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ABSORCIÓN DE GLUCOSA EN EL
INTESTINO AISLADO DE HÁMSTER

Blanca Ruiz Muñoz y Deepali Sharma Sharma

Fisiología Molecular de Animales
Grado en Bioquímica
INTRODUCCIÓN
La absorción de nutrientes tiene lugar mayoritariamente en el intestino delgado. Éste presenta
distintas diferenciaciones para aumentar considerablemente el área de absorción, como son la
presencia de vellosidades y “borde en cepillo” de las células epiteliales creado por numerosas
microvellosidades en la parte apical. La absorción no se encuentra directamente regulada, pero se
ve en gran medida afectada por la motilidad y secreción en el tubo digestivo, procesos que a su
vez están regulados por hormonas, sistema nervioso y mecanismos de control local.
Aproximadamente la mitad de las calorías de la dieta corresponden a hidratos de carbono,
principalmente almidón y sacarosa. El transporte intestinal de los hidratos de carbono está
limitado a los monosacáridos. Es decir, todos los hidratos de carbono complejos y disacáridos han
de ser digeridos previamente a monosacáridos para ser absorbidos. Esta degradación tiene lugar
gracias a la amilasa y a la disacaridasa. Los productos terminales de la digestión de los hidratos
de carbono son la glucosa, galactosa y fructosa (1).
La obesidad, la diabetes tipo II y el síndrome metabólico son algunos de los principales
desórdenes médicos y retos económicos de la sociedad moderna. La desregulación de la gestión
de los hidratos de carbono, un aumento de la ingesta de éstos (y de grasas) y una reducción de la
sensibilidad del receptor de la insulina contribuyen al desarrollo de desajustes metabólicos. Por
ello, medicamentos que reduzcan la absorción de D-glucosa en el intestino delgado (o reabsorción
renal de la misma) o que modulen la secreción de hormonas insulinotrópicas pueden aportar
nuevas estrategias terapéuticas (2). Para poder conseguirlo se necesita una plena comprensión de
los mecanismos moleculares subyacentes a los transportadores que median los movimientos de
D-Glucosa en el intestino delgado.
Se conoce que el transportador SGLT1 media la captación de glucosa a bajas concentraciones de
la misma a través de la membrana de borde en cepillo (BBM) del intestino delgado, y que
abandona los enterocitos gracias al transportador de glucosa GLUT2 a través de la membrana
basolateral. SGLT1 es un simportador glucosa/Na+, y que por tanto requiere de la energía de la
ATPasa Na+/K+ para mantener el gradiente de sodio (3). Hay estudios que sugieren que, tras una
comida rica en carbohidratos, GLUT2 es capaz de incorporarse a la membrana apical permitiendo
la absorción en masa de glucosa (4). Sin embargo, otros estudios muestran que la deposición de
GLUT2 no afecta de manera significativa a la tasa de transporte de glucosa, refutando esta
hipótesis (5). Distintos experimentos identifican SGLT1 como la vía primaria del transporte de
glucosa a través de la membrana apical y que además es esencial para la liberación del péptido
inhibidor pancreático (GIP) y péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1) (6). La fructosa, por otra
parte, es transportada a través de la membrana apical por GLUT5. No es necesario un
transportador activo puesto que las concentraciones de fructosa en plasma son insignificantes
frente a las de glucosa. A diferencia de GLUT5, altamente especifico para fructosa, GLUT2
transporta tanto glucosa como fructosa, proporcionando una vía de salida común del enterocito
para ambos monosacáridos (4). Parece ser que el metabolismo de las células intestinales difiere
del metabolismo del resto de células puesto que no utilizan la glucosa como fuente de energía.
Estudios actuales apuntan al uso de glutamina como principal fuente de energía, permitiendo así
que la glucosa absorbida pase sin modificaciones al torrente sanguíneo (1).
Para estudiar el transporte intestinal se usan numerosas técnicas in-vitro como son la técnica del
saco invertido, la técnica de la cámara de utilización (“ussing chamber”), aislamiento de células
epiteliales, así como aislamiento de membranas de borde en cepillo y basolateral de enterocitos
(7). En este caso estudiaremos la absorción de glucosa en el intestino de hámster mediante la
técnica del saco invertido. Esta técnica se introdujo por primera vez en 1954 por Wilson y
Wiseman (8), y desde entonces se ha ido perfeccionando con ánimo de aumentar la viabilidad del
tejido y mantener intacto el epitelio mucoso. Las ventajas que presenta la técnica es la gran

