ISO 4831:2006(E)

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C ISO 2006
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 ISO 4831:2006(E)

Prefácio

ISO (International Organization for Standardization) é uma federação mundial de órgãosnacionais de

normalização (organismos membros da ISO). O trabalho de elaboração das Normas Internacionais é
normalmente realizado através de comitês técnicos da ISO. Cada organismo membro interessado em um
assunto para o qual uma comissão técnica tem sido establisned tem o direito de ser representado nesse
comitê. Organizações internacionais, governamentais e não-governamentais, em ligação com a ISO, também
tomam parte na obra. ISO colabora estreitamente com a Comissão Electrotécnica Internacional (IEC) em todos os
assuntos de normalização electrotécnica.

Padrões internacionais são elaborados de acordo com as regras das Diretivas ISO / IEC.parte 2.

A principal tarefa dos comitês técnicos é preparar Normas Internacionais. Projecto de

Normas Internacionais adoptados pelos comités técnicos são sujeitos aos organismos membros para
votação. Publicação como um Padrão Internacional exige a aprovação em pelo menos 75% dos organismos
membros com direito a voto.

Atenção para a possibilidade de que alguns dos elementos deste documento pode ser objecto de direitos de
patente. ISO não deve ser responsável pela identificação de quaisquer direitos de patentes.

ISO 4831 foi elaborada pelo Comitê Técnico ISOTTC 34, produtos
alimentícios,Subcomitê SC 9, Microbiologia .

Esta terceira edição da ISO 4831 anula e substitui a norma

ISO 4831:1991 e ISO 5541-2:1986. Cláusulas 4,9 e 10 da norma
ISO 4831:1991 foram tecnicamente revistos. As principais alterações são as seguintes:

o procedimento alternativo de incubação a 35 ° C foi excluído:

detecção e enumeração de coliformes são cobertos (cláusulas 4 e 9);

descrição do MPN e os CCT foram omitidos (cláusula 10) e de referência é dado a ISO7218.

Considerando a natureza das mudanças para a edição anterior desta Norma, considera-se que a validação de
métodos alternativos com base na ISO 4831:1991 não é afetada por esta revisão.
ISO 4831:2006(E)

Introdução

Devido à grande variedade de produtos e alimentos para animais, este método horizontalpode não ser
apropriado em cada detalhe para determinados produtos. Neste caso,métodos diferentes, que são específicos
para esses produtos, podem ser usados seabsolutamente necessário por motivos justificados técnica. No entanto,
a cada tentativa deve ser feita para aplicar este método horizontal, tanto quanto possível.

Quando esta Norma é próxima revisão, serão tidos em conta de todas as informaçõesentão
disponíveis sobre a medida em que este método horizontal tem sido seguido e as razões para desvios
deste método, no caso de determinados produtos.

A harmonização dos métodos de ensaio não pode ser imediata e, para certos grupos de produtos, as
Normas Internacionais e / ou normas nacionais já podem existir que não cumprem com este
método horizontal. Espera-se que, quando tais normas são revistasque será alterada para dar cumprimento
à presente Norma, para que, eventualmente, as partidas que resta deste método horizontal serão
aqueles necessários para o bem-estabelecida razões técnicas.

A técnica descrita nesta Norma é menos preciso do que o descrito na norma ISO 4832 [1],mas permite um
exame microbiológico a ser realizado em uma parcela maior de teste,permitindo assim um menor número
de coliformes por grama ou por mililitro do produto aser detectado. Além disso, desde a definição
de''coliformes ", adotada nos dois documentos é diferente, os microrganismos enumerados não são
necessariamente os mesmos.

Para qualquer produto particular, o método a ser cnosen serão especificadas na NormaInternacional de lidar com
esse produto.

