UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA, MANAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

CARRERA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA

ACTIVIDAD No. 1
LABORATORIO: NORMAS DE BIOSEGURIDAD, INSTRUMENTAL, EQUIPOS BÁSICOS DE TRABAJO
DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y MICROSCOPÍA
SEMANA 2 FECHA: 06 AL 10 DE MAYO 2019
I. TEMARIO:
- Normas de Bioseguridad
- Instrumental y equipos básicos de uso en el laboratorio de Microbiología
- Microscopios

II. OBJETIVOS:
Al finalizar esta actividad práctica el estudiante será capaz de:

1. Valorar la importancia de la implementacion de las normas de bioseguridad en el

laboratorio.
2. Apreciar las buenas prácticas de laboratorio para disminuir el riesgo de contaminacion.
3. Familiarizarse con los instrumentos y equipos básicos del laboratorio.
4. Utilizar el microscopio óptico común para la observacion de muestras biologicas en el
laboratorio.
5. Discutir los diferentes niveles de bioseguridad (BSL) en el laboratorio.

III. INTRODUCCIÓN:

La presente guía ha sido elaborada con el propósito que el estudiante que cursa la asignatura de
Microbiología, conozca y practique las normas de bioseguridad en el laboratorio así como
familiarizarse con el instrumental y equipos básicos de uso, para el desarrollo práctico de la
asignatura.

Internacionalmente los laboratorios se clasifican en cuatro niveles, esta clasificación se basa

principalmente en la naturaleza del laboratorio así como el riesgo biológico con el que se trabaja.

IV. DESARROLLO:

4.1) Normas de Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología, Parasitología e

Inmunogenética:
En todo laboratorio de microbiología cualquiera que fuese su especialidad, se deben seguir una
serie de normas válidas que aseguren la calidad de las técnicas y resultados obtenido, además que
proporcionen seguridad en el trabajo. Esto se consigue mediante la implementación de “Normas
de Bioseguridad e higiene en el trabajo” destinados a evitar el riesgo de infección del personal
que trabaja en el laboratorio así como extensión a la comunidad. Estas normas están aprobadas
por el Ministerio de Salud y se derivan de normas internacionales. Debido al grado de
contaminación expuesta y por ser el Laboratorio de Microbiología un área potencialmente
infecciosa el estudiante o toda persona que tenga acceso a él, deberá cumplir de manera estricta
las normas de bioseguridad establecidas.

Por lo tanto cada laboratorio debe tomar como referencia las normas mencionadas
anteriormente, para elaborar las normas específicas de cada laboratorio según especialidad.

Las normas de bioseguridad se aplicaran en el transcurso del semestre y deben de tener estricto
cumplimiento.

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

1. Asistir a sus actividades prácticas de laboratorio usando gabacha (bata) manga larga y
quitársela antes de abandonar el local, guantes, anteojos protectores, zapatos cerrados,
cabello corto o recogido y no usar joyas u otras bisuterías.
2. Mantener las puertas del laboratorio cerradas.
3. Cuidar y dar buen uso a los equipos y/o materiales que se encuentran en el laboratorio.
4. Ubicar libros, mochilas, carteras u otras pertenencias personales, donde el docente le
indique.
6. Durante las prácticas de laboratorio está prohibido, comer, fumar, ingerir líquidos o
llevarse cualquier objeto a la boca, debido a la posibilidad de contagio.
7. No hablar ni toser sobre un medio de cultivo estéril o con crecimiento bacteriano.
8. No debe salir fuera del laboratorio durante la realización de la práctica; en caso necesario
deberá comunicarlo a su docente responsable.
9. Las mesas de trabajo deben ser desinfectadas con cloro y ordenadas antes y después de
cada práctica de laboratorio.
10. No hay que exponer la superficie de un medio de cultivo al aire más de lo estrictamente
necesario (20 cm del mechero de bunsen).
11. Se debe flamear la boca de los tubos de ensayos antes y después de extraer o depositar
(sembrar) un inóculo.
12. Esterilizar el asa y aguja bacteriológica antes y después de utilizarla. El asa debe tomarse
como un lápiz y dejar libre dos dedos (para sujetar tapones). Las asas o agujas
bacteriológicas deben descansar sobre un soporte y por ningún motivo sobre las mesas de
trabajo.
13. Todo material que use y que presuma estar contaminado (pipetas, caja petri, tubos,
láminas, etc.), colóquelo al terminar de usarse en los depósitos especiales para material
contaminado, los cuales estarán debidamente rotulados.
14. Si accidentalmente se contamina con alguna muestra o cultivo de microorganismos, o
sufre otro tipo de accidente como quemaduras, cortaduras o aspiración de material
contaminado, comuníquese con su docente responsable para que le indique el paso a
seguir.
 15. Bajo ningún concepto debe de extraerse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
16. Todos los equipos que hayan utilizado, tienen que dejarlos limpios y posición de descanso.
17. Al finalizar la práctica se deben cerrar todas las llaves de pases de gas y de agua.
18. Antes de finalizar sus actividades en el laboratorio, comuníquele a su docente responsable
que ya finalizó sus prácticas.

