Tesis Lista Modificada

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL POLITÉCNICA
“ANTONIO JOSÉ DE SUCRE”

VICERRECTORADO BARQUISIMETO
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE
LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE GALLINA (Gallus gallus
domesticus) VENEZOLANA.
Barquisimeto, Enero 2019

EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE
LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE GALLINA (Gallus gallus
domesticus) VENEZOLANA.
Autores:
Br. Casadiego Soleydimar
Br. Garcia Enderlys
Tutor Externo: Dr. Catarí Edgar
Tutor Académico: M.Sc. Mayantino Garaboto
Barquisimeto, Enero 2019

DEDICATORIA
Todo mi esfuerzo se lo dedico a Dios, a mi

madre Ana, a la memoria de mi padre Luis
y a mis hermanas Mariany y Ana.
Casadiego Soleydimar.
iv
DEDICATORIA
Este trabajo lo dedico mi madre, Euris

Alvarado.
García Enderlys.
v
AGRADECIMIENTOS COMPARTIDOS
A nuestro tutor, M.Sc. Angel Garaboto, por sus orientaciones y consejos durante la
realización de este trabajo, por trasmitirnos sus conocimientos y brindarnos la oportunidad
de adquirir nuevas experiencias como estudiantes de Ing. Química.
A los técnicos de laboratorio y profesores de la Universidad Nacional Experimental

Politécnica Antonio José de Sucre (UNEXPO), especialmente Cesar y Alejandro, por su
colaboración y enseñanzas durante nuestra carrera.
Al Dr. Edgar Catarí, y al cuerpo técnico del Laboratorio de Polímeros del Instituto
Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), por abrirnos las puertas de esta casa de
estudio, proporcionarnos toda su ayuda en el desarrollo de la investigación y permitirnos
realizar los experimentos de éste trabajo en sus instalaciones.
Al Ing. Vladimir de Amicis, Personal Asociado a la Investigacion (PAI) del Laboratorio de

Polímeros, por toda su disposición para ayudarnos y contribuir en el desarrollo de este
trabajo. Agradecemos su revisión y sus observaciones al presente escrito, así como su
sincera amistad.
A la Lic. Liz Cubillán, por su amable atención al realizar las pruebas de IR de las muestras
de nuestra investigación, así como sus consejos y enseñanzas durante nuestra permanencia
en el IVIC.
A nuestros compañeros de laboratorio y de institución, especialmente a Angel Seijas y

Keily Granados por su amistad, ayuda, colaboración y hacer nuestra estadía más amena,
gracias por todos los buenos momentos brindados, excelentes profesionales y personas.
Al Lic. Álvaro Mendoza, por darnos la oportunidad de participar en este proyecto, por su
entusiasmo y disposición para hacer que esta investigación se desarrollara de la mejor
manera brindándonos la mejor experiencia de nuestra carrera, muchas gracias.
A Agroindustrias D’EFRAIN y su personal, por toda su disposición para trabajar en este

proyecto desde sus inicios, por todas sus contribuciones económicas e inversiones de
tiempo, gracias por darnos la oportunidad de formar parte de su equipo.
vi
A la Ing. Karelys Vargas, quien siempre estuvo al pendiente durante nuestro trabajo en las
instalaciones de Agroindustrias D’EFRAIN dispuesta a ayudarnos en cualquier situación,
por brindarnos su apoyo incondicional y en especial por su amistad.
Al Ing. Carlos Mascia, por su colaboración para la adquisición del patrón de Hialuronato de
Sodio.
vii
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por iluminar mi camino, por darme la fuerza y perseverancia para seguir adelante y
permitirme alcanzar esta meta.
A mi madre Ana Córdoba, pilar fundamental en mi vida, mi ejemplo a seguir, te agradezco

por todo el apoyo y amor incondicional, por creer y tener paciencia en mí, por inculcarme
los valores y principios que me permiten ser una mejor persona cada día. Este logro es para
ti.
A mi padre Luis Casadiego, que desde el cielo estás como un ángel guiando mis pasos y sé
que estarías muy orgulloso de mí por este logro que hoy estoy cumpliendo.
A mis hermanas Mariany Casadiego y Ana Casadiego, por confiar siempre en mí, por
brindarme su amor incondicional, por ser mi fuente de alegría y ser mi motivación durante
todos estos años.
A mi Familia, por estar siempre pendientes de mí, por sus consejos, su cariño y apoyo
incondicional.
A mis compañeros y amigos en especial a Willianny y Natascha, por acompañarme en cada

momento, impulsarme a seguir y estar siempre pendientes de mí.
A Oscar Ortiz, por su cariño y apoyo incondicional, por siempre creer en mí y hacerme reír
en todo momento.
A mi compañera Enderlys García, gracias por tenerme paciencia, confianza y brindarme tu

amistad desde el inicio hasta el final de esta aventura.
Casadiego Soleydimar.
viii
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por brindarme la oportunidad de cumplir mis sueños y por darme la
determinación para culminar mis estudios.
Agradezco a mi madre, Euris Alvarado, pilar fundamental en mi vida, gracias por el amor
incondicional, gracias por guiarme y cuidarme, gracias por tu paciencia y comprensión, no
ha sido fácil pero lo logramos.
Agradezco a mi abuela, Juana Alvarado, por siempre creer y confiar en mí, gracias por el
amor más dulce que puedo recibir.
Agradezco a mi familia, especialmente a mis tías, Lesbia, Aury y Angie, sin olvidar a mi
tía Sailuma que nos cuida desde el cielo. A mis tíos, Ovidio, Félix, Arcadio y Carlos.
Gracias por el apoyo y disposición para siempre ayudarme cuando lo necesito.
Agradezco a mi amiga, María Elena Vásquez, quien me ha ayudado y acompañado en este

camino, gracias por ser mi apoyo en los momentos difíciles y estar para celebrar los
triunfos.
Agradezco a mis compañeros de Polifolklore y Unexpo Gaita, especialmente al Maestro

Armando Betancourt, quien a través de la música alegró mis días en la universidad, gracias
por los buenos momentos y consejos brindados.
Agradezco a mi compañera de tesis, Soleydimar Casadiego, no fue fácil pero fue divertido,
gracias por tu paciencia en esta aventura.
García Enderlys.
ix
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................................... xii

INDICE DE FIGURA ....................................................................................................................... xiii
ABREVIATURA ............................................................................................................................... xv
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1
CAPÍTULO I....................................................................................................................................... 3
EL PROBLEMA ................................................................................................................................. 3
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................................ 3
OBJETIVOS DEL TRABAJO ........................................................................................................ 7
Objetivo General ............................................................................................................. 7
Objetivos Específicos ...................................................................................................... 7
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................... 8
CAPÍTULO II ................................................................................................................................... 10
MARCO TEÓRICO .......................................................................................................................... 10
ANTECEDENTES ........................................................................................................................ 10
BASES TEÓRICAS ...................................................................................................................... 14
ÁCIDO HIALURÓNICO: BIOPOLÍMERO POTENCIAL PARA MÚLTIPLES
APLICACIONES ........................................................................................................ 14
MATERIA PRIMA: MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE
GALLINA .................................................................................................................... 20
ESTUDIO DE LAS MEMBRANAS INTERSTICIALES ........................................... 22
TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE INVESTIGACIÓN ..................................... 25
CAPÍTULO III .................................................................................................................................. 41
MARCO METODOLÓGICO ........................................................................................................... 41
NATURALEZA DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................................... 41
VARIABLES DE ESTUDIO ........................................................................................................ 42
RECURSOS Y MATERIALES .................................................................................................... 43
INGENIERÍA DE PROCESOS: EQUIPOS UTILIZADOS ................................................... 45
Definición de trituración ............................................................................................... 45
Fraccionamiento de la muestra ...................................................................................... 45
Definición de molienda ................................................................................................. 45
Definición del molino de bolas ..................................................................................... 45
x
Funcionamiento del molino de bolas ............................................................................ 46
Definición del tamiz ...................................................................................................... 46
Funcionamiento del tamizador ...................................................................................... 46
PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN.......................................................................... 47
ETAPA I: SEPARACIÓN FÍSICA DE LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA ......... 47
ETAPA II: EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE LA
MEMBRANA PULVERIZADA SECA ....................................................................... 49
ETAPA III: PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO OBTENIDO .............. 52
CAPÍTULO IV .................................................................................................................................. 56
PRESENTACIÓN Y DISCUSION DE RESULTADOS ............................................................. 56
ETAPA I: SEPARACIÓN FÍSICA DE LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA ......................... 56
Análisis granulométrico de cáscaras secas .................................................................... 58
ETAPA II: EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE LA MEMBRANA
SECA............................................................................................................................................. 60
Perfil de pH ................................................................................................................... 60
ETAPA III: PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO OBTENIDO .............................. 61
ETAPA IV: CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO FINAL ................................................. 62
Espectrometría Infrarroja por la Transformada de Fourier ........................................... 65
Comparación de los resultados respecto al solvente utilizado para realizar la extracción
....................................................................................................................................... 70
Comparación de los espectros IR del ácido hialurónico obtenido relacionando los
porcentajes de acetato de sodio y cloruro de sodio utilizado. ....................................... 71
Análisis Termogravimétrico (TGA) .............................................................................. 72
CAPÍTULO V ................................................................................................................................... 81
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................................ 81
Conclusiones ................................................................................................................. 81
Recomendaciones .......................................................................................................... 82
REFERENCIAS ................................................................................................................................ 83
APÉNDICE ....................................................................................................................................... 89
ANEXOS .......................................................................................................................................... 93
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas del Ácido Hialurónico .............................................. 17
Tabla 2. Constituyentes proteicos típicos de las membranas testáceas de la cáscara de

huevo de gallina. ................................................................................................................... 24
Tabla 3. Resumen de variables involucradas en el proceso de investigación. .................... 42
Tabla 4. Materiales, reactivos y equipos utilizados durante todo el proceso de obtención del
AH. ....................................................................................................................................... 43
Tabla 5. Pesos de las cáscaras y membranas empleadas en el proceso ............................... 57
Tabla 6. Rendimiento del proceso de separación de las cáscaras y membranas. ................ 57
Tabla 7. Porcentaje de retención en los tamices de la serie Tyler. ...................................... 58
Tabla 8. Resumen de muestras del producto final obtenido y otras. ................................... 62
Tabla 9. Porcentajes en pérdida de masa por extracción de humedad y descomposición en

las muestras tratadas con AS. ............................................................................................... 75

las muestras tratadas con NaCl. ............................................................................................ 79
xii
INDICE DE FIGURA
Figura 1. Unidad de repetición de ácido hialurónico que comprende ácido D-glucurónico y

N-acetilglucosamina unidos alternativamente por los enlaces glicosídicos β -(1–3) y β –
(1–4). .................................................................................................................................... 15
Figura 2. Esquema de la ubicación y estructura de las membranas del huevo de gallina. . 23
Figura 3. Estructura general de un proteoglicano ................................................................ 24
Figura 4. Diagrama de un Espectrómetro básico de IR de Transformada de Fourier. ........ 27
Figura 5. Diversos tipos de modo de vibración. .................................................................. 28
Figura 6. Esquema de un espectrómetro FT-IR con un interferómetro Michelson clásico. 29
Figura 7. Espectros (izquierda) y sus respectivos interferogramas. Radiación
monocromática(a) y radiación continua de una fuente térmica (d) ...................................... 31
Figura 8. Ejemplo de la curva de tipo TGA y DTG ............................................................ 38
Figura 9. Efecto de la velocidad de calentamiento en la forma de las curvas TGA del
benzociclobuteno curado en oxígeno. .................................................................................. 40
Figura 10. Diagrama del proceso de separación física de las membranas y cáscaras a partir
de residuos de cáscara de huevo de gallina. ......................................................................... 48
Figura 11. Montaje del sistema utilizado para la extracción del ácido hialurónico. ........... 51
Figura 12. Espectrómetro FTIR con accesorio RTA. .......................................................... 54
Figura 13. Equipo para análisis termogravimétrico. ........................................................... 55
Figura 14. Grafico del perfil de pH vs tiempo..................................................................... 61
Figura 15. Espectro IR por ATR del patrón de referencia de hialuronato de sodio. Este
espectro fue obtenido en un equipo modelo Nicolet iS10. ................................................... 66
Figura 16. Espectros de IR para el HS comercial, AS y Cloruro de Sodio. ....................... 67
Figura 17. Espectros IR por ATR de la muestra 31AI, hialuronato de sodio comercial y
acetato de sodio. ................................................................................................................... 68
Figura 18. Espectros IR por ATR de la muestra 31SE, hialuronato de sodio comercial y
cloruro de sodio. ................................................................................................................... 69
Figura 19. Espectros IR por ATR de la muestra 33AI, 33AE, 33AIE, hialuronato de sodio
comercial y acetato de sodio................................................................................................. 70
xiii
Figura 20. Espectros IR por ATR de la muestra 33AI, 32AI, 31AI, hialuronato de sodio
comercial y acetato de sodio................................................................................................. 71
Figura 21. Espectros IR por ATR de la muestra 33SE, 32SE, 31SE, hialuronato de sodio
comercial y cloruro de sodio. ............................................................................................... 72
Figura 22. Termogramas para el HS comercial, AS y Cloruro de Sodio. ........................... 73
Figura 23. Pérdida de masa en función de la temperatura de las muestras tratadas con
acetato de sodio. ................................................................................................................... 75
Figura 24. Termogravimetría Derivada (DTG) de las muestras obtenidas a través de la
primera derivada de la curva de peso en función de la temperatura..................................... 78
cloruro de sodio. ................................................................................................................... 79
xiv
ABREVIATURA
AG Ácido glucuróico
AH Ácido hialuróico
AS Acetato de sodio
ATR "Attenuated total reflectance" (reflectancia total atenuada)
CD-44 Receptores del ácido hialurónico
CGI Concentración de glucosa inicial
Da Dalton
"Differential scanning calorimetry" (Calorimetría de barrido
DSC
diferencial)
DTG "derived thermogravimetry" (Termogravimetría derivada)
FTIR Infrarrojo por la transformada de Fourier
HS Hialuronato de sodio
“High Performance Liquid Chromatographic” (Cromatografía
HPLC
líquida de alta eficacia).
IR Infrarrojo
RHAMM Receptores de la motilidad mediada por hialuronato

"Size exclusion chromatography" (Cromatografía de exclusión de
SEC
tamaño)
TGA Análisis termogravimétricos
Simboliza el enlace glicosídico en posición beta entre el carbono
β-(1→3) anomérico uno en este caso del ácido glucurónico y el carbono
tres de la N-acetilglucosamina
Simboliza el enlace glicosídico en posición beta entre el carbono
β-(1→4) anomérico uno en este caso de la N-acetilglucosamina y el
carbono cuatro del ácido glucurónico
1
H-NMR Resonancia magnética nuclear de protón
xv
EVALUACIÓN, DISEÑO Y SIMULACIÓN DE PROCESOS
INDUSTRIALES
EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE LA

MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE GALLINA (Gallus gallus domesticus)
VENEZOLANA.
Autores: Br. Casadiego Soleydimar

Br. Garcia Enderlys
Tutor Externo: Dr. Catarí Edgar
Tutor Académico: M.Sc. Mayantino Garaboto
RESUMEN
El presente trabajo permitió evaluar la obtención del Ácido Hialurónico a partir de la membrana
de la cáscara del huevo de gallina (Gallus gallus domesticus) venezolana. Primeramente se
estableció un método físico que permitió la separación de las membranas de las cáscaras con un
rendimiento del 51,0 %. Luego de lograr la separación se llevó a cabo la extracción, para esto se
realizaron ensayos experimentales a nivel de laboratorio, desarrollados en el Laboratorio de
Polímeros del Centro de Química del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).
Las membranas fueron tratadas bajo las siguientes condiciones de operación: control de pH desde
3,5 a 3,9 manteniendo constante la temperatura de 9 °C durante 3 días de extracción. Se
emplearon dos solventes, isopropanol y etanol en proporción 1:1 respecto al volumen de muestra
obtenida, resultando ser más eficiente el isopropanol. Dentro del proceso se utilizaron dos sales
como agentes precipitantes, acetato de sodio y cloruro de sodio, ambas al 3, 2 y 1% en diferentes
ensayos. Se caracterizó parcialmente el producto obtenido empleando la técnica de FTIR con el
accesorio ATR, resultando que para las muestras tratadas con 1% de acetato de sodio mostraron
bandas más definidas asociadas al hialuronato de sodio comercial, sin embargo, se encontró que
dichas muestras contenían un exceso de acetato de sodio. De igual manera, se practicaron análisis
de TGA que permitieron deducir que el exceso de acetato de sodio y cloruro de sodio
estabilizaban térmicamente las muestras elevando su temperatura de descomposición en
comparación a la del hialuronato de sodio puro.
Palabras claves: Ácido hialurónico, membranas intersticiales, cáscaras, huevos de gallina,

biopolímero, espectrometría.
xvi
INTRODUCCIÓN
En 1934, Karl Meyer y John Palmer aislaron un nuevo polisacárido del humor
vítreo de bovinos, compuesto por un ácido urónico y un aminoazúcar. Lo llamaron ácido
hialurónico (Peñuelas, 2016). El Ácido Hialurónico (AH) es un polímero de origen natural
que resulta de la polimerización alterna del Ácido Glucurónico (AG) y N-
Acetilglucosamina, esta molécula puede llegar a alcanzar una longitud de cadena del orden
de 102 a 104 unidades manométricas, obteniéndose así un rango de peso molecular de entre
104 a varios millones de Dalton. El AH se encuentra localizado en la matriz extracelular,
articulaciones, cartílago, piel actuando como esponja absorbiendo el agua. Por tanto, el AH
es el responsable principal de la hidratación de la piel. A nivel comercial, el AH se produce
a partir de crestas de gallo y por fermentación del Streptococcus pertenecientes al grupo C,
el cual el grupo C tiene una alta productividad de AH y no son patógenos humanos
(Peñuelas, 2016). Este trabajo consistió en evaluar la obtención de AH usando la membrana
de la cáscara del huevo de gallina como materia prima alternativa para extracción.
Agroindustrias D’EFRAIN C.A., es una empresa ubicada en Barquisimeto Edo.

