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Università degli Studi di Napoli

Federico II
Facoltà di Scienze MM.FF.NN.
A.A. 1997-1998

Tesi di Laurea in Fisica

Alterazioni molecolari indotte


da radiazioni sparsamente
ionizzanti: studi sperimentali
e teorici

Relatore: candidato:
Prof. Gianfranco Grossi Massimo Pinto
matricola: 07/6074
Correlatore:
Dr. Maurizio Conti
A Renata,
per avere creduto in me,
ed alla mia famiglia,
che mi ha sostenuto
in questi anni.
Indice

Indice

Introduzione 1

1 La radiazione ed il danno biologico 3


1.1 Aspetti generali e definizioni fondamentali . . . . . . . . . . . 3
1.2 Radiazione Elettromagnetica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.1 fotoni 60 Co-γ e raggi X da 240 kVp . . . . . . . . . . . 7
1.3 Particelle cariche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.1 Elettroni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4 Il danno biologico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2 Materiali e Metodi 22
2.1 Colture cellulari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2 Dosimetria ed irraggiamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.1 Fotoni X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.2 Fotoni γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3 Riparo di dsb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4 Isolamento del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) . . . . . . . . . . . . 29

3 Modelli matematici 39
3.1 Induzione di dsb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.1.1 modello Distribution shape . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.1.2 Broken stick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1.3 Background biased broken stick . . . . . . . . . . . . . 47
3.1.4 Conclusioni sui modelli matematici . . . . . . . . . . . 57

4 Esperimenti ed analisi dati 58


4.1 Calibrazioni in peso molecolare . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.2 Induzione di dsb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.2.1 Fotoni X e γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.3 Riparazione di dsb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

5 Risultati e loro discussione 82


5.1 Confronto con risultati di altri lavori . . . . . . . . . . . . . . 88

A Approssimazione n(M) · M · ∆M 90

B Dosimetria di Fricke 95
B.1 La soluzione di Fricke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

C Prodotti Chimici 99

Ringraziamenti 101

i
Introduzione

Gli effetti biologici della radiazione ionizzante sono legati al danno moleco-
lare sulle cellule, in particolare al danno sul DNA. Tra i vari tipi di danno che
il materiale ereditario può subire, la rottura della doppia elica (double strand
break, dsb) risulta di particolare interesse in biofisica delle radiazioni. Infatti,
dal momento che tale rottura può comportare un’interruzione nelle sequenze
in codice del DNA, il ”testo per la vita” della cellula, essa può rappresentare
la più seria minaccia alla sopravvivenza cellulare. La cellula dispone di mec-
canismi di riparazione di dsb, e solo se il riparo avviene in maniera errata,
oppure non avviene affatto, possono esserci conseguenze biologiche.
Non tutti i tipi di radiazione hanno la stessa efficacia biologica. In partico-
lare non tutte inducono, a parità di energia trasferita nella materia biologica,
lo stesso numero di dsb, per cui si trova in generale che la radiazione sparsa-
mente ionizzante (fotoni) è meno efficace di quella densamente ionizzante
(particelle). Per confrontare le radiazioni di diversa qualità, la capacità di
una data radiazione di indurre dsb è relazionata a quella di una radiazione di
riferimento, tipicamente i fotoni γ da decadimento di 60 Co. Tuttavia, alcuni
recenti esperimenti hanno mostrato che, anche nell’ambito delle radiazioni
sparsamente ionizzanti, esiste una diversa efficacia nell’induzione di alcuni
tipi di danno biologico. Questo implica che non è del tutto lecito considerare
i fotoni γ da decadimento di 60 Co come rappresentativi di tutte le radiazioni
sparsamente ionizzanti, e quindi riferirsi a tale tipo di radiazione per valutare
l’efficacia biologica di quelle di altre qualità.
In questo lavoro è stata confrontata la capacità di indurre dsb sul DNA di
fotoni γ da decadimento di 60 Co e fotoni X prodotti a 240 kV, studiando anche
la riparazione dei dsb radioindotti. Inoltre, è stata studiata l’induzione e la
riparazione dei dsb che vengono generati sul DNA a causa della manipolazione
delle cellule durante un esperimento, confrontando questo tipo di dsb con
quelli radioindotti.
Gli esperimenti sono stati condotti presso il Gray Laboratory Cancer Re-
search Trust in Inghilterra, utilizzando la tecnica dell’elettroforesi in campo
elettrico pulsato. Con tale tecnica si ottiene una distribuzione in peso moleco-

1
Introduzione 2

lare dei frammenti originati dai dsb radioindotti sul DNA, con una sensibilità
al momento ineguagliabile da altre tecniche.
L’analisi dei dati è stata effettuata con l’ausilio di modelli matematici
che consentono di quantificare il numero di dsb radiondotti, a partire dalla
distribuzione di peso molecolare di DNA. In un primo momento, sono stati
utilizzati due dei modelli già disponibili in letteratura, che richiedono una
correzione dei dati sperimentali per il danno di fondo introdotto durante
l’esperimento. Questa operazione di correzione è stata poi criticamente anal-
izzata, sottolineandone i limiti, ed in una seconda fase è stato sviluppato un
nuovo modello matematico, originale, che utilizza l’informazione disponibile
sul danno di fondo al DNA per l’analisi dei dati sperimentali.
Gli esperimenti di induzione di dsb, oltre che a fornire una misura del
numero di dsb radiondotti, consentono di sviluppare modelli al calcolatore
di interazione della radiazione con la materia biologica, per cui l’affidabilità
delle misure sperimentali è di enorme importanza. I risultati ottenuti con il
nuovo modello, cosı̀ come quelli ricavati dall’analisi effettuata con i modelli
tradizionali, sono consistenti con quelli di altri lavori pubblicati nella letter-
atura scientifica, ma il nuovo modello matematico consente anche di gettare
luce su un argomento di rilevanza centrale nella radiobiologia dell’ultimo
decennio:

”È il danno indotto dalla radiazione stocastico, oppure il ver-


ificarsi di un evento di dsb in un certo punto del DNA è correlato
con un altro evento vicino, originato dal passaggio di una stessa
particella?”

Entro i limiti di risoluzione sperimentale raggiunta in questo lavoro di


tesi, non è stata osservata alcuna differenza significativa tra le due radiazioni
utilizzate, quanto alla loro capacità di indurre dsb.
Capitolo 1

La radiazione ed il danno
biologico

1.1 Aspetti generali e definizioni fondamen-


tali
Dal punto di vista della deposizione di energia nella materia, l’azione della
radiazione ionizzante1 ha due caratteristiche fondamentali:

1. la stocasticità

2. la localizzazione

La prima proprietà della deposizione di energia implica l’uso di approcci


di tipo probabilistico per la sua descrizione. Da un punto di vista macro-
scopico, si utilizza il concetto di Dose per quantificare l’energia depositata in
un materiale. La Dose è definita come il valore medio dell’energia depositata
per unità di massa:

!Eabs "
D= (1.1)
∆M
e l’uso del valore medio sottolinea la casualità degli eventi.
In microdosimetria, ramo della ricerca sulle radiazioni che studia proprio
gli effetti stocastici della deposizione di energia in un materiale, il concetto di
Dose è sostituito dall’energia specifica z, definita come rapporto tra l’energia
1
La radiazione che deposita energia in un mezzo, in seguito a ionizzazione delle molecole
di cui questo è costituito

3
1.1 Aspetti generali e definizioni fondamentali 4

dE e la massa dm di un volume elementare in cui essa viene rilasciata. Il suo


valore d’aspettazione è proprio la Dose.
Dire che le deposizioni di energia sono locali significa che la radiazione
non rilascia energia in modo uniforme nel materiale che attraversa. Invece,
grandi quantità di energia sono depositate in piccoli volumi, in un modo che
è strettamente dipendente dalla qualità della radiazione, la quale definisce
la sua struttura di traccia nella materia. Per classificare la radiazione in
base alla deposizione di energia per unità di percorso, e quindi in base alla
località della deposizione di energia, si introduce il concetto di LET (Linear
Energy Transfer ), definito come la quantità di energia che viene depositata
localmente nel materiale al passaggio di una particella carica(2 ), per unità di
lunghezza:
!
dE !!
LET = (1.2)
dx !local
L’attributo “localmente” è di particolare importanza dal punto di vista
della deposizione di energia nel materiale. Sebbene la particella perda una
certa energia ∆E in un evento di collisione, parte di questa energia viene
trasportata lontano dal punto dove è avvenuto l’evento primario, per mezzo
di particelle secondarie (figura 1.1). In genere si considera locale una depo-
sizione di energia di 100 eV, corrispondente ad un range di elettroni di 5
nm, ed il LET si scrive LET100 . Se si rilassa la restrizione sulla località della
deposizione, il LET∞ diviene numericamente pari allo stopping power della
radiazione (si rinvia a pagina 8) anche se le due grandezze sono diverse da
un punto di vista concettuale.
Dal punto di vista della deposizione lineare (struttura di traccia), è d’uso
distinguere tra radiazione sparsamente e densamente ionizzante (o di basso
ed alto LET). Nella prima classe cade la radiazione elettromagnetica e gli
elettroni di alte energie, mentre la seconda categoria è essenzialmente costi-
tuita da protoni e ioni pesanti, nonché dai neutroni. Tuttavia è bene notare
che non sempre è possibile, dato un certo tipo di radiazione, attribuirlo senza
esitazione all’una o all’altra categoria.
In questo lavoro è stata utilizzata esclusivamente radiazione sparsamente
ionizzante, precisamente radiazione elettromagnetica: fotoni 60 Co-γ e raggi
X prodotti a 240 kV.
Prima di discutere del danno biologico che questi tipi di radiazione pos-
sono provocare, nei paragrafi 1.2 e 1.3 verranno caratterizzate, in particolare,
le radiazioni utilizzate in questo lavoro. Tralasciando i neutroni e le parti-
celle cariche pesanti, radiazioni che non sono qui mai state utilizzate, si dis-
2
il LET può essere definito in maniera rigorosa solo per le particelle cariche.
1.2 Radiazione Elettromagnetica 5

Figura 1.1: La località della deposizione di energia della radiazione nella ma-
teria (Kiefer 1990). Nell’elemento di massa simboleggiato con il rettangolo,
l’energia depositata ∆E è solo una frazione di quella persa dalle particelle di
energia iniziale E.

cuterà delle radiazioni elettromagnetiche di medie energie e dell’interazione


Coulombiana tra particelle cariche.
Come caso speciale, verrà discussa l’interazione della radiazione con la
materia biologica (paragrafo 1.4 ), definendo un altro concetto fondamentale
in biofisica delle radiazioni: l’RBE.

1.2 Radiazione Elettromagnetica


La radiazione elettromagnetica è indirettamente ionizzante, cioè provoca ion-
izzazioni ed eccitazioni per via degli elettroni che essa stessa libera nella
materia, secondo tre processi principali:

1. effetto fotoelettrico

2. diffusione Compton

3. produzione di una coppia elettrone-positrone

l’effetto fotoelettrico consiste nell’emissione di un elettrone atomico a se-


guito dell’assorbimento di un quanto di energia hν. L’elettrone viene emesso
con energia cinetica:

Te = hν − BE
1.2 Radiazione Elettromagnetica 6

dove BE è l’energia di legame (Binding Energy) dell’elettrone. La quan-


tità di moto si conserva in seguito al rinculo del nucleo.
La sezione d’urto atomica per l’effetto fotoelettrico puo’ essere scritta in
una versione approssimata (Kiefer 1990) come:

Z4
σAphoto $ (1.3)
(hν)3
dove con Z si è indicato il numero atomico dell’elemento bersaglio. L’aspet-
to più interessante dell’espressione 1.3 è la dipendenza inversa dall’energia.
Nella diffusione Compton, il fotone è di energia molto superiore a quella di
legame degli elettroni atomici. Per questo motivo, nell’analisi del fenomeno
si considera l’elettrone in uno stato non legato e affinché il momento della
quantità di moto totale sia conservato, non è possibile avere uno stadio finale
in cui ci sia un elettrone libero, senza un fotone (il quale ha energia inferiore,
rispetto al fotone iniziale). La conservazione dell’energia e del momento
impongono relazioni tra l’energia dell’elettrone libero e del fotone, oltre che
l’angolo compreso tra le loro traiettorie.
L’espressione della sezione d’urto per l’effetto Compton è piuttosto com-
plessa (Kiefer 1990):
" " # #
Compton 2 1 + α 2 (1 + α) ln(1 + 2α) ln(1 + 2α) 1 + 3α
σe = 2π·r0 − + −
α2 1 + 2α α 2α (1 + 2α)2

dove α = hν/me0 c2 ed r0 è il raggio classico di Bohr. Verranno qui solo


considerati gli aspetti generali della sezione d’urto scritta sopra, con l’aiuto
della figura 1.2, che mostra la sezione d’urto atomica per l’effetto Compton
σACompton = Z · σeCompton a confronto con quelle per gli altri due meccanismi
di interazione citati.
Per fotoni di basse energie, tipicamente dell’ordine dei keV o poche decine,
domina l’effetto fotoelettrico, poiché la sezione d’urto per l’effetto Compton
è molto inferiore. Superati circa 100 keV si può vedere dalla figura 1.2 che i
fotoni interagiscono quasi solo per diffusione Compton, essendo la loro energia
troppo alta per produrre fotoelettroni. Ciò è ancor più vero nell’ambiente
cellulare, costituito da elementi di numero atomico relativamente basso (si
veda la dipendenza da Z nell’espressione 1.3).
Il meccanismo di diffusione Compton domina l’interazione dei fotoni con
la materia fino ad un valore di soglia (1.022MeV=2m0 c2 ), oltre il quale l’en-
ergia del fotone è sufficientemente elevata per creare una coppia positrone-
elettrone. Il fenomeno può avvenire solo nei pressi del campo elettromagneti-
co di un nucleo, per la conservazione della quantità di moto totale. L’energia
1.2 Radiazione Elettromagnetica 7

Figura 1.2: Sezioni d’urto per i processi di interazione dei fotoni con la
materia. Tratto da (Hine and Brownell 1956)

del fotone che eccede il valore di soglia, viene divisa tra le due particelle
generate, secondo la relazione:

hν − 1.022MeV = Te− + Te+

valida solo se hν ≥1.022MeV.


La sezione d’urto per la produzione di coppia è proporzionale all’energia
del fotone, cosı̀ che a qualche decina di Mev il meccanismo è in competizione
con la diffusione Compton, come si vede dalla figura 1.2

60
1.2.1 fotoni Co-γ e raggi X da 240 kVp
È interessante osservare dove si collocano nel diagramma in figura 1.2 i fotoni
240 kVp X e 60 Co-γ.
I raggi X da 240 kVp sono prodotti per Bremsstrahlung di elettroni ac-
celerati in un potenziale elettrico di 240 kV. Lo spettro in energia di questi
fotoni è continuo e termina a 240 keV. Esso possiede anche una componente
discreta, in corrispondenza dei livelli elettronici del materiale di cui è costi-
tuito l’anodo. Queste righe spettrali di energia più bassa, corrispondenti ai
raggi X così detti “soffici” per distinguerli da quelli “duri” di più alta energia,
vengono però attenuate con l’ausilio di filtri, costituiti essi stessi da materiali
metallici.
1.3 Particelle cariche 8

I fotoni γ sono prodotti dal decadimento del 60 Co a 60 Ni, ad energie di 1.17


e 1.33 MeV, sufficienti per creare una coppia elettrone positrone, anche se
con probabilità inferiore, se confrontata con quella per la diffusione Compton
(figura 1.2).
Mentre gli elettroni liberati dai fotoni gamma hanno energia dell’ordine
del Mev, quelli liberati per effetto fotoelettrico e Compton dai fotoni hanno
un limite superiore di energia pari a 240 keV. Questa differenza può essere il
punto di partenza per la ricerca di una diversa efficacia biologica delle due
radiazioni. Invero, a seconda dell’energia dei fotoni, solo uno o al più due dei
processi citati saranno responsabili del trasferimento di energia nella materia,
e ne risulterà un certo spettro di energie elettroniche. Infine, questo spettro
determinerà il danno iniziale al DNA, secondo i processi descritti al paragrafo
1.4

1.3 Particelle cariche


Anche se la particelle cariche non sono state utilizzate in questo lavoro, la
radiazione elettromagnetica trasferisce energia in un mezzo tramite gli elet-
troni che ivi libera, secondo i tre processi citati al paragrafo 1.2.1. È impor-
tante quindi descrivere il processo di interazione delle particelle cariche con
la materia, soffermandosi sugli elettroni in particolare.
Una particella carica non rilascia tutta la sua energia in un singolo atto
elementare, come accade per la radiazione elettromagnetica. Essa interagisce
per forza Coulombiana con gli elettroni di shell(3 ) delle molecole e degli ato-
mi del mezzo in cui transita, depositando piccole frazioni della loro energia
totale. Tali deposizioni vengono utilizzate per ionizzare o per eccitare livelli
elettronici delle molecole colpite, e vengono descritte abbastanza accurata-
mente in termini di stopping power di una data radiazione in quel mezzo.
Durante questa interazione, l’energia della particella è attenuata, e la par-
ticella subisce una deviazione dalla sua traiettoria originaria. Quest’ultimo
processo è particolarmente rilevante nel caso degli elettroni, essendo la loro
massa a riposo uguale a quella delle particelle con cui interagiscono (elettroni
di shell).
Un’analisi quanto-meccanica dell’interazione Coulombiana tra uno ione e
le molecole di un certo materiale conduce alla ben nota formula di Bethe-
Bloch per lo stopping power, qui riportata in una forma approssimata:
3
Non verrà considerato lo scattering nel campo del nucleo, poiché questo fenomeno
avviene ad energie molto più elevate degli elettroni che vengono liberati dalla radiazione
elettromagnetica utilizzata in questo lavoro.
1.3 Particelle cariche 9

dT ∼ Z ∗2
− =K 2 (1.4)
dx β
dove Z ∗ è la carica effettiva dello ione, non esattamente pari alla sua
carica elettrica netta perché questa quantità considera effetti relativistici,
olte al fatto che alle basse velocità lo ione cattura elettroni liberi nel mezzo
circostante, e la sua carica iniziale viene diminuita; β è v/c, dove v è la
velocità dello ione e c quella della luce; K è una costante dimensionale. Una
forma alternativa della (1.4) può essere scritta come:

dT ∼ mZ ∗2
− =K (1.5)
dx T
che mette in risalto la massa dello ione m. Quanto minore è la velocità,
tanto più alto è lo stopping power, fino a che Z ∗2 tende a zero più rapidamente
di β 2 , e lo stopping power scende a zero. La curva deve quindi passare per
un valore di massimo, il picco di Bragg, che si trova nei pressi della fine della
traccia della particella.

1.3.1 Elettroni
Nel caso degli elettroni, non è possibile prescindere dagli effetti relativistici
nella derivazione di una formula per lo stopping power. Ne risulta un’e-
spressione molto più complessa, anche se si ha sempre la dipendenza 1/β 2.
Le proprietà della struttura di traccia degli elettroni verranno discusse tra
breve.
Oltre che all’interazione coulombiana, è interessante notare che gli elet-
troni possono rilasciare energia anche attraverso Bremsstrahlung (produzione
di raggi X da frenamento in un campo elettrico) e radiazione Čerenkov. Il
contributo del primo meccanismo aumenta con l’energia degli elettroni e con
il numero atomico del mezzo. Per elettroni di energia fino a 1MeV in ambi-
ente cellulare, dove il numero atomico Z è relativamente piccolo, il contributo
del Bremsstrhalung alla Dose totale è però trascurabile.
La radiazione Čerenkov viene emessa da particelle che viaggiano ad una
velocità superiore a quella che ha la luce nello stesso materiale. Se la ra-
diazione Čerenkov è ultravioletta, ne può conseguire un danno addizionale
al DNA che è tipico dei raggi UV. Questo tuttavia non è particolarmente
rilevante in questo lavoro, in quanto l’energia degli UV è inferiore a 3 eV, per
cui essi non possono indurre dsb, dato che, come verrà detto al paragrafo 1.4,
l’energia necessaria per creare un dsb è molto più elevata. Per elettroni in
acqua si ricava che l’energia delle particelle necessaria a superare la velocità
1.3 Particelle cariche 10

della luce deve essere almeno 500 keV, quindi il processo può avvenire con
fotoni 60 Co-γ ma non con raggi X da 240kVp.
In definitiva, gli elettroni liberati da entrambi i raggi X 240 kVp ed i
fotoni γ da decadimento di 60 Co, interagiscono con la materia principal-
mente attaverso scattering coulombiano con gli elettroni di shell molecolare
del materiale attraversato.
Dato che il rilascio di energia portata dalla radiazione elettromagnetica
è mediato dagli elettroni, è dunque nelle energie degli elettroni che occorre
soffermare l’attenzione, al fine di comprendere quali siano le origini del danno
biologico di radiazioni sparsamente ionizzanti. Brevemente, verranno eviden-
ziate le possibili differenze nelle strutture di traccia, al variare dell’energia
degli elettroni.
L’illustrazione 1.3 mostra la distribuzione di modalità degli eventi di de-
posizione, al variare dell’energia degli elettroni. Essa suggerisce che elettroni
di pochi keV rilascino tutta la loro energia in un breve percorso, producendo
tracce brevi (short track). Dal lato opposto, cioè alle alte energie, essi sono
caratterizzati da un basso valore del LET, cosı̀ che gli eventi di deposizione
sono più isolati e sparsamente distribuiti, con una probabilità significativa di
liberare ulteriori elettroni con energie sufficientemente elevate da avere loro
stessi una traccia sparsamente ionizzante. Questi elettroni veloci secondari
vengono chiamati elettroni δ, o raggi δ, e le tracce che essi lasciano ven-
gono chiamate isolated spurs (letteralmente: impulsi isolati) come mostrato
in figura 1.3.
Deposizioni di energia intermedie liberano elettroni di velocità più limi-
tata, non sufficientemente alta da sfuggire al campo elettrico dello ione che
hanno lasciato. Questi elettroni generano un’alta densità di ionizzazione
intorno alla regione in cui sono stati liberati, innalzando la concentrazione
di radicali liberi. Tali aree sono dette isolated blobs (chiazze isolate), per
distinguerle dalle normali spurs.
In seguito a ciò che è stato detto sugli elettroni δ, quanto più la radiazione
è sparsamente ionizzante, tanto meno frequenti sono le blobs, cosı̀ che la
struttura di traccia somiglia sempre di più a quella degli impulsi isolati da
cui partono le tracce secondarie.
Per i fotoni 60 Co-γ e raggi X da 240 kVp, lo spettro delle energie elettron-
iche iniziali è piuttosto complesso, e ciò rende difficile identificare possibili
differenze nelle loro strutture di traccia. Si può tuttavia dire che gli elet-
troni Compton di energia circa pari ad 1 MeV, esclusivi dei fotoni 60 Co-γ,
possono contribuire ad un eccesso di spurs isolate, in confronto agli elettroni
generati dai fotoni X, di energia massima pari a 240 keV. Questa differenza
potrebbe essere responsabile di una diversa efficacia biologica delle due ra-
1.4 Il danno biologico 11

diazioni elettromagnetiche, in quanto la localizzazione di energia è correlata


alla probabilità di indurre danno biologico.