Tarea 1: Cada estudiante realizará una investigación sobre los parámetros internacionales para la
clasificación de los laboratorios en niveles. Esta tarea será entregada a su profesor (a) responsable
de la mesa, antes de iniciar la actividad.

4.2) Instrumental y Equipos Básicos de Uso en el Laboratorio de Microbiología, Parasitología

e Inmunogenética:

 Instrumentos:

Tubos de ensayos, Tubos para centrífugas, Pipetas (graduadas, pasteur y automáticas), Frascos
(matraz, erlenmeyer, kitasato, castañeda, probetas, vasos de precipitación), Platos petri o cajas
petri, Embudo, Mortero, Cubreobjetos, Portaobjetos, Mechero de Bunsen, Trípode, Asas
bacteriológicas, etc.

 Equipos:
Microscopio, Centrífuga, Incubadora, Jarra para CO2, Autoclave, Horno, Refrigeradora, Cabina de
seguridad (campana), Baño María, Termociclador, etc.

1. En cada mesa de trabajo se ubicará un juego de instrumentos de laboratorio para su

observación y familiarización.

2. Cada grupo de estudiante pasará con su docente responsable al laboratorio de diagnóstico

del departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunogenética a reconocer los
equipos antes mencionados.

Tarea 2: Cada estudiante deberá traer dibujado todo el instrumental citado, mencionando la
función de cada uno de ellos. Esta tarea será entregada a su profesor (a) responsable antes de
iniciar la actividad.

 EL MICROSCOPIO
En todo laboratorio se hace necesario el uso de diferentes microscopios, con el fin de observar e
identificar la gran variedad de microorganismos. Por lo que existen dos clases de microscopios:

 Microscopio de luz: Se utiliza para observar y estudiar las características morfológicas y

estructurales de los microorganismos a excepción de los virus. Estos se clasifican en:
 Microscopio óptico común
 Microscopio de campo oscuro
 Microscopio de contraste de fase
  Microscopio de epifluorescencia
 Microscopio de fluorescencia

 Microscopio electrónico: Se utiliza para observar a los virus y estructuras internas de las
células, no se pueden usar para ver especímenes vivos. Existen dos tipos de microscopio
electrónico:

 Microscopio de transmisión  Microscopio de barrido

Tarea 3: Cada estudiante debe establecer la diferencia y utilidad entre cada uno de los tipos de
microscopios (de luz y electrónicos). Así como también deberá traer dibujado el microscopio
óptico común señalando cada una de sus partes. Este trabajo será entregado a su profesor (a)
responsable antes de iniciar la actividad.

El microscopio con el que trabajaremos en las actividades prácticas en la asignatura de

Microbiología será el microscopio de campo iluminado o microscopio óptico común, el que consta
de tres partes: Sistema mecánico, Sistema óptico y Sistema de iluminación.

El microscopio consta de tres partes:

1. Sistema mecánico: Está formado por la base, brazo, platina, tornillo macrométrico y
micrométrico.

2. Sistema óptico: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan los oculares y los
objetivos. Un microscopio moderno posee tres sistemas separadores de lentes:

Condensador: Esta interpuesto entre la fuente de luz y el preparado. Tiene la función de

concentrar los rayos de luz provenientes de la fuente de iluminación en un punto o foco.

Objetivos: Ofrecen una imagen ampliada. Los objetivos están montados sobre un
sistema de revólver, éste sistema facilitará girar el objetivo de un lado a otro. Los
microscopios tienen varios objetivos, los más utilizados en Microbiología son los
siguientes:

 Objetivo de 4X (Lupa) Se usa para ubicar el campo a analizar y para

observar estructuras externas de algunos insectos o ácaros.
  Objetivo de bajo poder (10X), es apto para explorar el preparado y
seleccionar el campo de observación.
 Objetivo de alto poder en seco (40 o 45X) permite la observación
detallada de microorganismos grandes tales como: algas, protozoos y
hongos)
 Objetivo de inmersión en aceite (100X) permite la observación de
muestras coloreadas (tinciones simples y compuestas)
Ocular: Aumenta la imagen real proyectada por el objetivo para permitir que sea percibido
por el ojo. La mayoría de los oculares amplían la imagen 10 o 12 veces.