Para efeitos de um método de teste possível, a definição de "coliformes" dada na cláusula 3 e usado como
base para o procedimento não é necessariamente idêntico ao dadodefinições correspondentes em
outros textos publicados. A proporção de cepas dos microorganismos descritos em outros textos
publicados como "conforme" (incluindoEscherichia coli) deixar de produzir gás suficiente para ser
detectada pelo uso de um tubo de Durham (ie "cepas anaerogenic"). Portanto, o método descrito nesta
NormaInternacional não irá detectar todas as cepas dos microorganismos referidos em outras
publicações como "(presuntivo) coliformes" (por exemplo, certas cepas de Citrobacter, Enterobacter,
Klebsiella) (ver referência [211

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 4831:2006(E)

Microbiologia de alimentos de alimentos e rações para animais –

Horizontal método para a detecção e enumeração de
coliformes - técnica do número mais provável

1 Escopo

Esta Norma fornece diretrizes gerais para a detecção e enumeração de coliformes. É aplicável a

-- produtos destinados ao consumo humano e para a alimentação de animais, e

--- amostras ambientais na área da produção de alimentos e manipulação de alimentos.

Enumeração é realizada pelo cálculo do número mais provável (NMP) após incubação em meio líquido a
30 ° C ou 37 ° C.

NOTA A temperatura está sujeita a acordo entre as partes interessadas. No caso do leite e produtos lácteos, a
temperatura de incubação é de 30 ° C.

Este método de enumeração é aplicável quando o número procurado é esperado para estar na faixa de 1 a 100
gramas por mililitro ou por amostra de.

Uma limitação da aplicabilidade desta norma é imposta pela susceptibilidade do método para um elevado grau
de variabilidade. A informação dada na Cláusula 11 fornece orientações sobre a aplicabilidade do método e
na interpretação dos resultados.

2 Referncia normativa
Os seguintes documentos são indispensáveis para a aplicação deste documento. Para referências datadas, apenas
a edição citada se aplica. Para referências não datadas, a última edição do referido documento (incluindo emendas) .

ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations

ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and
decimal dilutions for microbiological examination

ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of
culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory

ISO/TS 11133-2:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and
production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media

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ISO 4831:2006(E)

3 Termos e definições

Para efeitos deste documento, os seguintes termos e definições se aplicam.

3.1
coliformes

bactérias que à temperatura especificada (isto é, 30 ° C ou 37 ° C., conforme acordado) causa

fermentação da lactose com a produção de gás nas condições de ensaio especificados nesta
Norma Internacional

3.2
Detecção de coliformes
determinação da presença ou ausência dessas bactérias, em uma determinada quantidade de produto quando os
testes são realizados de acordo com o método especificado nesta Norma
3.3
enumeração de coliformes
número mais provável de coliformes encontrados por mililitro ou por grama de amostra de teste, quando o teste
é realizado em conformidade com o método especificado nesta Norma
4 Principio
4.1 Detecção de coliformes
4.1.1 Um tubo de caldo de enriquecimento seletivo é inoculado com a amostra de ensaio e incubados a 30 ° C ou
37 ° C (conforme acordado) por 24 h ou 48 h

4.1.2 Um tubo de meio de confirmação é inoculado a partir do tubo obtido em 4.1.1 quando opacidade e /
ou formação de gás for notado, e incubados a 30 ° C ou 37 ° C (conforme acordado) por 24 h ou 48 h.

4.1.3 A presença de coliformes é confirmada no caso de opacidade e formação de gás for observada após o
exame do tubo obtido em 4.1.2.

4.2 Enumeração pela técnica NMP

4.2.1 Três tubos de meio líquido de enriquecimento seletivo dupla concentração são inoculados com uma
determinada quantidade da amostra, se o produto inicial é líquido, ou com uma determinada quantidade
de uma diluição inicial, no caso de outros produtos.

4.2.2 Três tubos de meio líquido de enriquecimento seletivo concentração simples são inoculados com
uma determinada quantidade da amostra, se o produto inicial é líquido, ou com uma determinada
quantidade da diluição inicial, no caso de outros produtos. Então, nas mesmas condições, demais tubos de
meio concentração simples, são inoculadas com diluições decimais da amostra ou da diluição inicial.

4.2.3 Os tubos contendo o meio de enriquecimento seletivo dupla-concentração são incubados a 30 ° C

ou 37 ° C (conforme acordado) por 24 h, e os tubos contendo meio concentração simples, são incubados por
24 h ou 48 h, período após o qual os tubos são examinados para formação de gás ou opacidade
que impede a detecção de formação de gás.