Figura 1.3: Frazione di spurs, blobs e short tracks in funzione dell’energia


degli elettroni. Da (Mozumder and Magee 1966)

1.4 Il danno biologico


Cosa succede se la radiazione colpisce la materia biologica, ovvero le cel-
lule? In generale, solo se è il DNA ad essere colpito dalla radiazione si hanno
effetti biologici, essendo gli altri componenti cellulari molto meno sensibili.
Nelle sequenze in codice del DNA è scritto tutto ciò che la cellula deve pro-
durre per svolgere le sue normali attività: non solo il piano per la divisione
cellulare, ma anche l’informazione per sintetizzare proteine che possono avere
ruoli fondamentali nella vita di un organismo. L’effetto biologico più studiato
è sicuramente quello della mortalità cellulare. Da questo tipo di esperimenti,
tuttavia, non si può risalire al tipo di danno biologico che l’ha determinata.
L’acido desossiribonucleico (DNA) è un polimero, le cui unità, i nucleotidi,
sono composti da uno zucchero (il desossiribosio) un gruppo fosfato carico
(PO4 )− ed una di quattro basi azotate: adenina, guanina, timina, citosina
(figura 1.4).
La sua struttura tridimensionale è schematicamente illustrata in figura
1.5. I primi due elementi, zucchero e gruppi fosfato, polimerizzano formando
l’impalcatura elicoidale della macromolecola, la cui solidità è garantita dai
1.4 Il danno biologico 12

Figura 1.4: I nucleotidi: le unità che costituiscono il DNA. (A) Ciascun


nucleotide si distingue per una delle quattro basi azotate che sono legate al-
l’atomo di carbonio 1’ del desossiribosio. (B) Le quattro basi azotate possono
formare solo due coppie stabili: Adenina con Timina e Citosina con Guanina

legami covalenti tra l’atomo di carbonio 3’ dello zucchero di un’unità ed


un atomo di ossigeno del gruppo fosfato dell’unità adiacente, di energia di
legame pari a circa 80÷100 kcal/mole (figura 1.4). Le due eliche così formate
vengono tenute insieme per mezzo di legami deboli di tipo idrogeno (energia
di legame 6 kcal/mole) fra le basi azotate, le quali possono formare solo due
tipi di accoppiamento (regola di appaiamento della basi) come si vede in
figura 1.4.
Il passaggio di una particella può provocare danno sulla molecola di DNA
per azione diretta (40% circa dell’energia che viene usata per danneggia-
re il DNA), oppure indiretta (restante 60%). Nel primo processo, l’energia
trasportata da un elettrone viene direttamente depositata nel bersaglio bio-
logico, senza l’intervento di molecole radicali derivate dall’idrolisi dell’acqua
(figura 1.6). Le molecole maggiormente colpite sono le basi azotate, che non
portano a rottura della catena zuccherina. Nel processo di danneggiaman-
to indiretto, l’energia dell’elettrone viene spesa per idrolizzare le molecole
d’acqua circostanti il DNA, producendo specie chimiche come i radicali H•
ed OH• , o ioni come e− − +
aq (elettrone idrato), OH ed H . Di queste, le specie
• −
OH ed eaq sono le più reattive, con una costante di reazione con il DNA del-
l’ordine di 108 moli/s. Queste molecole possono essere subito neutralizzate
1.4 Il danno biologico 13

Figura 1.5: La struttura molecolare della doppia elica di DNA

nell’ambiente cellulare, per reazioni con altri ioni, oppure diffondere verso
il DNA e, nel caso del radicale OH• , reagire con un’atomo di idrogeno di
una base azotata o degli atomi di carbonio di un desossiribosio, in posizione
1’,2’,5’ e 4’ (figura 1.4, pannello A). Il prodotto è una molecola d’acqua e la
molecola con cui il radicale ha reagito viene lasciata in uno stato instabile.

OH • + DNA = H2 O + DNA•

La mobilità in ambiente acquoso della specie OH• è di circa 3.5 nm, per cui
il radicale deve essere prodotto nelle immediate vicinanze del DNA perché
possa provocare danno biologico. Tuttavia non è ancora del tutto chiaro se
un radicale che attacca una delle due eliche può indurre un danno in una zona
vicina a quella d’interazione primaria, oppure la sua azione è strettamente
locale (Michael et al. 1995).
Quando l’energia viene depositata nel DNA, sia per effetto diretto che
indiretto, possono derivare diversi tipi di danno. Tra questi, i single strand
breaks (ssb) ed i double strand breaks (dsb) sono una seria minaccia all’in-
tegrità della molecola.
I ssb (figura 1.7) originano dall’idrolisi di un legame fosfodiesterico che
provoca la rottura di una delle due eliche. Esistono più siti di rottura in tale
legame, non tutti ugualmente sensibili. Si stima infatti che il 15% dei ssb
1.4 Il danno biologico 14

Figura 1.6: La radiazione può colpire il DNA secondo un meccanismo diretto


oppure tramite un meccanismo indiretto. Nel secondo caso l’azione è mediata
dall’idrolisi delle molecole d’acqua nelle zone circotsanti

siano dovuti a prelievo di atomo d’idrogeno (da radicali OH• ) in posizione


3’ oppure 5’, il 50% per sottrazione da entrambi gli atomi C(3’) e C(5’), ed
il restante 35% da C(1’) o C(2’) o C(4’). L’energia necessaria per provocare
un ssb è dell’ordine di 60÷180 eV. Fino a poco tempo fa era creduto che i
ssb fossero biologicamente significativi, ma è stato poi dimostrato che tale
tipo di danno è facilmente riparabile dalle cellule, rimuovendo il nucleotide
danneggiato e sostituendolo con uno nuovo, per via enzimatica.
I dsb sono ora considerati il danno più severo che il DNA può subire. Essi
sono originati da due ssb che si trovano a distanza inferiore a dieci coppie di
basi (figura 1.7); a distanze maggiori infatti, l’energia del numero di legami
idrogeno tra le basi azotate è sufficientemente alta da mantenere la molecola
nella struttura a doppia elica. I dsb possono originare da due ssb indotti
sia simultaneamente sul DNA, a seguito dello stesso evento di deposizione
di energia, che in seguito a due ssb originati da due eventi indipendenti. La
1.4 Il danno biologico 15

Figura 1.7: I single strand breaks ed i double strand breaks, mostrati insieme
ad altri tipi di danno che la radiazione può indurre sul DNA

figura 1.8 illustra questi due casi, oltre ad un caso in cui il dsb è originato da
due ssb nei legami tra nucleotidi di basi complementari (dsb diretto).
Tutti i tre esempi descritti nella figura 1.8 si riferiscono sia ad eventi
di deposizione di energia diretti che mediati da specie chimiche originate da
radiolisi dell’acqua. L’energia che deve essere necessariamente depositata per
produrre un dsb è 1000÷1800 eV, molto più alta quindi di quella sufficiente
alla creazione di un ssb.
A differenza dai ssb, i dsb sono un danno biologicamente molto più sig-
nificativo, dal momento che il processo enzimatico per la loro riparazione è
soggetto ad errori che possono provocare effetti più o meno gravi alle cellule
in cui il danno persiste.
È consueto distinguere le fasi temporali dell’azione della radiazione in tre
categorie:
stadio fisico e fisico-chimico
comprende fenomeni che avvengono tra 10−18 e 10−12 secondi dal transito
della particella, nel corso dei quali la radiazione interagisce con le molecole
1.4 Il danno biologico 16

Figura 1.8: L’origine dei dsb: per cooperazione di due ssb simultaneamente
indotti, per produzione diretta, o per interazione di ssb indipendenti.

presenti nella regione attraversata, secondo le modalità espresse ai para-


grafi 1.2 e 1.3. Le molecole colpite dalla radiazione si trovano in uno stato
eccitato/ionizzato.
stadio chimico
tra 10−12 e 103 secondi dall’evento primario, teatro di reazioni tra rad-
icali vicini, migrazione verso tratti di DNA adiacenti e di prime reazioni
biochimiche, quali rotture del DNA e danneggiamento di basi azotate.
stadio biologico
da 103 a 108 secondi, durante i quali il danno al DNA può essere riparato
o ‘fissato’. Se il danno persiste, l’effetto della radiazione può manifestarsi per
lunghi tempi, per esempio con alterazioni cellulari che possono dare origine
a tumore.
Dato che i dsb sono reputati i maggiori responsabili della morte cellulare,
1.4 Il danno biologico 17

si misura sperimenalmente il numero di dsb che un certo tipo di radiazione


può indurre sul DNA. Dopo una serie iniziali di esperimenti condotti negli
anni settanta, è stato sempre trovato sperimentalmente che il numero di
dsb indotti dalla radiazione cresce linearmente con la Dose (Erixon and
Cedervall 1995, Löbrich et al. 1994b, Löbrich et al. 1996, Newman et al.
1997, Lehmann and Ormerod 1970a, Löbrich et al. 1994a). Questo significa
che un evento di deposizione presso il DNA è sufficiente a creare un dsb. Di
conseguenza, la capacità di una data radiazione di indurre dsb viene espressa
in dsb/(Gy·bp).
Per motivi che saranno illustrati tra breve, non tutti i tipi di radiazione
hanno la stessa capacità di indurre dsb, sia dal punto di vista quantitativo,
che anche dal punto di vista qualitativo. Per confrontare l’efficacia di di-
verse radiazioni nell’indurre un certo tipo di danno, non soltanto i dsb, in
biofisica delle radiazioni si utilizza il concetto di RBE (Relative Biological
Effectiveness). Come dice il nome stesso, L’RBE è un parametro che mette
a confronto due tipi di radiazione, una delle quali fa da riferimento. Esso è
definito come il rapporto tra la dose che occorre irraggiare con tale radiazione
di riferimento e quella della radiazione di test, per provocare lo stesso effetto.
!
Drif !!
RBE = (1.6)
Dtest !isoef f ect
Se il tipo di danno studiato è linearmente correlato con la Dose, il val-
ore dell’RBE di una cert radiazione è univocamente definito. Se però la
dipendenza lineare crolla (come nel caso della sopravvivenza cellulare) l’RBE
dipenderà dalla dose.
Il motivo per cui le radiazioni hanno diverse capacità di indurre danno
sulle cellule risiede nella localizzazione delle deposizioni di energia (figura
1.9).
Limitandosi ad una descrizione dell’origine dei dsb, è stato trovato che
questi vengono indotti, per la radiazione sparsamente ionizzante, principal-
mente dagli elettroni di fine traccia (track end), di energia pari a circa 5 keV
(Goodhead 1989). La maggior parte delle altre deposizioni, malgrado siano
sufficienti a ionizzare/eccitare le molecole dell’ambiente cellulare che attraver-
sano, sono biologicamente inefficaci, in quanto l’ambiente acquoso cellulare è
capace di neutralizzare facilmente radicali liberi e/o ioni ivi creati. Se però
la densità di ionizzazione nella traccia è molto alta, per esempio presso le
parti terminali, è più probabile che un radicale raggiunga il bersaglio biologi-
co prima di essere neutralizzato, causando il danno biologico iniziale. Per
quanto detto, le radiazioni sparsamente ionizzanti possono essere caratteriz-
zate, dal punto di vista della loro capacità di indurre dsb, in funzione della
1.4 Il danno biologico 18

Figura 1.9: La qualità della radiazione è legata alla localizzazione della


deposizione di energia. Sopra: radiazione sparsamente ionizzante; sotto:
radiazione densamente ionizzante

frazione di dose totale che esse depositano per mezzo di elettroni di fine trac-
cia. La frazione di energia depositata presso le parti terminali delle tracce
è, in ultimo, correlata con gli spettri di energia elettronica iniziale, deter-
minati dall’energia della radiazione elettromagnetica. Studi teorici (Nikjoo
et al. 1991) hanno riportato che, nel caso di radiazione sparsamente ioniz-
zante come i 60 Co-γ ed i raggi X ‘duri’, circa il 30% della Dose totale viene
depositata dagli elettroni di basse energie (∼1keV) che sono originati nelle
parti terminali delle tracce delle particelle secondarie. La maggiore efficacia
biologica degli elettroni di fine traccia è stata confermata da studi sperimen-
tali, nei quali si è fatto uso di raggi X ‘ultrasoffici’ (Botchway et al. 1997).
Questi fotoni liberano elettroni nella materia esclusivamente per effetto fo-
toelettrico, ad energie ben definite, che rappresentano proprio gli elettroni di
track end di cui sopra. I risultati del lavoro di Botchway et al. indicano che
i raggi X ultrasoffici sono più efficaci ad indurre dsb.
I raggi X duri ed i fotoni 60 Co-γ vengono spesso utilizzati senza distinzione
come radiazione di riferimento per l’espressione dello RBE di radiazioni di
altre qualità per la radiosensibilità cellulare, ovvero per esperimenti di so-
1.4 Il danno biologico 19

pravvivenza. Tuttavia, alcuni esperimenti condotti a partire dalla metà degli


anni settanta hanno mostrato che, nel caso della radiazione sparsamente ion-
izzante, i valori di RBE riferiti ai fotoni 60 Co-γ non erano sempre pari ad uno,
suggerendo che l’appellativo di sparsamente ionizzante individua una classe
ampia di radiazioni. Come prima accennato, l’RBE per la sopravvivenza
cellulare può variare molto con la Dose, ed in particolare fu riscontrato alle
basse dosi un aumento significativo, per molte radiazioni di basso LET. Una
discussione dettagliata sulla RBE dei raggi X da 250 kVp e da 55 kVp per
la sopravvivenza (relativamente ai 60 Co-γ) insieme ad una rivisitazione di
lavori simili, può essere trovata nel lavoro di Spadinger e Palcic (Spadinger
and Palcic 1992). Un altra indicazione sulla non equivalenza nel danno al
DNA indotto dai raggi X da 240 kVp ed i fotoni 60 Co-γ viene dal lavoro
sull’induzione di cromosomi dicentrici eseguito da Du Frain (Frain et al.
1979).
Da quanto trovato sperimentalmente e detto sopra sulla rilevanza dello
spettro di energia elettronica nella determinazione del danno biologico in-
iziale, risulta evidente che la discussione sull’equivalenza del danno da 60 Co-
γ e raggi X da 240 kVp non è del tutto chiusa. Parte di questo lavoro è
stata perciò dedicata alla misura della loro capacità di indurre double strand
breaks.
Se è vero che radiazioni di diverse qualità possono indurre un numero vari-
abile di dsb per unità di dose, è anche vero che non esiste un sol tipo di dsb.
Radiazioni densamente ionizzanti possono provocare lesioni molto complesse,
non inducibili da quelle saprsamente ionizzanti , in corrispondenza di zone di
elevata densità di ionizzazione, molto più elevata che nelle track ends degli
elettroni secondari (figura 1.9). Come verrà discusso più avanti, non tutti i
dsb sono letali per le cellule, in quanto esse dispongono di sofisticati meccan-
ismi biochimici di riparazione. Tuttavia, tali sistemi non sono infallibili, e se
i dsb sono molto complessi il danno può non essere riparato oppure riparato
erroneamente, con conseguenze più o meno gravi sulla sopravvivenza della
cellula. Le tecniche sperimentali attualmente disponibili non consentono di
distinguere tra i diversi tipi di dsb. Qualche informazione può però essere
ricavata dai risultati degli esperimenti di riparazione del danno, alla ricer-
ca di dsb che vengono ricongiunti con maggior lentezza. Questi dovrebbero
indicare un tipo di danno più complesso, che richiede l’uso di adeguati mec-
canismi biochimici e tempi più lunghi per la loro rimozione. Anche questo
tipo di esperimenti è stato eseguito in questo lavoro, utilizzando raggi X da
240 kVp come agente induttore.
L’uso di radiazioni di diversa qualità può servire come ‘sonda’ per studiare
i livelli di complessità dei dsb tramite esperimenti di riparazione (Prise 1994).
Da quando sono disponibili tecniche sofisticate come l’elettroforesi in campo
1.4 Il danno biologico 20

pulsato, utilizzata in questo lavoro di tesi, è stato trovato che, mentre l’RBE
per la morte cellulare varia molto con il LET, non si trova lo stesso andamento
per l’RBE per l’induzione di dsb. Ciò suggerisce che non esiste una relazione
diretta tra numero di dsb inizialmente indotti e mortalità cellulare. Piuttosto,
alcuni esperimenti hanno evidenziato che tale correlazione è più marcata se si
considerano i dsb che non vengono riparati, piuttosto che quelli inizialmente
indotti (Dikomey et al. 1998).
La scoperta che le cellule possono riparare i dsb è stata una pietra miliare
della biologia molecolare. Dal momento che il DNA contiene un testo scritto
in codice sulla base del quale vengono sintetizzate tutte le proteine di cui
la cellula ha bisogno, una rottura della doppia elica può comportare una
interruzione nel ‘testo’. Riparare un dsb significa ricongiungere i frammenti
di DNA in modo che venga ristabilita la sequenza di coppie di basi iniziale.

Figura 1.10: Una possibile via per il meccanismo di riparazione di dsb. (A)
tratto di DNA interrotto da un dsb. (B) escissione di parte delle sequenze
adiacenti il taglio che lasciano il DNA a singola elica. (C) ricombinazione con
il tratto di cromosoma omologo intatto. (D) nuova sintesi dei tratti a singola
elica, con l’ausilio del DNA intatto che funge da stampo. (E) rilassamento
della struttura di ricombinazione e termine dell’azione di riparazione.

Per compiere questa operazione in maniera fedele, il meccanismo enzi-


matico di riparazione legge la sequenza di nucleotidi intatta corrispondente
1.4 Il danno biologico 21

a quella danneggiata, sul cromosoma omologo, essendo ciascuna sequenza di


DNA scritta in duplice copia nel genoma. In seguito a scambi fisici tra le
regioni omologhe dei due cromosomi viene ristabilita la sequenza originaria.
Non esiste ancora un accordo per il meccanismo di riparazione dei dsb, una
possibile via è illustrata in figura 1.10. Dato un dsb in una certa regione
di DNA, la probabilità che la regione corrispondente sull’altro cromosoma
sia intatta (condizione necessaria affinché quest’ultima possa essere utilizza-
ta come modello durante la riparazione) diminuisce con la dose irraggiata.
Se il meccanismo enzimatico non riconosce una sequenza intatta a cui fare
riferimento, è molto probabile che il frammento rotto non venga riparato cor-
rettamente. Si parla perciò di errata riparazione in riferimento a tutti i casi
in cui la sequenza rotta del ‘testo’ non viene restituita nella sua forma orig-
inaria, come nel caso di inversioni di sequenze o perdita di coppie di basi, o
casi in cui le sequenze sono traslocate in altre regioni del cromosoma. D’altra
parte può capitare che il danno sia così complesso che il dsb non sia affat-
to riparato (persistenza del dsb). Tali eventi di errato riparo costituiscono
una seria minaccia alla sopravvivenza della cellula, dal momento che possono
impedire la produzione di proteine di ruolo fondamentale nello svolgimento
delle sue attività. Sono proprio questi dsb ‘fissati’ imputati come i maggiori
responsabili del danno biologicamente significativo.
Capitolo 2

Materiali e Metodi

2.1 Colture cellulari


Tutti gli esperimenti eseguiti in questo lavoro sono stati condotti utilizzando
fibroblasti umani primari, linea AG01522B. Le cellule sono state mantenute
in coltura facendole crescere in monostrati attaccati sul fondo di comuni
flasche da coltura cellulare. Il terreno di coltura deriva dalla modificazione
α del Eagle’s minimal essential medium (α MEM). Questo contiene un certo
numero di elementi nutritivi, tra i quali: glucosio, aminoacidi, vitamine e
precursori di DNA. Le cellule sono state fatte crescere in atmosfera di 5%
CO2 , che con l’aggiunta di NaHCO 3 nel terreno di coltura tampona il suo
pH a 7,4.
Per allestire un esperimento le cellule sono state portate in sospensione
dalle flasche di stock ed incubate in flasche da 75 cm2 . Per ottenere una
sospensione cellulare, a partire da una coltura monostrato, dopo avere tolto
il terreno di coltura, le cellule sono state lavate con abbondante PBS a 37◦ C
prima di un trattamento con di Tripsina/EDTA a 37◦ C. In questo processo,
a causa della rottura dei legami formati dalle proteine di membrana sul fondo
della flasca, le cellule si contraggono ed assumono una forma pressoché sferica,
per cui possono essere facilmente staccate dalla superficie in seguito ad una
lieve agitazione meccanica. Appena raggiunta una sospensione di cellule
singole, l’azione della tripsina è stata fermata con l’aggiunta di 20 ml di
αMEM, mantenuto a 37◦ C, il quale contiene proteine di siero che disattivano
la proteina. Si è prelevato in seguito un piccolo campione della sospensione
ottenuta, per misurare la concentrazione cellulare, operazione eseguita per
mezzo di un contatore di cellule elettronico.
Per potere misurare la distribuzione in peso molecolare del DNA genomi-
co, è necessario marcare radioattivamente il DNA con un isotopo che non

22
2.1 Colture cellulari 23

densità di piastramento (# cellule/cm2 ) 2·104


attività specifica (µCi/ml) 0.1
attività assorbita (dpm/cellula) 0.02-0.03

Tabella 2.1: Condizioni usate per la marcatura radioattiva del DNA

introduce ulteriore frammentazione a causa dell’energia rilasciata dal nucleo


che rincula durante il decadimento. Si è usato quindi il 14 C, che decade
emettendo un elettrone da 156 keV. L’isotopo è stato aggiunto al terreno di
coltura sotto forma di timidina sintetizzata con 14 C, nelle condizioni indicate
in tabella 2.1