3. Sistema de iluminación: Está compuesto por la fuente de luz, los filtros y el condensador y
el diafragma.

¿Cómo funciona el Microscopio? Lo que queremos ver bajo el objetivo se denomina objeto. El
objeto se coloca en un pedazo de vidrio llamado portaobjetos. El portaobjeto descansa en la
platina del microscopio. La luz de una lámpara va a dar a una parte del microscopio llamado
condensador y luego, a través del portaobjeto, hasta el objeto. La luz que ha pasado por el objeto
va a dar al objetivo. Luego esta luz penetra un tubo y atraviesan el ocular para llegar al ojo

Procedimiento para el manejo del microscopio optico común para la observacion de muestras
biológicas en el laboratorio:

a) Observación de una muestra preparada al fresco:

1. Antes de utilizar el microscopio, asegurarse que el estudiante conozca e identifique cada
una de las partes que lo componen, luego limpie todos los lentes con papel especial (papel
lente).
2. Al colocar el objetivo de menor aumento (4x o 10X) en posición de descanso por debajo
del tubo del microscopio, sentirá un chasquido cuando haya quedado bien colocado.
3. Conecte la fuente de luz y enciéndalo.
4. Coloque la preparación del portaobjeto sobre la platina del microscopio y asegúrela con
las pinzas o sujetadores correspondientes.
5. Acomode la porción de la preparación que va a examinar en la apertura central de la
platina.
6. Baje el objetivo de menor aumento con el tornillo de ajuste grueso (macrométrico),
aproximadamente medio centímetro por encima del cubreobjeto de la preparación.
7. Eleve el condensador al máximo con ayuda del tornillo de ajuste del condensador.
8. Observe por el ocular ajustando la distancia entre sus ojos y luego mueva la palanca del
diafragma, de modo que éste se abra a su límite máximo. Tal límite se determina mirando
por el ocular y observando los cambios en la intensidad de la luz; si la luz es demasiado
brillante haga los ajustes necesarios.
9. A continuación enfoque hacia arriba con el tornillo de ajuste fino (micrométrico), hasta
que el espécimen se observe con toda claridad.
 10. Para cambiar el objetivo (pasar de la lente de menor a mayor aumento o sea de 4X a 10X y
40 X) no eleve el tubo del microscopio, sino simplemente haga girar el objetivo deseado
para colocarlo en su lugar y ajuste mayor intensidad de luz abriendo el diafragma.
11. Una vez finalizada la observación microscópica, retire la lámina portaobjeto, limpie los
objetivos con papel lente y coloque el microscopio en posición de descanso (bajar la
intensidad de la luz, apagar el microscopio, cerrar los oculares, colocar el objetivo de
menor aumento (4X) bajar la platina, desconectarlo y enrollar el cable sobre la platina o
base).
NOTA: El paso numero 11 será evaluado de forma constante en todas las actividades en que se
involucre el uso del microscopio.

b) Observación de una muestra preparada con colorantes: (ej. con Giemsa, o tinción de
gram)
1. Verifique que el frotis coloreado este hacia arriba y coloque el frotis sobre la platina del
microscopio, asegurándose que éste quede sujetado por las pinzas de la platina.
2. Ilumine la muestra y descienda el objetivo de 10X haciendo uso del tornillo micrométrico
hasta situarlo aproximadamente a 1mm de la preparación, hasta obtener una imagen
nítida.
3. Mediante el carro mecánico haciendo uso de los tornillos mueva el frotis hasta localizar un
campo donde las células se presenten bien diferenciadas y bien definidas.
4. Haga los ajustes necesarios en la iluminación.
5. Haga girar el revólver hacia el objetivo de inmersión (100X) dejándolo a mitad del camino,
coloque una gota de aceite de inmersión sobre el preparado y termine de girar el revólver
colocando sobre la muestra el lente de inmersión. El lente objetivo de inmersión debe
tocar el aceite que contiene la muestra.
Nota: el uso de aceite de inmersión es necesario para concentrar los rayos de luz y evitar
el rayado de la lente de 100X.