Lara, que se dedica a la fabricación de ovoproductos, esta empresa genera una gran
cantidad de cáscaras de huevo de gallina como residuos industriales, los cuales son
desechadas al ambiente creándose así un problema ambiental. Es por ello, que se consideró
utilizar estas cáscaras de huevo como materia prima para la obtención del AH generando de
esta manera un nuevo producto de alto valor agregado para la empresa Agroindustrias
D’EFRAIN.
La finalidad de este trabajo tiene como objetivo evaluar el método físico y químico
para la obtención del Ácido Hialurónico a partir de la membrana de la cáscara del huevo de
Gallina (Gallus gallus domesticus) Venezolana, usando como solvente de extracción
isopropanol y etanol y como agentes precipitantes acetato de sodio y cloruro de sodio a
diferentes concentraciones.
El procedimiento para llevar a cabo la obtención del AH a partir de la membrana de

la cáscara del huevo de gallina se dividió en cuatro etapas: Etapa I: Separación física de la
1
membrana de la cáscara. Etapa II: Extracción del ácido hialurónico a partir de la membrana.
Etapa III: Purificación del ácido hialurónico obtenido. Etapa V: Caracterización del
producto final.
El presente trabajo especial de grado se presenta en cinco capítulos. En el Capítulo

I: se describe el problema al cual se pretende dar solución, así mismo se plantean los
objetivos y la justificación del presente estudio. En el Capítulo II: se presenta el marco
teórico, allí se indican los antecedentes y las bases teóricas que sustentan el presente
trabajo. En el Capítulo III: se describe la metodología de trabajo, empleada para el presente
estudio y las variables del trabajo. En el Capítulo IV: se presenta el análisis de resultados
obtenidos. En el Capítulo V: se indican las conclusiones y recomendaciones.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El AH es un biopolímero de especial interés industrial, debido a sus propiedades

estructurales, reológicas, fisiológicas y biológicas, tiene un amplio rango de aplicaciones en
áreas como la medicina, farmacología, oftalmología y estéticas (Allasia y Sarmiento, 2016).
La evidente versatilidad del AH lo convierten en una materia prima de gran importancia a
nivel comercial, y debido a su difícil obtención, este biopolímero se cotiza alto en el
mercado internacional.
De acuerdo a Stone y colaboradores (Stone, 2013), “el AH puede encontrarse

prácticamente en todos los seres vivos que poseen articulaciones y tejido conjuntivo. El
cuerpo humano está constituido en su mayor parte por agua, por lo que es necesaria la
existencia de mecanismos que mantengan esta agua en las células y tejidos”. Precisamente,
el AH interviene en este proceso de retención de agua en células y tejidos, proporcionando
o asegurando de esta manera el medio hidratado que nuestro organismo necesita para el
transporte molecular y otros procesos biológicos.
La fabricación industrial del AH se basa en dos procesos principales, la extracción

de tejidos animales y la fermentación microbiana utilizando cepas bacterianas. Ambas
3
tecnologías producen AH de alto peso molecular para aplicaciones biomédicas y
cosméticas. El primer proceso, que se aplicó a escala industrial, fue la extracción de AH a
partir de desechos animales, un inconveniente en el proceso de extracción es la inevitable
degradación del AH, causada por (a) la actividad hialuronidasa endógena en tejidos
animales, rompiendo la cadena del polímero a través de la hidrólisis enzimática, y (b) las
duras condiciones de extracción (Boeriu, 2013).
La producción del AH por fermentación bacteriana evolucionó a una tecnología

madura en las últimas dos décadas del siglo XX. En las etapas iniciales de desarrollo de la
fermentación bacteriana utilizando estreptococos del grupo A y C, se utilizaron la
optimización de los medios de cultivo y las condiciones de cultivo junto con la mejora de la
tensión para aumentar el rendimiento y la calidad del AH. La fermentación bacteriana
produce AH con alto peso molecular y pureza, pero existe riesgo de contaminación con
endotoxinas bacterianas, proteínas, ácidos nucleicos y metales pesados (Boeriu, 2013).
Además de las fuentes antes mencionadas, existen otros sustratos alternativos que
pueden ser útiles para extraer AH, como por ejemplo la membrana de la cáscara del huevo
de gallina, como se indica en la investigación descrita por Khanmohammadi (2014). No
obstante, se ha determinado que el contenido de AH presente en las membranas de las
cáscaras de huevo es menor en comparación a otras fuentes, como los cordones umbilicales
y las crestas de gallo, sin embargo las membranas de las cáscaras de huevo resultan ser una
fuente alternativa de AH con un gran potencial para ser usado en el campo industrial y
medicinal (Khanmohammadi, 2014).
La empresa Agroindustrias D’EFRAIN C.A., se dedica a la pasteurización, cocción,

deshidratación, liofilización, congelación, etc., de huevos enteros, claras y yemas, que
luego serán utilizados como ingredientes o materia prima en la producción de otros
alimentos en la hostería y procesos de la industria alimentaria (Instituto del Estudio del
Huevo, 2009). Esta actividad industrial genera desechos, como por ejemplo las cáscaras de
huevo de gallina, los cuales se convierten en residuo industrial no aprovechado. Es por esta
razón que se pretende usar dichas cáscaras de huevo de gallina como fuente de extracción
para la obtención del hiluronato de sodio y darle así un valor agregado.
4
Bajo el patrocinio de la empresa Agroindustrias D’EFRAIN C.A., y con el apoyo y
soporte técnico del Laboratorio de Polímeros del Instituto Venezolano de investigaciones
científicas (IVIC), se investigó la manera de obtener AH a partir de las cáscaras de huevo
residuales. Este AH representaría un producto secundario de gran valor comercial con el
cual se obtendría una excelente oportunidad de negocios para la empresa Agroindustrias
D’EFRAIN C.A., al mismo tiempo se reduce el impacto ambiental que se deriva de la
deposición de estos desechos industriales al entorno, a pesar de que son productos que no
contienen compuestos de alto riesgo medioambiental, la acumulación de estas cáscaras en
grandes volúmenes pueden plantear problemas de gestión.
La cáscara de huevo de gallina representa del 9 al 12% del peso total del huevo, la
misma está compuesta en un 96-98% de carbonato calcio (CaCO3), mientras que el 2-4%
restante constituye una matriz orgánica que se localiza dentro y entre los cristales de
carbonato de calcio, esta matriz orgánica, adherida internamente en la cáscara de huevo,
está compuesta por dos membranas llamadas membrana testácea interna y externa, la
principal función de esta matriz orgánica es la de proporcionar protección contra la
penetración bacteriana (Fernández, Arias, 2010). De acuerdo a estudios realizados en el
Laboratorio de Biología Celular del departamento de Ciencias Biológicas Animales de la
universidad de Chile, la membrana de la cáscara de huevo seca, está constituida en un 3%
de lípidos, 2% de polisacáridos y 95% de proteínas (Fernández, Arias, 2010). El
polisacárido al cual se refiere el estudio anteriormente mencionado, es el AH.
Un problema determinante a enfrentar en el presente trabajo es evaluar un método

que sea directo y rápido que permita aislar el AH de la membrana interna del huevo, usando
como solventes precipitantes isopropanol y etanol, que permita extraer dicho biopolímero
en un alto grado de pureza a partir de las membranas del huevo de gallina, por lo tanto, se
empleara un procedimiento de extracción de AH reportado por la Universidad de
Tecnología de Tabriz, Irán, y se realizaran las modificaciones del mismo que sean
necesarias. Para confirmar la efectividad del procedimiento de extracción del AH, se
utilizaran técnicas de caracterización fisicoquímicas por medio de las cuales se buscara
identificar y cuantificar el AH extraído.
5
De lo antes expuesto, surgen siguientes interrogantes que el trabajo experimental
buscara responder:
 ¿Se podrá establecer un método de forma manual para la separación de la membrana

de la cáscara?
 ¿Se podrán obtener las condiciones experimentales adecuadas para la extracción del
AH a partir de las membranas de la cáscara del huevo de gallina usando como
solventes isopropanol y etanol?
 ¿Qué fracción se obtendrá del proceso al usar acetato de sodio y cloruro de sodio
como agentes precipitantes?
En aras de dar respuestas a estas interrogantes antes planteadas, se procede a formular los
objetivos del presente trabajo.
6
OBJETIVOS DEL TRABAJO
Objetivo General
Evaluar la obtención del Ácido Hialurónico a partir de la membrana de la cáscara del huevo
de Gallina (Gallus gallus domesticus) Venezolana.
Objetivos Específicos
 Proponer un método manual para la separación física de la membrana de la cáscara del

huevo de gallina.
 Establecer las condiciones experimentales adecuadas para la extracción del Ácido

Hialurónico a partir de las membranas de las cáscaras de huevo de gallina usando
isopropanol y etanol como solventes de extracción y acetato de sodio y cloruro de
sodio como agentes precipitantes.
 Caracterizar parcialmente los productos de extracción mediante espectrometría

infrarroja por la Transformada de Fourier (FTIR) y por análisis termogravimétricos
(TGA).
7
JUSTIFICACIÓN
La finalidad de este trabajo es generar un método alternativo práctico para obtener

AH a partir de las membranas de las cáscaras de huevo de gallina, tomando en cuenta que,
el AH es un biopolímero de gran interés para la industria médica, farmacéutica y
especialmente en la cosmética. Al mismo tiempo, la utilización de un desecho industrial,
como lo son las cáscaras de huevo generadas en la fabricación de ovoproductos por parte de
Agroindustrias D’EFRAIN C.A., agrega un valor adicional al presente trabajo de grado.
En el 2016, Allasia y Sarmiento informa que dentro del sector de la cosmética, el

mercado de productos anti-edad se encuentra en crecimiento, principalmente aquellos
productos que poseen como ingrediente activo el AH, debido que, a diferencia de otros
métodos, no modifica el aspecto natural o los rasgos del rostro y se encuentra naturalmente
en la piel. El mercado abarca los países de la Unión Europea, Estados Unidos, algunos
países de Asia como Japón, y recientemente China e india. El AH es un sustituto del
colágeno y de otros materiales utilizados como rellenos dérmicos en cosmética y cirugía
reconstructiva (por ejemplo, toxina botulínica) y también se puede aplicar en productos
cosméticos de aplicación tópica, dadas sus propiedades como humectante natural.
La investigación de Allasia y Sarmiento (2016) indica que en la región Sur de

América, Brasil representa uno de los mercados dominantes en la región mostrando un
fuerte crecimiento en las ventas de productos para el cuidado de la piel desde el año 2002
hasta la actualidad. De acuerdo a las estadísticas mostradas en el 2014 sobre
procedimientos cosméticos quirúrgicos y no quirúrgicos desarrolladas por La Sociedad
Internacional de Cirujanos Plásticos Estéticos (ISAPS por sus siglas en inglés) muestra que
Brasil es el país con mayor número de intervenciones estéticas en la región. En el caso de
países como Chile, Colombia, Argentina y Venezuela se ha observado un creciente interés
de los habitantes por mantener el aspecto de la piel joven y firme, lo que permitió que las
ventas de productos para el cuidado de la piel se incrementan a pesar que estos países
representan solo pequeños mercados en la región. (Allasia y Sarmiento, 2016).
8
La empresa Agroindustria D’EFRAIN C.A. es una empresa dedicada a la
transformación y producción de los derivados industriales del huevo (ovoproductos) que
pueden destinarse al consumo humano directo, o para el uso en otras industrias para obtener
otros productos. La producción de estos ovoproductos genera grandes cantidades de
desechos sólidos, alrededor de unos 108.000 huevos por día durante el proceso de
quebrado, actualmente este pasivo ambiental no es aprovechado de ninguna manera,
además representa una fuente de contaminación generando las condiciones adecuadas de
procreación de insectos y otros entes patógenos. Por lo tanto, el presente trabajo utilizara
estos desechos como materia prima para la obtención del AH, lo cual aportará un valor
agregado a las cascaras de huevo desechadas, y se minimizará el impacto ambiental.
En la actualidad, el AH se extrae tanto de tejidos animales (crestas de gallo y

cordones umbilicales), como por fermentación microbiana. Sin embargo, el AH extraído de
fuentes animales requiere una purificación extensiva, siendo éste un proceso costoso,
laborioso y que genera una gran cantidad de residuos químicos (Peñuelas, 2016).
Extraer el AH a partir de la membrana del huevo de gallina resulta una alternativa

viable que consiste en el aprovechamiento de estos desechos sólidos dándole un gran valor,
a pesar de que implica ser un proceso laborioso y largo, así como los procedimientos de
extracción de AH a partir de otros tejidos animales e incluso a partir de la fermentación
microbiana.
Cabe destacar que el estudio de la obtención del Ácido Hialurónico a partir de la

membrana de la cáscara del huevo de Gallina se encuentra enmarcado en la línea de
investigación asociada a “Evaluación, Diseño y Simulación de Procesos Industriales” del
Departamento de Ingeniería Química, UNEXPO, ya que tiene como objetivo principal
evaluar la obtención del ácido hialurónico a partir de la membrana del huevo de gallina.
9
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
ANTECEDENTES
Con el propósito de darle fundamento teórico al presente trabajo de grado, se realizó

una revisión bibliográfica sobre aquellas investigaciones, que brindaron un aporte
significativo para el entendimiento de los fenómenos químicos y físicos observados durante
los trabajos experimentales dirigidos hacia la obtención del AH a partir de la membrana de
la cascara de huevo de gallina.
Estudios anteriores relacionados con la obtención del AH, han servido de base y
sustento en este trabajo de grado; algunos de gran importancia, se citan a continuación.
En el trabajo realizado por Lago (2007) titulada “Cordones umbilicales residuales,

nueva fuente de obtención de ácido hialurónico y sus fracciones” desarrollada en la Ciudad
de la Habana, Cuba; en este trabajo se discute un método de obtención de AH, a partir del
aprovechamiento de los cordones umbilicales residuales, generados como subproducto de
producciones biofarmacéuticas, como la elaboración del gel fotoprotector. Éstos se
caracterizaron por métodos químicos y fisicoquímicos. El polisacárido obtenido tuvo
interés tanto en la producción cosmética, como en la industria medico farmacéutica y de
10
esta forma se han elaborado a partir del mismo un jabón, gel y loción evaluadas para el
tratamiento antiacné, así como un gel cicatrizante propuesto en el tratamiento de ulceras y
una loción para después de afeitar, ya comercializada. En dicho estudio se determinó el
contenido de AH mediante el empleo de cromatografía líquida de intercambio iónico (HPIC
en sus siglas en inglés), se determinó la masa molar del ácido hialurónico por cromatografía
de exclusión molecular (SEC en sus siglas en inglés), se realizó un análisis mediante el
empleo de la espectrofotometría infrarroja por la transformada de Fourier (FTIR) para la
detección de los principales grupos funcionales presentes en el ácido hialurónico purificado
y en el tomado como estándar de referencia, de igual manera se aplicaron otros análisis para
su caracterización. La información aportada por esta tesis proporcionó algunas de las bases
teóricas necesarias para complementar esta investigación, además aportó información
referente al método de análisis y caracterización que fueron aplicados al producto obtenido
y al AH comercial.
Por su parte, Khanmohammadi (2014) reportaron el trabajo titulado “Estrategia de