1
superficie disponible para la absorción y la presencia de una capa mucosa. Sin embargo, la
viabilidad del tejido es una de las mayores limitaciones, junto con la presencia de la capa muscular
de la mucosa, que tiende a provocar una subestimación de la tasa de transporte de compuesto pues
las células musculares de esta capa tienen tendencia a unirse a ellos. El modelo del saco invertido
es una técnica sensible y específica. Hay varios parámetros a tener en cuenta dado que pueden
afectar al resultado obtenido, entre los que se encuentran los factores animales (edad, sexo,
especie, dieta, estado de salud…), el segmento intestinal utilizado y factores experimentales
(como el pH o la temperatura) (9). Entre las aplicaciones de esta técnica se encuentran el estudio
del transporte de drogas a través del intestino y el estudio del metabolismo intestinal de fármacos
(10).

OBJETIVO
El objetivo de la presente práctica es el estudio de la absorción de glucosa a través del epitelio
intestinal mediante la técnica del saco intestinal invertido. Con ello se pretende demostrar qué
tipo de transporte se da, cuantificarlo y entender por qué factores es afectado.

MÉTODOS
En esta práctica colaboran distintos grupos de prácticas, ocho en concreto, donde cada uno prepara
una situación control, y una de las siguientes condiciones experimentales
- Saco intestinal de intestino delgado incubado a 4ºC
- Saco intestinal de intestino delgado incubado en ausencia de O2
- Saco intestinal de intestino delgado incubado en ausencia de Na+
- Saco intestinal de intestino delgado sin inversión
- Saco intestinal de intestino delgado incubado en presencia de ouabaína (1 mM)
- Saco intestinal de intestino delgado incubado en presencia de 2-4-dinitrofenol (1 mM)
- Saco intestinal de intestino delgado en solución de galactosa 25 mM
- Saco intestinal de intestino delgado en solución de galactosa 50 mM
En primer lugar, se prepara el sistema de baño de órganos. Se emplea la solución Krebs-fosfato
(NaCl 0,154M, KCl 0,154M, CaCl2 0,11M, SO4Mg 0,154M, PO4HNa2 0,1M, pH 7,4) junto con
2 mM de glucosa, adaptada a cada situación experimental. La situación control consiste en un
saco intestinal invertido (de la misma porción de intestino que el experimental) incubado en
condiciones óptimas para que se produzca la absorción de glucosa (incubación en K-P-Glc-2
mM y oxigenación).
Se añaden en 30 mL de la solución correspondiente en un tubo de ensayo y se incuba en a 37ºC
(a excepción del caso experimental en el que la incubación debe realizarse a 4ºC) junto con una
presión óptima de O2 conseguida mediante burbujeo (excepto en uno de los tubos cuyas
condiciones exigen ausencia del gas) durante 30-40 minutos.
Se continúa con la preparación e inversión de los sacos intestinales. Para ello se emplean dos
porciones del intestino delgado frescos de un hámster adulto-joven para cada grupo de trabajo.
La inversión se realiza con la ayuda de pipetas Pasteur, mediante la inserción de éstas en el
intestino con cuidado de no perforarlo. En el borde inferior del intestino es necesario realizar una
atadura doble para, a continuación, deslizar hacia abajo la parte superior con las manos hasta
invertirla. Se vuelve a realizar una ligadura, esta vez en el extremo libre inferior. Es importante
tener humedecida las porciones intestinales y los dedos con solución salina (o acuosa en el caso
de que el experimento no permita la existencia de Na+).