4.2.4 Uma série de tubos do meio de confirmação são inoculados com as culturas dos tubos de meio de
enriquecimento seletivo dupla concentração, e com as culturas dos tubos de meio enriquecimento
seletivo concentração simples no qual a formação de gás ou opacidade impedindo a detecção
de formação de gás tem-se observado.

4.2.5 Os tubos de 4.2.4 são incubados a 30 ° C ou 37 ° C (conforme acordado) por 24 h ou 48h, e os tubos
são examinados para formação de gás.

4.2.6 O número mais provável de coliformes por mililitro ou por grama de amostra (ou seja, aNMP) é
calculado a partir do número de tubos na nova série (4.2.5) mostrando formação de gás. Uma tabela para a
determinação de números mais prováveis é utilizado.

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5 Meio de Cultura e diluentes

5.1 General

Ver ISO 7218, ISO / TS 11133-1 e ISO / TS 11133-2 para a preparação, testes de produção e desempenho de
meios de cultura.

5.2 Diluentes

Ver ISO 6887 (parte relevante), ISO 8261 ou o padrão específico Internacional lidar com o produto em análise.

5.3 Enriquecimento seletivo: caldo triptose Lauril Sulfato

5.3.1 Composição

b) Concentração
a) Dupla Concentração simples
Digestão enzimática das proteínas do leite e dos animais 40 g 20 g

Lactose (Ci2H22011.H20) 10 g 5g
Fosfato dipotássico hidrogênio (K2HPO4)
5,5 g 2,75 g

Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) 5.5 g 2,75 g

Cloreto de sódio 10 g 5g

Lauril Sulfato de sódio 0,2 g 0,1 g

1 000 ml 1 000 ml
Água

5.3.2 Preparo

Dissolver os diferentes componentes ou o meio desidratado completo na água, por aquecimento, se

necessário.

Ajustar o pH. se necessário, de modo que após a esterilização é de 6,8 ± 0,2 a 25 ° C.

Dispensar os meios em quantidades de 10 ml em tubos de dimensões de aproximadamente 16 mm x 160

mm (6.4), contendo tubos de Durham (6.5) no caso concentração simples meio, e em tubos de ensaio de
dimensões de aproximadamente 20mm x 200 mm (6.4) [não contendo tubos de Durham (6,5)] no caso do meio de
dupla concentração.

Esterilizar em um conjunto de autoclave a 121 ° C por 15 min. Os tubos de Durham não devem
conter bolhas de ar após a esterilização.

5.3.3 Testes de desempenho para a garantia da qualidade do meio de cultura

Para as definições de seletividade e produtividade, referem-se a ISO / TS 11133-1.Testes de

desempenho relacionados com caldo lauril sulfato triptose é dada em ISO / TS11133-2:2003. tabela B.1 .

C ) I S O 2 0 0 6 — A l l r ig h t s r e s e r v e d 3
ISO 4831:2006(E)

5.4 Meio de Confirmação: caldo verde brilhante bile lactose

5.4.1 Composição

Digestão enzimática da caseína 10 g

Lactose (C121-I22011.H20) 10 g
Bile bovina desidratado 20 g

verde brilhante 0,013 3 g

1 000 ml
Água

5.4.2 Preparo

Dissolver os componentes ou o meio desidratado completo na água, por aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que após a esterilização seja de 7,2 ± 0,2 a 25° C.

Verter o meio em quantidades de 10 ml em tubos de ensaio de aproximadamente 16 mm x 160 mm (6.4),

contendo tubos de Durham (6.5).

Esterilizar em um conjunto de autoclave a 121 ° C por 15 min. Os tubos de Durham não devem
conter bolhas de ar após a esterilização.

5.4.3 Testes de desempenho para a garantia da qualidade do meio de cultura

Para as definições de seletividade e produtividade, referem-se a ISO / TS 11133-1.Testes de

desempenho relativos à lactose bile caldo verde brilhante é dada em ISO / TS11133-2:2003, Tabela B.1.

6 Equipamentos e vidraria

Material corrente de laboratório microbiológico (ver ISO 7218) e, em particular, o seguinte.