optimización secuencial para la extracción de ácido hialurónico de cáscara de huevo y su
caracterización parcial” En este trabajo, el rendimiento de extracción del AH de la
membrana de cáscara de huevo, fue estudiado de acuerdo a las condiciones de extracción
planteadas en este trabajo, dichos parámetros fueron la estrategia de extracción (con control
de pH, sin control de pH), la temperatura y el tiempo de extracción usando un factor
completo de diseño experimental. La optimización de la extracción se llevó a cabo
utilizando información obtenida de los experimentos factoriales por metodología de
superficie de respuesta. El AH extraído se caracterizó parcialmente por el espectro FTIR
después de la purificación para evaluar sus posibles aplicaciones en la industria y la
medicina. El objetivo del estudio fue evaluar la posibilidad del uso de los desechos de
cáscara de huevo como una fuente alternativa para la producción del AH. Los datos
experimentales, así como las pruebas de validación, mostraron valores de AH extraídos más
de 5 mg / g de cáscara de huevo con el volumen de ácido acético menor de 10 ml / g de
cáscara de huevo cuando el pH y el tiempo de extracción estuvieron limitados en los
intervalos de 3,4-3,5 y 3-3,4 días, respectivamente, a 9 ° C. El AH purificado se caracterizó
por FTIR, obteniendo un polisacárido de peso molecular promedio. El estudio determinó
que la cáscara de huevo es una fuente alternativa para la extracción de AH para su uso en
11
la industria y la medicina. La metodología de extracción de AH descrita en el trabajo por
Khanmohammadi, sirvió como base metodológica para el presente trabajo de grado, para
ello se tomaron en cuenta las siguientes variables: pH, temperatura y tiempo de extracción.
Además sirvió como referencia en cuanto al uso de la técnica de análisis, FTIR para
detectar la presencia de los diferentes grupos amino, carboxilo e hidroxilo característicos
del AH.
Por otro lado, Urbano (2015) en su trabajo titulado “Extracción a escala de

laboratorio del complejo de proteínas presentes en las membranas intersticiales de la
cáscara del huevo de gallina (Gallus domesticus) mediante el proceso de hidrólisis alcalina”
extrajo el complejo proteico presente en las membranas intersticiales de residuos de cáscara
de huevo de gallina (abreviado como RCHG) mediante el proceso de hidrólisis alcalina,
para lo cual, en la etapa inicial del trabajo de grado, se aplicó el método de separación por
diferencia de densidades, para aislar la fase proteica (membranas) de la fase mineral
(cáscara). Con la separación de los constituyentes de los RCHG, se realizaron análisis de
caracterización para cada una de las fases, los cuales determinaron que las membranas
intersticiales son una fuente significativa de proteína, debido a que contienen alrededor de
71,19 % p/p de proteína, mientras que la fase mineral contiene altas concentraciones de
carbonato de calcio, ya que alcanza valores de 94 mg de Ca / g material. El producto final
fue un concentrado en polvo de proteína hidrolizada de membranas de cáscara de huevo,
con una concentración de 49,94 % de material proteico. Este estudio sirvió como guía en el
empleo del método de separación física aplicado a la cáscara del huevo de gallina para ser
separada de la membrana intersticial, pero de forma manual y adaptándolo a los materiales
y equipos con los que contaba la empresa Agroindustrias D’EFRAIN.
Por último, Peñuelas (2016), cuya investigación se titula “Producción y

caracterización de ácido hialurónico por cultivo sumergido de Streptococcus equi subsp.
Zooepidemicus” en Ciudad de México, México. El objetivo de este trabajo fue evaluar el
efecto de la concentración de glucosa inicial o CGI (2.5, 5 y 10 g/L), así como de la
agitación (0, 200, 400 y 600 rpm) en la producción de AH a partir de cultivo sumergido de
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus en caldo de soya y tripticaseína. El biopolímero
obtenido en cada experimento fue extraído y purificado, la extracción de AH se efectuó de
12
acuerdo al procedimiento descrito por Pires y Santana (2010). De igual manera, en este
trabajo se caracterizó el AH obtenido mediante la técnica de Espectrometría de Infrarrojo
por Transformada de Fourier (FTIR) y resonancia magnética nuclear de protón (1H-NMR)
con el objetivo de verificar la pureza y existencia de los grupos funcionales característicos
del AH. Además, se determinó el peso molecular y el índice de polidispersidad, que son
parámetros importantes de calidad, mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Lo significativo de este trabajo fue el uso de la técnica de infrarrojo utilizada para
caracterizar el AH obtenido, el cual permite su correcta identificación. Dicho método será
adaptado a las condiciones de trabajo en las que se desarrolle esta investigación.
13
BASES TEÓRICAS
Con la finalidad de ampliar el estudio del AH a partir de la membrana del huevo de

gallina, se plasma como información más relevante los siguientes conceptos, los cuales
ayudaran a un mejor entendimiento del tema a estudiar.
ÁCIDO HIALURÓNICO: BIOPOLÍMERO POTENCIAL PARA MÚLTIPLES

APLICACIONES
Definición
Según Tamer, (2013), el AH (figura 1) es un biopolímero compuesto por unidades

repetidas del disacárido N-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico, unidos por enlaces
glucosídicos β (1→3) y β (1→4). Ambos azúcares están en la configuración β, lo que
permite que todos los grupos voluminosos (carboxilo, hidroxilos y el carbono anomérico
del azúcar adyacente) se encuentren en posición ecuatorial, mientras que los pequeños
átomos de hidrógeno ocupan las posiciones axiales. De este modo, la estructura del
disacárido es muy estable energéticamente.
Este biopolímero es miembro de la familia de los glicosaminoglicanos, que incluye

al sulfato de condroitina, sulfato de queratina y sulfato de heparina, siendo estructuralmente
el más simple de ellos, ya que no se encuentra covalentemente asociado a un núcleo
proteico, ni es sintetizado en el aparato de Golgi, además de ser el único que no está
sulfatado (Boeriu et al., 2013; Kogan et al., 2007).
Los pesos moleculares del HA de diferentes fuentes son variables, encontrándose

entre 104 y 107 Da (Liu et al., 2011). El HA en soluciones acuosas, la molécula ocupa un
gran volumen hidrodinámico, e incluso a bajas concentraciones (< 1 mg/L) las cadenas son
capaces de interactuar para formar redes. Estas características estructurales, que son
altamente dependientes del peso molecular, le confieren al polímero su reología
viscoelástica y la habilidad de retener grandes volúmenes de agua, que son determinantes
para las funciones fisiológicas del HA (Armstrong y Johns, 1997).
14
Figura 1. Unidad de repetición de ácido hialurónico que comprende ácido D-glucurónico y
N-acetilglucosamina unidos alternativamente por los enlaces glicosídicos β -(1–3) y β –
(1–4).
Fuente: Chong et al., (2005).
Características estructurales
La investigación de Lago (2007) señala que mediante estudios de resonancia

magnética nuclear, microscopia electrónica y difracción de rayos X, se ha demostrado que
el AH posee estructura primaria, secundaria y terciaria. La estructura primaria está dada por
la secuencia monosacarídica del dímero constituido entre el ácido glucurónico y la N-
acetilglucosamina. La estructura secundaria, se establece por las interacciones
intramoleculares mediante puentes de hidrógeno (5 en total), provocando que la cadena
lineal del polisacárido se tuerza y forme una doble hélice y la estructura terciaria está
caracterizada por tres posibles puntos de contacto intermolecular que son: 1) cadenas
antiparalelas unidas a grupos hidrófobos, 2) cadenas paralelas mediante interacciones por
puentes de hidrógeno y 3) cadenas entrecruzadas por interacciones por puentes de
hidrógeno e interacciones con los posibles centros hidrófobos. Estos tipos de interacciones,
pueden explicar la gran mayoría de las propiedades asociadas a este polisacárido como son:
viscoelasticidad, poder hidratante, cicatrizante y antiinflamatorio, así como una barrera que
dificulta la difusión de los gérmenes, por lo que se le atribuye propiedades bacteriostáticas.
El poder hidratante del AH está relacionado con su estructura. En los tejidos se

manifiesta, al formar redes poliméricas comportándose como un medio gelatinoso que sirve
15
de base para las funciones tisulares. Estas redes poliméricas, tienen la posibilidad de
retener agua en su interior como si fuera una esponja molecular. En el caso de la piel, es
responsable de su capacidad hidratante. Se ha demostrado que cuando se aísla de fuentes
biológicas o se obtiene por vía biosintética, la capacidad de hidratación del mismo, permite
formar soluciones con características viscoelásticas, de interés en oftalmología. Según
algunos investigadores esta propiedad es única de esta estructura (Lago, 2007).
En el 2007, Lago añade que a diferencia de otros proteoglicanos, el AH, a pesar de

contener en su estructura algunas zonas hidrofóbicas, constituidas por grupos CH, no se une
de forma covalente a las proteínas, aunque se plantea que puede interactuar con algunas
muy específicas de las membranas como los receptores CD-44, el receptor para la motilidad
mediada por hialuronato (RHAMM), así como la molécula de adhesión intercelular. Otros
polisacáridos pertenecientes a esta familia, si pueden asociarse mediante enlaces covalentes
con las proteínas, como son el sulfato de condroitina (SCh), sulfato de heparina (SH) y el
sulfato de queratina (SQ), etc. Estas propiedades de asociación con las proteínas, debe
tenerse en cuenta al abordar un procedimiento de purificación. (Lago, 2007).
Especificaciones
Las propiedades fisicoquímicas del AH dependen del tamaño de la molécula, ya que

el mismo puede ser muy variable. En el mercado se puede encontrar AH de grado médico o
farmacológico y de grado cosmético, los cuales difieren en la calidad del producto.
También pueden encontrarse en grado laboratorio y grado técnico, en este caso la diferencia
es en la pureza (Allasia y Sarmiento, 2016). En general, las propiedades son las siguientes:
16
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas del Ácido Hialurónico
Fórmula Química (C14H21NO11)n
Estado físico, aspecto Polvo blanco, sin olor
pH 5,0 – 8,5 (solución acuosa al 0,5 %)
Pureza >93 – 95 %
Peso Molecular 8 – 2400 kDa

Soluble en agua y mezclas de agua
y solventes orgánicos miscibles en
Solubilidad agua (ej. Alcoholes). Insoluble en
grasas y solventes orgánicos
anhídridos.
Principales Características Higroscópico, poco inflamable.
Fuente: Allasia y Sarmiento, (2016).
Degradación
El AH, tanto a nivel de tejido como cuando se encuentra libre puede ser
degradado por diferentes vías: enzimáticas, por acción de agentes químicos, radiaciones
ionizantes y por efecto de la temperatura.
La enzima hialuronidasa testicular, cataliza la hidrólisis de los enlaces β-(1→4) del

AH. Esto viene acompañado de un descenso de la viscosidad y por tanto de su masa molar.
Sin embargo, la llamada hialuronidasa de sanguijuela escinde el enlace D glucosidurónico
β-(1→3) y la unidad más pequeña que se obtiene en esta hidrólisis es un tetrasacárido que
posee el ácido urónico en el extremo reductor. Esta enzima es específica para el AH y no
degrada otros glucosaminoglicanos, por esta razón se puede emplear en la identificación del
mismo. Otras, como la hialuronato glicanohidrolasa, de veneno de reptiles e insectos,
rompe el enlace aminodeoxihexosídico y se obtienen oligosacáridos de inferior masa molar
(Lago, 2007).
En 2007, Lago expresa que el ácido hialurónico se puede degradar también por
agentes oxidantes y radiaciones UV y gamma, produciéndose radicales libres en la
17
molécula de AH, que le permite inhibir algunas sustancias proinflamatorias como son
interleucinas (IL-1β) y el factor de necrosis tumoral (TNF−α), esta inhibición puede
explicar, el efecto antiinflamatorio y analgésico del mismo.
La investigación de Lago (2007) también señala que la degradación por efecto de la

temperatura se produce principalmente en solución, a temperaturas mayores de 25°C por
más de seis horas.
Función
EL AH se caracteriza por su ubicuidad, se encuentra localizado, en diferentes tipos

de tejidos en el ser humano: en la piel, en las membranas corioamnióticas, en el fluido
sinovial, en el cordón umbilical humano, en los tejidos de los cartílagos, humor vítreo, en
las células dendríticas etc. (Ponting y Kumar 1995).
El AH tiene una estructura que exhibe una amplia gama de efectos biológicos, dada
por su capacidad hidratante, acción antiinflamatoria, cicatrizante etc. Durante la última
década se ha demostrado que participa en un grupo de eventos que contribuyen en el
comportamiento y fisiología de las células tales como: movimiento, crecimiento, división y
diferenciación, remodelación del tejido, inflamación y tumorogénesis. Como se explicó con
anterioridad, el AH no forma enlace covalente con las proteínas sin embargo, las células
responden directamente al AH por medio de proteínas de la superficie de la membrana, que
se unen al mismo mediante interacciones no covalentes, éstas son: las hiadhelerinas, el
receptor CD-44, el receptor para la motilidad mediada por hialuronato (RMMAH), el cual
juega un papel importante en la motilidad de las células malignas, así como la molécula de
adhesión intercelular (MAC-1). De los anteriores, el receptor CD-44 de gran especificidad
hacia el AH, es una proteína integral de la membrana la cual está implicada, con la
regulación del desarrollo de tumores y con el potencial metastático (Tufvesson y
Westergren, 2000; Karvinen y col, 2003; Gao y col, 2004).
Entre los mecanismos de acción del AH en la cicatrización, está su interacción con

el fibrinógeno, acelerando el proceso de formación del coágulo de fibrina inducida por la
18
trombina. Aunque el nivel de AH es bajo en sangre, el mecanismo explica el significado
funcional y estructural de este polisacárido durante la cicatrización (Weigel y col, 1988).
El AH presente en el fluido sinovial, se sintetiza por los condrocitos articulares a

nivel intracelular, mediante la acción de la enzima hialuronato sintaza (Hascall, 2000). La
presencia de este polisacárido es el responsable, de la alta viscosidad de éste, contribuyendo
a la flexión de las articulaciones. Por la elevada masa molar y sus características
estructurales, el AH muestra un efecto analgésico y antiinflamatorio ya que cubre la
superficie de los receptores del dolor y actúa sobre los radicales libres que pueden aparecer
por desequilibrios metabólicos con el envejecimiento o por algún trastorno en la
articulación (Marshall y col, 2000). En la piel, el AH está vinculado con la defensa del
organismo, al formar parte de la barrera química, impidiendo la penetración o el desarrollo
de microorganismos o partículas extrañas y participa en la reparación de la misma.
Usos
Debido a las propiedades del AH, el desarrollo y la comercialización de productos a

base de AH están en continuo crecimiento. Este biopolímero se utiliza principalmente en el
tratamiento de la osteoartritis, en cosméticos, en oftalmología, en medicina estética, en
cirugías y cicatrización de heridas, en la administración de fármacos tópicos, y en la
ingeniería de tejidos.
Existen tres formulaciones comerciales del AH: en forma lineal, derivatizado y

reticulado. El AH se encuentra naturalmente en su forma lineal, sin embargo generalmente
se lo somete a procesos de reticulación (formación de enlaces covalentes entre las cadenas
de AH para obtener redes de AH tridimensionales) o procesos de derivatización
(modificación de la cadena lineal) ya que de esta forma es menos susceptible a la hidrólisis
química y enzimática, muestra una prolongada persistencia in vivo y se mejoran las
propiedades mecánicas específicas del material.
Dichas modificaciones químicas de AH implican el hidroxilo o los grupos carboxilo

del polímero, e incluyen procesos de esterificación y sulfatación (Schiraldi, et al., 2010).
19
MATERIA PRIMA: MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE GALLINA
La producción de AH se realiza mediante la membrana de la cáscara del huevo de

gallina pulverizada, seguido por una etapa de purificación.
Cáscara del huevo de gallina
La cáscara de huevo de gallina, ave que pertenece a la especie Gallus Gallus,

subespecie domesticus, representa aproximadamente del 9,00 al 12,00 % del peso total de
un huevo, lo que significa alrededor de 5 a 7 g constituye un sistema biomineralizado que
consta de dos fases o matrices: orgánica y otra mineral cristalina o inorgánica (Fernández y
Arias, 2000).
La investigación de Fernández y Arias, señala que la fase orgánica está compuesta

principalmente por proteínas, lípidos, proteoglicanos y glicoproteínas y constituye
alrededor del 3,00 al 5,00 % del peso total de la cáscara. Mientras que, la fase mineral
corresponde al 95,00 %, aproximadamente del peso de la cáscara. Esta fase es el resultado
del depósito de minerales, entre ellos el calcio.
Composición química
La cáscara de huevo de gallina químicamente está compuesta de 1,60 % de agua,