2
El siguiente paso es el llenado del saco intestinal invertido. Se introduce un volumen pequeño de
la solución del baño de órganos correspondiente en el intestino con una cánula fina de plástico
conectada a una aguja y a través de la pipeta Pasteur. Una vez que los sacos están llenos, se
transfieren a los tubos de ensayo preparados con el baño de órganos y se incuban durante 30-40
minutos en las condiciones experimentales adecuadas. Una vez finalizada la incubación, se retiran
los sacos y se eliminan los restos que puedan quedar en la parte externa. En un tubo de ensayo se
extrae el contenido interno de cada saco intestinal y, en otro, se incorpora la solución externa al
saco. Por tanto, cada grupo posee cuatro tubos de ensayo con cuatro muestras diferentes: una
externa e interna pertenecientes al control y otra al experimental.
Por último, se realiza la determinación de la concentración de glucosa en estas muestras mediante
el método de la glucosa oxidasa (GOD), que oxida a la glucosa para dar lugar a ácido glucurónico
y peróxido de hidrógeno. Este último, oxida a un compuesto cromogénico determinado en
presencia de la enzima peroxidasa, dando lugar a una coloración cuya intensidad en proporcional
a la concentración de la glucosa. Para ello, se añaden 50 µL de la muestra externa o interna junto
a 1 mL del reactivo GOD. Se incuba la mezcla a 37ºC durante 10 minutos y, transcurrido este
tiempo, se para la reacción con un baño de hielo. A continuación, se mide la absorbancia de las
muestras a 505 nm en un espectrofotómetro. El blanco se realiza con solución Krebs-fosfato sin
glucosa.

RESULTADOS
Tabla 1. Recogida de valores de absorbancia leídos a 505 nm para las distintas condiciones
experimentales. Para cada condición, realizada por un grupo de prácticas, se mide la absorbancia del
compartimento externo e interno. Todas las situaciones experimentales llevan asociadas un control que
consiste en una porción de intestino de la misma región que el experimental, pero incubado en condiciones
óptimas para que se produzca la absorción de glucosa y así poder determinar realmente qué efecto tienen
las distintas condiciones.

Absorbancia
Grupo Condiciones Control Experimental
Exterior Interior Exterior Interior
1 4 ºC 0.622 1.665 0.890 0.664
2 Sin O2 0.453 2.571 0.627 0.463
3 Sin sodio 0.482 1.494 0.698 0.478
4 Sin invertir 0.469 0.870 0.740 0.550
5 Dinitrofenol 0.445 2.150 0.760 0.652
6 Ouabaína 0.378 1.960 0.675 0.415
7 Galactosa 25 mM 0.606 2.303 0.785 0.922
8 Galactosa 50 mM 0.485 1.950 0.887 0.756

3
 3
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C o m p a r ti m e n t o in t e r n o
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Figura 1. Diagrama de barras de Absorbancia a 505 nm frente a cada condición experimental. Para
cada una de ellas se presenta la absorbancia registrada en el compartimento externo (color negro) y en el
compartimento interno (color gris). *Control: se presenta en media (± SD) debido a que se lleva a cabo en
las mismas condiciones experimentales (tampón Krebs-fofato, glucosa 2 mM, oxigenación y saco invertido)
para los 8 grupos de prácticas.