6.1 Aparelhos para esterilização a seco (estufa) ou esterilização úmido (autoclave). Ver ISO 7218.

6.2 Incubadora, capaz de operar a 30 ° C ± 1 ° C ou 37 ° C ± 1 ° C.

6.3 Alça feita de platina-irídio, ou níquel-cromo, cerca de 3 mm de diâmetro, ou alças descartáveis

6.4 Tubos de ensaio, de dimensões aproximadamente 16 mm x 160 mm e 20 mm x 200 mm.

6.5 Durham tubos, de um tamanho adequado para uso em tubos de ensaio de dimensões 16 mm x 160 mm (6.4).

6.6 Pipetas de esgotamento total, com capacidades nominais de 1 ml e 10 ml.

6.7 medidor de pH, com precisão de ± 0,1 unidade de pH, a 25 C.

4 o ISO 2006 —All rights reserved

 ISO 4831:2006(E)

7 Amostragem

Amostragem deve ser efectuada em conformidade com a Norma Internacional específica adequada ao
produto em questão. Se não houver norma específica Internacional, é recomendável que as partes
envolvidas chegam a um acordo sobre este assunto.

8 Preparo da amostra teste

Prepare a amostra de acordo com a norma ISO 6887 (parte relevante), ISO 8261 ou a
Norma Internacional específica adequada ao produto em questão. Se não houver norma
específica Internacional, é recomendável que as partes envolvidas chegam a um acordo sobre este
assunto

9 Procedimento (ver Anexo A)

9.1 Método de detecção (Ver Figura A.1).

9.1.1 Amostra teste diluição inicial

Ver ISO 6887 (parte relevante), ISO 8261 ou a Norma Internacional específica apropriadas ao produto
em questão.

9.1.2 Inoculação e incubação

9.1.2.1 Dependendo do limite de detecção que é necessário, x ml da amostra teste se líquido,

ou x ml da suspensão inicial, no caso de outros produtos, é transferida para um tubo contendo 10
ml meio de enriquecimento seletivo dupla concentração [5.3.1a)], quando 1 ml < x < 10 ml. ou a
um tubo contendo 10 ml concentração simples meio de enriquecimento seletivo [5.3.1b)] quando x ≤
1 ml.

9.1.2.2 Deixe o tubo de meio de concentração-dupla (9.1.2.1) na incubadora (6.2), fixado em 30 °

C ou 37 ° C (conforme acordado) por 24 h ± 2 h.

9.1.2.3 Deixe o tubo de meio de concentração simples (9.1.2.1) na incubadora (6.2) a 30 ° C ou 37 ° C

(conforme acordado) por 24 h± 2 h ou, se nem formação de gás nem de opacidade que impede a
detecção de formação gás é observado nesta fase, continue a incubação por mais 24 h ± 2 h.

9.1.3 Confirmação (Ver figura A.3)

9.1.3.1 Do tubo incubado de 9.1.2.2, inocular com uma alça (6.3) um tubo de meio de
confirmação (5.4). Incubar na incubadora (6.2), fixado em 30 ° C ou 37 ° C (conforme acordado) por
24 h ± 2 h ou se a formação de gás não é observada nesta fase, por 48 h ± 2 h.

9.1.3.2 Realizar o mesmo procedimento como descrito em 9.1.3.1 para os tubos incubados a partir de
9.1.2.3 mostrando a formação de gás, ou opacidade que impede a detecção de formação de gás ,
quando qualquer uma destas características é observada pela primeira vez (ou seja, após 24 h± 2 h ou
depois de 48 h ± 2 h).

9.1.4 Interpretação (Ver figura A.1)

Um tubo de 9.1.3.1 ou 9_1.3.2 na qual a formação de gás é observada após 24 h ± 2 h ou 48 h 2 h é

considerado como um tubo positivo.

C) ISO 2006 —An rights reserved 5

ISO 4831:2006(E)

9.2 Método de enumeração (NMP) (ver Figura A.2)

9.2.1 Amostra teste, a diluição inicial e diluições

Ver ISO 6887 (parte relevante), ISO 8261 ou a Norma Internacional específica apropriadas ao produto em
questão.

Prepare um número suficiente de diluições para garantir que todos os tubos correspondentes à diluição
final produzir um resultado negativo.