Dopo aver marcato selettivamente il DNA, le cellule sono state trattate


in modo da rendere libero il DNA dal confinamento imposto dalle membrane
cellulari (sezione 2.4). Il DNA è poi stato risolto in peso molecolare con l’elet-
troforesi (paragrafo 2.5) ed è stata quantificata la massa di DNA distribuita
(sia a causa del deterioramento cellulare durante l’esperimento, che a causa
del danno radio-indotto) nelle diverse regioni di peso molecolare, misuran-
do il numero di disintegrazioni di atomi di 14 C. Quest’ultimo passo è stato
effettuato con l’uso di un contatore a scintillazione.
Nel corso del ciclo cellulare il DNA è associato con diverse proteine, in
modo che la doppia elica si trova a diversi gradi di avvolgimento.
Nelle fasi G1 e G2, esso si trova in una forma detta ‘fibra di cromatina da
30 nm’ (1 ). In metafase (M) questa struttura è resa ancora più compatta nei
cromosomi (fino a diventare visibile, si rimanda all’illustrazione 2.7), mentre
nel corso della sintesi (S) o durante eventuale riparo di DNA, la fibra da 30
nm è più rilassata per consentire accesso alle basi azotate, e la doppia elica
è associata a proteine necessarie per la sintesi o la riparazione.
L’efficacia della radiazione sarà diversa nei casi sopra elencati, perchè
il DNA a diversi livelli di avvolgimento ed associazione con proteine è più
o meno protetto dall’azione della radiazione. Se si irraggiano cellule sin-
cronizzate nel ciclo cellulare, il DNA sarà approssimativamente nella stessa
configurazione tridimensionale. Per la sincronizzazione, le cellule vengono
lasciate crescere fino alla confluenza spinta, quando l’inibizione da contatto
con quelle vicine arresta la crescita in fase G1 (95 % delle cellule presenti), la
fase post-divisione in cui, come appena detto, la doppia elica è compattata
nella forma di fibra di cromatina da 30 nm.
1
Ci sono vari modelli proposti per questa struttura, uno dei quali prevede una forma in
cui i nucleosomi, proteine strutturali su cui la doppia elica di DNA si avvolge, spiralizzano
e formano essi stessi un’elica.
2.1 Colture cellulari 24

Figura 2.1: ciclo cellulare

Del restante 5%, alcune sono in fase S. Ciò può causare un problema:
a causa della natura del processo di replicazione del materiale genetico, il
DNA in fase S è parzialmentente costituito da brevi sequenze a singola elica
(frammenti di Okazaki), connessi tramite sequenze a doppia elica. Con il
procedere della sintesi di nuovo DNA, i frammenti di Okazaki vengono con-
giunti in una lunga sequenza a doppia elica, lasciando sempre meno tratti a
singola elica. Questi tratti a singola elica sono più fragili di quelli a doppia
elica, ed è più facile che si rompano già nella preparazione delle cellule per
l’analisi del DNA, producendo un eccesso di corti frammenti marcati radioat-
tivamente. Questi influenzeranno la distribuzione in peso molecolare di DNA
post-irraggiamento, in quanto essa è ottenuta mediante conteggio di disinte-
grazioni di atomi di 14 C incorporati nel DNA. Tale inconveniente può essere
evitato se il terreno di coltura viene sostituito con uno analogo, non marcato
radioattivamente, un giorno prima dell’inizio dell’esperimento, tipicamente
tra 12 e 24 ore prima (periodo di cold chase). Durante questo tempo, i fram-
menti di Okazaki marcati verranno congiunti in lunghe sequenze a doppia
elica, e quelli di nuova formazione (che potrebbero essere sintetizzati dalla
esigua frazione di cellule che si trova in fase S del ciclo) pur essendo presenti,
non influenzeranno la distribuzione di peso molecolare di DNA, dal momento
che non sono marcati con timidina radioattiva. Il cold chase dunque elimina
una sorgente di errore sistematico.
2.2 Dosimetria ed irraggiamento 25

Comunque, la dimensione dei frammenti di Okazaki marcati è tale da


influenzare solo minimamente la distribuzione del DNA nella regione di peso
molecolare a cui ci si è interessati in questo studio, compresa tra diecimila
coppie di basi (10 kbp) e sei milioni di coppie di basi (6 Mbp).

2.2 Dosimetria ed irraggiamento


Poiché il DNA cellulare è separato in peso molecolare attraverso l’elettroforesi
(paragrafo 2.5), le cellule sono state incapsulate in piccoli volumi di agaro-
sio (∼ 30µl) denominati ‘inserti’. Il vantaggio di questa tecnica risiede nel
fatto che è molto semplice manipolare tali inserti ed il DNA si trova già in-
capsulato in una matrice di agarosio alla fine dell’irraggiamento, pronto per
essere caricato nel gel. Gli inserti d’agarosio contenenti le cellule vengono
conservati in una soluzione tampone (1 X TE) fino alla loro utilizzazione,
con il rischio che frammenti molto piccoli di DNA (più piccoli di circa 1 kbp)
vengono perduti per diffusione all’esterno degli inserti stessi, ma questo non
ha particolare rilevanza sulla regione di peso studiata in questo lavoro.
È importante sottolineare che le cellule possono essere irraggiate in inser-
ti di agarosio soltanto con la radiazione sparsamente ionizzante, per cui le
proprietà del fascio incidente restano pressoché inalterate durante tutto l’at-
traversamento dell’inserto. Le cellule ivi incapsulate riceveranno cosı̀ tutte
la stessa dose.
Per la preparazione di inserti di agarosio, le cellule, dopo essere state incu-
bate in terreno radioattivo, vengono risospese ad una concentrazione di 3·105
cellule/ml. A causa della tecnica adoperata per la quantificazione dei dsb, è
importante avere una sospensione cellulare più concentrata, cosı̀ da ottenere
un più elevato numero di cellule per ciascun inserto di agarosio ed un numero
totale di conteggi, per inserto, compreso tra 2000 e 3000 dpm, distribuito su
tutto l’intervallo di peso molecolare risolto nell’elettroforesi. Ciò viene re-
alizzato centrifugando la sospensione cellulare e risospendendo il depositato
in un piccolo volume di PBS, che solitamente è stato di 0·3-0·4 ml per circa
1·107 cellule centrifugate. La nuova sospensione cellulare, contenente circa
5·106 cellule/ml (una parte delle cellule presenti prima della centrifugazione è
sempre perduta) viene accuratamente miscelata con un volume appropriato
di agarosio a basso punto di solidificazione, per ottenere una concentrazione
di agarosio dello 0.5-1.0 %. Il tutto è mantenuto a 37◦ C, di modo che la
soluzione resti liquida alla temperatura di lavoro imposta dalle cellule. La
sospensione di cellule in agarosio cosı̀ ottenuta viene poi trasferita in stampi
di plastica, le cui dimensioni sono 10×5×1.5 mm, per essere poi messa in
frigorifero a 4◦ C dove solidificano in circa 45 minuti.
2.2 Dosimetria ed irraggiamento 26

Induzione di dsb Riparazione di dsb


concentrazione cellulare #/ml 2-4·106 2-2,5·106
concentrazione di agarosio (%) 0,8-1,0 0,5

Tabella 2.2: Condizioni sperimentali adottate per incapsulare le cellule in


agarosio

Nella tabella 2.2 vengono riassunte le condizioni in cui le cellule sono state
incapsulate in inserti d’agarosio, distinguendo tra esperimenti di induzione e
di riparazione di dsb.

Una volta solidificati, gli inserti vengono posti in piastre di Petri da Ø 60


mm (irraggiamento con raggi X) oppure in provette da 10 ml (irraggiamen-
to con 60 Co-γ) in bagno di PBS per esperimenti di induzione o in terreno
tamponato con HEPES per esperimenti di riparazione.

2.2.1 Fotoni X
Le piastre di Petri che ospitano gli inserti di agarosi con le cellule vengono
appoggiate su una tavoletta sagomata in Plexi-glass, alloggiata in un con-
tenitore riempito di ghiaccio, per mantenere la temperatura del PBS (oppure
del terreno tamponato con HEPES) ad un livello tale da inibire i meccanismi
biochimici di riparo dei dsb, che necessitano di una temperatura di 37 C per
funzionare correttamente. La dosimetria non è stata effettuata come parte
di questo lavoro. La dose scelta viene impostata in numero di ‘divisioni di
irraggiamento’, secondo l’equazione dosimetrica:
divisioni 228.7XP
=
Gy T
dove si ha: P pressione atmosferica in Torr, T temperatura dell’ambiente
in K.
In funzione delle condizioni atmosferiche, fissata la dose, l’otturatore
dovrà essere tenuto aperto per un numero di divisioni diverso, che è sinonimo
di tempo variabile(2 ). A temperatura ambiente e pressione atmosferica, con
una corrente di elettroni di 13 mA la dose depositata è pari a 1,62 Gy/min.
Impostato il numero di divisioni, l’otturatore viene chiuso automaticamente
alla fine dell’irraggiamento.
2
L’accuratezza della proporzionalità lineare tra numero di divisioni e dose è legata al
fatto che la macchina che produce i raggi X deve essere sempre sottoposta ad un ciclo di
riscaldamento, prima di essere utilizzata per l’irraggiamento dei campioni.
2.2 Dosimetria ed irraggiamento 27

Negli esperimenti di induzione di dsb, le piastre di Petri vengono irrag-


giate in sequenza. Quando si è raggiunta la dose per il primo punto speri-
mentale, la piastra di Petri relativa viene rimossa dalla maschera d’irraggia-
mento e viene posta su ghiaccio, mentre le altre vengono lasciate per ricevere
la rimanente parte della dose scelta.

2.2.2 Fotoni γ
La dosimetria della sorgente di 60 Co-γ è stata eseguita durante questo lavoro
di tesi ed è presentata separatamente in appendice B.
Inizialmente l’irraggiamento avveniva in una maschera di Plexi-Glass a
forma di parallelepipedo, che poteva essere riempita di ghiaccio ed ospitare
fino a sette provette da 10 ml. Il dose-rate era piuttosto limitato ed irraggia-
menti con dosi fino a 200 Gy richiedevano tempi troppo lunghi. Inoltre, la
geometria dell’apparato non consentiva una deposizione di energia uniforme
in tutte le provette.
Dopo un paio si esperimenti si decise di adattare una maschera d’irrag-
giamento che consente di avere diversi dose rate, di forma circolare, costruita
in alluminio (figura 2.2)

Figura 2.2: La maschera d’irraggiamento utilizzata presso la sorgente di raggi


γ. Le distanze dal centro della maschera sono: (A)=165 mm ; (B)= 105 mm;
(C)=45 mm
2.3 Riparo di dsb 28

L’unico inconveniente sta nel fatto che le provette non possono essere
mantenute in ghiaccio durante l’irraggiamento, tuttavia essendo i dose rates
molto più elevati della precedente maschera d’irraggiamento usata, i tempi
d’esposizione sono conseguentemente più brevi. Le provette sono state man-
tenute in ghiaccio fino ad un attimo prima di essere traferite sulla maschera.
In questo caso l’irraggiamento non avveniva in più passi, come per i raggi X,
ma in un’unica esposizione per ciascun punto sperimentale. Il dose rate veni-
va aggiornato alla data dell’esperimento, per tenere conto del decadimento
del 60 Co.
Lo spessore della parete delle provette varia con l’altezza, il che comporta
che i fotoni, lungo il loro cammino verso gli inserti d’agarosio, attraversano
proporzioni di plastica e PBS non costanti, a seconda dell’altezza. Se la
sezione d’urto di assorbimento per i raggi γ varia tra plastica e PBS, ci si
aspetta di trovare un flusso di elettroni (liberati dai fotoni) nella regione
in cui si trova l’inserto di agarosio con le cellule, la cui intensità dipende
dall’altezza. Se l’inserto giacesse sul fondo della provetta, dove l’effetto è
ancora più pronunciato, la dose depositata nell’inserto potrebbe essere non
uniforme. Si è rimediato a questa situazione inserendo un supporto a forma
di tronco di cono in silicone, sul quale fisicamente si è appoggiato l’inserto,
il quale, coperto da 1 ml di PBS, si è cosı̀ trovato ad un’altezza in cui lo
spessore delle pareti della provetta è pressoché costante.

2.3 Riparo di dsb


Perché l’efficienza di riparo sia elevata, le cellule devono essere incubate in
terreno di coltura a 37◦ C. Negli esperimenti di induzione di dsb, durante l’ir-
raggiamento si è utilizzato PBS a 4◦ C per mantenere condizioni iso-osmotiche
tra le cellule e l’ambiente esterno. Negli esperimenti di riparazione invece,
con le cellule incapsulate in agarosio, ci vuole un tempo finito perché il ter-
reno di coltura permei l’agarosio e porti le sostanze nutritive alle cellule, il
che comporta una fase stazionaria iniziale nel riparo, appena la cellula rag-
giunge la temperatura di 37◦ C. Si è perciò scelto di mantenere le cellule in
terreno tamponato con HEPES durante l’irraggiamento, per fornire percur-
sori di DNA e risorse energetiche appena la riparazione comincia, nell’attesa
che l’α-MEM penetri nella parete cellulare. La riparazione è stata arrestata
cambiando il terreno di coltura con uno raffreddato a 4◦ C. Le cellule sono
poi andate subito incontro a lisi delle membrane, come discusso in sezione
2.4.
2.4 Isolamento del DNA 29

2.4 Isolamento del DNA


Affinché il DNA possa migrare dagli inserti di agarosio al gel, ed essere qui
risolto in peso molecolare, occorre lisare le membrane presenti nella cellula
ed isolare il DNA dagli altri componenti cellulari. Dopo la lisi, il DNA si
trova decondensato dalla struttura di fibra di cromatina del diametro di 30
nm in doppia elica, del diametro di 2 nm.
Il protocollo di lisi è stato gentilmente concesso da Heidi Newman, del
Gray Laboratory:

1. un’ora in 1 ml di soluzione di lisi (3 ) su ghiaccio

2. 24 ore nella stessa soluzione, ma a 50◦ C.

In seguito, gli inserti d’agarosio sono stati ripetutamente sciacquati in


buffer 1XTE, per eliminare tracce di soluzione di lisi dalla matrice di agaro-
sio che avrebbe potuto influenzare la migrazione del DNA. Gli inserti pos-
sono essere conservati per lungo tempo in 1XTE buffer a 4◦ C, senza alcuna
rilevante perdita per diffusione di frammenti di DNA del peso molecolare
studiato in questo lavoro.

2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE)


Dal momento che ciascun nucleotide porta una carica negativa (figura 1.4)
associata al grupo fosfato, la carica totale del DNA è proporzionale alla sua
lunghezza.
L’elettroforesi è una tecnica mediante la quale molecole elettricamente
cariche vengono separate, in base alla loro lunghezza, in un supporto semi-
solido e poroso, per mezzo dell’applicazione di un campo elettrico. Gen-
eralmente come supporto si utilizza un gel d’agarosio, un polimero naturale
estratto dalle alghe, la cui struttura chimica è illustrata in figura 2.3
Disciolto in acqua in ebollizione, l’agarosio solidifica in forma gelatinosa,
per cui è possibile ottenere la forma e dimensione di gel desiderata utilizzando
un opportuno stampo. La struttura del gel solidificato è quella di una ma-
trice porosa tridimensionale, con la dimensione dei pori che diminuisce con
la concentrazione di agarosio. Le molecole di DNA vengono fatte migrare,
sotto l’azione di una forza elettrica, attraverso questa matrice porosa, che si
comporta come un mezzo viscoso.
3
Si veda in appendice per la composizione chimica dei prodotti utilizzati
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 30

Figura 2.3: L’agarosio, il polimero naturale estratto dalle alghe, che viene
utilizzato per produrre gel da utilizzare in elettroforesi

Ricordando la dinamica di un corpo soggetto ad una forza costante (cam-


po elettrico) ed all’azione frenante di una forza viscosa (esercitata dalla ma-
trice tridimensionale del gel) l’equazione del moto di molecole elettricamente
cariche (in questo caso il DNA) è scritta come segue:

mẍ = QE − β ẋ (2.1)
con Q carica della molecola, E intensità del campo elettrico e β fattore che
dipende dalla viscosità del mezzo e dalla forma della molecola. La soluzione
per ẋ dell’equazione differenziale 2.1 è:
" $ %#
βt QE
ẋ = 1 − exp − (2.2)
m β
per β costante, dopo una fase transitoria le molecole migrano ad una
velocità pari a QE/β.
Il principio chiave è che le molecole più piccole (β piccolo) possono muover-
si più facilmente attraverso la matrice porosa di agarosio, migrando quindi
più lontano. Le molecole più grandi, malgrado la maggior carica elettrica,
hanno una mobilità molto limitata (β grande) e quindi migrano per ditanze
più brevi, a parità di tempo. Con la scelta di opportune condizioni di elet-
troforesi, è possibile ottenere un buona separazione anche di molecole di
lunghezza molto simile. Ciò è illustrato in figura 2.4
Poiché β dipende anche dalla viscosità del mezzo, la mobilità delle molecole
di DNA può essere influenzata dalla concentrazione di agarosio nel gel, ovvero
dalla dimensione dei pori, oltre che da altri fattori che saranno elencati in
seguito. L’effetto della concentrazione di agarosio sulla mobilià del DNA è
ben descritto in figura 2.5, dove si rappresenta la curva di mobilità nel gel,
per diverse concentrazioni di agarosio.
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 31

Figura 2.4: La separazione della molecole di DNA in un gel d’agarosio.


Molecole più piccole migrano più lontano nel gel, cosı̀ che molecole di diverse
lunghezza definiscono bande separate
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 32

Figura 2.5: La mobilità dei frammenti di DNA in un gel di agarosio a diverse


concentrazioni.

La dipendenza funzionale tra la mobilità di DNA e la concentrazione di


agarosio è descritta dalla formula:

logµ = logµ0 − Kr τ (2.3)


dove con µ si è indicata la mobilità elettroforetica del DNA, µ0 la mobilità
del DNA in acqua, senza agarosio, τ la concentrazione di agarosio e Kr
una costante che dipende dalla forma e dimensione delle molecole di DNA.
Non soltanto la concentrazione di agarosio influenza la mobilità del DNA nel
gel. A bassi valori di intensità del campo elettrico applicato, la mobilità dei
frammenti di DNA è proporzionale alla loro lunghezza. Con l’uso di campi
elettrici più intensi, i frammenti più grandi migrano invece a velocità sempre
maggiori. Al variare del grado di acidità della soluzione di elettroforesi,
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 33

espresso come pH o come ”concentrazione ionica”, cambia anche la carica


elettrica delle molecole di DNA, e quindi la forza elettrica che su esse agisce.
In caso di forze elettriche particolarmente intense, si possono verificare locali
innalzamenti di temperatura nel gel, con conseguente fusione della matrice
d’agarosio e denaturazione della doppia elica di DNA.
È stato trovato che, con l’utilizzo di un campo elettrico continuo, possono
essere risolti frammenti di DNA da 10 coppie di basi ad circa 50 kbp (Chu
et al. 1986).
Il DNA genomico, dopo l’isolamento dai rimanenti costituenti cellulari, si
trova in una forma agglomerata (coiled ) di lunghezza certamente maggiore di
50 kbp. Nell’elettroforesi convenzionale, queste molecole si distendono in for-
ma lineare sotto l’azione del campo continuo (e dunque cambiano forma, per
un valore del coefficiente β ridotto), migrando attraverso il gel indipenden-
temente dalla loro lunghezza. Ciò puo essere evitato se le molecole vengono
lasciate distendersi e riagglomerare subito dopo essere passate attraverso i
pori del gel, in modo da evitare l’elongazione. L’uso di un campo elettrico
alternato tra due direzioni può aiutare a risolvere questa situazione.
L’elettroforesi in campo pulsato è una tecnica inventata alla metà degli
anni ’80. Da allora, sono state sviluppate diverse varianti e qui verrà discus-
sa solo la Clamped Homogenous Electric Field (CHEF). Il campo elettrico
è applicato alternativamente lungo due direzioni, con l’angolo Θ tra esse
compreso che può essere scelto opportunamente. Anche la frequenza di pul-
sazione tra le due direzioni può essere variata, in ogni momento. Le molecole
di DNA vengono quindi spinte alternativamente lungo due direzioni, in modo
che possano tornare in forma agglomerata prima di andare in elongazione,
migrando quindi ancora in funzione della loro dimensione. In un certo inter-
vallo di tempo, le molecole che migrano più lontano lungo la direzione effetiva
del moto, la somma vettoriale delle due direzioni istantanee del campo elet-
trico, sono quelle il cui tempo di riorientamento nel campo elettrico è più
breve del tempo di pulsazione del campo stesso. Inoltre, molecole il cui tem-
po di riorientamento è in risonanza con la frequenza di pulsazione del campo,
restano bloccate nella matrice senza migrare, perché devono continuamente
riorentarsi nel campo, mentre quelle con tempi di assestamento ancora più
lunghi sentono l’azione di un campo elettrico praticamente costante, come
nell’elettroforesi convenzionale (Schwartz and Cantor 1984). Per risolvere
in uno stesso esperimento molecole di lunghezza diversa occorre perciò vari-
are la frequenza di pulsazione, cosa che può essere effettuata tra un valore
minimo ed uno massimo.
Il campo elettrico è uniforme in tutto il gel. Ciò si realizza con l’uso
di molti elettrodi distribuiti lungo un poligono chiuso, che nel caso dello
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 34

strumento utilizzato in questo lavoro(4 ) è un esagono con quattro elettrodi


per lato. Ciascun elettrodo è programmato autonomamente da un computer.
Lo strumento è mostrato in figura 2.6.

Figura 2.6: La cella elettroforetica CHEF DRIII. La linea continua con la


freccia all’interno del gel indica la direzione istantanea del campo elettrico,
mentre la linea tratteggiata indica la direzione effettiva del moto.