DISCUSIÓN
En la presente práctica se determina la absorción de glucosa a través del intestino por la técnica
del saco invertido. El uso de la misma está justificado por razones de gran peso. En primer lugar,
se consigue magnificar el proceso de transporte, debido a que, gracias a la inversión del saco
intestinal, el volumen que baña el lado mucoso (solución externa) es mucho mayor al volumen
que baña al lado seroso (solución interna). Partiendo de la misma concentración en ambos
compartimentos, tras el tiempo necesario para que tenga lugar la absorción, la glucosa se acumula
en el compartimento interno del saco variando en gran medida la concentración de glucosa
interna, sin embargo, la concentración de glucosa externa variará en menor medida. De esta
manera permite observar de una forma más obvia el transporte que se da desde el lado mucoso al
seroso. Esto se puede comprobar atendiendo a los valores de absorbancia obtenidos cuando no se
invierte el saco intestinal (Tabla 1). En el control, la absorbancia registrada en el compartimento
interno es el doble a la obtenida en el compartimento externo, mientras que en la condición
experimental (saco no invertido) no hay una diferencia de absorbancias entre los dos
compartimentos tan grande; la diferencia puede deberse incluso a un error de tipo experimental.
Con estos valores se pone de manifiesto que es más difícil concentrar la glucosa en un volumen
mayor de disolución, y que de no estar invertido dificultaría mucho el estudio del proceso de
transporte. Así, la comparación de la absorción de una sustancia en un saco invertido con uno no
invertido permite caracterizar a distintos transportadores, estimando si actúan en contra de
gradiente y la direccionalidad del transporte. Por otro lado, esta técnica hace óptimas las
condiciones de oxigenación de la capa mucosa, que es justo donde se da el transporte. La inversión
expone la capa mucosa activa al medio bien oxigenado, mientras que la capa serosa queda recluida
hacia el interior del saco. Además, el llenado del interior del saco invertido con la solución permite
la distensión del tejido, lo cual supone un aumento del área de superficie y reduce el grosor de la
pared intestinal (8). De esta manera se obtiene una mayor viabilidad del tejido y, por ende, unos
resultados experimentales más cercanos a lo que ocurre in-vivo.
La concentración de glucosa en este estudio es menor a la que hay en condiciones fisiológicas, 2
mM frente a 5 mM. Esto es así debido a que, en un mayor volumen, habrá un mayor número de
moléculas de glucosa que interactúen con el transportador, suficiente para que se sature el

4
transporte debido a su baja Km (0.1-0.6 mM). Además, en presencia de una mayor concentración
de glucosa, el incremento de presión osmótica en la luz del enterocito dificultará el proceso de
difusión pasiva (que depende del gradiente de concentración) hacia el interior del compartimento,
así la diferencia de concentraciones entre ambos compartimentos sería menor que la requerida
para estudiar el transporte a través del epitelio intestinal (11).
La situación control sirve para determinar qué tipo de transporte se está dando puesto que en ella
se dan las condiciones óptimas para el funcionamiento del saco invertido, esto es oxigenación,
incubación en tampón Krebs-fosfato-glucosa, baño a 37 ºC y presencia de 2 mM de glucosa. Para
unificar los valores de absorbancia pertenecientes a las situaciones control de cada grupo (Tabla
1) se realiza la media de los valores junto con su desviación estándar (Figura 1). La media de las
absorbancias obtenidas es de 0.493 (±0.082) para el compartimento externo y de 1.87 (±0.528)
para el compartimento interno. Esta diferencia tan notoria entre las absorbancias (directamente
proporcional a la concentración) de los dos compartimentos se debe a que hay un transporte
unidireccional de glucosa en contra de gradiente. Consultando bibliografía se comprueba nuestra
hipótesis, la glucosa entra en los enterocitos desde el lumen intestinal en simporte con sodio,
aprovechando el gradiente de sodio que se genera por la ATPasa de sodio potasio. El transportador
recibe el nombre de SGLT1, y requiere de energía indirectamente, puesto que sin la bomba sodio
potasio sería incapaz de funcionar. La glucosa es capaz de pasar por difusión facilitada desde el
citoplasma del enterocito hasta los capilares sanguíneos adyacentes a la membrana basal gracias
a GLUT2, completando el proceso de absorción de glucosa (Figura 2) (3).

Figura 2. Modelo de transporte de glucosa o galactosa y fructosa a través del epitelio intestinal.
Imagen tomada de Silverthorn, D. U. (2008).

