos y
Medicamentos de los Estados Unidos (FDA). Por lo tanto, se han desarrollado
estrategias para eliminar la secuencia de aminoácidos no deseada de la proteína
objetivo. Una forma de hacer esto es unir el gen de la proteína diana al gen de la
pareja de fusión estabilizadora con oligonucleótidos específicos que codifican tramos
cortos de aminoácidos que son reconocidos por una proteasa no bacteriana particular.
Por ejemplo, un enlazador oligonucleotídico que codifica la secuencia de aminoácidos
Ile-Glu-Gly-Arg puede unirse al gen clonado. Después de la síntesis y purificación de la
proteína de fusión, se puede usar un factor de coagulación de la sangre llamado Xa
para liberar la proteína diana de la pareja de fusión, porque el factor Xa es una
proteasa específica que rompe los enlaces peptídicos únicamente en el lado C-terminal
del Secuencia Ile-Glu-Gly-Arg (Fig. 6.7). Además, debido a que esta secuencia peptídica
se produce con bastante frecuencia en proteínas nativas, este enfoque puede
utilizarse para recuperar muchos productos génicos clonados diferentes.
Las proteasas más comúnmente utilizadas para escindir una pareja de fusión de un
interés de proteína diana son la enterocinasa, la proteasa del virus del ataque del
tabaco, la trombina y el factor Xa. Sin embargo, siguiendo esta división, es necesario
realizar pasos de purificación adicionales para separar ambos
Figura 6.6 Representación esquemática de una construcción de ADN que codifica una
proteína de fusión. Un plásmido que lleva tal construcción también contendría un gen
marcador seleccionable. P, promotor transcripcional; RBS, sitio de unión al ribosoma;
TT, terminador transcripcional. La flecha indica la dirección de la transcripción.
Cuando el uso de codones del gen extraño es diferente del uso de codones del
organismo huésped, se puede evitar el agotamiento de grupos específicos de
aminoacil-ARNt sintetizando completa o parcialmente el gen diana para reflejar mejor
el uso de codones del organismo huésped (ver la sección sobre el uso del codón
arriba). En un estudio, se encontró que los niveles de la proteína estreptavidina eran
10 veces más altos en E. coli cuando la expresión estaba dirigida por un gen sintético
con un contenido de G + C del 54% que cuando estaba dirigida por el gen natural con
una Contenido de G + C del 69%.
Aunque a primera vista pueda parecer contrario a la intuición, una forma de aumentar
la cantidad de proteína extraña producida durante el proceso de fermentación es
aceptar un nivel modesto de expresión de genes extraños (tal vez el 5% de la proteína
celular total) y, en cambio, concentrarse en alcanzar un alto densidad de la célula
huésped. Así, por ejemplo, un organismo con un nivel de expresión de proteína
extraña al 5% y un bajo nivel de carga metabólica que puede crecer hasta una
densidad de 40 g (peso seco) por litro produce más proteína objetivo que uno con un
15%. nivel de expresión para la misma proteína y una densidad celular de solo 5 a 10 g
(peso seco) por litro.
Integración cromosómica
cruce En este caso, los transformantes se seleccionan para la adquisición del gen
marcador (a menudo un gen de resistencia a antibióticos). Luego, el gen objetivo, bajo
el control de un promotor regulable, se inserta en medio del sitio de integración
cromosómica clonado en un plásmido diferente. Este constructo de plásmido se usa
para transformar células huésped que contienen el gen marcador integrado en su
cromosoma, y luego de un doble cruce catalizado por una enzima huésped, el gen
diana y su región reguladora transcripcional se insertan en el cromosoma en lugar del
gen marcador. La construcción final se selecciona para la pérdida del gen marcador.
También se pueden usar otros métodos para integrar genes extraños en el ADN
cromosómico del huésped. Por ejemplo, cuando un gen marcador está marcado por
ciertas secuencias cortas específicas de ADN y luego se inserta en un plásmido o en un
ADN cromosómico, el gen puede extirparse mediante el tratamiento del constructo
con una enzima que reconoce las secuencias de ADN que fallan y las elimina. ellos (fig.