Oltre a quanto osservato per l’elettroforesi convenzionale, le variabili su


cui è possibile agire per ottimizzare le condizioni elettroforetiche sono:

1. concentrazione di agarosio nel gel


2. concentrazione di buffer nel gel
3. buffer di raffreddamento e sua temperatura
4. intensità del campo elettrico

5. angolo di pulsazione Θ
4
BioRad CHEF DRIII
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 35

concentrazione di agarosio nel gel 0.8 %


concentrazione di buffer nel gel 0·5 X TAE

buffer di raffreddamento 13·5 C, 0·75 X TAE
! ! block 1 block 2
!−
→!
! E ! (V/cm) 2 6
angolo di pulsazione 106◦ 120◦
tempo di pulsazione (min-max) 20-40 min 7.5 s-1.9 min
durata 44 ore 4 ore

Tabella 2.3: Il protocollo di elettroforesi utilizzato per risolvere frammenti di


alto peso molecolare compreso tra 50kbp e 6Mbp

6. frequenza di pulsazione (min-max)

7. durata dell’elettroforesi

avendo tralasciato le condizioni in cui le cellule vengono incapsulate negli


inserti di agarosio da inserire nei pozzetti del gel.
Con un tal numero di variabili da controllare, si capisce come sia difficile
la ricerca delle condizioni ideali per un protocollo che soddisfi le proprie
esigenze. In questo lavoro di tesi sono stati utilizzati due protocolli, dei quali
uno consente di separare frammenti di lunghezza compresa tra 6 Mbp e 50
kbp, tratto da (Elia and Nichols 1993). Il secondo risolve frammenti tra
300 kbp e 500 bp ed è stato già utilizzato in questo laboratorio (Newman
et al. 1997). Il primo ha due ‘blocchi’, ciascuno con condizioni di campo
elettrico distinte, perché, come prima indicato, l’intensità del campo elettrico
controlla, in particolare, la mobilità dei frammenti di DNA più lunghi. La
tabella 2.3 riassume il primo protocollo, mentre la tabella 2.4 riassume il
secondo

Gli inserti contenenti DNA pronto per essere separato con l’elettroforesi
sono stati delicatamente inseriti nei pozzetti e qui sigillati con agarosio alla
stessa concentrazione del gel, per evitare che fuoriescissero e fossero perduti
nel corso dell’elettroforesi.
Per conservare un’immagine della distribuzione di DNA nel gel, ma non
per effettuare un’analisi quantitativa, dopo l’elettroforesi il gel è stato col-
orato per una notte in bagno di TAE o TBE a seconda del protocollo utiliz-
zato, contenente bromuro di etidio (0,5 µg/ml). Questa sostanza permette la
visualizzazione del DNA in quanto fluoresce se eccitata con raggi ultravioletti
(302 e 366 nm) emettendo luce a 590 nm, legandosi specificamente al DNA
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 36

concentrazione di agarosio ‘rapido’ nel gel 1%


concentrazione di buffer nel gel 0.5 X TBE

buffer !di !raffreddamento 13.5 C, 0.75 X TBE
!−
→!
! E ! (V/cm) 6
angolo di pulsazione 120◦
tempo di pulsazione (min-max) 0.1- 17.3 s
durata 7.5 h

Tabella 2.4: Il protocollo elettroforetico utilizzato per risolvere frammenti di


DNA tra 10kbp e 280 kbp

a doppia elica. Successivamente si è scattata una fotografia Polaroid nega-


tivo/positivo sulla lampada UV. Il gel radioattivo non può essere analizzato
con un’autoradiografia perchè gli elettroni del decadimento di 14 C non ri-
escono a penetrare il gel per impressionare una lastra fotografica. Si è perciò
proceduto sciogliendo regioni del gel opportunamente tagliate e contando le
scintillazioni (in una soluzione scintillante) in fase liquida. Il gel è stato poi
tagliato in 24 corsie, esclusi i marcatori non marcati radioattivamente, con
ciascuna corsia ulteriormente sezionata in 10 (11) segmenti, per un totale di
240 (264) sezioni di agarosio. In ciascuna corsia si ha:

• un pozzetto

• (9) segmenti lunghi 10 mm

• segmento lungo 50 (40) mm

I cubetti di gel ottenuti contengono DNA in diverse regioni di peso moleco-


lare, che vengono individuate con una calibrazione distanza di migrazione in
funzione del peso molecolare dei marcatori. I cubetti sono stati individual-
mente messi in contenitori cilindrici in plastica da 20 ml, aggiungendo a
ciascuno 200 µl di 1M HCl (in quantità tripla per il segmento da 40 o 50
mm). L’agarosio è stato sciolto in forno a 95◦ C per circa novanta minuti.
L’acido cloridrico veniva aggiunto per evitare la riformazione dei legami del-
l’agarosio, cosı̀ che i cubetti fusi restano in fase liquida anche a temperatura
ambiente, per evitare effetti di quenching.
Appena raffreddati, si aggiunge ad ogni boccetta 10 ml di liquido per
scintillazioni Beckman Ready Safe per il conteggio delle disintegrazioni di
14
C provenienti dal DNA marcato. Ciascuna boccetta viene monitorata per
15 minuti, e l’output viene fornito come (corretto per gli effetti di quenching
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 37

nel liquido scintillante) dpm in ciascuna boccetta, che normalizzato al numero


di disintegrazioni totali in una corsia del gel fornisce la frazione di peso in
ciascuna regione di mobilità (peso molecolare).
2.5 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) 38

Figura 2.7: L’organizzazione tridimensionale della doppia elica di DNA in


cellule eucariotiche
Capitolo 3

Modelli matematici

3.1 Induzione di dsb


In questo capitolo verranno presentati solo alcuni dei modelli matematici
esistenti che consentono di quantificare i double strand breaks radioindotti.
Tutti i questi modelli permettono di effettuare tali stime a partire dalla forma
della distribuzione di peso molecolare del DNA che è stato irraggiato. Tra
quelli non trattati, per motivi che verranno subito indicati, ne esiste uno che
consente di quantificare il numero di dsb radio-indotti a partire dalle misure
sperimentali della massa di DNA al di sotto di una certa dimensione specifica,
indipendentemente dal profilo dettagliato della distribuzione di peso moleco-
lare di DNA. Per questo motivo il metodo, chiamato specific size marker è
considerato di tipo integrale. Il suo sviluppo parte dal lavoro di Montroll e
Simha negli anni quaranta (Montroll and Simha 1940, Montroll e Simha).
Nonostante la sua semplicità, tuttavia, lavorare sulla massa di DNA compor-
ta perdere sensibilità in regioni di basso peso molecolare, oggetto particolare
di studio in questo periodo (vedere capitolo 5). Per questo motivo il metodo
specific size marker non è mai stato usato in questo lavoro per quantificare
i double strand breaks radioindotti, anche se spesso i dati sperimentali sono
stati rappresentati in forma di FAR(1 ), un caso particolare di grafico specific
size marker, nel quale si raffigura la frazione di DNA estratta dai pozzetti
del gel durante un’elettroforesi, in funzione della dose assorbita.
Verranno invece presentati due modelli che utilizzano entrambi tutta l’in-
formazione disponibile dal profilo della distribuzione di DNA. Verrà illustrata
in breve la loro derivazione, che è letteralmente sparpagliata in molti articoli
a partire dagli anni quaranta fino a questo decennio. L’analisi dei dati effet-
tuata con questi modelli considera l’informazione sulla quantità di DNA in
1
Fraction of Activity Relased

39
3.1 Induzione di dsb 40

diverse regioni di peso molecolare, invece che tutta la massa al di sotto di


un certo valore. Per contrapposizione allo specific size marker, questi metodi
vengono detti perciò differenziali, piuttosto che integrali.
Essi sono:

1. distribution shape method (DS)

2. broken stick analysis(2 ) (BS)

Vedremo che il primo è un’ottima approssimazione del secondo, ad alte


dosi. Il capitolo si chiude con lo sviluppo di un altro modello differenziale,
che è stato interamente sviluppato in questo lavoro di tesi. Questo mod-
ello, partendo dai risultati del broken stick, utilizza anche le informazioni
disponibili sul danno di fondo introdotto dallo sperimentatore sulle cellule,
nel corso dell’esperimento per derivare una nuova funzione, dipendente pro-
prio dal danno di fondo. Questo modello è stato chiamato background biased
broken stick (BBBS ). Tutti e tre i modelli sono stati utilizzati per l’analisi
dei dati sperimentali di questo lavoro di tesi.

3.1.1 modello Distribution shape


Il modello nasce dal lavoro di Lehmann ed Ormerod (Lehmann and Ormerod
1970b, Lehmann and Ormerod 1970a) i quali hanno utilizzato i risultati degli
studi di Charlesby (Charlesby 1953). I principi chiave sono:

1. L’induzione di dsb è random, ovvero:

1.a Ogni regione del DNA è ugualmente esposta alla radiazione ed


un dsb può essere indotto in qualsiasi area della molecola, con la
stessa probabilità.
1.b Ciascun dsb è originato da un evento indipendente. In altre parole,
non esiste alcuna correlazione tra i dsb.

2. La distribuzione dei pesi molecolari inizialmente presenti è centrata su


un solo valore
2
La scelta dei nomi per questi modelli non è affatto la più felice. Entrambi hanno un
approccio differenziale, come detto, per cui dipendono dalla forma della distribuzione di
massa e non dal suo integrale. Entrambi partono dalla frammentazione di molecole di
lunghezza definita. I nomi vengono qui lasciati per ragioni storiche.
3.1 Induzione di dsb 41

Quanto affermato al secondo punto sulla forma della distribuzione inizial-


mente presente non rappresenta la situazione reale, perché in un esperimento
si irraggia una distribuzione di DNA originata dalle rotture indotte durante la
manipolazione dello sperimentatore, come verrà meglio spiegato al paragrafo
3.1.3. Si può però qui invocare il lavoro di Charlesby per dire che i risul-
tati ottenuti a partire da questa ipotesi sono piuttosto generali, estendibili
anche a casi in cui essa non è soddisfatta. Infatti Charlesby, sofferman-
dosi sui momenti delle distribuzioni di peso molecolare, ha elegantemente di-
mostrato che, se tutte le molecole inizialmente presenti sono tagliate almeno
cinque volte per effetto della radiazione, la media pesata delle lunghezze
delle molecole presenti dopo l’irraggiamento è pressoché indipendente dalla
distribuzione iniziale, fosse questa stata uniforme, esponenziale, o qualsiasi
altra. Una distribuzione è completamente identificata se sono noti tutti i
suoi momenti intorno all’origine, ciononostante i risultati di Charlesby sono
sempre stati interpretati dicendo che il profilo della distribuzione finale è
indipendente da quello pre-irraggiamento. Ammesso che l’estrapolazione sia
lecita e che la condizione sui 5 dsb radioindotti per ciascuna molecola sia sod-
disfatta(3 ), la funzione ottenuta in questo modello a partire dalle condizioni
sopra indicate può essere utilizzata per l’analisi dei dati sperimentali.

Tutte le molecole inizialmente presenti posseggono u0 unità (nucleotidi)


e la radiazione le colpisce in modo random, producendo una distribuzione
continua in lunghezza.
Si definisce:

• p probabilità che qualsiasi legame fosfo-diesterico tra due unità venga


rotto dalla radiazione (dipendente dalla dose)

• n(u) numero di molecole di lunghezza u

• u1 numero di nucleotidi in una molecola di lunghezza media


&
u n(u) · u
u1 = & (3.1)
u n(u)

Il numero atteso di tagli per molecola sarà pari a u0 p.

Una molecola di lunghezza u verrà prodotta mediante due meccanismi


(figura 3.1):
3
Vedasi paragrafo 3.1.3 per un controllo sulla validità di questa affermazione negli
esperimenti condotti in questo lavoro. Si anticipa qui che la condizione non è praticamente
mai soddisfatta.
3.1 Induzione di dsb 42

1. In seguito ad un dsb presso uno dei due bordi di una qualsiasi molecola
lunga u0 , a distanza u dal bordo.

2. In seguito a due dsb in una qualunque regione interna di u0 , a distanza


u l’uno dall’altro.

Figura 3.1: Un frammento di lunghezza u puo’ derivare da un taglio su una


molecola di lunghezza u0 oppure da due tagli

Il primo meccanismo contribuirà come:

n1 (u) = 2n0 · p · exp (−pu) (3.2)


dal momento che ciascuna molecola ha due estremità libere, n0 sono le
molecole presenti, p è la probabilità di avere un dsb ed exp(−pu) è la prob-
abilità che a seguito di un taglio venga generato un frammento di lunghezza
u. Per quanto riguarda il termine exp (−pu), se p è difatti la probabilità di
avere un taglio in una regione di lunghezza infinitesima du, la probabilità
di non avere alcun taglio in una regione di lunghezza infinitesima du sarà
1-pdu. Si può pensare da una lunghezza finita u come costituita da n unità
di lunghezza infinitesima, con n che tende all’infinito. Allora si ha per la
probabilità di un frammento di lunghezza u:
' pu (n
P (0, u) = lim (1 − p du)n = lim 1 − = exp (−pu)
n n n
Il secondo meccanismo produrrà frammenti di lunghezza u secondo:

n2 (u) = p2 n0 exp (−pu) · (u0 − u) (3.3)

perché u0 − u è il numero di diversi modi in cui si può ottenere una


molecola di lunghezza u (e quindi ancora il termine exp(−pu)) da una lunga
3.1 Induzione di dsb 43

u0 , dopo due tagli (per cui si ha p2 ) su n0 molecole presenti. Sommando i


due contributi (3.2) e (3.3) si ha:
$ %
2 2
n(u) = n1 (u) + n2 (u) = n0 p exp (−pu) · + u0 − u (3.4)
p
Se la dose è sufficientemente elevata (p grande) le molecole generate
saranno molto più piccole di u0 per cui u0 − u $ u0 . Dunque:
1
n(u) = n0 p2 exp (−pu) · (2 + u0 p)
p
dove u0 p è il numero atteso di tagli sulle molecole originarie. Se u0 p è molto
maggiore di due(4 ), allora la formula (3.4) si semplifica:

n (u)
= p2 exp (−pu) (3.5)
n0 u0
Il numero atteso di tagli sulle molecole lunghe u0 è anche dato da:
u0
pu0 = −1
u1
con u1 dato nella (3.1). Cosı̀ p può essere ricavato come:
1 1 1
p= − $ (3.6)
u1 u0 u1
per un alto livello di depolimerizzazione, e&
cioè a dosi elevate. Sostituendo
la (3.6) nella (3.5) ed osservando che n0 u0 = u n(u) · u, ovvero che la massa
totale di nucleotidi si conserva, si ha:
$ %
n (u) 1 u
& = 2 exp − (3.7)
u n (u) u u1 u1
In un esperimento, a prescindere dal modello matematico che si sceglie
di utilizzare per la stima dei dsb radioindotti, si misura il numero di disin-
tegrazioni di 14 C incorporati nel DNA appartenenti ad una specifica regione
di peso molecolare. Come detto a pagina 22 il precursore radioattivo è uni-
formemente distribuito nel DNA replicato, cosı̀ che il numero di conteggi è
proporzionale alla massa del frammento. Inoltre, spesso è comodo pensare
alla lunghezza del DNA come ad una variabile continua, pure essendo questo
un polimero.
Detto allora w peso molecolare medio di una coppia di nucleotidi, si ha:
4
u0 p > 5, condizione imposta da Charlesby affinché la distribuzione post-
irraggiamento sia pressoché indipendente da quella iniziale, è troppo debole perché questa
approssimazione sia buona. Occorre un grado di depolimerizzazione maggiore.
3.1 Induzione di dsb 44

• M =u·w

• Mn = u1 · w

• ∆M = ∆u · w

ed inoltre:

• FDN A =frazione di peso di DNA in una particolare regione

• I(M) =frazione di peso di DNA di frammenti di lunghezza M

• T =massa totale di DNA in tutta la distribuzione

D’ora in avanti si useranno le parole ‘peso’ e ‘lunghezza’ senza distinzione.


Siccome il numero di disintegrazioni in una certa regione di lunghezza di DNA
è proporzionale al peso stesso dei frammenti, si ha:
I(M) n(M) · M
=&
T M n(M)M

e da FDN A = I(M) · ∆M/T (5 ), con M e ∆M rispettivamente media


numerica ed intervallo di peso molecolare nel segmento in cui si misura una
frazione di peso pari a FDN A , si ha:

FDN A n(M) · M
=& (3.8)
∆M M n(M)M

Prendendo poi n(M) dalla (3.7) e sostituendo nella (3.8), dopo il cambio
di variabile u → M, si ha:
$ %
FDN A 1 M
= 2 exp − (3.9)
M · ∆M Mn Mn
il cui logaritmo naturale è:
$ %
FDN A M
ln = −2 ln Mn − (3.10)
M · ∆M Mn
Quando si grafica ln (FDN A / (M · ∆M)) in funzione di M, ci si aspetta di
trovare una retta di pendenza 1/Mn proporzionale al numero di dsb indot-
ti, cosı̀ come proporzionale alla dose, secondo l’equazione (3.6). Ripetendo
5
Questa è un’approssimazione. Si rimanda all’appendice A per una discussione
approfondita.
3.1 Induzione di dsb 45

l’operazione per dati sperimentali relativi a diverse dosi, si dispone di un


insieme di valori ‘livello di depolimerizzazione-dose’. Un fit lineare su questo
insieme di dati servirà da test per la linearità dell’induzione di dsb, oltre che
a fornire una stima della capacità della radiazione in esame di indurre dsb,
espressa come dsb/(Gy · bp). Questa procedura descritta viene detta analisi
della pendenza (slope analysis), poiché si fa uso del valore della pendenza
nella regressione lineare di cui all’equazione 3.10.

3.1.2 Broken stick


Questo modello è stato derivato da Cantopolou, Cook e Mortimer (Con-
topoulou et al. 1987, Cook and Mortimer 1991). Le assunzioni di partenza
sono essenzialmente le stesse del modello distribution shape (si rimanda a
pagina 40) ma qui non è necessario fare ricorso ad approssimazioni di alte
dosi. Radivoyevitch (Radivoyevitch and Cedervall 1996) ha sviluppato una
via alternativa a quella che ora verrà presentata per la derivazione del mod-
ello, nella quale egli distingue tra frammenti originati da tagli ai bordi delle
molecole inizialmente presenti, e tagli in regioni interne (come hanno fat-
to anche Lehmann ed Ormerod, vedere paragrafo 3.1.1). Il risultato finale
è lo stesso, per cui qui verrà riassunto il lavoro pubblicato nell’articolo di
Cantopolou, essendo di più rapida derivazione.
Si consideri una molecola di DNA di lunghezza S. La probabilità che
dopo un dsb su questa molecola venga prodotto un frammento di lunghezza
maggiore o uguale ad x è pari alla probabilità che il dsb sia ‘posizionato’ in
maniera casuale al di fuori di una regione di lunghezza x :
x
1−
S

Figura 3.2: La probabilità di avere un frammento di lunghezza maggiore o


eguale ad x dopo un taglio su una molecola di lunghezza S è (1-X/S)

Dopo j tagli indipendenti si ha:


' x (j
1− = P (x, j, S) (3.11)
S
3.1 Induzione di dsb 46

La funzione densità di probabilità per un frammento di lunghezza com-


presa tra x ed x+dx è la derivata della 3.11:
! !
! dP ! j ' x (j−1
P (x, j, S) = !! !! =
%
1−
dx S S
La frazione di massa dei frammenti di lunghezza x è tuttavia pesata per
la lunghezza. Questa distribuzione di massa è spesso chiamata in letteratura
di ‘intensità’ ed è data da:
* +j−1
P % (x, j, S) · x jx 1 − Sx
I(x, j, S) = ) S = ) * + (3.12)
P % (x, j, S) · xdx S j S x 1 − x j−1 dx
0 S 0 S

che dopo integrazione fornisce:


x ' x (j−1
I(x, j, S) = j(j + 1) 1 − (3.13)
S2 S
La 3.13 rappresenta la distribuzione di massa di frammenti di lunghezza
x, allorché j tagli siano stati introdotti in maniera random su un molecola di
lunghezza S. A partire da una popolazione iniziale di molecole di lunghezza
S, i frammenti di lunghezza x possono però essere generati in seguito ad un
qualsiasi numero di dsb, compreso tra 1 ed ∞, inflitti sulle molecole iniziali.
Per ciascun numero j di dsb indotti, la probabilità di avere un frammento
lungo x è data dalla 3.13.
Il prossimo obiettivo è la derivazione della distribuzione teorica di inten-
sità (massa) di frammenti di DNA per un numero qualsiasi di dsb. Per questa
operazione occorre sommare la (3.13) su tutti i valori di j, pesando ciascun
termine per la probabilità di avere j tagli sulla molecola iniziale di lunghezza
S. Se si pensa ad un dsb come un evento raro, il fattore di peso che si cerca
è dato da una distribuzione di Poisson Pµ (j) con µ numero atteso di dsb
(parametro dipendente dalla dose). Si ha:

' $ %
, , x x (j−1 µj
I(x, µ, S) = I(x, j, S)·Pµ (j) = j(j+1) 1 − exp(−µ)
j j
S2 S j
(3.14)
che dopo un cambio di indice alla sommatoria j+1=n ed un successivo
cambio k=n+1 diviene:
µx - ' x (. ' µx (
I(x, µ, S) = 2+µ 1− exp − (3.15)
S S S
L’espressione 3.15 trovata per la distribuzione di massa di DNA è valida
solo se x < S. Perché la distribuzione sia completa, occorre considerare la
3.1 Induzione di dsb 47

probabilità che la molecola S resti intatta. La 3.15 ha perciò un termine


addizionale centrato sulla lunghezza S:
x
I unbroken (x, µ, S) = exp (−µ) δ (x − S) (3.16)
S
Il contributo di questo termine diminuisce con il livello di depolimeriz-
zazione secondo exp(−µ). Basta cioè una piccola dose per frammentare gran
parte delle molecole presenti. Quando la 3.16 è utilizzata per regressioni
sui dati sperimentali, S viene posto pari alla lunghezza dell’intero DNA ge-
nomico, qui 5·109 bp. Dal momento che i dati sperimentali si riferiscono a
frammenti di lunghezza fino a 6 Mbp, il termine 3.16 è fuori range e non
viene utilizzato per le regressioni sui dati. Tuttavia esso sarà di enorme im-
portanza nella derivazione del modello BBBS nel paragrafo 3.1.3. Inoltre si
può verificare che la distribuzione di intensità è normalizzata ad uno solo se
nel calcolo della norma si considerano entrambi i termini 3.15 e 3.16.
Quando i dati sperimentali vengono graficati in funzione della dose come
frazione di DNA in una certa regione di peso molecolare, si può modificare la
funzione 3.15 di modo che µ diventi la variabile ed x sia il parametro. Detto
∆x l’intervallo di peso molecolare in una certa regione,

µ · x · ∆x - ' x (. ' µx (
FDN A (x, ∆x, µ, S) = 2+µ 1− exp − (3.17)
S S S
Dalla distribuzione di intensità è anche possibile derivare quella di densità,
ovvero numero di frammenti in funzione del loro peso. Dividendo la 3.15 e
la 3.16 per x, si ottiene:

µ- ' x (. ' µx ( 1
N (x, µ, S) = 2+µ 1− exp − + exp (−µ) δ (x − S) (3.18)
S S S S
6
Per x * S e µ + 1, cioè ad alte dosi( ), si ha [2 + µ (1 − x/S)] $ µ,
per cui la distribuzione di densità, escluso il contributo della delta di Dirac,
assume un andamento esponenziale, come la distribuzione (3.9) del modello
descritto al paragrafo 3.1.1. Si può dire perciò che il modello distribution
shape è un’approssimazione del broken stick alle alte dosi.