9.2.2 Inoculação e Incubação

9.2.2.1 É comum que haja uma combinação de três tubos de cada série de diluição. No entanto,
para alguns produtos e / ou cada vez que os resultados de maior precisão são necessários, pode ser
necessário para inocular série composta por mais de três tubos (por exemplo, cinco tubos). Para esses
casos, para o cálculo do NMP consulte as tabelas relevantes incluídas na ISO 7218.

9.2.2.2 Pegue três tubos de dupla-concentração meio de enriquecimento seletivo [5.3.1a)]. Usando uma
pipeta esterilizada (6.6) a transferência para cada um destes 10 tubos ml da amostra teste se líquido. ou
10 ml da suspensão inicial, no caso de outros produtos.

9.2.2.3 Em seguida, tomar três tubos meio concentração simples de enriquecimento

seletivo [5.3.1b)]. Usando uma pipeta estéril (6.6), transferir para cada um desses tubos de 1 ml da
amostra teste se líquido, ou 1 ml da suspensão inicial, no caso de outros produtos.

9.2.2.4 Para cada uma das diluições, continue como descrito em 9.2.2.3. Use uma pipeta nova estéril
para cada diluição. Misturar cuidadosamente o inóculo e o meio.

9.2.2.5 Deixe os tubos de meio de concentração-dupla (9.2.2.2) na incubadora (6.2), fixado em 30 ° C ou 37 °

C (conforme acordado) por 24 h ± 2 h.

9.2.2.6 Deixe os tubos de meio de concentração simples (9.2.2.3 e9.2.2.4) na incubadora (6.2), fixado
em 30° C ou 37 ° C (conforme acordado) por 24 h ± 2 h ou, se nem formação de gás nem de
opacidade prevenção da detecção de formação de gás é observado nesta fase, continue a incubação por
mais 24 h ± 2 h.

9.2.3 Confirmação (Ver Figura A.3)

9.2.3.1 De cada um dos tubos incubados a partir de 9.2.2.5, inocular com uma alça (6.3) um tubo de meio
de confirmação (5.4). Incubar na incubadora (6.2), fixado em 30 ° C ou 37 ° C (conforme acordado) por
24 h ± 2 h ou, se a formação de gás não é observado nesta fase continue a incubação por mais 24 h ± 2 h.

9.2.3.2 Realizar o mesmo procedimento como descrito em 9.2.3.1 para os tubos incubados a
partir 9.2.2.6 mostrando a formação de gás, ou opacidade impedindo a detecção de formação de gás,
quando qualquer uma destas características é observada pela primeira vez (ou seja, após 24 h ±
2 h ou depois 48 h ± 2 h).

9.2.4 Interpretação (Ver Figura A.2)

Para cada diluição, contar o número total de tubos em que a formação de gás é observada em 9.2.3 (tubos
positivos) após 24h ± 2 h e (se usado) 48 h 2 h

10 Cálculo e expressão dos resultados

De acordo com os resultados da interpretação (ver 9.1.4),indicam a presença ou ausência de coliformes em
uma porção teste de x g ou x ml de produto (ver ISO 7218).

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 ISO 4831:2006(E)

11 Precisão

Reconhece-se que grandes variações no resultado podem ocorrer com a técnica de NMP. Resultados obtidos
com este método devem ser usado com cautela.

Limites de confiança são apresentados na ISO 7218.

12 Relatório de Ensaio
O relatório deverá especificar:
todas as informações necessárias para a completa identificaçãoda amostra;
- O método de amostragem utilizado, se conhecido:
o método de ensaio utilizado, com referência a esta Norma:
- O objetivo do teste e da temperatura de incubação utilizados;
- Todos os detalhes operacionais não especificadas nesta NormaInternacional, ou consideradas
como opcional. juntamente com os detalhes de qualquer incidente que possa ter influenciado o
resultado (s);
- O resultado do teste (s) obtidos.

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 ISO 4831:2006(E)

Bibliografia

[1] ISO 4832, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of
co//forms — Colony-count technique

[2] EDWARD,P.R. and EW ING, W.H. Identification of Enterobacteriaceae, 3rd edn., Burgess Publishing
Company, Minneapolis, Minnesota, USA, 1972

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