3,30 % de materia orgánica y 95,10 % de minerales, de los cuales: 93,60 % corresponden a
carbonato de calcio (CaCO3) en su forma morfológica como calcita, 0,80 % de carbonato
de magnesio (MgCO3) y 0,73 % de fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2).
Organización estructural
La cáscara del huevo se compone de cinco capas, morfológicamente distintas, que

se fabrican de forma secuencial durante el paso del huevo a través el oviducto. Desde el
exterior hacia el interior estas capas son: cutícula, capa en empalizada, capa mamilar,
membrana externa y membrana interna, según lo explica Fernández y Arias (2010). Los
componentes que conforman las cinco capas se depositan sucesivamente a manera de una
línea de ensamblaje, a medida que el huevo avanza a lo largo del oviducto. Sus
características y funciones se detallan a continuación:
20
Cutícula
La cutícula se deposita sobre la superficie de la cáscara durante la fase final de
formación del huevo, se distribuye de manera desigual y su espesor varía desde 0,5 hasta
12,8 µm. en ella se encuentra en gran mayoría los pigmentos (moléculas de porfirinas)
responsables de la coloración de la cáscara (Fernández y Arias, 2010).
Capa en empanizada
Corresponde a la capa más gruesa de la cáscara de huevo, con un espesor

aproximado de 200 – 350 µm. su nombre se debe a la estructura de columnas que forman
los cristales de calcita, con una organización paralela a manera de un cerco.
Capa mamilar
La capa mamilar tiene un grosor aproximado de 100 µm. Está formada por las
mamilas, que constituyen pequeñas masas de material orgánico distribuidas de manera
discreta en toda la capa y que se hallan unidas a la superficie externa de la membrana
externa. Es a partir de las mamilas que se inicia la mineralización por el depósito de
cristales de calcita, constituyéndose de esta manera la base de las columnas cristalinas de la
capa en empanizada.
Membranas externa e interna

Las membranas de la cáscara de huevo de gallina que también son conocidas como
membranas intersticiales, membranas testáceas o fárfaras, constituyen la materia primordial
de experimentación en la que se basa la presente investigación, por lo tanto, se dedica un
subcapítulo a continuación para un estudio más detallado.
USOS Y APLICACIONES PARA LOS RESIDUOS DE CÁSCARAS DE HUEVO DE

GALLINA
Las cáscaras del huevo de gallina y sus membranas son materiales de desecho
baratos y abundantes, cuyos usos tradicionales son como alimento para animales, como cal
sustituta o como fertilizante. Sin embargo, la separación de este residuo en sus
constituyentes minerales (cáscara) y proteicos (membranas), permite el desarrollo de
21
diferentes aplicaciones para cada material, dando lugar a productos de mayor valor
agregado (Urbano, 2015).
Las compañías de ovoproductos (derivados del huevo de gallina), durante más de 10
años, han invertido en la investigación y desarrollo de procesos que permitan la extracción
de productos con potencial aplicación comercial a partir de sus residuos. El alcance de estos
estudios ha dado lugar a un sinnúmero de usos tanto para las membranas intersticiales como
para la cascara limpia (Urbano, 2015).
Muchos de ellos han desarrollado de manera exitosa y rentable, de tal forma que
actualmente se encuentran como aplicaciones patentadas. A su vez las investigaciones
realizadas han marcado precedentes importantes para futuros e innovadores usos de estos
residuos.
ESTUDIO DE LAS MEMBRANAS INTERSTICIALES
Caracterización y función
Las membranas de las cáscaras de huevo de gallina tienen un espesor aproximado

de 65 hasta 96 µm. Se encuentran dispuestas en dos capas, una interna de 15 – 26 µm de
espesor, que está en contacto con la albumina y otra externa de 50 – 70 µm de grosor, que
está situada entre la zona mineralizada de la cáscara y la membrana interna. Estas dos
membranas están en intimo contacto en toda su extensión, excepto a nivel de la cámara de
aire, como se observa en la figura 2. El contacto entre las membranas interna y externa, se
describe como un enlace irregular y tenue (Fernández y Arias, 2000).
22
Figura 2. Esquema de la ubicación y estructura de las membranas del huevo de gallina.
Fuente: Revista educativa Partesdel.com.
Las membranas testáceas representan en promedio el 3,00 % del total del peso de la
cáscara, lo que indica que, de cada 100 g de residuos de cáscara de huevo de gallina, 3 g
corresponden a las membranas intersticiales (Barroeta, 2002).
Composición química
La parte orgánica de las membranas de la cáscara, en base seca, está constituida por
3,00 % de lípidos, 2,00 % de polisacáridos y 95,00 % de proteínas, de acuerdo con lo que
establecen estudios realizados en el laboratorio de Biología Celular del Departamento de
Ciencias Biológicas Animales de la Universidad de Chile (Fernández y Arias, 2000).
La fracción proteica de las membranas testáceas contiene colágeno, glicoproteínas y
proteoglicanos. En un corte transversal se observa que cada fibra está compuesta por un
núcleo rico en colágeno, el cual se encuentra rodeado por un manto rico en glicoproteínas y
proteoglicanos. El manto de proteoglicanos y glicoproteínas es importante en la
determinación de las propiedades viscoelásticas de las membranas ya que contienen la
capacidad de adoptar la consistencia de un gel solido con buena resistencia a las fuerzas de
comprensión. Los proteoglicanos presentes en el manto de las fibras de las membranas
testáceas consisten en unidades hechas de 95,00 % de glicosaminoglicanos, o
23
mucopolisacáridos y 5,00 % de proteína. La molécula central organizadora del
proteoglicano es el AH; a partir de esta cadena central se proyectan las largas proteínas del
proteoglicano, las mismas que sirven de punto de anclaje de numerosas cadenas del
polisacárido condroitina (Hernández y Sastre, 1999).
La figura 3 indica la configuración de los componentes de los proteoglicanos.
Figura 3. Estructura general de un proteoglicano

Fuente: Hernández y Sastre, (1999).
Long et al. (2008) realizó una publicación detallada de las proteínas,
glicosaminoglicanos y polisacáridos que se hallan presentes en las membranas de la cáscara
de huevo. Para su cuantificación, los investigadores implementaron ensayos como
colorimetría y cromatografía. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Constituyentes proteicos típicos de las membranas testáceas de la cáscara de
huevo de gallina.
Constituyente Porcentaje (%)

Colágeno 35,0
Glucosamina 10,0
Condroitina 9,0
Ácido Hialurónico 5,0 – 10,0
Fuente: Long et al, (2008).
24
Descripción y usos de los principales constituyentes de la membrana de la cáscara de
huevo de gallina
El Colágeno se clasifica como una holoproteína y pertenece a la clase de las

escleroproteínas. Constituye la proteína más abundante del organismo humano, con una
proporción de casi 25,00 % del contenido proteico total. Se encuentra en estructuras
tisulares como la piel, huesos, cartílagos, ligamentos, tendones, córnea y en el tejido
conectivo (Urbano, 2015).
La Glucosamina es una aminoazúcar o aminosacárido que actúa como parte
constitutiva de las glicoproteínas. Sus principales funciones son de formación y reparación
del cartílago articular. Se halla presente en los cartílagos, tendones y ligamentos, a los
cuales les confiere las propiedades de elasticidad y flexibilidad. Al ser aislado es utilizado
como suplemento para el tratamiento de dolencias articulares (Urbano, 2015).
La Condroitina constituye un mucopolisacárido de alta densidad que, en su forma
de sulfato de condroitina, es parte de los proteoglicanos. Se encuentra en el tejido
cartilaginoso, en la córnea y en la piel. La condroitina es responsable, en gran parte, de dar
al cartílago articular resistencia contra la compresión. Junto con la glucosamina, el sulfato
de condroitina, constituye un componente integral de las medicinas alternativas que se
utilizan para tratar la osteoartritis (Urbano, 2015).
El AH es un glicosaminoglicano estructural, formado por la repetición de unidades
disacáridas de ácido glucurónico y glucosamina. Se encuentra en el cartílago y piel. Es
responsable del aumento de la resistencia a la comprensión en algunos tejidos. Debido a la
alta capacidad de hidratación, se usa a gran escala en las cremas cosméticas. Otros usos son
para el tratamiento de la artritis reumatoide y osteoartritis y para la cicatrización de heridas
(Urbano, 2015).
TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE INVESTIGACIÓN
Espectrometría Infrarroja
La espectrometría del infrarrojo es sumamente útil para determinaciones cualitativas
de compuestos orgánicos y para deducir estructuras moleculares a partir de sus grupos
funcionales tanto de compuestos orgánicos como inorgánicos. En el análisis cualitativo la
25
espectroscopia de infrarrojo puede usarse para la identificación de sustancias puras o para
la absorción, localización e identificación de impurezas. Para localizar una impureza en una
sustancia se hace una comparación en el espectro de las sustancias que se estudia y una
muestra de la sustancia pura. Las impurezas causan bandas de absorción adicionales que
aparecen en el espectro (Skoog et al, 1998).
Teoría de la Espectrometría Infrarroja

Los compuestos orgánicos absorben un haz de radiación electromagnética con
longitudes de onda menores que las de la luz visible, cuando dicho haz posee una energía
igual a la del enlace orgánico en vibración. En la espectrometría infrarroja, la energía (ΔE)
y la frecuencia (𝑣) se relacionan por medio de la constante de Planck, ℎ
(6,6242 𝑥 10−27 𝑒𝑟𝑔 𝑠).
𝛥𝐸 = ℎ𝑣
Con frecuencia, para describir la magnitud de la radiación IR se usa el número de

onda, ῡ en vez de la frecuencia, 𝑣.
𝛥𝐸 = ℎῡ
Los espectros IR contiene los números de onda de 4000 a 600 o 400 𝑐𝑚−1. Los
espectrómetros IR con transformada de Fourier (FTIR) ofrecen numerosas ventajas sobre
los antiguos espectrómetros IR. Dado que l0os datos se obtienen y almacenan en forma
digitalizada en la computadora, es posible manejarlos, transportarlos y presentarlos en una
pantalla con facilidad. Los instrumentos FTIR son muy rápidos, sensibles y precisos
comparados con los espectrómetros más antiguos (Shriner y Hermann, 2013).
La figura 5 muestra un esquema de un espectrómetro FTIR. La energía infrarroja
del láser pasa a través de una abertura que controla la cantidad de energía infrarroja
emitida. El haz infrarrojo se divide en dos haces ópticos mediante el separador de haces del
interferómetro. El separador de haces puede ser un espejo parcialmente recubierto que
puede manipularse para que deje de pasar en forma alterna la radiación, ya sea hacia el
espejo fijo o hacia el movible. Este último se ajusta con cuidado en forma creciente de
manera que la longitud de la trayectoria varíe regularmente. Las señales se recombinan en
26
el separador de haces. La diferencia entre las longitudes de la trayectoria da como resultado
una diferencia entre las dos longitudes de onda de energía. Dichas diferencias producen un
interferograma. Este interferograma posee información acerca de cada señal infrarroja que
proviene de la fuente y, de esta manera, todas las frecuencias se miden de manera
simultánea. Cuando la diferencia entre las dos longitudes de onda es un múltiplo entero par
de la longitud de onda del haz invariante, se produce una interferencia constructiva. Si la
diferencia entre ambas longitudes de onda es un múltiplo entero impar de un cuarto de la
longitud de onda del haz invariante, se genera interferencia destructiva. El interferograma
pasa entonces a través de la muestra y luego al detector. La señal de este no puede
interpretarse directamente, sino que se somete a una transformación de Fourier, un
procedimiento matemático muy complejo. La señal resultante se imprime como un espectro
infrarrojo (Shriner y Hermann, 2013).
Figura 4. Diagrama de un Espectrómetro básico de IR de Transformada de Fourier.

Fuente: Shriner y Hermann, (2013).
Los espectros infrarrojos contienen diferentes tipos de absorción para el mismo

enlace, los cuales se representan en la figura 5.
27
Figura 5. Diversos tipos de modo de vibración.
Fuente: Shriner y Hermann, (2013).
Instrumentación y preparación de muestras
Los espectrofotómetros IR tienen los mismos componentes básicos que el resto de

aparatos utilizados en procesos de absorción, por ejemplo, en el estudio de la zona visible-
ultravioleta del espectro. Básicamente, se necesita un instrumento para medir la transmisión
de radiación electromagnética de una muestra en función de la longitud de onda o del
número de ondas. El elemento más importante debe permitir aislar la radiación de regiones
espectrales definidas y permite diferenciar entre los distintos tipos de espectrofotómetros:
no dispersivos, dispersivos y de transformada de Fourier (FT). En estos últimos se utiliza
un interferómetro que permite una modulación de la radiación dependiente de la longitud
de onda. Otro elemento esencial en los espectrofotómetros es una fuente de radiación que
debe aportar la mayor intensidad posible en la región de longitud de onda que se está
investigando. Las fuentes de radiación térmicas (sólido inerte calentado eléctricamente) son
las más utilizadas, proporcionando una radiación continua, en contraste, el uso de fuentes
láser suministra longitudes de onda muy concretas. El propósito del sistema óptico es
transmitir la radiación desde la fuente al detector con la mínima pérdida. Los sistemas de
lentes de vidrio o cuarzo utilizados en otras regiones no tienen utilidad en el IR porque
28
absorben radiación, de modo que se utilizan espejos de vidrio con un recubrimiento de oro
o aluminio. El sistema óptico va equipado con un compartimento para la muestra, en el que
ésta se sitúa en el camino de la radiación, bien mediante celdas u otros accesorios que
permitan realizar medidas diferentes a la transmisión. (Ej. Attenuated Total Reflectance
ATR) El detector se emplea para convertir la señal óptica en una señal eléctrica fácilmente
medible, como el voltaje. Esto se consigue con la ayuda de equipos electrónicos para
amplificar y digitalizar las señales. Mientras que los primeros espectros se registraban de
forma analógica sobre papel, hoy en día el ordenador es un componente esencial con
múltiples posibilidades para procesar y almacenar los espectros. Los aparatos basados en el
método de transformada de Fourier ofrecen una relación señal/ruido mucho mejor y mayor
rapidez en la obtención de espectros, por lo que se imponen en el mercado (Serrano, 2017).
Electrofotómetros FTIR
Los espectrofotómetros dispersivos son los primeros que se utilizaron, aunque muy
pocos quedan activos en la actualidad para medidas de rutina en el IR-medio. Emplean un
dispositivo para restringir la longitud de onda que se mide de forma sucesiva, frente a la
medida simultánea de todas las longitudes de onda que realizan los aparatos basados en la
transformada de Fourier. En éstos últimos el componente más importante es el
interferómetro que se muestra en la figura 6 (Serrano, 2017).
Figura 6. Esquema de un espectrómetro FT-IR con un interferómetro Michelson clásico.