3.1.3 Background biased broken stick


Le distribuzioni trovate nei paragrafi 3.1.2 e 3.1.1 partivano dalle assunzioni
riportate a pagina 40, ovvero radio-induzione di dsb puramente random e
molecole inizialmente presenti tutte della stessa lunghezza.
6
sperimentalmente si trova che µ vale circa 50 dsb/Gy per radiazione sparsamente
ionizzante, ed x è solitamente nell’intervallo 103 −106 bp, quando S vale 109 bp.
3.1 Induzione di dsb 48

La verità dell’affermazione che l’induzione di dsb è random è oggetto di


grandi discussioni in questo periodo e si rimanda al capitolo dei risultati
per una discussione approfondita. Nel paragrafo 3.1.1 è stato detto che in
un esperimento si irraggia una popolazione di molecole che non è centrata su
una sola lunghezza. Ciò comporta piuttosto che la distribuzione sperimentale
iniziale è continua. Di conseguenza, la seconda delle sopracitate condizioni
(pagina 40) non è soddisfatta negli esperimenti, ma i risultati trovati possono
essere generalizzati, se altre condizioni sono soddisfatte.
Quando si effettuano regressioni non lineari sui dati sperimentali, utiliz-
zando le funzioni riportate nelle formule 3.10, 3.15 e 3.18, generalmente si
graficano i dati sperimentali ‘corretti’ per il danno di background. Questa
correzione consiste nella sottrazione della frazione di DNA trovata nelle corsie
di controllo da quella misurata nei campioni irraggiati, in ciascuna regione di
peso molecolare. L’operazione mira a simulare la distribuzione di DNA che
sarebbe stata originata per frammentazione radioindotta di una popolazione
di molecole di lunghezza S, quella dell’intero DNA genomico(7 ).
In questo paragrafo verrà innanzitutto mostrato che l’operazione di cor-
rezione per il danno di fondo, effettuata nel modo descritto, è errata. Verrà
poi presentato lo sviluppo di un modello alternativo, del tutto originale, da
utilizzare per l’analisi dei dati sperimentali non corretti per il danno di fondo:
invece che correggere i dati, verrà aggiornato il modello. A questo modello è
stato perciò attribuito il nome di Background biased broken stick.
Osservando l’espressione 3.15 per la distribuzione d’intensità I(x, µ, S) si
nota subito che la dipendenza da µ non è lineare. Se si pensa di infliggere in
modo random prima µ1 e poi µ2 dsb, con µ1 > µ2 , tanto per fissare le idee,
ci aspettiamo ovviamente che

I (µ1 + µ2 ) = I (µ2 + µ1 ) = I(µ)


dove µ = µ1 + µ2 . Vista però la non linearità di I in µ si ha:

I (µ1 + µ2 ) ,= I(µ1 ) + I(µ2 ) ⇒ I(µ1 ) ,= I (µ1 + µ2 ) − I(µ2 ) (3.19)


Non è possibile in pratica sottrarre i profili delle distribuzioni per ottenere
quello per un numero di dsb intermedio, come indicato nella formula 3.19. Si
può però eseguire una regressione sui dati sperimentali relativi al danno di
background, con il modello random, per poi eseguirla nuovamente sul profilo
‘non corretto’ per il background, e valutare il numero dei dsb radioindotti a
partire dalle due stime separate, come µrad = µtot − µback .
7
Non è ancora stato provato se il DNA in interfase nel ciclo cellulare è già ripartito in
cromosomi oppure è un’unico polimero senza interruzioni.
3.1 Induzione di dsb 49

Purtroppo è stato trovato, sia in questo lavoro che in precedenti (Ceder-


vall 1995), che il danno di fondo non è indotto in modo random, e a tutt’oggi
non esiste modello che possa predire la forma della distribuzione trovata nei
campioni di controllo. Pertanto, l’operazione dei due fit separati suggerita
sopra non è effettuabile. Quanto al danno di fondo, si suppone che la manipo-
lazione dei campioni durante l’esperimento colpisca le cellule in maniera ca-
suale, ma danneggi severamente solo una parte delle cellule presenti. Queste,
subendo la rottura delle membrane (citoplasmatica e nucleare) rilascerebbero
in sospensione il DNA, che diviene cosı̀ più vulnerabile. Le cellule non dan-
neggiate alle membrane manterrebbero il loro DNA sostanzialmente integro,
cosı̀ come la loro intera struttura, e ciò può essere verificato sperimentalmente
se le cellule, messe in condizioni adeguate, continuano a dividersi e svolgere
regolarmente le loro attività.
Questi concetti della correzione del danno di fondo e sulla non linearità
delle funzioni coinvolte possono essere chiariti se si osserva la figura 3.3, nella
quale è graficata la funzione definita in 3.17 per due diverse regioni di peso
molecolare, centrate su 4 Mbp e 200 kbp.

Figura 3.3: La tendenza della frazione di DNA nelle regioni di peso molecolare
centrate su 4 Mbp (linea continua) e 200 kbp (linea tratteggiata) secondo la
predizione di un modello ad induzione di dsb random su molecole di lunghezza
5X109 bp.

Si consideri la linea continua, che rappresenta l’andamento con la dose


3.1 Induzione di dsb 50

della frazione di massa totale, nella regione di peso molecolare intorno a 4


Mbp. A dose nulla, non si prevede nessun frammento di questa lunghezza,
perché tutte le molecole inizialmente presenti sono lunghe S, posto qui pari
a 5X109 bp. La frazione di DNA inizialmente aumenta con la depolimeriz-
zazione, poi le molecole di DNA di 4 Mbp sono ulteriormente frammentate e
generano molecole più piccole, per cui il loro numero diminuisce. Per quelle di
200 kbp la crescita è più lenta (linea tratteggiata) perché le molecole lunghe S
devono essere maggiormente frammentate per produrre polimeri di 200 kbp,
per cui occorre una dose più alta. Anche la curva tratteggiata, cosı̀ come
quelle relative ad ogni regione di peso molecolare, aumenta fino ad un valore
massimo per poi decadere, tanto maggiore il punto di massimo quanto minore
il peso molecolare. Se si pensa al danno di background come originato dalla
depolimerizzazione per un certo valore di dose ‘equivalente’(8 ), per esempio
10 Gy sulla curva continua in figura 3.3, si vede dal grafico che dopo circa
100 Gy la frazione di DNA in questa regione è minore di quella nel campione
non irraggiato, ed una sottrazione porta ad un numero negativo per la dis-
tribiuzione ‘netta’. Questi valori negativi non possono essere utilizzati per
un fit con una funzione che non è mai negativa, come quella di intensità di
DNA in formula 3.15. D’altra parte, rigettando questi dati negativi si perde
informazione preziosa su una regione di peso molecolare. Questo fenomeno si
verifica in ogni esperimento in cui si sia utilizzata una dose sufficientemente
alta da produrre tali valori negativi, e la figura 3.4 illustra un caso. L’esisten-
za di valori negativi per la frazione ‘netta’ di DNA mostra che l’approccio
usato è poco accurato. E’ importante capire che la sottrazione produce dati
non affidabili anche se positivi, quelli che non vengono rigettati.
E’ chiaro quindi che una sottrazione di distribuzioni sperimentali può
portare a risultati svianti, se i dati cosı̀ ottenuti vengono utilizzati per stimare
grandezze come il numero di dsb radioindotti.

Il danno di fondo e le distribuzioni teoriche


La distribuzione di massa di DNA derivata dalla depolimerizzazione di molecole
di lunghezza S è scritta nelle formule 3.15 e 3.16, derivate nel paragrafo 3.1.2.
Essa viene qui riscritta per un veloce riferimento:
µs · x ' ' x (( ' µ · x( x
s
I(x, µs , S) = 2 + µs 1 − exp − + exp (−µs ) δ (x − S)
S S S S
(3.20)
è stato aggiunto un pedice ‘s’ a µ per specificare che il numero di tagli
è indotto su una molecola di lunghezza S. L’idea che verrà seguita adesso
8
Cioè che il danno di fondo è generato in modo random, in prima approssimazione.
3.1 Induzione di dsb 51

Figura 3.4: La frazione di DNA nelle corsie di controllo (cerchi pieni) e


relative a campioni irraggiati con 200 Gy (quadrati vuoti). Intorno a 5 Mbp
c’è più massa di DNA nei controlli che nei campioni irraggiati.

sarà quella di considerare la frazione di massa di frammenti di lunghezza x


non più come originata da una distribuzione discreta, centrata su una sola
lunghezza, ma da una popolazione di molecole le cui dimensioni coprano
più ordini di grandezza, originata in seguito alla manipolazione delle cellule
durante gli esperimenti. La radiazione comincerà la sua azione, random,
proprio su questa distribuzione.
Si consideri perciò S come una variabile continua. Se µ è il numero
di dsb radioindotti sull’intero DNA, per il quale si assume la lunghezza di
G = 5 · 109 bp, allora, sempre supponendo che la radiazione agisce in maniera
random, il numero atteso di tagli µS indotti su una molecola di lunghezza S
è:
S µS µ
µS = µ ↔ = (3.21)
G S G
per qualunque valore di S¡G. Questo significa che la media numerica ese-
guita sulle lunghezze delle molecole trovate dopo l’irraggiamento è uguale se
viene valutata a partire dall’intero DNA genomico, oppure da una famiglia
di molecole di lunghezza qualsiasi.
Sostituendo la (3.21) nella (3.20) si ha:
3.1 Induzione di dsb 52

µ·x' µ ( ' µx ( ' µ · x(


I(x, µ, G, S) = 2 + (S − x) exp − + x exp − δ (x − S)
G G G G
(3.22)
L’espressione 3.22 è valida ancora per una sola lunghezza S delle molecole
inizialmente presenti. Se però S è variabile, l’intensità totale dei frammenti
di lunghezza x sarà una sovrapposizione di distribuzioni date nella 3.22,
ciascuna derivata dalla depolimerizzazione di una molecola di lunghezza S.
Se la distribuzione di lunghezze inizialmente presente può essere descritta
con una funzione continua y(S), si ha per l’intensità totale:
/ G
I(x, µ, G) = y(S) · I(x, µ, S)dS (3.23)
x
L’estremo inferiore di integrazione è x perché frammenti di questa lunghez-
za possono essere originati da depolimerizzazione di molecole lunghe almeno
quanto x. L’estremo superiore è posto pari a G supponendo che esistano
molecole ancora intatte anche dopo la preparazione delle cellule per l’irrag-
giamento. Occorre ora conoscere y(S). Come già detto non esiste un modello
che possa prevedere la forma della distribuzione di molecole dopo il danno di
fondo, tuttavia è possibile osservarla a posteriori.
E’ stato trovato euristicamente in questo lavoro che, in molti esperimenti,
la distribuzione di densità (numero) di frammenti di DNA nei campioni di
controllo è una retta se disegnata su scala bilogaritmica, ossia è piuttosto
ben descritta dalla funzione:

y(S) = 10A · S B (3.24)

con A e B reali, e B negativo. La distribuzione di densità del background


sperimentale dovrebbe avere norma pari al numero medio di tagli indotti per
cellula, prima dell’irraggiamento. L’espressione (3.24) mostra chiaramente
che il danno di fondo non è causato da un processo random. Se cosı̀ fosse,
la distribuzione dovrebbe avere la stessa espressione della (3.18), dove µ
quantifica il livello di depolimerizzazione di fondo, ed il suo profilo sarebbe
quello della curva continua in figura (3.6). Su scala bilogaritmica si vede che
la distribuzione di cui alla (3.24) è invece una retta di pendenza B, come
appare chiaro dalla figura (3.5).
Ci si potrebbe chiedere adesso se tale distribuzione sperimentale sia rapp-
resentativa della popolazione di frammenti di DNA in regioni di peso moleco-
lare esterne a quella mostrata in figura (3.5), per esempio al di sopra di 6·106
Mbp. Se G è la lunghezza del DNA genomico delle cellule, non è possibile
trovare nessuna molecola più lunga di S. Un problema insito nell’espressione
3.1 Induzione di dsb 53

Figura 3.5: Il diagramma sperimentale per la distribuzione di DNA originata


dal danno di fondo. E’ evidente un alto livello di depolimerizzazione già
nella preparazione delle cellule per l’irraggiamento. I dati contrassegnati con
‘Rydberg’ sono tratti dal lavoro di Björn Rydberg (Rydberg 1996). Quelli
contrassegnati con REP8 e REP10 si riferiscono a due esperimenti di questo
lavoro di tesi.

3.24 è che questa non va a zero per S = G(9 ). Si può verificare parzialmente
l’affidabilità della funzione y(S) calcolando la frazione di DNA che si prevede
non venga estratta nel gel e confrontare con il dato sperimentale. Se si as-
sume che tutte le molecole di lunghezza superiore a 10 Mbp siano trattenute
nei pozzetti alla fine dell’elettroforesi, si ha:

)G ) G B+1
107
y(S) · S · dS 7 S dS
FDN A ∈ [10Mbp, 5Gbp] = = )10G (3.25)
0y(S) · S0 S B+1 dS
1

per A = 5.5 e B = −1.58, risultati dal fit lineare per l’esperimento REP8
9
Se si pone x=S nella distribizione di densità tradizionale (formula 3.18) neppure questa
va a zero:
µS
N (x = S, µS , S) = · 2 · exp(−µS )
S
Ma in pratica è un valore molto piccolo.
3.1 Induzione di dsb 54

mostrato in figura 3.5, l’integrazione fornisce il valore 0.93, vicino a quello


sperimentale 0.88.
Sostituendo l’equazione (3.24) nella (3.23) si ha:

/
A
G
µ·x' µ ( ' µx (
I(x, µ, G) = 10 SB ·2 + (S − x) exp − dS +
x G G G
/ G ' µ · x(
A B
10 S · x exp − δ (x − S) dS (3.26)
x G
Dopo integrazione questa diviene:
' µx ( " µ G2+B − x2+B
A µx
I(x, µ, B, G) = 10 exp − +
G G G 2+B
#
G1+B − x1+B ' µx (
2− +
1+B G
' µx (
A B+1
10 x exp − (3.27)
G
Avendo utilizzato la proprietà di scambio della funzione δ di Dirac, per
cui per σ piccolo a piacere:
/ x+σ
f (S)δ (x − S) dS = f (x)
x−σ

Al solito si ottiene la distribuzione di densità dividendo per x quella di


intensità di massa scritta all’equazione (3.27):

µ ' µx ( " µ G2+B − x2+B


A
N(x, µ, G, B) = 10 exp − +
G G G 2+B
#
G1+B − x1+B ' µx (
2− +
1+B G
' µx (
A B
10 x exp − (3.28)
G
La funzione 3.28 è mostrata in figura (3.6) con una linea tratteggia-
ta, assieme alla funzione scritta all’equazione 3.18 del modello Broken stick
tradizionale, per lo stesso numero di dsb radioindotti, µ=5000. L’integrale
delle due curve è tuttavia diverso perché la curva tratteggiata sottende un’area
aggiuntiva, pari al numero dei dsb indotti nei processi di danneggiamento di
fondo del DNA.
3.1 Induzione di dsb 55

Figura 3.6: La funzione di densità tradizionale del modello di Cook e


Mortimer e quella dipendente dal background, a confronto.

La funzione trovata con il modello BBBS converge a quella di background


se il numero di dsb radioindotti viene posto a zero, come si richiede che sia.
Ciò è mostrato in figura 3.7, in cui la distribuzione di background è disegnata
con tratto continuo.
Nelle regressioni sui dati sperimentali occorre utilizzare funzioni di fit
con l’adeguata costante di normalizzazione, perché queste possano ripro-
durre l’andamento dei dati. In un primo momento si era cercato di inte-
grare la funzione di intensità in formula 3.27 per calcolare la sua costante di
normalizzazione. In quell’integrale però comparivano termini del tipo:
/ G
xβ exp (−αx) dx
0

con α e β reali. Tali integrali definiscono la funzione Γ di Eulero incom-


pleta (cosiddetta perché l’integrale è limitato superiormente). L’integrazione
richiede l’uso di algoritmi specifici per le funzioni Γ di Eulero incomplete.
Un semplice ragionamento viene in aiuto a risolvere questa complicazione.
I due termini nell’equazione 3.20 contribuiscono alla distribuzione di inten-
3.1 Induzione di dsb 56

Figura 3.7: La funzione di distribuzione di molecole di DNA influenzata dal


danno di fondo, per diversi gradi di depolimerizzazione radioindotta. La linea
continua rappresenta il danno di background in un particolare esperimento.

sità con egual peso, anche quando vengono integrati su tutta la distribuzione
di background, per fornire la funzione 3.27. Inoltre, la costante di normal-
izzazione della distribuzione di intensità deve essere indipendente dal livello
di depolimerizzazione, cioè la massa totale deve comunque essere conserva-
ta. Ciò detto, si può cercare di calcolare la costante di normalizzazione per
µ (depolimerizzazione radioindotta) pari a zero, cosı̀ da svincolarsi da quei
termini della (3.27) che danno origine alle funzioni Γ di Eulero incomplete
nel calcolo della norma (tutto il primo rigo). Per µ pari a zero, la 3.27 con-
verge alla distribuzione di background, che è stata tratta proprio dai dati
sperimentali, e quindi è già normalizzata al valore ‘giusto’. A questo punto
non è più nemmeno necessario calcolare il valore delle norma.
Ne consegue che la funzione riportata in 3.27 è normalizzata al valore
‘giusto’ per essere utilizzata per regressioni non lineari sui dati sperimentali.
3.1 Induzione di dsb 57

3.1.4 Conclusioni sui modelli matematici


Sono stati analizzati alcuni dei modelli che attualmente vengono utilizzati in
diversi laboratori per la quantificazione dei dsb radioindotti.
E’ stata ricavata una funzione (3.28) da utilizzare per regressioni su dati
sperimentali quando non si effettuano correzioni del danno di background
sulle misure relative ai campioni irraggiati. Anche se l’analisi dei dati con
il metodo BBBS è più lunga di quella effettuata con i metodi BS e DS, in
quanto bisogna effettuare prima una regressione lineare e poi una non lineare,
le conclusioni che possono esser tratte dall’analisi dei dati con il metodo
BBBS possono gettar luce su un problema attualmente molto discusso, quello
della induzione di dsb random da parte della radiazione (capitolo 5).
Bisogna tuttavia sottolineare che il metodo BBBS può essere utilizzato
se il danno al DNA da manipolazione dei campioni è limitato solo alla fase
pre-irraggiamento. Nulla è stato detto in questo paragrafo sul danno che può
essere inflitto al DNA dopo l’irraggiamento e sull’effetto che esso può avere
sulla stima dei dsb radioindotti.
Capitolo 4

Esperimenti ed analisi dati

Gli esperimenti condotti in questo lavoro di tesi possono essere classificati in:

1. esperimenti di induzione di dsb mediante radiazioni di diverse qualità

2. esperimenti di riparazione di dsb indotti da raggi X da 240 kVp

Nei primi le cellule vengono sottoposte a lisi subito dopo l’irraggiamen-


to, secondo la procedura descritta nel paragrafo 2.4. Negli esperimenti di
riparazione invece, dopo l’irraggiamento in agarosio, gli inserti vengono in-
cubati in condizioni tali che le cellule possano riparare il danno radioindotto.
Terminato il ciclo di conteggi di disintegrazioni di atomi di 14 C sul gel,
il numero di conteggi in ciascuna frazione di peso molecolare viene espresso
come frazione del numero totale di disintegrazioni nella corsia di appartenen-
za. Come discusso nel paragrafo 3.1.1 il numero di disintegrazioni di atomi
di 14 C in una certa regione di peso molecolare di DNA è proporzionale alla
massa totale dei frammenti di DNA qui presenti, ovvero al loro numero ed
alla loro lunghezza media. Espressi come frazione del numero totale di dis-
integrazioni al minuto nell’intera corsia, i risultati dei conteggi nelle diverse
regioni di peso molecolare forniscono quindi una misura della frazione di mas-
sa di DNA, in ciascuna delle 10(11) regioni originate dal frazionamento delle
corsie del gel.
Ricavata la curva di calibrazione di peso molecolare, è possibile associare a
ciascuna sezione del gel un valore minimo ed uno massimo di peso molecolare.
Da questi valori si ricava subito la media M e l’intervallo di peso ∆M per
ciascuna regione. La frazione di massa di DNA che si misura in un segmento
di gel è pari a:
/ Wmax
i
FDN A = n(M)M dM (4.1)
Wmin

58
Esperimenti ed analisi dati 59

avendo indicato con n(M) la distribuzione sperimentale del numero di


molecole di DNA, Wmin e Wmax valori minimi e massimi del peso molecolare
nella regione specificata. L’espressione indicata in equazione 4.1 è con buona
approssimazione semplificata come segue:

i
FDN A = n(M ) · M · ∆M (4.2)
dove n(M ) è il valore della distribuzione di densità (si indica la densità
come il numero di molecole) nel punto medio della regione di peso molecolare
in esame. L’accuratezza dell’espressione 4.2 come approssimazione della 4.1
è discussa in appendice A. Dalla 4.2 si può ricavare una stima della frazione
n(M ) di frammenti di lunghezza M o del loro segnale di intensità n(M ) · M ,
che come è evidente è pesato dalla loro lunghezza media M . Fatta eccezione
per la prima sezione di gel sotto i pozzetti elettroforetici, la quale non è
calibrata in peso molecolare per assenza di marcatori, si può disegnare un
grafico di densità oppure di intensità di frammenti di DNA in funzione del
peso molecolare. Su queste misure sperimentali di densità di frammenti è
possibile effettuare delle regressioni con i modelli teorici, come quelli descritti
al capitolo 3.
Oltre alle distribuzioni sperimentali di densità e di intensità è comune
trovare in letteratura grafici della frazione di massa di tutto il DNA che
migra fuori dai pozzetti elettroforetici (FAR(1 )) in funzione della dose. Sper-
imentalmente la FAR si misura come:
&10 i
FDN A
F AR = &i=2 10 i
i=1 FDN A

dove l’indice i=1 rappresenta la prima sezione della corsia, il pozzetto


dove vengono inseriti i campioni.
I grafici di FAR sperimentale in funzione della dose possono essere anal-
izzati con modelli teorici come lo specific size marker. Questo tipo di analisi
però non è stata scelta in questo lavoro, come discusso al capitolo 3 a pagina
39.
Nella preparazione degli inserti di agarosio viene sempre inflitto un danno
sulle cellule che provoca una depolimerizzazione del DNA. Come risultato,
si ha una migrazione del DNA dai pozzetti nel gel già nei campioni di con-
trollo, quelli che cioè non vengono irraggiati. Dal momento che i campioni
di controllo sono manipolati, nel corso dell’esperimento, rigorosamente nello
stesso modo di quelli irraggiati, si presume che il danno misurato nei campi-
oni di controllo venga inflitto anche sui campioni che vengono poi irraggiati.
1
Fraction of Activity Released
4.1 Calibrazioni in peso molecolare 60

La distribuzione di massa di DNA in corsia che si osserva dopo l’irraggia-


mento è perciò dovuta sia alla depolimerizzazione radio-indotta che a quella
provocata dall’intervento dello sperimentatore, che rappresenta ovviamente
un effetto indesiderato.
Dal momento che l’analisi dei dati mira a quantificare esclusivamente i
dsb radioindotti sul DNA, occorre trovare un modo per distinguere nel pro-
filo dei campioni irraggiati i due tipi di danno. Come discusso al paragrafo
3.1.3, la procedura comunemente adoperata per determinare quale sarebbe
stato il profilo prodotto dall’irraggiamento di una distribuzione di molecole
centrate su una sola lunghezza, consiste di una mera sottrazione della massa
di DNA, estratta in seguito alla frammentazione di fondo, da quella misurata
nei campioni iraggiati. Nei grafici FAR in funzione della dose, in particolare,
i valori di FAR netti per ciascuna dose si ottengono sottraendo il valore di
FAR misurato nel controllo da quello misurato nei campioni irraggiati. Nei
grafici che rappresentano il profilo della distribuzione di massa in funzione
del peso molecolare (in pratica tutti i grafici che sono studiati con gli ap-
procci differenziali, che guardano alla forma della distribuzione di massa) la
sottrazione della massa di DNA viene effettuata in ciascuna regione di peso
molecolare per la quale si è misurata la frazione di DNA presente. Mentre
questa operazione di sottrazione è stata criticamente discussa al paragrafo
3.1.3, si sottolinea qui che la sottrazione dello FAR come sopra descritta non
è un’operazione accurata. In breve, riferendosi al lavoro di Blöcher (Blöcher
1990) la frazione di DNA estratta dal pozzetto (FAR) non è una funzione
lineare del numero di dsb inflitti, per cui si ha che:

F AR(rad),=F AR(rad + back) − F AR(back)


dove si è voluto indicare con rad il numero di dsb indotti dalla radiazione e
con back il numero di dsb indotti nei processi si manipolazione delle cellule.
Fa eccezione al metodo di correzione sottrattivo (negli approcci differen-
ziali prima accennati) quello proposto da Cedervall (Cedervall et al. 1995),
secondo cui la frazione di DNA da sottrarre in ciascuna regione di peso
molecolare è diminuita da una costante moltiplicativa, pari al rapporto tra
la frazione di DNA trattenuta nei pozzetti dei campioni irraggiati e quella
dei campioni di controllo.