6. Observe por el ocular y manipule el tornillo micrométrico para darle nitidez a la

preparación. Realice el recorrido por la muestra e identifique las estructuras.
7. Una vez finalizada la observación microscópica, retire la lámina portaobjeto, limpie los
objetivos con papel lente y coloque el microscopio en posición de descanso (bajar la
intensidad de la luz, apagar el microscopio, cerrar los oculares, colocar el objetivo de
menor aumento (4X) bajar la platina, desconectarlo y enrollar el cable sobre la platina o
base
V. EVALUACIÓN:
El valor total de la actividad será de 100 puntos, distribuyéndose de la siguiente manera:
- Al inicio de la actividad, se realizará una prueba escrita con un valor de 50 puntos, en la
que se evaluarán los contenidos ya descritos.
- El valor de la discusión tendrá un valor de 50 puntos, tomando en cuenta su coherencia en
las respuestas y aclaración sobre el contenido de la misma. Se podrá considerar los
trabajos realizados por los estudiantes.
VI. BIBLIOGRAFÍA:
 Brooks, G.C, Butel, J, Morse, S, Mietzner, T. (2014). Microbiología médica de Jawetz,
Melnick y Adelberg. 26ª Edición. Mc Graw Hill LANGE.
 Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica: fundamentos y guía práctica. 2a
Edición. Editorial Médica Panamericana S.A. España.
 Murray P, Rosenthal KS, Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta Edición. Editorial
MOSBY, Madrid, España.
 N. Arraiza, P.M. Viguria, J. Navarro, A. Ainciburu (2001) Manual de microscopía, Historia,
descripción y uso del microscopio óptico. Auxilab, S. L.
 OMS 3ra ed. (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio. Recuperado de
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS CSR LYO 2004 11 SP.pdf
 Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P adn Woods G. (2006).
Koneman Diagnostico Microbiológico. 6ta Edición. Editorial Médica Panamericana S. A.
España.
https://books.google.com.ni/books?id=jyVQueKro88C&printsec=frontcover&dq=koneman
+diagnostico+microbiologico+pdf&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwjbmq_B0PDRAhUC_IMKHXn
YB2YQ6AEIGDAA#v=onepage&q&f=false
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CARRERA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
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ACTIVIDAD No. 2
LABORATORIO: MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
SEMANA 3 FECHA: 13 AL 17 DE MAYO 2019

I. TEMARIO:
- Preparación del examen al fresco
- Preparación de frotis
- Tinción de Gram

II. OBJETIVOS:
Al finalizar esta actividad práctica el estudiante será capaz de:

1. Señalar las caracteristicas morfologicas, estructurales y funcionales de la célula bacteriana.

2. Explicar los fundamentos científicos de los diferentes métodos de observación bacteriana.
3. Realizar preparación al fresco de muestras biológicas para observar las características
generales de las bacterias (ejemplo: movilidad, morfología).
4. Caracterizar los grupos bacterianos (gram positivas y negativas) a través de microscopía
óptica según sus características de tinción.

III. INTRODUCCIÓN:

Los métodos de laboratorio por lo común comprenden el estudio microscópico de materiales

obtenidos en frescos sin teñir y con tinción, así como la preparación de cultivos con medios
idóneos para la proliferación de agentes muy diversos.

Los métodos de exámenes directos de laboratorio; por ejemplo, la preparación al fresco de una
suspensión microbiana se utiliza para examinar muestras clínicas sin colorear. Permite observar
microorganismos (bacterias, parásitos y hongos) vivos y ciertas actividades biológicas como
movilidad, morfología y disposición.

Las técnicas de coloración en microbiología se clasifican en simples y compuestas:

-Coloración Simple: Es un método que utiliza un solo colorante, ácido o básico y tiñen todos los
elementos por igual.

-Coloraciones Diferenciales o Compuestas: Por ejemplo, la Tinción de Gram: es un procedimiento

de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas microbiológicas. Es
definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos
grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.

Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una
de las tinciones más utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta.

En microbiología clínica, la tinción de Gram resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras
clínicas directas (exudados, sangre, LCR, Liquido peritoneal, liquido pleural, material purulento,
tejidos obtenidos de biopsia) obtenidas de los pacientes con patologías infecciosas, con sepsis,
meningoencefalitis bacteriana, abscesos, neumonía de la comunidad etc. Se puede saber de
manera rápida los posibles microorganismos causantes de una infección.

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las
bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular
de las bacterias gram positivas está constituida por una capa celular gruesa de peptidoglucano,
pero no cuentan con membrana celular externa; en cambio las gram negativas cuentan con una
capa delgada de peptidoglucano y una membrana celular externa; así pues, la composición
química y el contenido de peptidoglucano en la pared celular de las bacterias explica y determina
las características tintoriales.

La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene
afinidad con el peptidoglucano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual
sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal
violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglucano de la pared bacteriana. En seguida, se
coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de
la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que
ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos (alcohol-acetona).

Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglucano, retienen con
mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener
menos cantidad de peptidoglucano. Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un
colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el
complejo cristal violeta-yodo. La afinidad de las Gram positivas y negativas de las bacterias
depende de la composición química de la pared celular y en parte de su estructura física.