De forma general, las distintas situaciones experimentales disminuyen la diferencia de

absorbancia entre los dos compartimentos como se puede ver en la Tabla 1 y Figura 1. Esto quiere
decir que el transporte de glucosa se ve en gran parte disminuido ante las situaciones
experimentales expuestas.

5
Atendiendo a los datos experimentales obtenidos por el grupo 1 (Tabla 1), que realizó el
experimento a 4ºC, se observa una inhibición del transporte. Esto se debe a que los transportadores
de glucosa son proteínas insertas en la membrana plasmática, y al disminuir la temperatura los
fosfolípidos de la bicapa lipídica crean interacciones con las proteínas más rígidas, disminuyendo
así el grado de flexibilidad de las mismas y por tanto impidiendo que se de su correcto
funcionamiento (12).
Cuando el experimento se ensaya sin oxigenación (grupo 2) también cesa el transporte. El
transporte de glucosa hacia el interior del enterocito requiere del gradiente de sodio generado en
ultima instancia por la bomba sodio potasio, dependiente de ATP. El oxígeno es el aceptor final
de electrones en la cadena de transporte electrónico que genera energía en forma de ATP. Si al
tejido no se le suministra oxígeno, cuando consuma el ATP presente en el citoplasma, la bomba
sodio-potasio dejará de funcionar (pues, aunque se dé el proceso fermentativo, éste no es tan
eficiente como la respiración aeróbica) por lo que no se genera un gradiente de sodio y el
cotransportador glucosa-sodio deja de actuar (8). Esta condición experimental es una de las
afirmaciones de que el transporte de glucosa intestinal requiere de energía.
Por otra parte, el uso de ouabaína y 2,4-dinitrofenol (DNP) también afirman que la absorción de
glucosa a través de la mucosa intestinal es dependiente de energía. La ouabaína es un inhibidor
de la bomba sodio-potasio, de esta forma, el sodio se acumula en el interior celular,
imposibilitando la acción del contransportador SGLT1 (13). Por otra parte, el DNP es un
compuesto orgánico que actúa como agente desacoplante de la cadena de transporte electrónico.
Su mecanismo de acción consiste en la creación de un poro en la membrana mitocondrial interna
por el que se disipa el gradiente de protones (fuerza protón-motriz) empleada en la formación de
ATP. De esta manera, la bomba de sodio-potasio se inactiva e impide que se de el transporte de
glucosa de igual manera que la ouabaína (14).
Por último, es interesante hablar de la presencia de galactosa. Ambos azúcares son transportados
hasta el interior del enterocito por SGLT1 con la misma afinidad, el cual es incapaz de distinguir
entre ellos puesto que químicamente son muy parecidos (epímeros en el carbono 4). Una vez
dentro del enterocito, la galactosa pasaría al compartimento interno por difusión facilitada gracias
a GLUT2, al igual que la glucosa. Este transportador presenta una Km de 17 mM para la glucosa,
mientras que para la galactosa presenta una km mucho mayor, de 92 mM. En este experimento
podemos tratar a la galactosa como un inhibidor competitivo de la glucosa, puesto que, a mayor
concentración de galactosa, mayor cantidad de ésta será transferida por SGLT1 y de la misma
manera, menor cantidad de glucosa se transfiere al compartimento interno (Tabla 1). En realidad,
esto no es así en el organismo. El hecho de que SGLT1 transporte de forma indiscriminada
glucosa y galactosa supone una ventaja puesto que hay enzimas convertidoras de estos
monosacáridos, pudiendo usarlos en función de las necesidades metabólicas (15, 16).
Una vez conocido cómo tiene lugar el transporte de glucosa a través del epitelio intestinal
mediante la técnica del saco invertido, es de gran importancia determinar la localización de los
transportadores implicados en el modelo propuesto. Los transportadores implicados son SGLT1
y GLUT2. Su localización en enterocito se puede determinar empleando la técnica del saco
invertido haciendo uso de inhibidores de estos transportadores. En primer lugar, la fluoridzina es
un glucósido de tipo flavonoide de la familia de las floretinas. Se trata de un inhibidor del