6.11). Una combinación de una secuencia de enzima y ADN que es útil para este tipo
de manipulación es el sistema de recombinación Cre-loxP, que consiste en la enzima
recombinasaCre y dos sitios de recombinación loxP de 34 pb. El gen marcador que se
eliminará está marcado por los sitios loxP, y después de la integración del plásmido en
el ADN cromosómico, el gen marcador se elimina por la enzima Cre. El gen que codifica
la enzima Cre se encuentra en su propio plásmido, que puede introducirse en las
células huésped transformadas cromosómicamente. La escisión del gen marcador se
desencadena por la adición de IPTG al medio de crecimiento; esto elimina la presión
del gen lacI (que codifica el represor lac), que activa el promotor-operador lac de E.
coli, que estaba presente antes del gen Cre, y hace que la enzima Cre se sintetice. Una
vez que ya no hay necesidad de la enzima Cre, el plásmido que contiene el gen para
esta enzima bajo el control del promotor lac puede eliminarse de las células huésped
simplemente elevando la temperatura. Este plásmido tiene un replicón sensible a la
temperatura que le permite mantenerse en la célula a 30 ° C, pero no por encima de
37 ° C.
secuencia que codifica un péptido señal para el gen clonado. Cuando la proteína
recombinante se secreta al periplasma, el péptido señal es eliminado con precisión por
el aparato de secreción de la célula, por lo que el extremo N-terminal de la proteína
diana es idéntico a la proteína natural.
Desafortunadamente, la fusión de un gen diana con un fragmento de ADN que
codificauna secuencia peptídica señal no garantiza necesariamente una alta secreción.
Cuando se encuentra que esta estrategia simple es ineficaz para producir un producto
proteico secretado, es necesario emplear estrategias alternativas. Un enfoque que
resultó exitoso para la secreción de la citoquina IL-2 fue la fusión del gen IL-2 en
sentido descendente del gen para la proteína de unión a la maltosa del propéptido
completo, en lugar de solo la secuencia señal de la proteína de unión a la maltosa. con
el ADN que codifica el sitio de reconocimiento del factor Xa como un péptido
enlazador que separa estos dos genes (Fig. 6.13). Cuando esta fusión genética, en un
vector plasmídico, se usó para transformar células de E. coli, como se esperaba, se
encontró una gran fracción de la proteína de fusión localizada en el periplasma de la
célula huésped. La IL-2 funcional podría luego liberarse de la proteína de fusión por
digestión con factor Xa.
A veces, un nivel demasiado alto de traducción de una proteína extraña puede
sobrecargar la maquinaria de secreción de la célula e inhibir la secreción de esa
proteína. Por lo tanto, para garantizar que la secreción de una proteína diana se
produzca de manera más eficiente, es necesario disminuir el nivel de expresión de esa
proteína.
E. coli y otros microorganismos gramnegativos generalmente no pueden segregar
proteínas en el medio circundante debido a la presencia de una membrana externa
(además de la membrana interna o citoplásmica) que restringe este proceso. Por
supuesto, es posible utilizar como organismos huésped procariotas grampositivos o
células eucariotas, las cuales carecen de una membrana externa y, por lo tanto,
pueden secretar proteínas directamente en el medio. Alternativamente, es posible
aprovechar el hecho de que algunas bacterias gramnegativas pueden secretar una
proteína bactericida llamada bacteriocina en el medio. Un mecanismo en cascada es
responsable de esta secreción específica. Una proteína liberadora de bacteriocina
activa la fosfolipasa A, que está presente en la membrana interna bacteriana, y escinde
los fosfolípidos de membrana para que las membranas interna y externa sean
permeabilizadas (Fig. 6.14A). Esto da como resultado algo de citoplasma y
periplásmica.
Figura 6.13 Ingeniería de la secreción de IL-2. Cuando la IL-2 se fusiona con la proteína
de unión a la maltosa de E. coli y su péptido señal, con las dos proteínas unidas por un
péptido enlazador, se produce la secreción al periplasma. Después de la purificación de
la proteína de fusión secretada, la proteína de unión a maltosa y el péptido enlazador
se eliminan mediante digestión confactor Xa. doi: 10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.13
Figura 6.14Representación esquemática de una proteína recombinante de liberación
de bacteriocina que activa la fosfolipasa A (presente en la membrana interna de E. coli)
para permeabilizar las membranas celulares (A). También se muestran esquemas de
células de E. coli diseñadas para secretar una proteína extraña al periplasma
fusionando el gen de interés (verde) a una señal de secreción (B) y al medio de
crecimiento mediante la permeabilización de las membranas celulares con una
proteína de liberación de bacteriocina codificada en Otro plásmido (rojo) (C). doi:
10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.14
Acetato reductor
A menudo es difícil lograr altos niveles de expresión de genes extraños y una alta
densidad de células hospedadoras al mismo tiempo debido a la acumulación de
productos de desecho dañinos, especialmente acetato, que inhibe el crecimiento
celular y la producción de proteínas, y también desperdicia carbono disponible.