Los colorantes utilizados en la tinción de Gram:

1. Cristal violeta o Violeta de Genciana (colorante primario o principal)
2. Zafranina o Fucsina básica (contracolor o colorante secundario o básico)
3. Lugol o solución yodada (mordiente o fijador del colorante principal)
4. Alcohol acetona (disolvente orgánico o decolorante).

Ventajas:
 Es un método rápido, sencillo y económico.
Desventajas:
 Las Micobacterias y ciertos hongos, pueden no tomar la coloración de Gram.
 Tiñe débilmente bacterias sin pared como los Micoplasma y Ureaplasma.
 Su técnica es más laboriosa que la de una coloración simple.

Utilidades:
 Permite observar forma, tamaño y disposición
 Diferencia a las bacterias Gram positivas y Gram negativas
 Permite detectar la presencia de más de una bacteria en la muestra (mixta o monoespecífica)
 Proporciona información para la toma de decisiones del médico
 Conservación de los preparados teñidos.

IV. DESARROLLO:
 Al iniciar la actividad práctica se debe discutir sobre la caracteristicas morfologicas,
estructurales y funcionales de la célula bacteriana (Revisar el capítulo de estructura
bacteriana en su texto básico y en las conferencias sobre Citología Bacteriana, que es la
base científica para comprender el fundamento de las tinciones).

 Posterior se realizará la preparación del examen al fresco, preparación de frotis y tinción

de Gram, así como su debida interpretación diagnóstica.

4.1) Preparación del examen al fresco:

Materiales, reactivos y equipos: Cultivo bacteriano en tubo o plato Petri, solución salina 0.85%,
láminas portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur, palillos, lápiz graso, azas bacteriológicas,
fósforos, frascos de descarte, mecheros, microscopios.

Procedimiento:
1. Tome una lámina portaobjeto, márquela en uno de los extremos con un número o letra,
coloque una gota de solución salina al 0.85% en el centro de la lámina.

2. Con el asa bacteriológica estéril tome una o varias colonias contenidas en el plato Petri y
homogenice en la solución salina y coloque el cubreobjeto sobre la muestra preparada.

3. Tome la lámina preparada y colóquela al microscopio, inicie la observación con el objetivo

de bajo poder (10X). Observe los movimientos y disposición natural de las bacterias. Para
lograr una mejor observación de los microorganismos, utilice el objetivo seco de alto
poder (40 X).

4. Interprete y anote los resultados

Motilidad: __________________________________________________
 Morfología: __________________________________________________
Otras características que pueda observar: ____________________________
4.2 Preparación de frotis para tinción de Gram:
Materiales, reactivos y equipos: Cultivo de microorganismos en medios líquidos y sólidos, asas
bacteriológicas y/o palillos, pipetas Pasteur, mecheros, goteros, láminas portaobjetos, lápiz graso,
fósforos, frascos de descarte, agua destilada, solución salina, mecheros, microscopios.

Procedimiento:

1. Ubicar sobre la mesa un portaobjeto limpio, desengrasado y márquela en uno de los

extremos con un número o letra y coloque una gota de agua destilada estéril o solución
salina 0.85%.

2. Con el asa estéril tome una pequeña cantidad de la muestra a examinar (ej. colonias
contenidas en el medio de cultivo) y la coloca sobre el portaobjeto que contiene la
solución salina.

3. Se procede a extender la gota de tal forma que quede distribuido uniformemente en la

parte céntrica del portaobjeto.

4. Deje que el extendido o muestra se seque al aire libre.

5. Fije las bacterias al portaobjeto, pasándolo de dos a tres veces por encima de la llama del
mechero, con la finalidad que las bacterias queden adheridas al vidrio de modo que en los
sucesivos lavados que se realizan durante la coloración no arrastren los microorganismos.

Existen dos métodos de fijación: Método físico o de Koch (calor) y método químico
(Metanol).

Nota: Si el material se obtiene de un medio de cultivo líquido no es necesario realizar los pasos 1,
2 y 3, sino que basta con colocar y extender la muestra de la suspensión microbiana directamente
sobre el portaobjeto y continuar con los pasos 4 y 5 de la preparación de frotis para tinción.

4.3 Tinción de Gram:

Materiales y equipos: Frotis (fijados previamente), set de coloración de Gram, puente de tinción,
pizetas con agua destilada, aceite de inmersión, papel lente o de filtro, frascos de descarte y
microscopios.

Procedimiento:
1. Colocar los frotis (ya fijados) en el puente de tinción.

2. Cubra los frotis (láminas) con solución de Cristal violeta, durante 1 minuto.

3. Lave la lámina haciendo uso del agua de la pizeta y escúrrala.

 4. Cubra la lámina con solución de Lugol durante un minuto.

5. Lave la lámina haciendo uso del agua de la pizeta y escúrrala.

6. Agregue el alcohol-acetona sobre la preparación, hasta que deje de soltar color violeta (30
segundos), inmediatamente después lave con agua y escurra.