Fuente: Serrano, (2017).
29
En un interferómetro Michelson el haz de radiación que viene de la fuente se divide
mediante un espejo semipermeable (beamsplitter) en dos haces parciales que se reflejan en
sendos espejos, uno fijo y otro móvil, vuelven al beamsplitter y se recombinan en
interferencia. Un desplazamiento del espejo móvil cambia el camino óptico en ese brazo del
interferómetro, introduciendo una diferencia de fase entre los haces y por tanto un cambio
en la amplitud de la interferencia. La intensidad de señal que llega al detector tras atravesar
la muestra, representada como función de la diferencia en la trayectoria de ambos haces
(retardo) es lo que se llama interferograma. Con una radiación monocromática se obtiene
una señal coseno, que en el caso de caminos ópticos idénticos en ambos brazos proporciona
una interferencia constructiva sin diferencia de fase entre los haces y por tanto una
intensidad máxima. Si la fuente suministra diferentes radiaciones el patrón de interferencia
corresponde a la suma de las señales coseno generadas por las frecuencias individuales. En
la Figura 7 se muestran algunos interferogramas y los espectros (intensidad en función de
frecuencia o número de ondas) a los que dan lugar mediante el tratamiento matemático de
transformada de Fourier, observándose que para bandas espectrales anchas el máximo del
interferograma cae rápidamente (Serrano, 2017).
30
Figura 7. Espectros (izquierda) y sus respectivos interferogramas. Radiación
monocromática(a) y radiación continua de una fuente térmica (d)
Fuente: Serrano, (2017).
Preparación de muestras
Por lo que respecta a las muestras, la Espectroscopia Infrarroja es una técnica

versátil que permite obtener espectros de sólidos, líquidos y gases utilizando en cada caso
las celdas o soportes adecuados. El material en cuestión debe ser transparente a la radiación
incidente y los haluros alcalinos son los que más se emplean en los métodos de transmisión
(NaCl, KBr, KCl etc.). En comparación con otras técnicas instrumentales, las muestras a
analizar requieren poca o ninguna preparación. Basta con moler el sólido en una matriz de
KBr o disolver la muestra en un disolvente apropiado (se prefiere 𝐶𝐶𝑙4o 𝐶𝑆2 ). El agua debe
ser retirada de la muestra siempre que sea posible, ya que tiene una fuerte absorción en la
región infrarroja. El tiempo de análisis para obtener un espectro en una muestra rutinaria es
31
de 1 a 10 minutos, dependiendo de la resolución y el número de barridos requerido
(Serrano, 2017).
𝐼
De acuerdo con la ley de Beer 𝐼 = 𝐼0 𝑒 −𝑎𝑏𝑐 la trasmitancia 𝑇 = 𝐼 es función de la
0
absortividad, el camino óptico y la concentración, de modo que para obtener un espectro de

intensidad moderada de una muestra sólida o líquida no diluida son suficientes caminos de
0.01-0.05 mm. Es necesario variar este parámetro en función de la concentración de la
muestra. Aunque las cantidades en análisis de rutina pueden variar en función de la muestra
disponible, el límite inferior cuando el sólido se analiza en un disolvente adecuado, estaría
en torno a 1-10 μg; 1 mg para pastillas de KBr; para analizar un líquido, basta con 0,5 μl. y
para analizar un gas, es suficiente una concentración de 50 ppb (en este caso con el
comentado aumento del camino óptico).
Preparación de muestras líquidas
Las celdas mencionadas en el apartado anterior se usan para medir disoluciones

diluidas de muestras sólidas y líquidas disueltas en disolventes transparentes al IR.
Desafortunadamente ningún disolvente es transparente a lo largo de todo el IR medio. Los
-1
más utilizados son: el 𝐶𝐶𝑙4 para la región 4000-1330 cm y el 𝐶𝑆2 para la región 1330-625
-1
cm . Ambos disolventes son bastante tóxicos y deben ser manipulados con precaución. Se
puede reemplazar el 𝐶𝐶𝑙4 con el 𝐶𝐶𝑙2- 𝐶𝐶𝑙2 o con el 𝐶𝐻2 𝐶𝑙2 , menos tóxicos, y sustituir el
𝐶𝑆2 con n-hexano o n-heptano. Los disolventes polares, como el agua o los alcoholes son
raramente usados, ya que absorben fuertemente en el IR medio y reaccionan con los haluros
de los metales alcalinos, como el NaCl, comúnmente usados como ventanas transparentes
al IR (Serrano, 2017).
Preparación de muestras sólidas
La mayoría de los compuestos orgánicos presentan numerosos picos de absorción en

el infrarrojo medio, y encontrar un disolvente que no dé lugar a solapamiento de picos es
con frecuencia imposible. Como consecuencia, a menudo se obtienen los espectros de
32
dispersiones del sólido en una matriz líquida o sólida. Generalmente, en estas técnicas la
muestra sólida se debe pulverizar hasta que el tamaño de sus partículas sea menor que la
longitud de onda de la radiación (<2 μm) para evitar los efectos de la dispersión de la
misma (Serrano, 2017).
Pastillas
Una de las técnicas más populares es la formación de pastillas de KBr (también se

han usado otros haluros de metales alcalinos). Las sales de haluros tienen la propiedad de
flujo en frío (cold flow), por lo que, cuando se somete a la presión adecuada este material
finamente pulverizado, sinteriza y forma una tableta transparente que se asemeja a un
cristal. Al usar esta técnica, se mezcla a fondo un miligramo o menos de la muestra
finamente pulverizada, con aproximadamente 100-300 mg de polvo de KBr. La mezcla se
puede realizar con un mortero y su mano o en un pequeño molino de bolas. Posteriormente
2
se presiona la mezcla en un troquel especial entre 700 y 1000 kg/cm hasta obtener un disco
transparente. Se obtienen mejores resultados si el disco se prepara a vacío para eliminar el
aire ocluido. A continuación, el disco se coloca en la trayectoria del haz del instrumento
para su examen espectroscópico. Los espectros obtenidos presentan a menudo bandas a
-1
3450 y 1640 cm debidas a la humedad absorbida (Serrano, 2017).
En la investigación de Serrano, (2017), añade que, Para muchos compuestos las

pastillas de KBr producen espectros excelentes para medidas cualitativas que aparecen en
las colecciones de espectros (No es una técnica muy utilizada en el análisis cuantitativo). Al
ser un compuesto iónico, el KBr transmite a lo largo de la mayor parte de la región del
-1
infrarrojo hasta una frecuencia de aproximadamente 400 cm . El ioduro de cesio absorbe
-1
por debajo de 200 cm y se utiliza para mayor transparencia a bajas frecuencias.
Después del prensado es importante realizar una limpieza cuidadosa de todos los
accesorios, puesto que los residuos de KBr pulverizado son higroscópicos y muy corrosivos
una vez húmedos. En relación con esto conviene resaltar la elevada polaridad de los haluros
alcalinos que pueden incluso interactuar física o químicamente con la muestra, de tal modo
33
que el espectro registrado por este método puede diferir si lo medimos empelando alguno
de los métodos que se comentan a continuación. Algunos cambios son la hidratación de la
muestra, saponificación de esteres, sustitución de grupos funcionales por haluro o
descomposición del producto. Si se observan anomalías en la identificación de la muestra
es recomendable probar otra técnica de preparación (Serrano, 2017).
Suspensiones
Cuando los sólidos no son solubles en un disolvente transparente en la región del

infrarrojo ni es conveniente prepararlos en forma de pastillas de KBr, sus espectros de
infrarrojo se suelen obtener por dispersión del analito en una suspensión de un aceite
mineral o un hidrocarburo fluorado. Las suspensiones se preparan moliendo de 2 a 5 mg de
la muestra finamente pulverizada (tamaño de partícula <2 μm) en presencia de una o dos
gotas de un aceite hidrocarbonado pesado.
Láminas delgadas de polímeros
Se pueden obtener, con ayuda de un par de placas calientes y una prensa, láminas
delgadas de polímeros con un espesor altamente reproducible, desde 15 hasta 500 μm.
Respecto a la cantidad de muestra necesaria, para hacer un disco de 20 mm de diámetro
basta con 10 mg de polímero si se quiere hacer una lámina de 15 μm de espesor. Esta
lámina se analizará por transmisión.
Preparación de muestras gaseosas

En el caso de los gases se requiere un método de trabajo diferente a los
mencionados. Es también posible realizar estudios cuantitativos y, con la suficiente
resolución, el espectro permite obtener conclusiones adicionales sobre el diseño molecular
basadas en la estructura fina rotacional (Serrano, 2017).
Las muestras gaseosas suelen distribuirse y almacenarse en cilindros metálicos o de

vidrio, desde lo que hay que transferirlas a la celda, normalmente utilizando un aparato de
vacío que tras la evacuación del sistema permite una medida exacta de la presión parcial.
34
Después de forma similar se añade nitrógeno para conseguir la presión total deseada, puesto
que hay una importante dependencia de la absortividad con esta magnitud que hay que
considerar en los ensayos cuantitativos. Así, es muy importante utilizar la misma presión
total en las medidas de la muestra y en la correspondiente calibración (Serrano, 2017).
Otros métodos y accesorios
También se puede observar el comportamiento de los sólidos en el infrarrojo por

técnicas de reflectancia. Estos espectros son, con frecuencia, similares a los espectros de
absorción y proporcionan la misma clase de información.
Reflectancia Total Atenuada (ATR)
Esta gama de dispositivos es especialmente útil para obtener espectros infrarrojos de

muestras que no pueden ser colocadas en los soportes habituales para el método de
transmisión. Así, son apropiadas para estudiar sólidos gruesos insolubles o muy
absorbentes, muestras líquidas, incluyendo láminas, recubrimientos, polvos, hilos,
adhesivos, polímeros y muestras acuosas. La ATR requiere poca o ninguna preparación
para la mayoría de las muestras y es una de las técnicas de muestreo más versátiles
(Serrano, 2017).
En (2017), Serrano señala que, La ATR ocurre cuando un haz de radiación entra
desde un medio más denso (con un mayor índice de refracción) en un medio menos denso
(con un menor índice de refracción). La fracción del haz incidente reflejado se incrementa
cuando aumenta el ángulo de incidencia. Toda la radiación incidente se refleja en la interfaz
cuando el ángulo de incidencia es mayor que el ángulo crítico (que es función del índice de
refracción). El haz penetra una distancia muy pequeña más allá de la interfaz hacia el medio
menos denso antes de que suceda la reflexión completa. Esta penetración se llama «onda
evanescente» y se produce a una profundidad de unas pocas micras. Su intensidad se ve
atenuada por la muestra en las regiones del espectro infrarrojo donde la muestra absorbe
En la práctica, la muestra se coloca en contacto íntimo con un cristal denso y
altamente refractivo, de ZnSe, bromuro de talio – ioduro de talio (KRS-5) o de Ge. El haz
infrarrojo se dirige hacia un extremo biselado del cristal y se refleja internamente a lo largo
35
del cristal con una o más reflexiones. Tanto el número de reflexiones como la profundidad
de la penetración decrecen con el incremento del ángulo de incidencia. Para un ángulo
dado, las mayores relaciones longitud/espesor dan un mayor número de reflexiones. Existe
una variedad de tipos de accesorios de ATR, como los verticales de ángulo variable, de 25 º
a 75º, los cristales horizontales o las cubetas cilíndricas de reflectancia interna para
evaluación de líquidos.
El espectro resultante FTIR - ATR se asemeja al espectro infrarrojo convencional,

pero con algunas diferencias: las posiciones de las bandas de absorción son idénticas en
ambos espectros, pero las intensidades relativas de las bandas correspondientes son
diferentes. Aunque los espectros ATR se pueden obtener usando instrumentos dispersivos o
por transformada de Fourier, estos últimos permiten obtener espectros de mayor calidad en
situaciones en las que la intensidad de la señal se halla limitada (Serrano, 2017).
Análisis Termogravimétrico
La Termogravimetría (TGA) mide la variación en peso. Es una técnica en la cual el

peso de una muestra se mide continuamente en función de la temperatura, mientras la
muestra está sometida a un programa controlado de calentamiento o enfriamiento. Incluye
programas de calentamiento dinámico o de temperatura fija (proceso isotérmico).
Suministra más información que la pérdida por secado a una temperatura determinada, ya
que detecta las temperaturas a las que se desprenden las sustancias volátiles retenida,
además de cuantificar los respectivos desprendimientos (Rivas, 2007).
Muchas sustancias tienen la capacidad de formar hidratos y/o solvatos. En los

primeros, el agua está presente no solo en su superficie como humedad, sino también en el
cristal. Esta propiedad, conocida como psedopolimorfismo, puede conducir a complejos
procesos de fusión.
Generalmente, la perdida de solvente adsorbido en la superficie puede distinguirse

de la perdida de solvente ocluido en el cristal y de las pérdidas de masa producidas por
descomposición de la sustancia.
36
Las mediciones se llevan a cabo bajo reflujo programado de un gas apropiado. El
contenido porcentual de pérdida, G, se calcula por la formula siguiente:
𝛥𝑚
𝐺(% 𝑑𝑒 𝑝é𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎) = 100
𝑚𝑜
En la cual:
𝛥𝑚 es la pérdida de masa.
𝑚𝑜 es el peso inicial de la muestra
Dado que el Análisis Termogravimétrico no identifica específicamente los

productos de reacción, pueden analizarse los gases desprendidos con metodologías
apropiadas, empleándose para la caracterización de sustancias la combinación de DSC y
TGA (Rivas, 2007).
En la investigación de Rivas, (2007), se muestra que en la curva TGA se representa

el peso en el eje de ordenadas y la temperatura (o a veces el tiempo) en el de abscisas. La
variación de peso se puede representar bien en miligramos o en porcentaje de muestra
original. La mayor parte de las curvas TGA presentan perdidas de peso, cuyo origen está
en reacciones químicas (descomposición, combustión, reducción a óxidos metálicos, etc.) y
transformaciones físicas (evaporación, vaporización, sublimación, etc.). Además de la
curva TGA, hay que recurrir a otras curvas con fines interpretativos, como lo son: la
primera y segunda derivada.
Otra forma de representar los datos en Termogravimetría es por medio de la llamada

Termogravimetría Derivada (DTG) a través de la primera derivada de la curva de peso, en
función de la temperatura o del tiempo. La curva DTG representa por tanto, la variación de
peso frente a la temperatura. La curva DTG representa el desarrollo del mismo experimento
que la curva TGA (variación del peso frente a la temperatura o el tiempo), pero de forma
diferente. Una curva TGA de un compuesto puro puede ser considerada como característica
de tal compuesto, debido a la secuencia de procesos fisicoquímicos que experimenta en
unas determinadas condiciones en un intervalo de temperatura, figura 8.
37
Figura 8. Ejemplo de la curva de tipo TGA y DTG
Fuente: Rivas, (2007).
Instrumentación
La instrumentación utilizada se determina termobalanza. Básicamente consiste en la

balanza de precisión, un horno controlado por un programador de temperatura y un registro.
Balanza
Las condiciones requeridas para la balanza son exactitud, sensibilidad y
reproducibilidad, siendo también necesarias una capacidad razonable, elevada estabilidad y
rapidez de respuesta. Los dos sistemas de balanza más comunes son las de punto nulo y las
de desviación. A medida que el peso varía y el brazo de la balanza comienza a desviarse de
su posición normal, un sensor detecta la desviación y provoca la fuerza que devuelve al
brazo de la balanza a su posición de cero o punto nulo. La fuerza aplicada es directamente
proporcional al cambio de peso. Se suele utilizar una microbalanza electrónica, de
capacidad máxima 1.0 g incluido el peso del portamuestra, que permite acomodar hasta 500
mg de muestra aproximadamente (Rivas, 2007).
38
Horno
El horno se puede considerar como el corazón de la termobalanza; tiene que
acomodar el portamuestra y asegurar velocidades de calentamiento lineal en un amplio
intervalo de temperatura, así como trabajar en régimen isotérmico. Estos requisitos se
pueden conseguir utilizando un horno con un rebobinado no inductivo, provisto de algún
sistema de refrigeración. El horno conecta directamente al programador. Es muy importante
que el horno posea una zona caliente uniforme, lo cual es fácil de conseguir en un horno de
masa apreciable. Sin embargo, estos se enfrían muy lentamente y también necesitan mucho
más tiempo para alcanzar una determinada temperatura. Por estas razones, el diseño de los
hornos comerciales varía considerablemente de unos fabricantes a otros. Además, si ha de
ir provisto de sistemas de circulación de gases para trabajar en atmosfera controlada, se
dificulta aún más el diseño del horno (Rivas, 2007).
Para la medida de la temperatura a la que se somete la muestra en el interior del

horno, se utilizan diferentes dispositivos, siendo lo más frecuente el uso de termopares.
Para temperaturas de hasta 1000 °C se utilizan termopares de chromel-alumel, y de Pt/Pt-
Rh para temperaturas de hasta 1500 °C. Obviamente, los termopares deben ser
químicamente inertes a temperaturas elevadas y su situación con respecto a la muestra es
crítica (Rivas, 2007).
Programador
El programador está conectado directamente al horno y lo controla a lo largo de
todo el proceso. Debe existir un sensor de temperatura en contacto directo con el horno, que
envíe información al programador para controlar la potencia eléctrica que se envía al horno.
El desarrollo de dispositivos de estado sólido permite disponer actualmente de
programadores que pueden ejecutar complicados programas de calentamiento, isotérmico y
enfriamiento. El objetivo es poder disponer de un registro continuo del peso de la muestra
en función de la temperatura, generalmente a través de un sistema informatizado de
adquisición de datos, así como para el procesado de los mismos (Rivas, 2007).
Los polímeros exhiben generalmente la pérdida de masa, a pesar de la ganancia de

masa se puede observar antes de la degradación a velocidades de calentamiento lentos en
39
una atmósfera oxidante (ver Figura 10). Pérdida de masa puede ser categorizado como
componentes volátiles, tales como la humedad absorbida, disolventes residuales, productos
de reacción, tales como agua y formaldehído a partir de la cura de fenólicos y amino
resinas, que generalmente se forman entre 100 ° C y 250 ° C; y la generación de productos
de degradación volátiles que resultan de la escisión de cadena que generalmente requieren
temperaturas superiores a 200 ° C pero no más de 800 ° C. Todos estos procesos de pérdida
de masa se puede caracterizar mediante TGA para producir información tales como la
composición, grado de curado, y estabilidad térmica (Menczel y Prime, 2009).
Figura 9. Efecto de la velocidad de calentamiento en la forma de las curvas TGA del

benzociclobuteno curado en oxígeno.8
Fuente: Menczel y Prime, (2009).
40
CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
En este capítulo se presenta la metodología, métodos, técnicas e instrumentos que se

emplearon para cumplir los objetivos planteados en el presente Trabajo Especial de Grado.
NATURALEZA DE LA INVESTIGACIÓN
El presente trabajo según lo establecido por la Universidad Pedagógica