transportador de glucosa dependiente de sodio (SGLT1) (15). Para confirmar que este
transportador se encuentra en el lado apical, necesitamos realizar un control (saco invertido en
condiciones óptimas) y dos situaciones experimentales, en una de ellas se añade el glucósido
únicamente en la solución externa y en la segunda situación se añade en la solución interna. En la
primera situación no habría transporte de glucosa, y de esta manera no se registraría un aumento
de la concentración de la misma en el compartimento interno, mientras que la segunda situación
debería parecerse al control, ya que el transportador únicamente se encuentra en la membrana
6
apical del lado mucoso, si no entra en contacto con su inhibidor, el transporte se daría de forma
normal. Para demostrar la localización de GLUT2, se procede de la misma manera, pero esta vez
usando quercetina, un flavonol que inhibe la absorción pasiva de glucosa mediada por GLUT2
(15). En este caso, no se registraría transporte de glucosa cuando la quercetina se halla en la
solución interna, de esta manera se confirmaría que se localiza en la membrana basolateral el
enterocito.
La fructosa es consumida en altas cantidades en forma de sacarosa, frutas, jarabes, etc. Aun así,
los niveles de fructosa circulantes en sangre son generalmente de 10 a 100 veces más bajos que
los de glucosa, debido a que la fructosa de la dieta se metaboliza rápidamente tras su absorción
en el intestino, hígado y riñón. GLUT5 presente en la membrana apical del enterocito es altamente
específico para fructosa, y media la absorción de fructosa procedente de la dieta a través de la
membrana apical del intestino delgado (17). Una vez en la luz del enterocito, la fructosa sale hacia
los capilares por un transporte pasivo mediado por GLUT2 (que posee una menor afinidad por
fructosa que por glucosa). Se ha generado un gran interés en el estudio del metabolismo de la
fructosa desde que este monosacárido ha sido relacionado con un aumento de diabetes tipo II,
síndrome metabólico y obesidad (18). Para confirmar que se trata de un transporte pasivo se puede
usar el mismo procedimiento experimental que en el presente estudio. Pero, al contrario que con
la glucosa, debe haber transporte de fructosa en presencia de DNP, ouabaína y en condiciones de
hipoxia, puesto que es un transporte que no depende de energía. También se podría estudiar
variando ligeramente el modelo experimental de saco invertido utilizado, esto es, poniendo
fructosa únicamente en el compartimento externo contabilizando el transporte pasivo que se da
hacia el interior.
Por último, uno de los factores que puede modificar los resultados obtenidos en el modelo del
saco intestinal invertido usado en la práctica es la edad de los hámsteres. Durante el
envejecimiento, aunque hay muchos factores fisiológicos y sociales implicados, de forma general,
una disminución de la absorción de nutrientes puede contribuir a una desnutrición.
El efecto de la edad sobre la absorción intestinal se puede estudiar mediante el método del saco
intestinal invertido, empleando para ello muestras intestinales procedentes de hámsteres de
distintos grupos de edad: hámsteres jóvenes de 2 meses de edad, adultos de un año y, por último,
hámsteres mayores de dos años. El protocolo a seguir sería igual al de la práctica que se ha
realizado (19).
También es posible estudiar el impacto de la edad mediante el estudio de vesículas de membrana.
Este estudio se ha realizado previamente en ratas (19), pero también en humanos (20). Consiste
en la obtención de vesículas de membrana a partir de individuos que difieran en la edad. Para ello
es necesario extraer las células del epitelio intestinal y obtener las vesículas de BBM mediante
sucesivas centrifugaciones. A continuación, se realiza el estudio del transporte de glucosa,
habiendo incubado previamente las vesículas en soluciones con glucosa marcada. Las membranas
se recolectan mediante microfiltración y detecta la presencia de glucosa mediante la técnica de
conteo de centelleo.

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