7. Cubra la lámina con solución de Zafranina durante 1 minuto.

8. Lave la lámina haciendo uso del agua de la pizeta y escúrrala.

9. Examine la preparación con lente de 10X y posterior con el objetivo de inmersión 100X,
adicionando una gota de aceite de inmersión al frotis.

10. Observe, interprete y anote los resultados.

Forma: _____________________________________
Coloración: __________________________________
Disposición: __________________________________

11. Con los resultados obtenidos, anote en el espacio en blanco, que morfotipo de bacterias
identificó: ___________________________________

V. EVALUACIÓN:

La evaluación de este laboratorio se realizará de la siguiente manera:

Prueba corta de entrada: 50 puntos
Desarrollo del laboratorio: 50 puntos
_____________
Total: 100 puntos

VI. BIBLIOGRAFÍA:

Brooks, G.C, Butel, J, Morse, S, Mietzner, T. (2010). Microbiología médica de Jawetz, Melnick y
Adelberg. 25ª Edición. Mc Graw Hill Lange.

Koneman, E y col. (2008). Diagnóstico Microbiológico: texto y atlas en color. 6a edición. Editorial
Panamericana. México.

Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica: fundamentos y guía práctica. 2a Edición.

Editorial Médica Panamericana S.A.
Murray P, Rosenthal KS, Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta Edición. Editorial MOSBY,
Madrid, España.

Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología – Medigraphic.

www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf.
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ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA

ACTIVIDAD No. 3
LABORATORIO: IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS
SEMANA 4 FECHA: 20 AL 24 DE MAYO 2019
I. TEMARIO
 Identificación de Staphylococcus
 Identificación de Streptococcus

II. OBJETIVOS
Al finalizar esta actividad práctica el estudiante será capaz de:
- Reconcocer las características de las colonias de bacterias gram positivas en los medios de
cultivos.
- Identificar a las bacterias gram positivas utilizando diferentes técnicas de laboratorio
(Tinción de Gram, catalasa, coagulasa, optoquina, bacitracina y prueba de CAMP)
- Discutir el fundamento de cada una de las pruebas de laboratorio

III. INTRODUCCIÓN
Las bacterias gram positivas, se caracterizan por presentar forma de cocos (redondeados) con
disposición en racimos o cadenas, son bacterias que se asocian a infecciones en el humano, se
transmiten por objetos afilados o puntiagudos contaminados, éstos provocan lesiones en piel
debidas a traumas o en procedimientos quirúrgicos. También se han aislado en pacientes que
presentan heridas infectadas, heridas quirúrgicas infectadas, celulitis, erisipela y abscesos etc.
Dentro de este grupo se encuentran las especies patógenas de los géneros Staphylococcus y
Streptococcus.

Algunas especies se recuperan regularmente de sitios con mala higiene, polvo de los pisos,
paredes y de una variedad de objetos inanimados.

Estas bacterias son capaces de producir enzimas y toxinas durante su metabolismo provocando
lesión tisular localizada (meninges, alvéolos, membrana timpánica, piel, tejido celular subcutáneo,
cavidad articular, tejido óseo etc.).

Las muestras obtenidas de los pacientes pueden ser; secreción de heridas y/o abscesos, secreción
nasal y/o faríngea, sangre, esputo, secreción ótica, orina, piel, líquido articular, tejido óseo, tejido
blando, LCR, Líquido pleural, etc. Éstas deben ser tomadas en condiciones de asepsia y antisepsia
en recipientes estériles o medios de trasporte y deben ser enviadas al laboratorio debidamente
identificado (nombre y apellido del paciente, edad, sexo, tipo de muestra, sitio de la toma, fecha
de la toma, diagnóstico, etc.) y en el menor tiempo posible.
 En ambos casos, éstas deben ser manipuladas cerca de un mechero, con guantes e inoculada en
los medios de cultivos correspondientes, por ejemplo en agar sangre de carnero y agar McConkey,
agar chocolate. Posteriormente se incuban (18 a 24 horas) a 35 grados centígrados (cultivo
primario), posteriormente se realiza un cultivo secundario a partir del cual se realizan todas las
pruebas bioquímicas para su debida identificación.

IV. DESARROLLO

4.1) Procedimientos de las pruebas diagnósticas para la identificación de Staphylococcus:

Materiales, reactivos y equipos: Cultivo de Staphylococcus aureus y epidermidis, platos de agar

sangre estéril, láminas portaobjeto, set de colorante de Gram, solución salina, plasma humano o
de conejo, aceite de inmersión, asas bacteriológicas, aplicadores, puente de tinción, mecheros,
fósforos, microscopio.