Experimental Libertador (UPEL, 2003) fue una investigación de campo, debido a que se
realizó un estudio a la membrana de la cáscara del huevo de gallina para evaluar la
obtención del ácido hialurónico, biopolímero de gran importancia comercial. De acuerdo
con el tipo de conocimiento fue una investigación descriptiva ya que consistió en la
caracterización del producto final obtenido, analizando el comportamiento de las variables
involucradas en el proceso, con base en los resultados obtenidos se ofrecieron
recomendaciones. La investigación de igual manera abordo el diseño experimental ya que
se realizaron análisis experimental mediante la aplicación de técnicas y métodos conocidos,
como fue el caso de la técnica de FTIR y TGA.
La investigación se llevó a cabo en 4 etapas:
 Etapa I: Consistió en separar físicamente la membrana de la cáscara por diferencias

de densidades.
41
 Etapa II: En esta etapa se realizó la extracción del AH a partir de la membrana
pulverizada seca.
 Etapa III: Consistió en purificar el producto obtenido.
 Etapa IV: En esta última etapa se caracterizó parcialmente el producto final
obtenido.
VARIABLES DE ESTUDIO
En el proyecto de investigación relacionado con los estudios de campo de carácter

descriptivos, se hace necesario presentar el sistema de variables como un importante
aspecto del marco teórico. (Mendenhall 2008), Definen variable como una característica
que cambia o se modifica con el tiempo o para diferentes individuos u objetos en
consideración.
Las variables que se estudiaron en el presente trabajo investigativo sobre la

obtención de AH a partir de la membrana de la cáscara del huevo de gallina, se muestran a
continuación en la siguiente tabla.
Tabla 3. Resumen de variables involucradas en el proceso de investigación.
Variable Definición Unidad

Independientes
Medida de acidez de una disolución. El pH
pH indica la concentración de iones hidrógenos [H+] adimensional
presentes en determinadas disoluciones.
Magnitud escalar relacionada con la energía
Temperatura °C
interna de un sistema termodinámico.
Magnitud física que indica el tiempo de
Tiempo de
extracción del ácido hialurónico de la membrana h
Extracción
de la cáscara del huevo de gallina.
Dependientes
Rendimiento Indica la cantidad de ácido hialurónico extraído
%
de extracción con respecto a la cantidad de membrana usada.
Fuente: Propia.
42
SUJETO DE ESTUDIO
En esta investigación el conjunto que representa el sujeto de estudio para evaluar la

obtención de AH fueron los desechos de cáscaras de huevo de gallina suministrados por la
empresa Agroindustrias D’EFRAIN C.A. del estado Lara. De dichas cáscaras se separó la
membrana en la cual se obtuvo el AH. La membrana fue tratada mediante disoluciones
químicas de acuerdo a cada una de las etapas llevadas a cabo, para lograr la obtención del
AH.
RECURSOS Y MATERIALES
Los recursos económicos y materiales necesarios para la investigación, fueron

solicitados a la empresa Agroindustria D’EFRAIN C.A. Barquisimeto - Estado Lara, y al
Instituto Venezolano de Investigación Científica (IVIC), Centro de Química, Laboratorio
de Polímeros, Los Teques - Estado Miranda.
A continuación, se detalla en la Tabla 4 los materiales, reactivos y equipos que se

usaron para llevar a cabo los procedimientos experimentales planteados en este capítulo.
Tabla 4. Materiales, reactivos y equipos utilizados durante todo el proceso de obtención del
AH.
Materiales Reactivos Equipos

Cáscaras de huevo de Ácido acético, marca MERCK al
Balanza analítica, marca
gallina. 100%
Espátula de acero Termómetro digital, marca
Alcohol isopropílico al 96-99 %.
inoxidable. TRACEABLE.
Plancha de agitación y
Agitador de vidrio. Alcohol etílico al 96-99 %.
calentamiento, marca ARE.
Acetato de sodio trihidratado, marca pH-metro, marca
Agitador magnético.
SPECTRUM Chemical al 99 %. SPERSCIENTIFIC.
Carbón activado, marca SIGMA- Agitador mecánico, marca
Cápsulas de Petri.
ALDRICH. COLE-PARMER.
Circulador de fluidos de
Gel de silice en polvo, marca
Vidrio de reloj. temperatura constante, marca
MERCK.
COLE-PARMER.
43
Homogenizador, marca
Mortero de porcelana. Cloruro de sodio al 97 %.
HEIDOLPH.
Continuación de tabla 4
Campana de extracción, marca
Piceta. Agua destilada.
MOBILABCA.
Envases de plástico para
Horno con sistema al vacío,
almacenar.
marca NATIONAL.
Envases de vidrio para
Rotavapor, marca HEIDOLPH.
almacenar.
Balones aforados de 25, Batidor industrial, marca
100, 250 y 1000 mL. G.PANIZ
Balones de fondo redondo
Tamices series Tyler.
de 250 y 500 mL.
Beaker de 100, 300, 600, Centrifuga, marca
900, 1400 y 3000 mL. EPPENDORF.
Cilindros graduados de 10,
Liofilizador, marca VirTis.
250 y 500 mL.
Espectrómetro FTIR, marca
Kitasato de 1000 mL.
Thermo SCIENTIFIC
TGA, marca METTLER
Embudo de vidrio para
TOLEDO, modelo
filtrado.
TGA/SDTA851e.
Embudo Buchner. Viscosímetro de Ubbelohde,

marca SCHOTT MAINZ.
Papel de filtro.
Tubos de centrífuga de 50
mL.
Reactor con camisa de
vidrio de 100 y 500 mL.
Pinzas de metal.
Jeringa de vidrio.
Colador de aluminio.
Tobos de plástico de 16 L.
Bandejas de aluminio.
Fuente: Propia.
44
INGENIERÍA DE PROCESOS: EQUIPOS UTILIZADOS
Definición de trituración
Es una operación unitaria que permite el proceso de reducción de tamaño de una

sustancia o materiales desempeñando un papel importante en el tratamiento y elaboración
de materias primas de múltiples tipos (Cedeño y Gómez, 2017).
Los equipos para la reducción de tamaño se pueden clasificar de acuerdo con la

forma en que se aplican las fuerzas, de la siguiente manera: entre dos superficies, como en
la trituradora y el corte; en una superficie sólida, como en el impacto; y por la acción del
medio circundante como en los molinos coloidales. Una clasificación más practica consiste
en dividir los equipos en trituradores, molinos, molinos finos y cortadores (Geankoplis,
1998).
Fraccionamiento de la muestra
La materia prima limpia a procesar fue triturada inicialmente de forma manual

logrando que su tamaño disminuya considerablemente. Seguidamente fueron introducidas a
un batidor industrial durante 20 minutos, obteniendo partículas de cáscaras de huevo más
pequeñas y uniformes, permitiendo así una mejor separación de la membrana de la cáscara.
Definición de molienda
Es una operación unitaria referida a la desintegración de un material solido con

respecto al volumen promedio de una partícula, en consecuencia, la reducción de tamaño a
pesar de implicar solo una transferencia física sin afectar su naturaleza (Cedeño y Gómez,
2017).
Definición del molino de bolas
Los molinos de bolas consisten en cámaras giratorias de cerámica o acero, de forma

cilíndrica llenas hasta la mitad con bolas de cerámica o acero. La reducción de tamaños se
produce gracias a los choques que ocasionan estas bolas al caer, desde la altura a que son
elevadas, por la rotación de la cámara (Brown, 1965).
45
Funcionamiento del molino de bolas
La materia prima que fue colocada dentro del molino de bolas fue golpeado por un
conjunto de bolas cilíndricas de cerámica de alúmina de igual tamaño, girando a una
velocidad media simulando la rotación de un tambor, se produjo la pulverización de las
membranas gracias a la fricción que se ejerció entre las bolas a medida que giraban dentro
del molino. Este proceso se llevó a cabo durante un tiempo aproximado de 12 horas.
Definición del tamiz
Un tamiz es una malla metálica constituida por barras tejidas y que dejan un espacio
entre sí por donde se hace pasar el sólido previamente triturado. Las aberturas que deja el
tejido y, que en conjunto constituyen la superficie de tamizado, pueden ser de forma
distinta, según la clase de tejido (Vian y Ocón, 1952).
La separación de materiales sólidos de acuerdo a su tamaño es importante para el

análisis granulométrico de los productos de molinos para observar la eficiencia de éstos y
para su control. Es por esto que realiza el tamizado.
 Esta operación unitaria separa por granulometría la muestra dándole homogeneidad

y medida por el tamaño malla usado.
 Se realiza en ausencia de presión.
 Acompaña a la molienda cuando se quiere separar a los sólidos de distintos
tamaños.
 Se utilizan mallas de marca Tyler de tamaño universal, mientras mayor sea el
número Tyler, menor será la abertura y por ende menor será el tamaño de las
partículas que pasan por la malla.
Funcionamiento del tamizador
Se colocaron de forma correcta los tamices desde la granulometría más grande a la

más pequeña (forma descendente), se agregaron las cáscaras de huevo secas sobre el tamiz
más grande y se llevaron los tamices al equipo vibratorio durante 5 min, seguidamente
fueron retirados los tamices con las distintas muestras de tamaño granulométrico y
finalmente se procedió a pesar cada muestra.
46
PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN
ETAPA I: SEPARACIÓN FÍSICA DE LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA
Selección de la fuente de extracción

Se realizó la recolección de aproximadamente ___ cáscaras de huevo de gallina que
fueron desechadas durante el proceso de quebrado (ruptura del huevo donde se separa la
yema de la clara) que se llevó a cabo en el área de quebrado de la empresa dedicada a la
producción de ovoproductos, Agroindustrias D’EFRAIN.
Tratamiento de la fuente de extracción

Las cáscaras de huevo luego del proceso de quebrado, contienen restos de clara,
yema e impurezas que quedan adheridos a la pared interna del huevo, por lo tanto, se
requirió realizar varios lavados con suficiente agua hasta obtener la materia prima limpia,
seguidamente se dejaron en remojo las cáscaras de huevo en una solución salina 0,2 mol/L
durante 0,5 h para solubilizar la membrana y permitir mejor su separación.
Separación física de la membrana de la cáscara por diferencia de densidades
Luego del tratamiento previo de las cáscaras, se procedió a realizar la separación

física de la membrana de la cáscara, para ello se empleó un método físico basado en la
patente desarrollada por MacNeil (2001) pero de forma manual y adaptándolo a los
materiales y equipos con los que contaba la empresa Agroindustrias D’EFRAIN. A
continuación, se muestra un diagrama del procedimiento llevado a cabo para la separación.
47
Figura 10. Diagrama del proceso de limpieza y separación física de las membranas y
cáscaras a partir de residuos de cáscara de huevo de gallina.
Fuente: Propia.
El método de separación planteado se observa en el diagrama de flujo de la figura

10, se inició con un tratamiento previo de las cáscaras que implica el lavado de las mismas,
seguidamente se realizó el procesamiento de los residuos de cáscaras de huevo, a fin de
producir partículas pequeñas, durante el tratamiento de las cáscaras en remojo con la
solución salina, estas fueron trituradas de forma manual ejerciendo sobre ella fricción
logrando que los residuos de las cáscara de huevo sean parcialmente desgastados, por lo
tanto, la estructura de unión entre las membranas y las cáscaras se rompe, pero no
completamente. A continuación, las partículas de residuos de cáscaras de huevo fueron
trasladadas a un batidor industrial con una carga aproximada de 2 Kg por litro de solución
de NaCl. Las cáscaras alimentadas experimentaron fuerzas turbulentas en el líquido, debido
a la agitación generada por una paleta mecánica acoplada al batidor industrial a una
velocidad media durante un tiempo de trituración de 20 min, lo que causó que las porciones
48
de membrana y cáscaras se separaran casi en su totalidad. Dado que las partículas de
membranas son muy livianas, tienden a permanecer atrapadas en la parte superior del
líquido, para retirar las membranas suspendidas en el agua, se usó un colador de malla
metálica. Estas membranas fueron lavadas con suficiente agua destilada y depositadas en
un recipiente adecuado donde fueron secadas a temperatura ambiente, para eliminar la
mayor humedad se sometió a un proceso de secado al vacío a temperatura ambiente por 24
horas, una vez ya secas fueron pulverizadas usando un molino de bolas ubicado en el
Laboratorio de Polímeros en el Centro de Química del Instituto Venezolano de
Investigaciones Científicas (IVIC). Finalmente, las membranas pulverizadas fueron
almacenadas en un recipiente de vidrio.
Por otro lado, las partículas de cáscaras de huevo limpias se depositaron en el fondo
del mezclador donde fueron recogidas, secadas a temperatura ambiente y almacenadas para
luego realizar su cuantificación.

MEMBRANA PULVERIZADA SECA
Se llevaron a cabo dos tipos de tratamientos diferentes, con el fin de trabajar con
dos métodos distintos y comparar el rendimiento del ácido hialurónico obtenido.
Extracción del ácido hialurónico usando como solvente alcohol isopropilico
Descripción del método de extracción
Una vez obtenida la materia prima ya pulverizada, se procedió a la extracción del

ácido hialurónico en el Laboratorio de Polímeros del Centro de Química del Instituto
Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Los Teques – Edo Miranda. Trabajando
en base a la metodología descrita por Khanmohammadi, (2014) dado que las características
y condiciones de esta investigación pueden ajustarse a su modelo. Se realizaron varios
ensayos, controlando el pH desde (3,5 – 3,9), manteniendo constante la temperatura de 9 °C
y variando el tiempo de extracción de (1, 2 y 3) días, esta última fue la variable modificada,
49
dado que el trabajo desarrollado por Khanmohammadi, utilizan como fuente de extracción
las cáscaras de huevo molidas junto con las membranas lo que añade una gran cantidad de
carbonato de calcio y otros compuestos a la matriz del proceso generando interferencias en
la extracción del ácido hialurónico. Y en la presente investigación se tiene como fuente de
extracción las membranas secas pulverizadas eliminando las interferencias que pueda
causar el carbonato de calcio por lo que se requirió menos tiempo para la extracción. A
continuación se explica el procedimiento llevado a cabo para la extracción del AH usando
como solvente alcohol isopropílico.
Procedimiento experimental
1. Se preparó en la campana extractora una solución de ácido acético de
concentración 0,006 mol/L y una de concentración 4 mol/L.
2. Se instaló el sistema de extracción como se muestra en la figura 12, se dio inicio
al sistema y se esperó a que se estabilizara la temperatura de 9 ºC en el circulador
de fluidos.
3. Se pesaron 3 g de muestra en la balanza analítica.
4. La muestra se agregó al reactor tipo batch el cual se encuentra acoplado al
sistema de enfriamiento instalado, manteniendo contante la temperatura.
5. Se midieron 110 mL de solución de ácido acético de concentración 0,006 mol/L
y se agregaron al reactor para llevar a cabo la reacción.
6. Se midió el pH al inicio de la reacción con el pHmetro y se desarrolló una curva
de pH en función del tiempo (s) usando para su control y registró el programa
RS232 Software Ver 2.1.
7. Para neutralizar la reacción, se agregaron 22 mL de solución de ácido acético de
concentración 4 mol/L.
8. Se realizó la extracción del ácido hialurónico durante 3, 2 y 1 día.
9. Al completar el tiempo de extracción, se agregó alcohol isopropílico en
proporción 1:1 respecto al volumen de muestra obtenida.
10. Se agito durante 0,5 h hasta obtener una mezcla homogénea y se mantuvo en
reposo durante 24 h.
50
11. Se centrifugo en frio a 4 ºC, a una velocidad de 4000 rpm durante un tiempo de
operación de 40 minutos.
12. Se preparó 200 mL de una solución de acetato de sodio al 3%, 2% y 1%.
13. El precipitado obtenido, se lavó con una solución de acetato de sodio
correspondiente a 3%, 2% o 1%.
14. Se homogenizo la solución a temperatura ambiente, manteniendo una velocidad
de agitación de 7 rpm durante un tiempo de 10 minutos.
15. Se agregó en agitación durante 2 h sílica gel y carbón activado a la solución
luego de la homogenización, ambos al 2% en peso respecto al volumen de
solución a tratar.
16. Al pasar las 48 h, se filtró la solución al vacío.
17. La solución liquida se liofilizo durante 48 h.
18. El sólido blanco obtenido luego de la liofilización fue pesado.
19. Finalmente el sólido purificado es analizado mediante FTIR – ATR y TGA.
En la figura 11, se muestra el montaje del sistema utilizado para la extracción de