4.1 Calibrazioni in peso molecolare


Dal momento che nel gel è stata risolta una serie di marcatori di peso moleco-
lare sottoposti a condizioni elettroforetiche identiche a quelle dei campioni
sperimentali, è possibile effettuare una calibrazione in peso molecolare della
4.2 Induzione di dsb 61

distanza di migrazione del DNA dai pozzetti. In linea di principio la mobilità


del DNA dovrebbe essere sempre riproducibile, cosicché effettuata la cali-
brazione, una tantum, questa potrebbe essere usata per diversi gel sottoposti
a condizioni elettroforetiche identiche. Tuttavia, se si ricordano tutti i fattori
che influenzano la mobilità dei frammenti di DNA nel gel è comprensibile che
anche assumendo che le condizioni di campo elettrico siano fedelmente ripro-
ducibili (e lo strumento usato è molto affidabile) una accidentale fluttuazione
in uno qualunque degli altri fattori, come la concentrazione di agarosio o la
temperatura del buffer, possano determinare una diversa mobilità del DNA
nel gel. È necessario quindi eseguire una calibrazione in peso molecolare
in ogni esperimento, che generalmente si ottiene graficando il logaritmo del
peso molecolare dei marcatori in funzione della mobilità. L’insieme dei mar-
catori di peso molecolare utilizzati nei due protocolli elettroforetici, descritti
a pagina 35, è mostrato in figura 4.1 per quelli di basso peso molecolare, ed
in figura 4.2 per quelli di alto peso molecolare. Le illustrazioni riproducono
l’effettiva mobilità dei marcatori nelle corsie.
Generalmente si trova una funzione parabolica per le curve di calibrazione
dei protocolli di elettroforesi da 48 ore, e lineare per quelli da 7.5 ore, quando
si grafica il lograitmo del peso molecolare in funzione della mobilità, ovvero
distanza di migrazione (figure 4.3 e 4.4). Spesso non è possibile determinare
una funzione che possa descrivere la mobilità dei marcatori in tutte le re-
gioni di peso molecolare risolte nel gel, a causa della presenza di regioni di
compressione e di decompressione di peso molecolare. In queste regioni la
mobilità è rispettivamente quasi costante (per cui non si ha risoluzione) o
fortemente dipendente dal peso molecolare. Ci si limita perciò a ricavare una
curva di calibrazione che sia rappresentativa della mobilità del DNA in una
ristretta zona, di particolare interesse.
Due esempi di calibrazione sono mostrati in figura 4.3 (alto peso moleco-
lare) ed in figura 4.4 (basso peso molecolare).

4.2 Induzione di dsb


In questo tipo di esperimenti si misura il numero di dsb indotti dalla radi-
azione, per diverse dosi assorbite. Esperimenti di induzione di dsb sono stati
condotti con successo con raggi X da 240 kVp e fotoni γ da decadimento di
60
Co. Le dosi irraggiate variano tra 10 e 200 Gy, in entrambi i casi. La figura
4.5 mostra un gel di un esperimento di induzione di dsb sul quale è stata
eseguta un’elettroforesi per 24 ore.
La tabella 4.1 riassume tutti i punti sperimentali ed il numero di misure
effettuate per ciascuno di essi.
4.2 Induzione di dsb 62

A B C
compression zone

285 kbp
225 kbp

48.5 kbp

12.21 kbp 12.2 kbp


10.18 kbp 10.0 kbp
9.16 kbp
8.14 kbp 8.3 kbp
7126 bp
6108 bp
5090 bp

4072 bp

3054 bp

2036 bp

1636 bp

1018 bp

506 bp

Figura 4.1: I marcatori di DNA di basso peso molecolare separati con il


protocollo di elettroforesi da 7.5 ore. (A) 1kb standard, (B) 8-48 kbp, (C)
Saccaromyces Cerevisiae

Punti sperimentali a basse dosi ¡ 100 Gy) non sono stati mai esaminati su
gel di basso peso molecolare. Questo perché in tali protocollo di elettroforesi
la massa di DNA estratta è minore, e cosı̀ il numero totale di disintegrazioni
di 14 C disponibili. Se si ricorda che i risultati di misure di conteggi seguono

la statistica di Poisson, e che l’indeterminazione relativa va come 1/ µ, si
intuisce che la sensibilità della misura del numero di dsb a bassi conteggi è
molto limitata. Una dose più elevata consente di estrarre maggiore massa di
DNA nel gel e quindi di ottenere un più alto numero di conteggi.
I dati ottenuti sono stati analizzati con i tre modelli matematici descritti
al capitolo 3. Il danno inflitto al DNA durante la manipolazione delle cellule
varia di esperimento in esperimento, come si può osservare misurando la FAR
nei campioni di controllo. Se si considera la FAR misurata nei gel sottoposti
al protocollo elettroforetico da 48 ore, la FAR nei controlli è variata tra 8 e
20 %. I valori sono più bassi nei gel da 7.5 ore, essendo la massa estratta
minore.
4.2 Induzione di dsb 63

Figura 4.2: I marcatori di DNA di alto peso molecolare separati con il


protocollo di elettroforesi da 48 ore. (A) Schyzosaccaromyces Pombe, (B)
Hansenula Wingei, (C) Saccaromyces Cerevisiae, (D) 8-48 kbp

Nell’analisi della pendenza con il modello distribution shape per ciascuna


dose si grafica il logaritmo della frazione del numero totale di frammenti di
DNA, in funzione del peso molecolare medio in ciascuna regione, in scala
lineare. Questi valori sono medie di misure effettuate in diversi esperimenti
ed i dati sono corretti per il danno di fondo. L’equazione 3.10 a pagina 44
prevede che questi dati siano lineramente correlati, cosı̀ che una regressione
lineare possa fornire una stima del peso molecolare medio di tutte le molecole
frammentate, Mn (figura 4.6). Si ripete l’operazione a diverse dosi (figura
4.7) e si costruisce un nuovo grafico, sul quale si rappresentano i valori di
1/Mn trovati in funzione della dose (figura 4.8). La pendenza della retta
fornisce una stima del numero di dsb radioindotti della radiazione in esame,
espressa come dsb/(Gy·bp).
Nell’analisi Broken stick, la frazione del numero totale di dsb viene grafi-
cata in funzione del peso molecolare, eseguendo poi un fit non lineare che
fornisce una stima dei dsb indotti sull’intero genoma, per un certo valore
4.2 Induzione di dsb 64

Figura 4.3: Una curva di calibrazione effettuata su un gel in cui sono risolti
frammenti di DNA di alto peso molecolare

della dose (figura 4.9). Parallelamente, si costruisce, per ciascuna regione di


peso molecolare, un grafico della frazione di massa di DNA Vs Dose, e per
ciascuna regione si esegue una regressione non lineare (figure 4.10 e 4.11). I
risultati dei fit nelle singole regioni di peso molecolare vengono confrontati
per studiare la randomicità della radiazione (figura 4.12) .
Nell’analisi Background biased broken stick, viene dapprima stimato il
danno di background con una regressione lineare. In seguito si effettua una
regressione non lineare sulla frazione del numero di dsb in funzione del peso,
ma questa volta i dati non sono corretti per il danno di background. In questo
tipo di analisi non si effettua la media sui dati per eseguire poi un’unica
regressione, bensı̀ si conduce l’analisi dei dati per ciascun esperimento per
poi effettuare la media dei risultati ottenuti (figure 4.13 e 4.14).

4.2.1 Fotoni X e γ
Il grafico 4.6 rappresenta la regressione lineare che si effettua al primo passo
dell’analisi con il metodo distribution shape , mostrata qui per dati rela-
4.2 Induzione di dsb 65

Figura 4.4: Una curva di calibrazione effettuata su un gel in cui sono risolti
frammenti di DNA di basso peso molecolare

tivi ad una dose di 100 Gy. Si riporta la dipendenza funzionale predetta


teoricamente, per la quale si rimanda a pagina 44:
$ %
FDN A M
ln = −2 ln Mn −
M · ∆M Mn
L’accordo teoria-esperimento in figura 4.6 è buono nella regione di alto
peso, mentre per lunghezze inferiori si trova sempre un eccesso di frammenti
di DNA rispetto alla curva ottenuta dalla regressione.
Storicamente, questa discrepanza è stata interpretata come dovuta ad
una induzione di dsb non random. Si rimanda al capitolo dei risultati per
una discussione approfondita.
Il grafico 4.7 mostra tutte le rette che si ottengono da regressioni simili a
quella figura 4.6, in riferimento agli esperimenti con i fotoni 60 Co-γ. Si nota
la variazione della pendenza delle rette con la dose assorbita, legata al grado
di depolimerizzazione.
La relazione lineare in tutte le curve in figura 4.7 è mostrata solo per
la regione per cui si disponeva di dati positivi. Oltre alla variazione della
pendenza, dovuta alla depolimerizzazione radioindotta, si nota che le rette
4.2 Induzione di dsb 66

Figura 4.5: Il risultato di un’elettroforesi su un esperimento di induzione di


dsb con raggi γ da 60 Co. I punti sperimentali sono stati raggruppati in terzine;
da sinistra verso destra: marcatori, controlli, 10 Gy, 30 Gy, 50 Gy, 80 Gy,
100 Gy, 150 Gy, 200 Gy, marcatori. Oltre alla progressiva depolimerizzazione
del DNA e lo spostamento di tutta la distribuzione verso regioni di peso
molecolare inferiore, si vede l’andamento prima crescente e poi decrescente
con la dose della massa di DNA nelle regioni di alto peso molecolare.

non terminano tutte nella regione di 5-6 Mbp, perché in queste regioni si è
dovuto rigettare i dati. In particolare, quelle relative a 150 e 200 Gy sono
state ricavate da regressioni su un minor numero di punti sperimentali, fino
ad un massimo di 4 Mbp. Per 150 e 200 Gy, le correzioni per il danno di
background (pagina 58) sui dati relativi a peso molecolare superiore a 3-4
Mbp producono sempre valori negativi, che per questo tipo di analisi devono
essere rigettati. L’origine di questi valori negativi è spiegata al paragrafo
3.1.3.
Quando i valori delle pendenze 1/Mn , stimati dalle regressioni lineari, le
cui rette sono mostrate in figura 4.7 , vengono mostrati in funzione della dose
a cui si riferiscono, si ottiene un grafico del tipo mostrato in figura 4.8.
Un grafico riassuntivo dell’analisi broken stick a dose fissata è mostrato
4.2 Induzione di dsb 67

raggi X
Dose (Gy) 6 Mbp - 48 kbp 285 kbp - 10 kbp
10 4 /
40 1 /
50 6 /
80 1 /
100 7 5
150 / 3
200 / 3
fotoni γ
Dose (Gy) 6 Mbp - 48 kbp 285 kbp - 10 kbp
10 3 /
30 3 /
50 3 /
80 2 /
100 3 4
150 3 4
200 2 4

Tabella 4.1: Sommario degli esperimenti di induzione di dsb effettuati con


fotoni γ ed X

in figura 4.9 Qui è rappresentato il fit eseguito sui dati relativi all’induzione
di dsb a 100 Gy di raggi X e fotoni γ.
Anche in figura 4.9 si osserva una deviazione dei dati sperimentali dalla
predizione teorica di induzione random di dsb, in regioni di basso peso moleco-
lare. Come è spiegato nel paragrafo 3.1.2, il modello distribution shape è una
buona approssimazione del modello broken stick, per cui non stupisce che
l’analisi dei dati porti a risultati simili ed alle stesse conclusioni sulla non
randomicità del danno da radiazione. Dal momento che le discrepanze con
il modello teorico di induzione random sono più forti nelle regioni di basso
peso molecolare (inferiori a 100 kbp circa) si cerca di guadagnare qualche
informazione in più analizzando i dati in ciascuna regione. Il grafico 4.10
mostra le regressioni non lineari effettuate con il modello broken stick sui
dati di alto peso molecolare. La funzione di fit è riportata in formula 3.17
a pagina 47: rispetto alla figura 4.9, la dose diviene la variabile ed il peso
molecolare il parametro.
I risultati dei fit nelle regioni di peso molecolare basso sono sensibilmente
più elevati (figura 4.11). Questo fa credere che l’induzione di dsb non è del
4.2 Induzione di dsb 68

Figura 4.6: Analisi della pendenza con il modello Distribution Shape. Il


grafico mostra una regressione lineare su dati relativi agli esperimenti di
induzione di dsb, ad una dose di 100 Gy. Le barre di errore delimitano
l’intervallo di confidenza al 68% per le misure effettuate.

tutto random in queste regioni e che ci sia un fenomeno di clustering di


danno.
I risultati dei fit di cui alle figure 4.10 e 4.11 vengono poi graficati in
funzione del peso molecolare, per evidenziare le regioni in cui le stime sono
più elevate (figura 4.12).
Una tipica analisi dei dati relativi ad induzione di dsb con il modello BBBS
prevede due fasi, come accennato in introduzione in questo capitolo. La stima
del danno di fondo, prima fase, è effettuata tramite una regressione lineare,
la retta ottenuta è mostrata in figura 4.13 per un particolare esperimento.
In pratica, in tutti gli esperimenti analizzati la distribuzione di back-
ground è ben descritta da una retta, la cui pendenza ed intercetta non sono
però sempre le stesse. È stata tuttavia riscontrata una deviazione sistematica
nei dati sperimentali da tale retta, nella regione di 5-6 Mbp. Si può tentare
di fornire una spiegazione osservando che la posizione di alcuni marcatori di
peso molecolare in questa regione non è ben definita in una banda stretta ma
4.2 Induzione di dsb 69

Figura 4.7: Le rette ottenute al primo passo dell’analisi Distribution Shape


per gli esperimenti sui fotoni gamma. Le curve si estendono in tutta la
regione ove erano disponibili dati sperimentali, per evidemziare l’assenza di
dati nelle regioni di più alto peso molecolare a dosi elevate (150-200 Gy).

è bensı̀ offuscata (figura 4.2), il che risulta in indeterminazioni sulla curva di


calibrazione in questa specifica parte del gel. Di norma il punto sperimentale
in questione è stato rigettato nell’analisi del danno di background.
La seconda fase dell’analisi BBBS consiste nell’effettuare una regressione
non lineare sui dati ottenuti dai campioni irraggiati, graficati come numero di
frammenti in funzione del peso molecolare. Poiché i dati che vengono tratti
da esperimenti distinti sono influenzati (biased) da un danno di background
di diversa entità, non è possibile effettuare regressioni su dati ‘combinati’
da diversi esperimenti. In particolare non è possibile effettuare una stessa
regressione su dati relativi ai due protocolli elettroforetici. Ciascun set di
dati deve essere perciò analizzato separatamente. La figura 4.13 mostra un
caso particolare per la regione di peso molecolare maggiore (100 kbp-6Mbp),
mentre la figura 4.14 mostra una analoga analisi per i dati di basso peso
molecolare (10-300 kbp).
4.2 Induzione di dsb 70

Figura 4.8: La stima della capacità di indurre dsb, sia per i raggi X che
per i fotoni γ. I risultati delle regressioni della seconda fase del metodo
Distribution shape mostrano che le due radiazioni hanno la stessa capacità
di indurre dsb

I risultati trovati nei vari esperimenti mostrano, di norma, un buon ac-


cordo tra teoria ed esperimenti per i frammenti più grandi.
I risultati dei fit sui dati di basso peso molecolare indicano un numero di
dsb molto maggiore di quello che si misura sui frammenti grandi, suggerendo
ci sia una correlazione di dsb su distanze brevi, e quindi che il meccanismo
di induzione possa non essere random. Si può tuttavia stimare l’eccesso
di frammenti trovati, rispetto alla predizione random del modello BBBS.
Ciò si effettua misurando la deviazione dei dati sperimentali da una curva
BBBS, parametrizzata da un numero di dsb che si ricava dalle regressioni sui
dati di alto peso molecolare, dove i risultati delle regressioni sono affidabili.
Quando si confrontano queste stime di eccesso di dsb rispetto al modello
random con quelle che si effettuano utilizzando il modello BS tradizionale,
si trovano risultati piuttosto intressanti. In breve, pur essendo entrambi
i modelli incapaci di predire tale eccesso di frammenti, le stime effettuate
con il modello broken stick sono influenzate dal modo in cui i dati vengono
4.3 Riparazione di dsb 71

Figura 4.9: Analisi broken stick dell’induzione di dsb di Raggi X e fotoni γ. I


dati mostrati sono medie su tutti gli esperimenti effettuati, e le barre d’errore
rappresentano i limiti dell’intervallo di confidenza del 68 %.

preparati per l’analisi. Si rimanda al capitolo 5 per un’analisi quantitativa,


insieme ad un’interpretazione sull’origine delle discrepanze trovate.

4.3 Riparazione di dsb


Negli esperimenti di riparazione di dsb, dopo l’irraggiamento le cellule ven-
gono messe in incubatore per tempi tra 15 minuti e 24 ore, tipicamente tre o
quattro punti di riparo per ciascun esperimento, e si osserva la distribuzione
di massa di DNA nelle corsie del gel per ciascun tempo di riparo. Poiché
la cellula ripara molti dei dsb ricongiungendo frammenti di DNA, si osserva
una progressiva migrazione dell’intera distribuzione di DNA verso i pozzetti
elettroforetici, ovvero verso regioni di più alto peso molecolare.
Nei pozzetti vengono inseriti campioni di controllo accanto a quelli ir-
raggiati, per ciascun tempo di riparo. Tale accorgimento può fornire infor-
mazioni sull’evoluzione del danno di fondo al DNA nel corso del riparo stesso.
Il sospetto di una instabilità del danno di fondo nasce dal fatto che è sta-
4.3 Riparazione di dsb 72

Figura 4.10: Analisi Broken Stick dell’induzione di dsb di Raggi X e fotoni


γ nelle regioni di alto peso molecolare. In ciascun pannello e’ mostrato il
risultato del fit per le due radiazioni utilizzate. I fit sono buoni se confrontati
con quelli relativi al basso peso molecolare
4.3 Riparazione di dsb 73

Figura 4.11: Analisi Broken Stick peso molecolare-specifica dell’induzione di


dsb di fotoni γ. I risultati dei fit su questi dati sono più elevati di quelli
relativi ai dati di alto peso molecolare

ta trovata in diversi laboratori una progressiva degradazione nel tempo del


DNA nei campioni di controllo, a causa delle difficili condizioni di incapsula-
mento in agarosio a cui le cellule sono sottoposte (Whitaker and McMillan
1992). Tale degradazione è misurabile con la FAR o deducibile dal profi-
lo della distribuzione di massa nella corsia. Questo ovviamente interferisce,
dal punto di vista dell’analisi del gel, con il riparo di dsb condotto da quella
frazione di cellule presenti nell’inserto di agarosio che si trovano in condizioni
relativamente più favorevoli.
Inizialmente, in questo lavoro di tesi è stata trovata una simile degradazione,
crescente con il tempo di riparo (figura 4.15).
Kysela ha studiato le condizioni che possono eliminare o almeno ridurre
il progresso temporale del danno di fondo (Kysela et al. 1993b, Kysela et al.
1993a). Essenzialmente il problema è risolto diminuendo la concentrazione
cellulare e quella di agarosio negli inserti. Quando sono state adottate tali
condizioni (2÷3X106 cellule/ml e agarosio 0.5 %) la situazione è notevolmente
migliorata. Non si è mai osservata tuttavia una riparazione nei campioni
4.3 Riparazione di dsb 74

Figura 4.12: Riassunto delle regressioni con il metodo Broken stick per cias-
cuna regione di peso molecolare. Se il meccanismo di induzione di dsb fos-
se completamente random, si attenderebbero valori indipendenti dal peso
molecolare.

di controllo, tutt’al più stabilità del danno. Questo supporta l’ipotesi sulla
natura del danno di fondo da preparazione degli inserti, citato in precedenza:
se il DNA migrato nelle corsie di controllo del gel proviene da una minoranza
di cellule severamente danneggiate, dal punto di vista dei meccanismi di
riparo biochimicamente inattive, non c’è alcun modo in cui questi polimeri
possano essere ricongiunti.
Tecnicamente, il protocollo elettroforetico utilizzato in questo lavoro non
consente di distinguere tra eventi di riparazione e di errato riparo. Entram-
bi i meccanismi riducono infatti il grado di depolimerizzazione trasportando
DNA verso regioni di peso molecolare superiore. Una stima dei dsb erronea-
mente congiunti può essere effettuata confrontando i risultati provenienti
dall’analisi convenzionale tramite FAR in funzione del tempo di riparazione
con dati provenienti da ibridizzazione di specifiche sequenze di DNA (Radi-
voyevitch et al. 1998). Nel primo caso infatti si può stimare il numero di
frammenti correttamente ed incorrettamente riparati, mentre con l’ibridiz-
zazione si misura solo la frazione dei frammenti correttamente ricongiunti.
Combinando i dati si misura la frazione di quelli riparati in modo errato,
4.3 Riparazione di dsb 75

Figura 4.13: Analisi BBBS per un particolare esperimento a 100 Gy.