1) Identificación de las características morfológicas de las colonias de Staphylococcus:

 Se realiza observando la forma, color y tamaño de las colonias crecidas en el medio de

cultivo.
 Anote sus observaciones: ____________________________________________________

A la izquierda positivo para infección por Staphylococcus, a la derecha positivo para un

cultivo de Streptococcus

1) Prueba de hemólisis en sangre:

a) En una mitad del plato de agar sangre siembre colonias de S. aureus de manera que pueda obtener
colonias aisladas. En la otra mitad del plato siembre colonias de S. epidermidis
b) Incube los platos inoculados a 37ºC por 24 horas

c) Después del período de incubación, observe las colonias que produjeron hemólisis y anote lo
observado: _______________________________________________________________________
Nota: hemólisis, es el halo que se forma alrededor de la colonia crecida en el medio de cultivo o
sea que hay un aclaramiento del medio que rodea la colonia.
 2) Tinción de Gram:
 Este procedimiento esta descrito en la guía del laboratorio No. 2
Nota: El frotis y la tinción de gram, los realizará con cultivos suministrados por su profesor o
profesora.

Staphylococcus Streptococcus

3) Prueba de la catalasa: Su principio se basa en que el peróxido de hidrógeno (H202) es uno de

los productos oxidativos finales en el metabolismo aerobio de los carbohidratos, si se
acumula es letal para las células bacterianas. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno
en agua más oxígeno.

- Tome un portaobjeto y coloque una ò dos gotas de peróxido de hidrógeno al 3%

- Con una asa bacteriológica ó unos palillos tome una porción de las colonias
que crecieron en el medio de cultivo (Staphylococcus)
- Homogenice suavemente en el peróxido de hidrógeno que contiene el portaobjeto.
- La liberación de gas (burbujas) nos indica que estamos en presencia de Staphylococcus.
- Anote sus resultados: __________________________________________________

4) Prueba de la coagulasa: Proteína tipo enzimático que coagula el plasma. Las cepas

coagulasa positivas por lo general producen un coagulo visible en 1 a 4 horas a 35 grados

centígrados.
a) En un tubo de ensayo conteniendo plasma humano o de conejo, inocule una asada de colonias de
Staphylococcus aureus y homogenice. En otro tubo haga lo mismo con Staphylococcus epidermidis.

b) Incube los tubos con plasma inoculados a 37ºC por un período de 4 - 8 horas.

c) Inclinando un poco los tubos, observe en cuál de ellos se formó un coágulo como tapón mucoide

d) Anote los resultados. (Si se formó el coagulo es coagulasa positiva y nos indica presencia de S.
aureus.) ________________________________________________________________________

Nota: Si el tubo de prueba continúa siendo negativo después de 4 - 8 horas de incubación, debe
quitarse de la incubadora y dejarse a temperatura ambiente durante la noche, debido a que la
bacteria puede producir enzima fibrinolíticas y disolver los coágulos formados, pudiendo producir
falsos negativos. La incubación de los tubos coagulasa negativo durante la noche, a Tº ambiente,
permite detectar cepas que producen lentamente la coagulasa.

4.2) Procedimientos de las Pruebas diagnósticas para la identificación de Streptococcus:

Materiales, reactivos y equipos:

Cultivos de Streptococcus y Staphylococcus en agar sangre, platos de agar sangre estéril, set de
tinción de Gram, puente de tinción, discos de Bacitracina y Optoquina, asas bacteriológicas,
mecheros, fósforos y microscopios aceite de inmersión.

1) Identificación de las características morfológicas de las colonias de Streptococcus:

Se realiza con la observación de la forma, color y tamaño de las colonias crecidas en el medio de
cultivo.

Anote los resultados: _________________________________________________________

A la izquierda positivo para infección por Staphylococcus, a la derecha positivo para un

cultivo de Streptococcus
2) Prueba de hemólisis en agar sangre:

a) En un plato agar sangre, siembre colonias de Streptococcus.

b) Incube los platos inoculados o sembrados a 37ºC por 24 horas

d) Después del período de incubación, observe las colonias que produjeron hemólisis y anote lo
observado: ________________________________________________________________

Ej. Strept. pneumoniae Ej. Strept. pyogenes

Strept. agalactiae

3) Tinción de Gram: Este procedimiento esta descrito en la guía del laboratorio No. 2.