Recursos energéticos. Dado que el acetato a menudo se asocia con el uso de glucosa
como fuente de carbono, generalmente se obtienen niveles más bajos de acetato y,
por lo tanto, rendimientos más altos de proteína cuando se usa fructosa o manosa
como fuente de carbono. Además, se han desarrollado varios tipos diferentes de
células huésped de E. coli manipuladas genéticamente que producen niveles más bajos
de acetato. Una de estas cepas modificadas se produjo mediante la introducción de un
gen (de B. subtilis) que codifica la enzima acetolactatosintasa en las células huésped de
E. coli. Esta enzima cataliza la formación de acetolactato a partir de piruvato,
disminuyendo así el flujo a través de acetil coenzima A a acetato (Fig. 6.16). En la
práctica, los genes de acetolactatosintasa se introducen en la célula en un plásmido,
mientras que el gen diana (que codifica la proteína que se va a sobreexpresar en E.
coli) se introduce en un segundo plásmido de un grupo de incompatibilidad diferente.
Las células que se transformaron con los genes de acetolactatosintasa produjeron un
75% menos de acetato que las células no transformadas y en su lugar sintetizaron
acetoína, que es aproximadamente 50 veces menos tóxica para las células que el
acetato. El rendimiento de la proteína recombinante también se duplicó.
En otro enfoque para reducir el nivel de acetato, los investigadores transformaron las
células huésped de E. coli con un gen bacteriano para la enzima piruvatocarboxilasa,
que convierte el piruvato directamente en oxaloacetato y no está presente en E. coli
(Fig. 6.17). Con la introducción de la piruvatocarboxilasa, los niveles de acetato
disminuyeron a menos del 50% de su nivel normal, el rendimiento celular aumentó en
más del 40% y la cantidad de proteína extraña sintetizada aumentó en casi el 70%. Este
resultado refleja el hecho de que la adición de piruvatocarboxilasa permite que las
células de E. coli utilicen el carbono disponible de manera más eficiente, alejándolo de
la producción de acetato hacia la biomasa y la formación de proteínas.
De manera similar a la estrategia discutida anteriormente, el ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA) también se puede reponer al convertir el aspartato en fumarato
(Fig. 6.17). Para hacer esto, las células huésped de E. coli se transformaron con el gen
para la l-aspartato amoníaco liasa (aspartasa) bajo el control del promotor tac fuerte
en un plásmido estable de bajo número de copias. La proteína recombinante diana se
introdujo en un plásmido separado. Usando este sistema, la actividad de la aspartasa
se indujo mediante la adición de IPTG en el medio paraFase logarítmica tardía de
crecimiento. Cuando las células de E. coli recombinantes se cultivaron en un medio
mínimo que contenía aspartato, la producción de diferentes proteínas recombinantes
podría aumentarse hasta cinco veces, con un 30 a 40% más de producción de biomasa.
Plegamiento de proteínas
El uso de condiciones que resultan en tasas muy altas de expresión de genes extraños
en E. coli a menudo también conduce a la producción de proteínas mal plegadas que
pueden agregarse y formar cuerpos de inclusión insolubles dentro de la célula
huésped. Si bien es posible solubilizar cuerpos de inclusión y posteriormente
establecer condiciones que permitan que al menos una parte de la proteína
recombinante se pliegue correctamente, esto es típicamente un proceso tedioso,
ineficaz, costoso y lento, y es mejor evitarlo si es posible. . Una estrategia simple para
evitar la formación de proteínas mal plegadas y, por lo tanto, los cuerpos de inclusión
implica reducir la velocidad de síntesis del producto del gen diana.