Protocollo di gel di alto peso molecolare

limitatamente alla regione ibridizzata.


Oltre a variare i tempi di riparazione è possibile anche variare la dose
irraggiata. La tabella 4.2 riassume le condizioni utilizzate negli esperimenti,
eseguiti esclusivamente con raggi X da 240 kVp.
Il tipico modo di analizzare i dati ottenuti da esperimenti di riparazione
consiste nel rappresentare la FAR misurata in funzione del tempo di riparo,
ed effettuare una regressione con una somma di esponenziali a diverse veloc-
ità. Di norma infatti si osserva una componente rapida, relativa a dsb più
facilmente riparabili, ed una più lenta che dovrebbe rappresentare una catego-
ria di dsb di maggior complessità, generalmente imputata come responsabile
della morte cellulare (figura 4.16).
Il motivo per cui si sceglie la funzione di fit come una somma di esponen-
ziali sta nell’assunzione che ciascuna delle due categorie di dsb viene riparata
in modo indipendente, per cui in ogni istante di tempo la cinetica di un tipo
di dsb non è influenzata e non influenza quella dell’altro tipo. Inoltre, ciascun
termine è un esponenziale perché si considera il dsb come l’unità soggetta a
4.3 Riparazione di dsb 76

Figura 4.14: Analisi BBBS a 100 Gy su un particolare esperimento. Pro-


tocollo di gel di basso peso molecolare. Il fit sui dati fornisce un valore
molto elevato per il numero di dsb radioindotti; per confronto è stata dis-
egnata la curva relativa ad un numero di dsb pari a 5000, corrispondente a
10−8 dsb/(Gy·bp).
4.3 Riparazione di dsb 77

Figura 4.15: La progressione del danno di fondo al DNA dovuta all’incap-


sulamento di cellule in agarosio. Si nota un deterioramento del DNA dei
campioni di controllo, evidenziato da un progressivo aumento della massa di
DNA nelle region intorno a 105 bp.

riparo (piuttosto che i due frammenti, caso che sarà accennato tra breve) per
cui la rapidità della loro estinzione dipende dal numero dei dsb non ancora
riparati:
dn
= −kn ⇒ n(t) = n0 exp(−kt)
dt
La suddivisione dei dsb in due categorie di complessità può sembrare un
po’ semplicistica se si pensa che il danno da radiazione, sia diretto che indi-
retto, può causare uno spettro di danneggiamento molto vasto, in particolare
nei dsb. Ad una estremità di questo spettro ci sono i dsb ‘semplici’, coppie
di tagli molto ravvicinati sulle singole eliche, relativamente facili da riparare.
All’altro estremo ci sono dsb in cluster, molto vicini ed associati a basi azo-
tate danneggiate e/o perse dallo scheletro zucchero-fosfato. La riparabilità
di questo secondo tipo di lesioni è sicuramente più limitata. Malgrado gli
4.3 Riparazione di dsb 78

Riparo di dsb
Esperimento Dose (Gy) Peso molecolare Tempi (ore) Agarosio %
REP1 100 alto 0,0.25,1,2 0.8
REP2 100 alto 0,0.25,1,2 0.8
REP3 100 alto 0,0.25,1,19 0.8
REP4 100 alto 0,0.5,1,3,6,19 0.8
REP5 50 alto 0,0.5,1,3,6,22 0.7
REP6 100 alto 0,0.5,1,3,6,22 0.8
REP7 50 alto 0,0.5,1,4,6,24 0.5
REP8 50 alto 0,0.5,1,4,6,24 0.5
REP9 100 basso 0,0.5,1,3,6,24 0.5
REP10 100 basso 0,0.5,1,3,6,24 0.5

Tabella 4.2: le condizioni adottate nei dieci esperimenti di riparazione


condotti in questo lavoro

Figura 4.16: La frazione di DNA estratta nel gel, in funzione del tempo
di riparo. Oltre alla ripolimerizzazione del DNA a due velocità, dedotta
dalla diminuzione di FAR, si nota una persistenza del danno di background,
irreparabile.
4.3 Riparazione di dsb 79

spettri di complessità di dsb siano più larghi per la radiazione di alto LET,
dove un’alta densità di ionizzazione può causare molti tagli ravvicinati (figu-
ra 1.9), la tendenza bifasica dei diagrammi di FAR trovata in questo stesso
lavoro suggerisce che anche la radiazione sparsamente ionizzante è in grado
di indurre dsb complessi.
D’altra parte, aumentare il numero di esponenziali nei fit significa diminuire
il numero di gradi di libertà. Tenendo in mente lo spettro quasi continuo di
complessità di dsb, si può tuttavia spingere questo concetto di numero di
categori di dsb al limite, ed effettuare una convoluzione di esponenziali:
/ ∞
1
numero totale di frammenti = exp(−αt) dα = (4.3)
0 t
Si trova una dipendenza temporale di tipo iperbolico. Fowler ha mostrato
durante un seminario presso il Gray Laboratory che, centrando l’attenzione
sul concetto che un dsb è riparato se due frammenti vengono a trovarsi in
vicinanza l’uno dell’altro, si può partire da una diversa equazione differen-
ziale, secondo cui i frammenti (non i dsb diminuiscono come il quadrato di
quelli non ancora riparati:
dn 1 1
= −kn2 =⇒ = kt +
dt n n0
La dipendenza temporale cosı̀ trovata per il numero di frammenti non ricon-
giunti è di tipo iperbolico. Questo risultato è in accordo con quello che si
deriva supponendo uno spettro continuo di dsb riparati indipendentemente
(equazione 4.3).
Si può cercare di spingere l’analisi sperimentale un po’ oltre quello che si
può effettuare con la FAR, spostando l’attenzione sulla cinetica di riparo nelle
diverse regioni di lunghezza risolvibili nel gel. Il fondamento di questo ap-
proccio sta nell’idea che i dsb più ‘severi’ dovrebbero essere più strettamente
correlati, originati da un’alta deposizione di energia in un volume limita-
to: i frammenti cosı̀ formati sarebbero più corti. Se dunque c’è una corre-
lazione tra lunghezza del frammento e complessità del dsb che l’ha originato,
si dovrebbe osservare una cinetica più lenta nelle regioni di peso molecolare
più basso. Nelle figure 4.17 e 4.18 vengono mostrati i dati riassuntivi sulla ci-
netica di riparo lunghezza di DNA specifica. in assenza di un modello cinetico
per l’interpretazione di questo tipo di dati, non è stata eseguita alcun’analisi
quantitativa.
4.3 Riparazione di dsb 80

Figura 4.17: Il riparo lunghezza-specifico dei frammenti di DNA di più grande


peso molecolare. Il limite superiore della regione di peso più alto non è noto
con esattezza, in quanto esso si trova al di fuori della regione di calibrazione
di peso molecolare
4.3 Riparazione di dsb 81

Figura 4.18: Il riparo lunghezza-specifico dei frammenti di DNA di più piccolo


peso molecolare. Rispetto ai frammenti di lunghezze dell’ordine dei milioni
di coppie di basi, si nota qui la persistenza dei dsb spaziati meno di 200
kbp, in parte dovuta alla progressione del danno di fondo sul DNA durante
l’incubazione delle cellule.
Capitolo 5

Risultati e loro discussione

In altri lavori è stato trovato che i risultati dell’analisi del numero di dsb
radioindotti possono dipendere dal modello matematico utilizzato (Almod-
ovar et al. 1994, Cedervall et al. 1995). In particolare in (Almodovar et al.
1994) è stato trovato che per dosi inferiori a 20 Gy le stime effettuate con
il metodo distribution shape non sono consistenti con quelle effettuate con
altri modelli (analisi della frazione di massa estratta dai pozzetti o FAR,
modello broken stick ). Questo è in accordo con quanto è stato detto nel
capitolo 3 sul modello distribution shape: essenzialmente questo è una buona
approssimazione del modello broken stick, ma solo a dosi elevate. La tabella
5.1 riassume i risultati sperimentali ottenuti in questo lavoro dalle analisi
effettuate con i modelli discussi al capitolo 3, espressi in unità di dsb/Gy·bp.
L’indeterminazione rappresenta l’intervallo di confidenza al 68%.

I risultati relativi al modello BBBS sono medie pesate di valori stimati da


fit effettuati su singoli esperimenti. Si è scelto di esprimere il risultato come

induzione di dsb/(Gy·bp)X10−9
DS BS BBBS
60
Co-γ (8.9±0.8) (8.0±0.6) (11.8±0.6)
240 kVp X-rays (9±2) (10.4±0.4) (11.0±0.1)
RBE (rispetto ai 60 Co-γ)
DS BS BBBS
1.0±0.2 1.3±0.1 0.93±0.05

Tabella 5.1: Confronto tra le stime di induzione di dsb effettuate con i tre
modelli matematici discussi in questo lavoro. DS indica distribution shape,
BS indica broken stick e BBBS background biased broken stick.

82
Risultati e loro discussione 83

media pesata, perché la regressione si basa sull’assunto che la distribuzione


di background è, in ciascun esperimento, una retta in scala bilogaritmica,
e piccole deviazioni dalla dipendenza lineare in diversi esperimenti possono
produrre incertezze variabili con gli esperimenti.
Tutti i valori mostrati sono stati ricavati da analisi sui dati sperimentali
fino a 100 kbp circa, dal momento che includere dati relativi a frammenti più
piccoli peggiora sempre la qualità del fit, oltre che a fornire valori molto più
elevati per il numero di dsb radioindotti sull’intero genoma. Questo sottolinea
l’azione non random della radiazione, per cui le stime di dsb/Gy·bp dipen-
dono dalla regione esaminata, in contrasto con quanto scritto all’equazione
3.21 a pagina 51.
Il metodo distribution shape produce un’incertezza più elevata, special-
mente nel caso dei raggi X perché la regressione lineare è stata effettuata su
soli tre punti sperimentali (contro i 5 punti relativi al 60 Co, figura 4.8) ma
in generale le analisi effettuate con i tre modelli producono risultati molto
simili. Il modello BBBS fornisce un modo per ottenere una misura più ac-
curata, come si vede dagli errori sulle stime riportate in tabella 5.1. Questo
potrebbe essere legato al fatto che le correzioni per il background nei modelli
BS e DS non sono accurate (si rinvia al paragrafo 3.1.3), ed i dati ottenuti
da tali correzioni restano comunque influenzati dal danno di fondo nell’es-
perimento a cui si riferiscono. Ne risulta una fluttuazione nei dati ‘corretti
per il backgorund’ che verrebbe eliminata solo se il danno di fondo nei di-
versi esperimenti fosse sempre lo stesso. Con il modello BBBS non si tenta
nessuna sottrazione per il background sui campioni irraggiati. Le stime di
dsb radioindotti, effettuate in ciascun esperimento e poi utilizzate per calco-
lare una media pesata, sono effettivamente indipendenti dal livello di danno
indotto dallo sperimentatore, ammesso che questo sia matematicamente ben
rappresentato dalla funzione indicata a pagina 52 con il numero 3.24. Dai
valori mostrati in tabella 5.1 si può concludere che non è stata rilevata alcu-
na differenza significativa tra 60 Co-γ e raggi X da 240 kVp, quanto alla loro
capacità di indurre dsb.
Come più volte detto in precedenza in questa tesi, la scarsa bontà dei
fit nelle regioni di peso molecolare inferiori a circa 100 kbp è stata sem-
pre interpretata in letteratura come dovuta ad un meccanismo di induzione
non random di dsb. Riprendendo il concetto di randomicità esposto a pag-
ina 40, ciò significherebbe che esistono regioni di DNA più esposte di al-
tre all’insulto della radiazione e/o che dsb vicini sono correlati, in quanto
originati da uno stesso evento di deposizione di energia. Diversi studi sono
avviati verso la prima strada, nei quali si studia la depolimerizzazione in
particolari regioni di DNA, mediante tecniche di ibridizzazione di specifiche
sequenze (Löbrich et al. 1994a, Löbrich et al. 1994b, Löbrich et al. 1996,
Risultati e loro discussione 84

Sak et al. 1996). Questi studi focalizzano maggiormente sulla conformazione


tridimensionale di particolari regioni di DNA, quelle che, dovendo essere ac-
cessibili ai meccanismi enzimatici di trascrizione, sono meno protette dalle
proteine strutturali che di norma sono associate al DNA. Altri studi invece
(tra i quali questo lavoro) hanno centrato la loro attenzione sulla distribuzione
di dsb in tutto il DNA genomico (Newman et al. 1997, Rydberg 1996) ma non
su particolari sequenze di DNA e sull’informazione che queste contengono,
trovando un eccesso di frammenti di DNA in regioni di peso molecolare di
lunghezza, in generale, inferiore a 100 kbp.
L’assunzione che il DNA sia un lungo ‘bastoncino’ sul quale la radiazione
distribuisce tagli in maniera stocastica, è un po’ grossolana se si guarda la
macromolecola da distanze ravvicinate. Il DNA è ‘avvolto’ nella cellula in
diverse strutture superiori della doppia elica, come la già citata fibra di cro-
matina da 30 nm e le anse (loops) di 10-200 kbp della fibra di cromatina
stessa, attaccate ad una matrice proteica (illustrazione 2.7). Questi avvolgi-
menti consentono di mettere 5 miliardi di coppie di basi, per un totale di 1.7
metri lineari di filamento di DNA a doppia elica, in una sfera del diametro
di pochi micron, il nucleo cellulare.
La radiazione interagisce piuttosto con questo tipo di strutture, e si può
immaginare che un’alta densità di energia depositata in volumi di dimensioni
comparabili con quelle del diametro della fibra di cromatina (o le dimensioni
delle sue anse) possa originare dsb vicini sul DNA, correlati. È d’uso ormai
dividere i livelli di correlazione di danno in locally multiply damaged sites
(LMDS) e regionally multiply damaged sites (RMDS). I primi si riferiscono
ad eventi di danneggiamento molto vicini sul DNA, che ricoprono regioni
lunghe poche coppie di basi. Il concetto di LMDS riveste un ruolo di pri-
maria importanza nello studio del danno indotto da radiazioni densamente
ionizzanti, per cui un dsb può essere associato ad altri tipi di danno a distanza
ravvicinata, che rendono il dsb stesso più difficile da riparare dai meccanismi
enzimatici cellulari (Ward 1985).
Il concetto di RMDS si riferisce invece a danno correlato su dimensioni
maggiori, da 100 bp fino a 200 kbp circa. Questi clusters sono originati
dall’interazione della radiazione con i citati super avvolgimenti del DNA. In
questo campo, uno degli studi pioneristici ai quali si fa spesso riferimento
è quello teorico (che coinvolge l’uso di simulazione di traccia di particelle
cariche con il DNA, con il metodo di Monte Carlo) condotto da Holley e
Chatterjee (Holley and Chatterjee 1996) in parallelo a quello sperimentale
di Rydberg (Rydberg 1996). In questi lavori essi hanno studiato la pro-
duzione di frammenti di DNA di dimensioni simili a quelli dei ‘periodi’ delle
strutture secondarie del DNA. Un esempio sono i frammenti la cui lunghezza
Risultati e loro discussione 85

corrisponde ad un giro del solenoide (periodo di solenoide, 1kb), giri intorno


ai nucleosomi (periodo di nucleosoma, ∼200 bp), o frammenti ancora più
piccoli, corrispondenti a sequenze di DNA più esposte, che collegano due nu-
cleosomi (linker di nucleosoma, 85 coppie di basi). Per queste strutture di
organizzazione si rimanda all’illustrazione 2.7. I loro risultati mostrano un
buon accordo tra teoria ed esperimenti, e vengono spesso invocati per dire
che la radiazione non agisce in modo random in questo ordine di lunghezze.
In questo studio, avendo utilizzato la marcatura con 14 C, la sensibilità di
misura nelle regioni di basso peso molecolare è stata limitata e non si sono
mai osservati frammenti di lunghezze confrontabili con quelle di periodi di
nucleosoma o di solenoide, tutt’al più si è riusciti a misurare la produzione
di frammenti di 30 kbp, per i quali il segnale di dpm era ancora apprezz-
abile. Nelle regioni di peso molecolare studiate si è trovata una deviazione
tra predizione teorica ed esperimenti nel numero di dsb che danno origine a
frammenti di lunghezze inferiori a 100 kbp, in accordo generale con il con-
cetto di RMDS. Nel dubbio che queste deviazioni fossero dovute, in parte,
alla procedura di analisi sperimentale, è stato sviluppato un approccio alter-
nativo, il metodo BBBS. Anche utilizzando questo tipo di analisi sono state
trovate delle discrepanze nelle regioni di peso molecolare di cui sopra. Come
accennato al paragrafo 4.2.1, si è stimato l’eccesso di frammenti in queste
regioni rispetto al modello random di induzione di dsb. La domanda che ci
si era posti era infatti :

‘Fino a che punto l’eccesso di frammenti di DNA trovati con le


analisi convenzionali è dovuto a processi di induzione non random,
e quanto le stime sono influenzate dal danno inflitto sul DNA
prima dell’irraggiamento?’

Si è perciò deciso di confrontare le stime sull’eccesso di frammenti di DNA,


effettuate con entrambi i modelli BBBS e BS tradizionale, nelle regioni di peso
30-60 kbp. È nato subito il problema di come mettere a confronto le due
stime, essendo le funzioni dei sue modelli normalizzate a valori diversi. Per
il modello BS la stima dell’eccesso di frammenti di DNA di peso molecolare
M è stata effettuata come segue:

v(M) − BS(M)
100 · (5.1)
BS(M)
avendo indicato con v(M) il valore sperimentale della distribuzione di
densità di frammenti, media su tutti gli esperimenti disponibili, e con BS(M)
il valore atteso per lo stesso peso molecolare, stimato con la funzione di
densità del modello broken stick (pagina 47, formula numero 3.18, escluso il
Risultati e loro discussione 86

regione broken stick background biased broken stick


60 kbp 400±200 400±600
30 kbp 1200 ± 400 200±300

Tabella 5.2: L’eccesso di dsb rispetto ad un modello d’induzione random,


valutato utilizzando i modelli BS e BBBS. Valori percentuali.

termine di Dirac). Il parametro µ nella funzione BS(M) di formula 5.1 è quello


indicato a pagina 82 in tabella. Questa analisi è stata effettuata per i raggi X
a 100 Gy perché si disponeva di più dati sperimentali. La figura 5.1 mostra
graficamente la grandezza di cui all’equazione 5.1. La freccia al pannello (B)
indica la deviazione dei dati sperimentali dal modello di induzione random
di dsb, per un particolare peso molecolare in un esperimento.
La stima dell’eccesso di dsb è stata effettuata con il modello BBBS, in
parallelo per ciascun esperimento, come segue:

v2(M) − BBBS(M)
100 · (5.2)
BBBS(M) − back(M)
dove BBBS(M) è il valore della funzione di densità del modello back-
ground biased broken stick (pagina 54, formula 3.28) e back(M) rappresenta
il valore della funzione di background (formula 3.24) per il peso molecolare
M. Come prima, BBBS(M) nella formula 5.2 è stato parametrizzato dal val-
ore indicato in tabella a pagina 82. Nel pannello (A) della figura 5.1 sono
mostrate due frecce, rappresentative delle grandezze a numeratore (la più
grande) denominatore (la più piccola) dell’equazione 5.2.
v % (M) nella formula 5.2 è diverso dal termine v(M) della formula 5.1,
in quanto rappresenta un valore sperimentale non corretto per il danno di
fondo. Ciò che è scritto al denominatore della 5.2 è sicuramente suscettibile
alle critiche sulla sottrazione per il danno di fondo di cui si è parlato più
volte in questo lavoro, ma lo scopo che ci si era qui prefissato era quello
di fornire stime quantitative, che potessero servire da confronto per le con-
clusioni traibili dai modelli BS e BBBS, quanto all’eccesso di frammenti di
lunghezze dll’ordine di 30-60 kbp.
I risultati trovati con questa analisi sono riassunti nella tabella 5.2, espres-
si come deviazioni percentuali.
Sebbene ci sia un’indicazione che le deviazioni dei dati sperimentali dalla
predizione teorica effettuata con il modello broken stick sono maggiori delle
corrispondenti effettuate con il modello background biased broken stick, si
deve concludere che la sensibilità del metodo sperimentale è troppo limitata
Risultati e loro discussione 87

Figura 5.1: La stima dell’eccesso di frammenti di DNA rispetto ai modelli di


induzione random di dsb: background biased broken stick (A) e broken stick
(B). In (A) le frecce mostrate nel riquadro rappresentano le deviazioni di
un particolare dato sperimentale (17 kbp) e della curva BBBS stimata dai
dati dello stesso esperimento (curva tratteggiata) dalla distribuzione di DNA
originata dal danno di fondo al DNA (curva continua). In (B) la freccia
rappresenta la deviazione dello stesso dato sperimentale, stavolta corretto
per il danno di fondo, dalla curva del modello broken stick, parametrizzata
dallo stesso numero di dsb radioindotti rispetto al pannello (A).
5.1 Confronto con risultati di altri lavori 88

perché ciò possa essere affermato con sicurezza. I risultati in tabella 5.2
indicano che la non randomicità dell’azione della radiazione, dedotta dai
risultati dell’analisi con il modello broken stick tradizionale, è sovrastimata.
L’eccesso di frammenti trovati nella regione di 30 kbp è in parte dovuto
all’erronea procedura dell’analisi broken stick, non soltanto all’interazione
non random della radiazione con il DNA.
È lecito chiedersi ”Che cosa è che nell’analisi dei dati con il modello broken
stick conduce a risultati fuorvianti?” L’interpretazione è che nelle regioni di
alto peso molecolare (tipicamente qualche Mbp) si ha un’eccessiva correzione
per il danno di fondo, quando questa è effettuata per sottrazione della massa
di DNA in ciascuna regione di peso molecolare. È stato indicato che, nella
regione di peso molecolare intorno a 5 Mbp, questa correzione porta persino
a valori negativi per quella che è stata chiamata la frazione ‘netta’ di DNA
(paragrafo 3.1.3) già a dosi di 100 Gy. Trattandosi di una sovracorrezione nei
valori alle estremità superiore del range dei dati sperimentali disponibili, la
curva stimata con il metodo dei minimi quadrati è forzata a passare per tali
punti, cosı̀ che i risultati del fit per il parametro ‘numero di dsb radioindotti’
sono, in media, più bassi. Di conseguenza, le curve corrispondenti deviano
maggiormente dai dati sperimentali nelle regioni di peso molecolare inferiore,
per le quali l’effetto correttivo è più limitato (si rimanda all’illustrazione a
pagina 49 per una visualizzazione della dipendenza non lineare con la dose
delle funzioni di distribuzione di massa).
Comunque, se i risultati dell’analisi sui dati sperimentali di cui alla tabella
5.2 fossero confermati in altri lavori, ed in regioni di peso molecolare anche
inferiore, come quelli studiati nel lavoro di Rydberg (Rydberg 1996), le
informazioni ottenute sarebbero preziosissime per lo sviluppo di modelli al
calcolatore per la simulazione dell’interazione tra la radiazione ed il materiale
ereditario, del tipo proposto da Holley e Chatterjee (Holley and Chatterjee
1996).