Staphylococcus Streptococcus

4) Prueba de la catalasa: (Su principio está escrito anteriormente)

a) En un portaobjeto coloque 1 ò 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%

b) Con un asa bacteriológica o un palillo, tome una porción de las colonias crecidas en el medio de
cultivo (Streptococcus)
c) Homogenice, si no hay liberación de gas, nos indica que estamos en presencia de Streptococcus.
d) Anote los resultados: _________________________________________________________
5) Prueba de la Bacitracina: Los microorganismos son inhibidos por concentraciones bajas de
Bacitracina en discos de papel sobre el medio de cultivo (forman un halo alrededor del disco de la
Bacitracina).
a) En un plato de agar sangre de carnero al 5% sembrar colonias de Streptococcus pyogenes
(Streptococcus  hemolítico del grupo A)
b) Colocar un disco de Bacitracina al 0.04 microgramos, presionar suavemente con una pinza
estéril, para que el disco se adhiera a la superficie del agar.
c) Incubar los platos a 37ºC durante 24 horas
d) Observe lo ocurrido y anote los resultados: _________________________________________

6 Prueba de Optoquina: Su principio se basa en que el etilhidroxicupreina (Optoquina) un derivado

de la quinina que inhibe el crecimiento de Streptococcus pneumoniae (Streptococcus alfa hemolítico).
La Optoquina es soluble en agua y difunde con rapidez en el medio de agar. Las colonias de
S.peumoniae son lisados debido a cambios en la tensión superficial produciendo una zona de
inhibición de crecimiento (halo alrededor de la Optoquina).
a) Con un asa seleccione 3-4 colonias de Streptococcus pneumoniae y siembre un área de 3 cms
de diámetro en medio de agar sangre carnero al 5%
b) Colocar un disco de Optoquina en el tercio superior del área sembrada, presionar suavemente
con una pinza estéril, para que el disco se adhiera a la superficie del agar sangre
c) Incubar a 37ºC durante 24 horas

e) Anotar los resultados obtenidos: _________________________________________________

7. Prueba de CAMP- Test: Su principio se basa en que los Streptococcus β hemolítico del grupo B
(Streptococcus agalactiae) producen un factor llamado CAMP (factor de

monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por la hemolisina del
Staphylococcus aureus, el que se observa en forma de flecha producto de la sinergia de ambas
hemolisis.

a) En un plato de agar sangre de carnero o humano al 5%, siembre en línea perpendicular una
asada de microorganismos en estudio (Streptococcus del grupo B) y de forma horizontal a la
anterior sembrar Staphylococcus aureus. Las dos líneas de siembra no deben tocarse (ver figura

siguiente)

Camp (-) Camp (+)

En la zona de intersección del factor CAMP (producto de los Streptococcus del grupo B) y la beta
hemolisina (Staphylococcus aureus) se encuentra una zona en forma de punta de flecha de
hemólisis sinérgica.

b) Las placas inoculadas incúbelas por 24 horas a 37 grados centígrados en atmósfera ambiental,
pero no en ambiente anaerobio porque muchos Streptococcus del grupo A positivos en ausencia
de oxigeno no crecen.

c) Observe y anote los resultados: _____________________________________________

Para mayor comprensión de este laboratorio, se elaboró el siguiente flujograma de Pruebas

Diagnósticas:

MUESTRAS

CULTIVOS

Agar Sangre de Carnero

Colonias planas lisas, convexas de Colonias translúcidas pequeñas

color blanco o amarillo, opacas de 3 parecidas a perlas, con un tamaño de
a 7 mm de tamaño, con hemólisis 0.5 a 1 mm, con hemólisis tipo alfa,
tipo beta. beta y gamma.

TINCIÓN DE GRAM

CATALASA

POSITIVA NEGATIVO

Coagulasa

Bacitracina Optoquina CAM test

POSITIVAA NEGATIVA

S. aureus S.epidermidis S. pyogenes S. pneumoniae S. agalactiae

S. saprophyticus
V. EVALUACIÓN:

La evaluación de este laboratorio se realizará de la siguiente manera:

Prueba corta de entrada : 50 puntos

Desarrollo del laboratorio : 50 puntos

Total : 100 puntos

VI. BIBLIOGRAFÍA:

• Brooks, G.C, Butel, J, Morse, S, Mietzner, T. (2011). Microbiología médica de Jawetz,

Melnick y Adelberg. 25ª Edición. Mc Graw Hill LANGE.
• Koneman, E y col. (2008). Diagnóstico Microbiológico: texto y atlas en color. 6ta edición.
Editorial Panamericana. México.
• Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica: fundamentos y guía práctica.2a
Edición. Editorial Médica Panamericana S.A.
• Murray P, Rosenthal KS, Pfaller, M.A.(2017). Microbiología Médica. 8va edición. Editorial
MOSBY, Madrid, España