AH usando como solvente alcohol isopropílico (este mismo sistema es también empleado
para la extracción del ácido hialurónico usando como solvente alcohol etílico).
Figura 11. Montaje del sistema utilizado para la extracción del ácido hialurónico.
Fuente: Casadiego y García, 2018.
51
Descripción del funcionamiento del sistema
El sistema que se utilizó está comprendido por: un circulador de fluidos que permite
el mantenimiento de temperaturas constante, un reactor tipo batch con agitador mecánico,
este sistema contiene aberturas que permitió la medición periódica del pH.
 El circulador de fluidos permitió mantener una temperatura constante durante

todo el proceso de extracción de 9 °C.
 Dentro del reactor tipo batch se llevó a cabo la reacción de extracción.
 Se controló el pH utilizando un pHmetro.
 El agitador mecánico mantuvo en agitación constante la reacción durante el
proceso de extracción.
Extracción del ácido hialurónico usando como solvente alcohol etílico
Para la extracción del AH usando como solvente alcohol etílico, se realizó el mismo
procedimiento experimental desarrollado anteriormente, diferenciándose en que para este
caso se usa alcohol etílico en vez de alcohol isopropílico y soluciones al (3, 2 y 1) % de
cloruro de sodio con una pureza del 96% en vez de acetato de sodio. A excepción de una
muestra donde se usó acetato de sodio al 3%.
ETAPA III: PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO OBTENIDO
Para purificar el AH obtenido, se llevó a cabo el siguiente procedimiento el cual se

describe a continuación:
Procedimiento: sílica gel y carbón activado
 Se agregó sílica gel y carbón activado a la solución luego del proceso de

homogenización, ambos al 2% respecto al volumen de solución.
 Se dejó en reposo la sílica gel y carbón activado durante 48 h (manteniendo una
agitación constante las primeras 2 h) para lograr la separación de impurezas
presentes en la solución.
52
 La solución de sal del ácido hialurónico fue separada de la sílica gel y carbón
activado por medio de una filtración al vacío a través una membrana con una
capacidad de retención media de 4 – 12 µm.
 Finalmente se liofilizó la solución para obtener el producto en su forma sólida y
libre de impurezas.
ETAPA IV: CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO FINAL
Durante esta etapa de la investigación, se realizaron análisis de identificación,

evaluación y caracterización del AH obtenido luego del proceso de liofilización, las
técnicas aplicadas se desarrollaron en el Centro de Química del Instituto Venezolano de
Investigaciones Científicas (IVIC).
Espectrometría Infrarroja por la Transformada de Fourier
El equipo utilizado para esta técnica fue un espectrómetro FTIR marca THERMO
SCIENTIFIC, modelo Nicolet iS10. Las muestras fueron analizadas empleando el accesorio
de Reflectancia Total Atenuada, en sus siglas en inglés (ATR) debido a la versatilidad del
equipo. Para el estudio de esta técnica se colocaron las muestras obtenidas así como la del
AH estándar de referencia, en contacto íntimo con un cristal denso y altamente refractivo
de ZnSe, el accesorio usado para la técnica de ATR fue el smart iTR. El espectro se
realizó mediante un barrido desde 4000 a 400 𝑐𝑚−1 con una apertura=80, velocidad
óptica=0.4747 y con una ganancia = 8 y resolución= 4. En la figura 12 se puede observar
el equipo utilizado para los análisis realizados de FTIR – ATR.
53
Figura 12. Espectrómetro FTIR con accesorio RTA.
Fuente: Propia.
Análisis Termogravimétrico
Las muestras obtenidas, así como la del AH estándar de referencia y acetato de

sodio, se sometieron a un tratamiento térmico en atmosfera inerte de gas nitrógeno (𝑁2 ) a
un flujo de 20 mL/min, haciendo uso del TGA marca METTLER TOLEDO, modelo
TGA/SDTA851e. Este tratamiento inicio con la toma de una pequeña cantidad de muestra,
aproximadamente 10 mg, para luego ser llevadas de 25 °C a 600 ºC a una velocidad de 20
ºC/minuto. Para este tratamiento se usaron crisoles de alúmina de 70 µL. En la figura 13 se
observa el equipo empleado para los tratamientos térmicos realizados a las muestras en
estudio.
54
Figura 13. Equipo para análisis termogravimétrico.
Fuente: Propia.
55
CAPÍTULO IV
PRESENTACIÓN Y DISCUSION DE RESULTADOS
Este trabajo consta de cuatro etapas, en la primera se realizó la separación de la

membrana de la cascara, dicho trabajo fue desarrollado en las instalaciones de
Agroindustrias D’EFRAIN, posteriormente las últimas tres etapas fueron ejecutadas en el
Laboratorio de Polímeros del Centro de Química del Instituto Venezolano de
Investigaciones Científicas (IVIC). En este capítulo se presentan los resultados de los
experimentos realizados para la investigación.
ETAPA I: SEPARACIÓN FÍSICA DE LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA
Utilizando el método propuestos por MacNeil (2001) basado en la diferencia de

densidades entre la cáscara y la membrana se realizó de manera manual el procedimiento en
el cual está basado el equipo diseñado por dicho autor.
Se procesó un total de 30.7 kg de cáscaras contaminadas con albúmina, vitelo,

suciedad y agua. Una vez secas se obtuvieron los resultados que se muestra en la Tabla 5.
56
Tabla 5. Pesos de las cáscaras y membranas empleadas en el proceso
1ª separación 2ª separación 3ª separación Total

Peso húmedo de las
cáscaras con membranas 8,80 10,0 11,9 30.7
(Kg)
Peso seco de las cáscaras 5.92 7.45 7.75 21.12
(Kg)
Peso seco de las 0.0850 0.116 0.122 0.323
membranas (Kg)
Tomando como referencia que las membranas intersticiales representan el 3% del

peso total de los residuos de cáscara de huevo de gallina, de acuerdo con Barroeta (2002),
eso implica que para un proceso 100% efectivo se extraería un total de 0,633 Kg de
membranas intersticiales a partir de 21.12 Kg de cáscaras que se procesaron. En relación a
estos resultados se obtuvieron los siguientes rendimientos.
Tabla 6. Rendimiento del proceso de separación de las cáscaras y membranas.
1 2 3 Promedio del rendimiento
%rendimiento 47.9 51.7 52.6 51.03
El proceso de separación aplicado tuvo un rendimiento del 51.03 %, logrando

recolectar un total de 323 g de membranas para realizar la extracción. Tomando en
consideración que el proceso se realizó de forma manual y que no se contó con los equipos
adecuados para realizar la separación se puede decir que es un resultado aceptable en
comparación con los resultados de Urbano (2010), quien obtuvo un porcentaje de
rendimiento del 61.56 % cuyo proceso contó con equipos aproximados al modelo patentado
por MacNeil (2001). Uno de los principales factores que afectan el rendimiento es el
tamaño de partícula puesto que si la cáscara no se tritura lo suficiente el enlace entre la
membrana y la cáscara no se rompe completamente y por tanto no se logra una separación
eficiente.
57
Análisis granulométrico de cáscaras secas
Luego de realizar el proceso de separación de las cáscaras de las membranas por

diferencia de densidades, las cáscaras sin membrana fueron secadas a temperatura
ambiente, ya secas se procedió a realizar un análisis granulométrico para conocer el tamaño
de partícula a la cual se logró reducir con la batidora industrial. Las cáscaras se pasaron por
un total de 15 tamices de la serie Tyler, cuyos resultados se indican en la Tabla 7.
Tabla 7. Porcentaje de retención en los tamices de la serie Tyler.
Tamaño de poro Porcentaje de masa retenida

Nº Tamiz
(mm) (%)
3 6.68 0
3½ 5.60 0.1333 ± 0.0057
4 4.75 1.6333 ± 0.7571
5 4.00 5.3000 ± 1.0148
6 3.35 17.267 ± 2.8219
7 2.80 50.467 ± 9.8500
8 2.36 2.4333 ± 1.1846
10 2.00 4.1333 ± 2.0207
12 1.397 3.0000 ± 0.7000
16 0.991 10.900 ± 4.0286
20 0.850 3.0333 ± 1.0503
25 0.710 0.4 ± 0.1
58
Continuación de tabla 7
30
0.597 0.4 ± 0.2
35 0.500 0.2 ± 0.1
40 0.425 0.13 ± 0.0577
Fondo 0.1 ± 0.0
(n=3)
En la tabla 7 se puede observar que un 50.5 % de las cáscaras fueron retenidas en el

tamiz Nº 7, cuyo diámetro interno es de 2,80 mm. El valor recomendado para el tamaño de
partícula por MacNeil (2001) se encuentra entre 0,50 – 0,40 mm, valor mucho menor que el
obtenido. Cuando el tamaño de partícula es mayor a 0,50 mm, las cáscaras debido a su
tamaño sedimentan junto a las membranas pegadas a ellas porque no se logra debilitar el
enlace que une las membrana y cáscaras; y si el tamaño de partícula es menor a 0,40 mm,
las cáscaras tienden a adherirse fácilmente a las membranas y flotar junto a ellas y no
precipitan hacia el fondo del tanque. En este sentido, un tamaño distinto al valor
recomendado hace que aumenten las pérdidas en el proceso de recuperación de membranas.
El equipo utilizado para realizar la reducción del tamaño de las cáscaras fue una
batidora industrial con la que contaba la empresa, dicho equipo no es adecuado para hacer
dicha operación por lo tanto no se logró el tamaño de partícula recomendado, sin embargo,
se alcanzó separar el 50 % de las membranas. Para futuras investigaciones en las que se
pueda profundizar en el proceso de separación por diferencia de densidades para residuos
de cáscara de huevo de gallina se plantea realizar diseño óptimo de esta etapa.
59
MEMBRANA SECA
El desarrollo de esta segunda etapa se apoyó en la investigación de
Khanmohammad, (2014), manteniendo las condiciones de tiempo, temperatura y pH que
garantizan una mayor extracción del ácido hialuónico.
Perfil de pH
Se presentó un aumento del pH como consecuencia de la desnaturalización de la

proteína contenida en las membranas en medio ácido y la solubilización del carbonato de
calcio presente en la matriz de la muestra de la membrana. Dicho aumento fue neutralizado
con una solución de ácido acético 4 mol/L. Las proteínas son aminoácidos que en medio
ácido se comportan como bases aceptando protones del medio lo que genera un aumento
del pH. Otro factor importante se debe a que las proteínas en medio ácido son insolubles lo
que facilita la separación del ácido hialurónico. Por su parte, el CaCO3 presente en la capa
mamilar adherida a las membranas intersticiales es solubilizado en el medio ácido lo que
influye en el aumento del pH. A continuación, se muestra el perfil del pH durante cada
extracción.
60
8
6
pH
3
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
Tiempo (s)
Figura 2. Grafico del perfil de pH vs tiempo.
En el gráfico 15 se observa un aumento del pH desde el momento en que se agrega

la membrana, alcanzado un valor cercano a 8, en ese punto se agrega la solución de ácido
acético 4 mol/L para disminuir el pH, el cual baja súbitamente y se mantiene constante
durante la extracción.
ETAPA III: PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO OBTENIDO
La purificación fue realizada con sílica gel y carbón activado, ambos al 2% en peso
respecto al volumen de solución a tratar. La mezcla se dejó en reposo por 48 horas para que
así el carbón activado junto al sílica gel lograra adsorber las proteínas y demás impurezas
permitiendo la separación de la solución de hialuronato de sodio mediante un proceso de
filtración al vacío a temperatura ambiente.
61
Luego de obtener la solución de hialuronato de sodio purificada se llevó a un
liofilizador, el cual permite la extracción de agua a bajas temperaturas sin alterar las
propiedades del compuesto, se utilizó este equipo puesto que el ácido hialurónico se
degrada a altas temperaturas. Debido a las condiciones y capacidades del equipo el proceso
tardó 48 horas para 200 mL de solución, obteniéndose al final un sólido blanco que
posteriormente fue analizado y parcialmente caracterizado.
Mediante los espectros de infrarrojo se puede visualizar la existencia de impurezas

en las muestras obtenidas que pueden asociarse a un exceso de acetato de sodio y cloruro de
sodio utilizado para la generación de la sal del ácido hialurónico, dichos espectros serán
analizados con mayor detalle en la siguiente sección. Sin embargo, este tipo de análisis no
permite la identificación exacta ni la cuantificación de dichas impurezas, es necesario
utilizar otras técnicas con las que no cuenta actualmente el laboratorio como Resonancia
Magnética Nuclear (1H-NMR) para conocer con mayor detalle la composición de las
muestras.
ETAPA IV: CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO FINAL
A continuación se muestra en la siguiente tabla el resumen de las muestras totales

obtenidas y otras.
Tabla 8. Resumen de muestras del producto final obtenido y otras.
Número de muestra Código Descripción
3 días de extracción, con

1 33AI* CH3COONa.3H2O al 3% e
Isopropanol

2 33AE CH3COONa.3H2O al 3% y
Etanol

3 23AI
CH3COONa al 3% e
62
Isopropanol

4 23SE
NaCl al 3% e Isopropanol

5 32AI CH3COONa al 2% e
Isopropanol

6 32SE
NaCl al 2% e Etanol

Isopropanol

8 31SE
NaCl al 1% e Etanol

Isopropanol

10 33SE
NaCl al 3% e Etanol

11 33AIE CH3COONa al 3%,
Isopropanol/Etanol

Isopropanol
13 13SE 1 días de extracción, con
63
NaCl al 3% e Etanol

CH3COONa al 3% e
14 33AIP Isopropanol, con
purificación después de la
liofilización

CH3COONa al 2% e
liofilización

CH3COONa al 1% e
liofilización

CH3COONa al 1%,
17 31AP
liofilización

CH3COONa al 2%,
18 32AP
liofilización

19 33AP CH3COONa al 3%,
64
liofilización
20 A CH3COONa puro
21 S NaCl puro
22 AH Patrón de ácido hialurónico
23 M Membrana pulverizada
Espectrometría Infrarroja por la Transformada de Fourier
A continuación, se muestran los espectros de FTIR por ATR de las muestras de

ácido hialurónico producidas en esta investigación, bajo diferentes condiciones
experimentales, así como el espectro de FTIR - ATR del ácido hialurónico comercial.
65
100
AH comercial
80
2911
%Transmitancia
60
3282
40
1405
1605
20
1147
1078
1038
0
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
-1
Numero de onda (cm )
Figura 3. Espectro IR por ATR del patrón de referencia de hialuronato de sodio. Este
espectro fue obtenido en un equipo modelo Nicolet iS10.
El espectro del hialuronato de sodio comercial presentó cuatro bandas

características: una a 3287 𝑐𝑚−1, que es típica del estiramiento del enlace O-H; otra que se
encuentra a 1605 𝑐𝑚−1, que indica la flexión del enlace N-H del grupo amida; una a 1407
𝑐𝑚−1que representa el estiramiento del enlace C-O del grupo carbonilo de la amida; y
finalmente, una banda a 1035 𝑐𝑚−1 que corresponde al estiramiento de los enlaces C-O-C
presentes en la molécula (Jagadeeswara Reddy y Karunakaran, 2013).
Por su parte, Lago (2007) aporta tres bandas más características en el espectro de
HS, a 2907 𝑐𝑚−1 característica de estrechamientos C-H en el plano de grupos metilo y a
1084 𝑐𝑚−1 y 1147 𝑐𝑚−1 aparecen bandas que pueden estar asociadas a C-N alifático.
Durante el proceso de extracción de ácido hialurónico se emplearon las sales acetato

de sodio y cloruro de sodio como agentes precipitantes para obtener la sal de AH que es
térmicamente más estable que el AH (Lago, 2007). Dichas sales presentan grupos
funcionales que también contiene el HS y se ven reflejados en sus espectros IR como se
muestra en la figura 17.
66
El acetato de sodio (CH3COONa) contiene un grupo hidroxilo (O-H), un grupo
carbonilo (C-O) y grupos metilos (C-H), por lo que estos grupos funcionales generan
señales a longitudes de ondas específicas en su espectro de IR, dichos grupos también se
encuentran presente en el HS por tanto existen bandas que coinciden para ambos
compuestos. Por otro lado, en el espectro correspondiente al NaCl (ver figura 17) presenta
una banda de gran amplitud cerca de los 3500 cm-1 que puede estar asociada a enlaces O-H
aportados por la humedad en la sal.
Ac. de sodio
HS comercial
% Transmitancia
NaCl
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

A
Figura 4. Espectros de IR para el HS comercial, AS y Cloruro de Sodio.
La figura 18 corresponde al espectro de la muestra 31AI obtenida utilizando acetato

de sodio anhidro, se puede visualizar el solapamiento de las bandas características del
hialuronato de sodio debido al exceso de acetato de sodio utilizado, sin embargo, a los 1141
y 1112 𝑐𝑚−1 aparecen bandas que puede estar asociada a C-N alifático, las cuales
coinciden con el patrón de referencia. Por otra parte, la banda que corresponde al
estiramiento de los enlaces C-O-C representa el enlace de unión entre los monómeros del
ácido hialurónico y se encuentra un poco desplazada respecto al espectro de la sal del ácido
hialurónico comercial, a los 1053 𝑐𝑚−1, además es de menor amplitud debido a que el
polímero extraído es de menor peso molecular que el hialuronato de sodio comercial.
67
HS comercial
31AI
% Transmitancia
Acetato
de sodio
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