5.1 Confronto con risultati di altri lavori


Il modello background biased broken stick, e tutta l’analisi dell’effetto del
danno di background al DNA sulla valutazione della stocasticità della depo-
sizione della radiazione, il risultato principale di questo lavoro, non hanno
precedenti il letteratura, pertanto, non è possibile effettuare confronti con
risultati pubblicati da altri laboratori.
È possibile invece confrontare i risultati ottenuti dalla misura della ca-
pacità della radiazione di indurre dsb, nella fattispecie i fotoni 60 Co-γ ed i
raggi X da 240 kVp. Nella tabella 5.1 vengono riassunti alcuni dei risultati
5.1 Confronto con risultati di altri lavori 89

Autore Calcolo dsb/(Gy·bp)·10−9 Cellule Radiazione


(Whitaker et al. 1995) integrale 3.6÷9.7 9 linee 60
Co-γ
(Badie et al. 1995) integrale 4.4±0.2 HF19 137
Cs-γ
4.0±0.4 AT2
4.6±0.4 180BR
(Cedervall et al. 1994) integrale 4.6 U1810 250 kVp X
5.1 U1285
(Foray et al. 1997) integrale 6.0±0.6 11 linee 60
Co e 137 Cs-γ
(Löbrich et al. 1995) ibridizzazione 5.8 GM38 225 kVp X
(Löbrich et al. 1996) diff. ed ibrid. 10.7 GM38 150 kVp X
(Löbrich et al. 1994a) ibridizzazione 6.3 SP3 80kVp X
(Rydberg 1996) differenziale 5.8 GM38 225 kVp X
(Stenerlöw et al. 1996) integrale 5.6±0.3 U343MG 60
Co-γ
(Stenerlöw et al. 1994) integrale 4.2±0.2 tre linee 60
Co-γ
(Weber and Flentje 1993) integrale 22 CASKI 60
Co-γ
9.1 50 kVp X

Tabella 5.3: Risultati di alcuni esperimenti di induzione di dsb condotti in


altri laboratori.

trovati in letteratura per l’induzione di dsb da diverse radiazioni sparsamente


ionizzanti, relativamente a cellule umane.
Si vede dalla tabella 5.3 che la maggior parte delle analisi è stata eseguita
sui valori di FAR sperimentali o con altri metodi di calcolo di tipo integrale.
I valori misurati per la capacità di indurre dsb delle radiazioni sparsamente
ionizzanti sono quasi sempre più bassi di quelli riportati in questo lavoro
(per i quali si rimanda a pagina 82). Si osserva però che quando vengono
utilizzati approcci quantitativi di tipo differenziale, le stime per la capacità di
indurre dsb sono, in media, più alte. L’interpretazione è che i metodi integrali
sono troppo poco sensibili alla frazione di massa presente nelle regioni di
peso molecolare più piccole, per cui le stime sono pesate dai frammenti delle
lunghezze di qualche Mbp, che guidano i riultati dei fit verso valori inferiori
per il numero di dsb/(Gy·bp).
Quanto agli esperimenti di riparazione, il protocollo sperimentale è sta-
to migliorato con il tempo, ma solo negli ultimi esperimenti si è riusciti a
trovare le condizioni che limitano il progresso del danno di fondo nelle cellule
incapsulate in agarosio. Non è stato possibile pertanto effettuare un’analisi
quantitativa. Oltretutto, mentre si dispone di una vasta scelta per i mod-
elli matematici da utilizzare per l’analisi dei dati diesperimenti di induzione
di dsb, la letteratura scientifica non è altrettanto generosa in modelli per lo
studio della cinetica di riparo dei dsb, in particolar modo lunghezza-specifica.
Appendice A

Approssimazione n(M ) · M · ∆M

Nell’analisi dei gel relativi ad un esperimento di induzione (o di riparo) di


dsb occorre convertire le misure della frazione di massa di DNA in frazione
del numero totale di frammenti, per ciascuna regione di peso molecolare
disponibile. Se la marcatura radioattiva del DNA è uniforme, la misura della
radioattività incorporata in ciascuna regione rappresenta la frazione di massa
di DNA presente. Considerando continue la variabile M e la distribuzione
n(M) del numero di frammenti di massa M, si ha per la frazione di massa:
/ M2
W = n(M)M dM (A.1)
M1

avendo indicato con W la frazione di massa, con M1 ed M2 l’estremo


inferiore e superiore del peso molecolare nella sezione scelta, e con n(M) la
frazione del numero di frammenti di lunghezza M.
L’integrale espresso nella A.1 viene generalmente approssimato con la
seguente espressione:

W $ n(M ) · M · ∆M (A.2)
dove n(M ) è la frazione del numero di frammenti di lunghezza M ed
∆M = M2 − M1 è l’intervallo di peso molecolare nella regione considerata.
Essendo però n(M) continua, si ha per il ben noto teorema della media:

/ M2 / M2
W = n(M)MdM = g(M) dM =
M1 M1

g(M) · (M2 − M1 ) (A.3)

Si vede subito che la A.3 ed il secondo membro della A.2 non sono uguali:

90
Approssimazione n(M) · M · ∆M 91

) M2 ) M2
M1
n(M)M dM n(M ) · M1
M dM
g(M) = n(M) · M = ,= = n(M ) · M
M2 − M1 M2 − M1
(A.4)
La formula A.2 equivale alla A.1 solo se n(M) è costante nella regione
considerata. In tal caso infatti n(M) può essere portato fuori dall’integrale
A.1 e posto pari a n(M ). L’integrazione fornisce poi il peso molecolare medio
M moltiplicata la larghezza della banda.
E’ l’approssimazione A.2 accurata? In altre parole, è n(M) ‘sufficiente-
mente’ costante in un segmento di gel della tipica lunghezza di 1 cm? Per
rispondere a quest’ultima domanda si può espandere n(M) in serie di Taylor,
intorno al valore medio di peso molecolare di una regione qualsiasi:

! !
dn !! * + d2 n !! * +2
n(M) = n(M ) + ! M −M + ! M − M + ... (A.5)
dM M dM 2 M
ignorando tutti i termini maggiori della prima potenza segue dalla A.5
che n(M) $ n(M ) se:
* + dn ! !
M − M · dM ! ∆M dn !! 1
M
≤ · ! · *1
n(M ) 2 dM M n(M )
ovvero
!−1
∆M dn !!
* · n(M ) (A.6)
2 dM !M
o ancora
!−1
∆M d ln n(M) !!
* ! (A.7)
2 dM M
Per valutare se la relazione A.7 è soddisfatta, in funzione della regione
di peso considerata perché compare M, occorre conoscere la funzione n(M).
Questa può esser tratta dal modello Broken stick, basato su induzione di dsb
random sul DNA1 . Si riporta qui la funzione di distribuzione di densità di
molecole di DNA predetta dal modello BS:
" $ %# $ %
µ M µM
n(M) = 2+µ 1− exp − (A.8)
S S S
1
Utilizzare il modello background biased broken stick introdurrebbe ulteriori
complicazioni
Approssimazione n(M) · M · ∆M 92

ricavata al paragrafo 3.1.2 e derivata per la prima volta in (Contopoulou


et al. 1987), dove S è la lunghezza del genoma intatto prima dell’irraggia-
mento, µ è il numero di dsb inflitti dalla radiazione ed M è la variabile peso
molecolare.
Prima di procedere ed effettuare la derivata della funzione A.8 per la sti-
ma della validità della A.7, si può notare che nelle regioni di peso molecolare
studiate in questo lavoro (10 kbp-6 Mbp) e per dosi sufficientemente elevate,
la forma della funzione indicata in A.8 è dominata dal termine esponenziale.
Questo è stato osservato anche nel paragrafo 3.1.2 quando si è detto che il
modello Distribution Shape è una buona approssimazione del Broken Stick.
Come tutti gli esponenziali, la sua derivata sarà essa stessa una esponenziale,
con una costante moltiplicativa. Nelle condizioni indicate, la derivata log-
aritmica di cui alla A.7 sarà quindi una costante, precisamente pari a S/µ,
ovvero il peso molecolare medio Mn delle molecole di DNA.
Quanto detto si può osservare anche effettuando direttamente la derivata
del logaritmo della funzione di densità di frammenti n(M):
" $ %#
µ M µM
ln n(M) = ln + ln 2 + µ 1 − −
S S S
derivando si ha:
 ' (
! 3 + µ 1− M
d ln n(M) !! µ S µ
! = − ' ( $ −
dM M S 2+µ 1− M S
S

che non è più dipendente dal peso molecolare M. La A.7 si può perciò
riscrivere come:
∆M S
*
2 µ
e ricordando che S/µ = Mn :
∆M
*1 (A.9)
Mn
Una relazione che può non essere soddisfatta in certe regioni di peso
molecolare, a certe dosi particolarmente elevate, in quanto dipende sia da
∆M che da Mn . Se si considera ∆M dell’ordine di 105 ÷ 106 bp e µ circa
pari a 5000 (a 100 Gy), per esempio, Mn vale 106 e la condizione A.9 non è
soddisfatta. Si potrebbe cercare di forzare sperimentalmente ∆M ad un val-
ore più ridotto, ma ciò significherebbe diminuire anche il numero dei conteggi
di 14 C nel segmento considerato e quindi ridurre la sensibilità della misura.
Approssimazione n(M) · M · ∆M 93

Se la A.9 non è soddisfatta, l’approssimazione A.2 non consente di stimare


n(M ) da W in modo affidabile.
Si può raffinare l’approssimazione A.2 considerando anche il primo ter-
mine dell’espansione in serie di n(M) (A.5).
Da n(M) al primo ordine:
!
dn !! * +
n(M) $ n(M ) + M − M
dM !M

ricaviamo:

/ M2
W ≡ n(M)M dM $
M1
" $ % # / M2
1 M S * +
n(M ) · M · ∆M − exp − · M − M · M dM
Mn2 Mn Mn M1

e dalla A.8:

$ %
n(M ) ' 2 2
( 2
σM
W $ n(M )·M ·∆M − · M ∆M − M ∆M = n(M )·∆M · M −
Mn Mn
(A.10)
La relazione A.10 mostra il livello di approssimazione al primo ordine della
A.1 per n(M). A spese di un’approssimazione migliore della A.2, si vede che
nella A.10 compare la grandezza che si vuole stimare nelle regressioni sui
dati sperimentali. Si può procedere allora per approssimazioni successive,
stimando Mn all’ordine zero per n(M), per poi utilizzare il risultato trovato
per Mn e calcolare ricorsivamente n(M ) dalla A.10, e su questi valori di n(M )
eseguire una nuova regressione sui dati.
Le regressioni lineari per l’analisi della pendenza del modello distribution
shape dovranno essere quindi effettuate su dati graficati come:
 
FDN A
ln  ' ( V s M
σ2
M − MMn ∆M

per ottenere, come al solito, una stima della depolimerizzazione radioin-


dotta a partire dalla pendenza della retta, −1/Mn . Anche nell’analisi Broken
Stick, per graficare il numero di frammenti in funzione del loro peso moleco-
lare medio, ad una certa dose, occorre tenere conto della nuova relazione tra
n(M ) e W (o FDN A ) :
Approssimazione n(M) · M · ∆M 94

" $ %# $ %
FDN A µ M µM
' 2
( = 2+µ 1− exp −
σM
M − Mn ∆M S S S

con µ parametro da stimare.


Quando si applicano queste correzioni ai dati si vede che l’effetto è com-
pletamente mascherato dall’errore sperimentale. Il fattore correttivo che dis-
tingue l’approssimazione al primo ordine A.10 da quella d’ordine zero (A.2)
dell’equazione A.1 dipende dal segmento di gel, cosı̀ come dal protocollo elet-
troforetico utilizzato per separare i frammenti di DNA, data la dipendenza
2
da σM . Il termine Mn diminuisce con la dose, ciò comporta che la correzione
al primo ordine per n(M), per un dato segmento di gel, è più sensibile alla
alte che alle basse dosi.
Per completezza si è studiato l’effetto dell’espansione al secondo ordine
per n(M) sull’approssimazione della A.1. Da quanto osservato sulla dominan-
za del temine esponenziale nelle funzioni n(M) ed dn/dM, si può far vedere
che l’espansione al secondo ordine di n(M) aggiunge un termine positivo per
la densità di frammenti di DNA:
/ M2
1 * +2
n(M ) · 2 · M − M M dM
Mn M1

L’integrale fornisce per questo termine una dipendenza dai momenti su-
periori della distribuzione di densità di frammenti. Il peso molecolare medio
M che compariva nella A.2 viene adesso sostituito da:
' (
2 M 3 − 2M · M 2 + M 3
σ
M −→ M − M + (A.11)
Mn Mn2
Conclusione: Approssimare n(M) al suo valore nel punto medio di cias-
cuna regione delle corsie elettroforetiche non introduce un errore superiore
a quello sperimentale. L’equazione A.2 fornisce un modo semplice e rapido
per convertire la massa di DNA, misurata in una certa regione, in densità di
frammenti di DNA. Tale conversione è stata effettuata in tutti gli esperimenti
condotti in questo lavoro.
Appendice B

Dosimetria di Fricke

Effettuare una dosimetria significa misurare la dose rilasciata da un certo tipo


di radiazione, ad una particolare distanza dalla sorgente da cui questa viene
emessa, in un determinato materiale. Tipicamente, si effettua una misura
della dose depositata nell’unità di tempo (dose rate).
Nella dosimetria chimica, la dose viene determinata misurando la vari-
azione nella composizione di un opportuna sostanza per effetto del rilascio
di energia da parte della radiazione. Questi liquidi dosimetrici consistono
sempre di soluzioni acquose diluite, come ad esempio la soluzione di Fricke
che è stata usata in questo lavoro. Poiché anche le cellule sono essenzial-
mente costituite di acqua, le misure effettuate sulle soluzioni dosimetriche
forniscono con buona approssimazione anche la dosimetria nelle cellule.
Trattandosi di soluzioni acquose, si dà per assunto in genere che l’inter-
azione avvenga con le molecole del solvente, cioè l’acqua, e che diano origine
a specie radicali come H• ed OH• , cosı̀ come specie molecolari altamente reat-
tive come H2 ed H2 O2 . Queste specie chimiche vengono originate presso la
traccia delle particelle ionizzanti, per cui la loro distribuzione è inizialmente
eterogenea nella soluzione. Dopo 10−6 secondi dall’evento di ionizzazione
primario però esse tendono a diffondere nella soluzione, cosı̀ che ogni in-
formazione sulla loro distribuzione di densità iniziale viene persa. Oltre a
diffondere, esse possono anche ricombinare fra loro e neutralizzarsi, ad una
velocità che è misurata da un coefficiente di estinzione, dipendente dalla
temperatura, cosı̀ come dalla concentrazione delle molecole.
La produzione della specie chimica che si vuole misurare viene misurata in
valore G, ovvero come numero di entità prodotte a seguito del rilascio di una
dose di 100 eV. Più recentemente è stata introdotta una nuova unità di misura
che viene detta radiation chemical yield G(X), misurata in moli/Joules. Dal
momento che i valori di resa G(X) sono dell’ordine di 10−6 -10−7 moli/Joule,
dosi basse come 10 Gy richiedono strumenti abbastanza sensibili per misurare

95
B.1 La soluzione di Fricke 96

variazioni di concentrazione della specie osservata dell’ordine di 10−5 − 10−6


M. L’uso di tali strumenti richiede particolari accorgimenti nell’uso dei con-
tenitori nei quali viene introdotta la soluzione dosimetrica. Vengono utilizzati

contenitori in vetro che devono essere riscaldati a temperature di 400 C per
eliminare tracce di elementi organici che potrebbero interferire con le misure.
Dalla misura della resa G(X) si ricava una stima della dose media rilas-
ciata nel mezzo:
∆M
D= (B.1)
ρG(X)
dove ∆M è la variazione di molarità della specie chimica osservata e ρ è
la densità della soluzione. Si assume che la resa G(X) sia costante in tutta
la variazione di concentrazione ∆M.

B.1 La soluzione di Fricke


Nel sistema dosimetrico di Fricke si misura l’ossidazione radioindotta dello
ione ferroso (Fe2+ ) a ione ferrico (Fe3+ ). La soluzione di Fricke è composta
da FeSO4 0.001 M e da 0.8 N H2 SO4 , in acqua distillata di elevata purezza.
Il solfato di ferro si ossida spontaneamente nel tempo a Fe2 (SO4 )3 . Si può
limitare l’ossidazione mantenendo la soluzione all’oscurità e basse tempera-
ture. Dal momento che la produzione di trisolfato diferrico da ossidazione
naturale del solfato simula gli effetti della radiazione, bisogna sempre utiliz-
zare soluzioni ‘fresche’ e misurare il livello di background di Fe2 (SO4 )3 prima
dell’irraggiamento.
La specie chimica di cui si misura la resa G(X) è lo ione Fe3+ , il cui valore
è legato all’energia assorbita dalla relazione 1.036·10−6moli/J . La misura
di produzione di ioni Fe3+ viene effettuata tramite uno spettroscopio, che
rileva l’assorbimento attraverso il campione di raggi UV di lunghezza d’onda
pari a 304 nm. L’output è la variazione della densità ottica ∆(OD) della
soluzione, legata all’intensità a 304 nm prima (I0 ) e dopo l’irraggiamento (I)
dalla formula:

I/I0 = 10−∆(OD)

La variazione di densità ottica è data da:

∆(OD) = * · l∆M (B.2)



dove * è il coefficiente di estinzione dello ione Fe3+ (2121M−1 cm−1 a 20 C
e 304 nm), l è il cammino della luce nel campione (tipicamente 1 cm) e ∆M
B.1 La soluzione di Fricke 97

è la variazione della molarità dello ione Fe3+ . Prendendo ∆M dalla B.2 e


sostituendolo nella B.1 si ottiene:

∆(OD)
D= (B.3)
* · lρG(X)
dove ρ per la soluzione di Fricke vale 1.024 g/cm3
Per ciascuna delle tre posizioni A, B e C sulla maschera d’irraggiamento
presso la sorgente di 60 Co è stata misurata la variazione di densità ottica
nella soluzione di Fricke, in seguito ad irraggiamento per diversi tempi. Dal
momento che il coefficiente di estinzione * dipende dalla temperatura, si è
avuto cura nel corso delle misure di controllare il valore della temperatura
della soluzione campionata. Per ciascuna temperatura sono stati tratti i
corrispondenti valori di * da una tabella.
Misure della ∆(OD) Vs tempo sono state utilizzate per costruire grafici
e per effettuare regressioni lineari. I valori della pendenza trovata, espressi
come ∆(OD)/min, sono stati convertiti in dose rate (dose/min) con l’ausilio
dell’equazione B.3.

Figura B.1: La dosimetria di Fricke. Le lettere A, B e C indicano la posizione


del campione

La figura B.1 mostra le rette ottenute nelle tre regressioni lineari effet-
tuate. Nel corso dei mesi in cui sono stati svolti gli esperimenti è stato
B.1 La soluzione di Fricke 98

tenuto conto del decadimento del 60 Co, aumentando il tempo d’esposizione


dei campioni in funzione della diminuzione del dose rate.
Appendice C

Prodotti Chimici

1 M Tris

121.1 g Tris in 800 ml H2 O filtrata Millipore


pH 8.0 si ottiene con 42 ml di HCl
portare ad un litro soluzione aggiungendo H2 O

5XTE Buffer pH 7.5

25 ml 1M Tris
1mM EDTA

5XTBE

54 g Trizma base
27.5 g acido borico
20 ml EDTA 0.5 m (pH 8)
portare fino ad un litro in H2 O

50XTAE

242 g Trizma base


57.1 ml acido acetico
100 ml 0.5 m EDTA (pH 8)
portare ad un litro in H2 O

0.5 m EDTA

99
93.05 g EDTA in 400 ml H2 O.
5 g NaOH in capsule
il pH viene portato ad 8 aggiungendo NaOH quanto basta
diluire a 500 ml di H2 O

proteinasi K

20 mg/ml in H2 O sterile

Colorazione con Bromuro di Etidio


50 µl in 1 l 0.75XTAE buffer

Acidificazione del liquido scintillante

26 ml di acido acetico in 3.75 l di liquido scintillante.

Terreno di coltura cellulare α-MEM


500 ml modificazione α dell’EAGLE’s MEM
Penicillina-Streptomicina (SIGMA) 16.6 ml
Siero fetale di bovino 133 ml
Glutammina 6.64 ml
Aminoacidi non essenziali 6.64 ml
Nucleotidi 1.33 ml

Terreno di coltura tamponato con HEPES


Per 500 ml:
10 ml HEPES
5.6 ml NaHCO3 (7.5 % peso/volume)
37.5 ml FBS
50 ml 10X MEM Eagle per sospensioni cellulari
5 ml Glutamina
600 mg Benzylpenicillina
1 g Streptomicina solfato
H2 O fino a 500 ml

Soluzione di lisi di membrane cellulari

1% N-Laurylsarcosyne
0.5 mg/ml proteinasi K
0.5 M buffer EDTA
Ringraziamenti

Desidero ringraziare il mio relatore prof. Gianfranco Grossi ed il mio cor-


relatore dott. Maurizio Conti per gli utilissimi consigli che hanno guidato
questa tesi alla sua stesura finale. Un sentitissimo ringraziamento va al prof.
Barry Michael, al dott. Kevin Prise, Heidi Newman e Marjorie Hance, per
l’inestimabile supporto fornito presso il Gray Laboratory, cosı̀ come a tutto
il gruppo di biofisica molecolare e cellulare.
Senza l’aiuto del dottor Marco Durante questo lavoro non sarebbe stato
svolto presso il Gray Laboratory, a lui va un sincero grazie.

101
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