-1
Figura 5. Espectros IR por ATR de la muestra 31AI, hialuronato de sodio comercial y

acetato de sodio.
Las muestras tratadas con cloruro de sodio para la obtención de la sal del ácido
hialurónico presentaron espectros similares al mostrado en la figura 19. En este espectro se
puede observar la coincidencia de las bandas en la zona de huella dactilar, particularmente
se muestran las bandas asociadas a los enlaces N-H a los 1144 y 1111 𝑐𝑚−1, y a 1031
𝑐𝑚−1 aparece una banda de baja amplitud correspondiente a los enlaces C-O-C. La banda
que identifica al grupo O-H puede encontrarse desplazada por el exceso de NaCl presente
en la matriz de la muestra y por esto no coincide con el espectro del hialuronato de sodio
comercial.
68
HS comercial
31SE
% Transmitancia
NaCl
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

-1
Figura 6. Espectros IR por ATR de la muestra 31SE, hialuronato de sodio comercial y

cloruro de sodio.
69
Comparación de los resultados respecto al solvente utilizado para realizar la
extracción
33AI
33AE
%Transmitacia
33AIE
HS comercial
Ac. de sodio
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

-1
Figura 7. Espectros IR por ATR de la muestra 33AI, 33AE, 33AIE, hialuronato de sodio
comercial y acetato de sodio.
Durante el proceso de extracción se usaron dos solventes, etanol e isopropanol y una

mezcla 1:1 de isopropanol y etanol, manteniendo las mismas condiciones de operación, los
espectros de infrarrojo de estas pruebas se muestran en la figura 20. Se puede notar que la
banda característica correspondiente al enlace C-N alifático que se encuentra a los 1084
𝑐𝑚−1 y 1147 𝑐𝑚−1 es de mayor amplitud en el espectro de la muestra 33AI, mientras que
para la muestra 33AE es menor, por otro lado, en la muestra que contiene la mezcla de
solventes dicha banda no es tan notable. El resto de las bandas se encuentran solapadas por
el exceso de acetato de sodio, sin embargo, se puede decir que el isopropanol como
solvente es más eficiente que el etanol basándose en la definición de la banda
correspondiente al enlace C-N, pero en términos económicos el etanol es más accesible que
el isopranol, una mezcla de ambos no muestra mejores resultados.
70
Comparación de los espectros IR del ácido hialurónico obtenido relacionando los
porcentajes de acetato de sodio y cloruro de sodio utilizado.
Se realizaron pruebas con 1, 2 y 3% de acetato de sodio y cloruro de sodio los

resultados se muestran en las figuras 21 y 22, respectivamente. Las muestras tratadas con
1% de acetato de sodio arrojaron bandas más definidas asociadas al hialuronato de sodio
comercial, sin embargo, el acetato de sodio aún se encuentra en exceso.
33AI
32AI
%Transmitacia
31AI
HS comercial
Ac. de sodio
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

-1
Figura 8. Espectros IR por ATR de la muestra 33AI, 32AI, 31AI, hialuronato de sodio
comercial y acetato de sodio.
Por su parte, en la figura 22 se pueden observar los espectros resultantes de las

muestras tratadas con etanol y cloruro de sodio. En las muestras 31SE y 33SE se hacen
notar las bandas asociadas al ácido hialurónico comercial que se encuentran en la zona de
huella dactilar del compuesto, aunque la banda correspondiente al grupo –OH alrededor de
los 3400 𝑐𝑚−1 no se muestra o se encuentra muy desplazada por el exceso de cloruro de
71
sodio. Para la muestra 32SE la banda asociada a la presencia del grupo –OH es más visible
y de igual manera los picos en la zona de huella dactilar corresponden a los del espectro del
patrón de referencia.
33SE
32SE
%Transmitacia
31SE
HS comercial
NaCl
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

-1
Figura 9. Espectros IR por ATR de la muestra 33SE, 32SE, 31SE, hialuronato de sodio
comercial y cloruro de sodio.
Análisis Termogravimétrico (TGA)
En esta sección se discutirán los resultados de los análisis termogravimétricos

(TGA) y térmico diferencial (DTA) realizados a las muestras extraídas del proceso de
obtención de ácido hialurónico (AH) comparándolos con un patrón de hialuronato de sodio
(HS) comercial y el efecto de los distintos tratamientos empleados. Esto con el objetivo
inicial de utilizar la precisión de esta técnica para estimar el contenido de HS en los
distintos materiales obtenidos. En principio, esto se realizará mediante la identificación de
eventos asociados a pérdida de masa y la identificación del posible fenómeno con el que se
72
encuentran relacionados y a partir de allí estimar su contenido en función de la pérdida de
masa relacionada con dicho evento.
En la figura 23, se muestran los termogramas obtenidos vía TGA para los distintos
patrones y materiales puros utilizados en el presente trabajo, los cuales permiten observar
las pérdidas de masa en función de la temperatura de la muestra debido a la degradación del
material, pérdidas de agua y liberación de gases productos de la reacción.
100
Porcentaje de perdida de masa (%)
90
80
70
60
50
40
HS comercial
Cloruro de Sodio
30 Ac. de Sodio
100 200 300 400 500 600

Temperatura (‫؛‬C)
Figura 10. Termogramas para el HS comercial, AS y Cloruro de Sodio.
En lo referente al comportamiento del HS, se pueden apreciar dos etapas claramente

definidas: en primera instancia, se destaca una pérdida de masa progresiva en temperaturas
cercanas a los 100ºC, éste fenómeno se asocia a la perdida de agua atrapada por el material
dado su carácter higroscópico; en un segundo caso, también se aprecia una pérdida
importante de masa en un rango de temperaturas comprendido entre 250 y 300ºC, el cual ya
ha sido reportado en otros trabajos de investigación y se asocia a la descomposición del HS.
Por otro lado, en la figura 23, también se presenta el termograma asociado al

Acetato de Sodio (AS) utilizado en el presente trabajo. Al igual que en el caso del HS, se
debe destacar dos eventos la pérdida de masa a temperaturas circundantes a 100ºC, la cual
73
se asocia a perdida de agua atrapada debido a que este material, al igual que el HS, también
es higroscópico. La segunda pérdida de masa observada en el termograma para este
material ocurre en temperaturas comprendidas entre 500 y 550ºC, las cuales se
corresponden con la descomposición del AS, en donde se desprenden trazas de CO2 y
acetona como productos volátiles, dejando a su vez carbonato de sodio como residuo
sólido.
Por último, en la figura 23, se presenta el termograma asociado al cloruro de sodio

(NaCl), el cual se destaca por no presentar ningún fenómeno de pérdida de masa en el
ensayo realizado, debido a que el NaCl al ser una sal inorgánica, posee alta resistencia
térmica, por lo que era de esperarse que no presentara ningún evento transitorio en el rango
de temperaturas considerados para el análisis termogravimétrico. Un factor interesante a
destacar, es que partiendo del espectro infrarrojo observado en la figura 22, se podría
presumir que el material contenía humedad en su estructura, dado el pico ancho a números
de onda cercanos a 3500cm-1, sin embargo, los resultados obtenidos en el presente apartado
se contrastan con dicho postulado debido a que no se aprecian caídas de masa relacionadas
con pérdida de humedad.
Los termogramas referentes a las muestras tratadas con AS se presentan en la figura

23, presentada a continuación:
74
100

90
80
70
60
50
40
33AI
32AI
30 31AI
100 200 300 400 500 600

Temperatura de la muestra (°C)
acetato de sodio.
Partiendo de lo presentado en la figura 24, se puede destacar en primera instancia

que todos los termogramas presentan una primera caída referente a perdida de agua en
temperaturas circundantes a 100ºC, lo que era de esperar, ya que los distintos elementos
presentes en estos materiales (HS y AS) son de carácter higroscópico. Otro detalle a
destacar se relaciona con la heterogeneidad del porcentaje de pérdida de peso en todos estos
elementos, el cual se presenta con mayor detalle en la tabla 9, presentada a continuación:
las muestras tratadas con AS.
% Pérdida de masa por % Pérdida de masa por
Compuesto
extracción de humedad descomposición
HS 21.4 42,9
AS 22,1 26
31AI 27,5 16,95
32AI 33,5 26,84
33AI 13 21,14
75
Con base a lo expresado en la tabla 9, se puede concluir que no existe una tendencia
clara entre el porcentaje de absorción de agua en los materiales considerados y el tiempo de
tratamiento con acetato de sodio. Por otro lado, estos resultados demuestran heterogeneidad
en las muestras estudiadas, lo cual puede ser consecuencia errores en las distintas variables
involucradas durante el proceso de mezclado, la forma en que se depositaron las distintas
sales en el envase posteriormente al proceso de liofilización, o incluso al tamaño, forma y
densidad de los cristales de ambas sales presentes en el material, las cuales podrían haber
actuado como barrera evitando la total absorción de humedad por parte de estos materiales,
es de destacar que este último fenómeno ya ha sido reportado para otras estructuras.
Otro factor que se debe de tomar en cuenta se relaciona con la temperatura de

descomposición de las muestras consideradas en la figura 24, la cual se encontró entre 400
y 550ºC, además se debe destacar que se considera que estos materiales son mezclas entre
HS y AS, sin embargo, no se aprecia ninguna transición gravimétrica en el rango de
descomposición del HS comercial analizado en la figura 22 (entre 250 y 300ºC), lo que
podría suponer que el AS estabiliza el comportamiento degradativo de dicho polímero.
Además, partiendo del comportamiento presentado por los materiales 32AI y 33AI, se
considera que pudiesen existir dos eventos de pérdida de masa ocurriendo casi de manera
simultánea, esto se infiere debido a la presencia de un “escalón” (identificado con flechas
en la figura 23) en el rango de temperatura observado.
Partiendo de estos resultados, se pueden inferir distintos fenómenos que

posiblemente estén ocurriendo durante el calentamiento, estos se mencionan a
continuación:
 Cristalización conjunta de los distintos elementos del material: Es conocido que

el proceso de cristalización de una mezcla de materiales, ya sea por enfriamiento
desde el fundido o por medio de extracción de solvente (como lo ocurrido en el
presente trabajo), puede generar estructuras que incluyan las distintas moléculas
presentes en el sistema, promoviendo estructuras que pueden tener, incluso,
resistencias térmicas a descomposición superiores a las generadas por las estructuras
puras (Lowry,1994) . Partiendo de esto, se puede presumir que el HS y el AS
76
pudieron cristalizar en conjunto formando una fase cuya estabilidad térmica se
asemeja a la del AS.
Cabe resaltar que en un sistema de esta naturaleza pueden existir distintas
fases de cristales (Lowry, 1994), en donde pueden coexistir en conjunto tanto
cristales de AS puro, como del hibrido, lo cual explicaría el comportamiento por
etapas observado para los materiales 32AI y 33AI.
 Interacción o reacción entre los elementos presentes en los materiales: En este

caso, se podría inferir que el HS presente en los materiales considerados podría
haberse degradado en temperaturas cercanas a las presentadas por la versión
comercial, sin embargo, los productos volátiles generados por la descomposición de
este material podrían haber interactuado o reaccionado con el AS restringiendo de
esta manera su salida del sistema y evitando el registro del evento por parte de la
microbalanza del TGA.
Por otro lado, en lo referente a los resultados vía DTA, presentados en la figura 25,
se tiene que existe una transición cercana a 250 °C, coincidiendo con la temperatura de
descomposición del HS, por lo que se puede suponer que dicho material puede sufrir una
transición, la cual es estabilizada por la presencia del AS.
77
8
6
Diferencia de temperatura (°C)
4
-2
-4 33AI
32AI
31AI
-6 HS comercial
Ac. de sodio
-8
100 200 300 400 500 600

Figura 12. Termogravimetría Derivada (DTG) de las muestras obtenidas a través de la

primera derivada de la curva de peso en función de la temperatura.
Es importante resaltar que los ensayos y análisis realizados durante el desarrollo del
presente trabajo de grado no son suficientes para demostrar la validez de las suposiciones
descritas anteriormente con el objetivo de explicar los fenómenos que ocurren entre 400 y
550ºC de los materiales tratados con acetato de sodio. Esto deja abierta la posibilidad de
que físicamente pueda estar ocurriendo uno de estos a la vez, así como también cualquier
otro evento aun no considerado.
De igual manera se debe resaltar que debido a las posibles interacciones existentes
entre los distintos elementos en las muestras tratados con AS, así como la heterogeneidad
de las muestras limitan la estimación de la concentración del HS dentro de las distintas
composiciones obtenidas para la extracción de dicha sal.
Por otro lado, las curvas de TGA de las muestras tratadas con cloruro de sodio y
etanol se pueden visualizar en la figura 26, donde son comparadas con la sal de ácido
hialurónico y la sal utilizada en el proceso.
78
100

90
80
70
60
50
40 32SE
31SE
HS comercial
30 NaCl
100 200 300 400 500 600

cloruro de sodio.
Como se puede notar, el comportamiento de estas muestras difiere del AH, y se

asemeja al comportamiento del NaCl puro, cuyas curvas son características de muestras con
baja tensión de vapor por lo que no muestra efectos gravimétricos casi despreciables puesto
que el cloruro de sodio es térmicamente estable y el exceso de la sal estabiliza las muestras.
Sin embargo, al igual que en los casos anteriores existen dos transiciones definidas en el
comportamiento de los distintos materiales tratados con NaCl: uno en torno a 100ºC,
relacionado con el agua atrapada y otro cercano a 400ºC, posiblemente relacionado con la
descomposición del HS en estos materiales, lo que hace posible su estimación cuantitativa,
la cual se presenta en la tabla 10.

las muestras tratadas con NaCl.
% Pérdida de masa por % Pérdida de masa por
Compuesto
extracción de humedad descomposición
31SE 1,7 2,7
32SE 0,6 1,55
79
De la tabla 10, se puede estimar que la concentración de HS dentro de estos
materiales fue cercana al 2% considerando los errores asociados a la heterogeneidad de las
muestras estudiadas. Se resalta que estos resultados se presentan asumiendo que la pérdida
de masa obtenida a 400ºC se corresponden con el HS presente en los materiales estudiados.
Cabe destacar, que el exceso de ambas sales utilizadas en el proceso generó la

estabilidad térmica de las muestras aumentando su temperatura de descomposición y
resultando que las curvas de los análisis termogravimétricos presentaran caídas a
temperaturas superiores a las observadas para el HS utilizado como patrón. Dicha
estabilización también puede estar relacionada con fenómenos similares a los descritos para
los materiales tratados con acetato de sodio.
80
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
 La separación por diferencia de densidades es un método de separación económico,

sencillo y no afecta la composición química de las membranas.
 Se desarrolló un método de separación física por diferencia de densidades el cual

permitió recuperar las membranas intersticiales a partir de residuos de cáscara de
huevo de gallina triturados de forma manual, con un rendimiento del 51,03 %.
 El método de extracción usando como solvente alcohol isopropílico resulto ser el

método más adecuado, puesto que para las muestras tratadas con este solvente se
obtuvieron bandas características correspondiente al enlace C-N alifático con mayor
amplitud, mientras que para las muestras tratadas con etanol como solvente fue de
menor amplitud. Sin embargo, en términos económicos el etanol es más accesible
que el isopropanol.
 Las muestras tratadas con acetato de sodio al 1% muestra un espectro de IR con

bandas más definidas, sin embargo, aún se aprecia el exceso del acetato de sodio.
81
 Las muestras tratadas con cloruro de sodio al 2% presenta bandas más definidas que
las muestras que contienen 1 y 3% de NaCl.
 La estabilidad térmica de las muestras aumenta debido al exceso de sales presentes

en el producto final por lo que su temperatura de descomposición es mayor a la de
ácido hialurónico comercial.
Recomendaciones
 Desarrollar un diseño experimental para optimizar el proceso de separación por

diferencia de densidades, con el fin de determinar las mejores condiciones para
obtener el tamaño de partícula adecuado y la velocidad de agitación que permita la
mayor cantidad de membranas testáceas extraídas.
 Reevaluar las condiciones del proceso de extracción usando soluciones de acetato

de sodio y cloruro de sodio de menor concentración para evitar el exceso de estas
sales en el producto final.
 Efectuar diferentes rutas de purificación del producto con el fin de realizar una
eficaz eliminación de restos de los reactivos utilizados durante el proceso que
afecten la estabilidad térmica de la sal de ácido hialurónico extraído.
 Realizar análisis de caracterización como resonancia magnética nuclear de protón

(1H-NMR), viscosimetría, calorimetría diferencial de barrido (DSC) y cromatografía
de exclusión molecular (SEC) con el objetivo de verificar la pureza y existencia de
los grupos funcionales característicos del ácido hialurónico.
82
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88
APÉNDICE
89
Apéndice A: Cálculos típicos
1. Cálculo del volumen de ácido acético con una pureza de 100 % y una densidad de
1,05 g/mL para preparar 500 mL de una disolución de concentración 4 mol/L.
𝑀𝑀𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻 = 60,05 𝑔/𝑚𝑜𝑙
1𝐿 4 𝑚𝑜𝑙 60,05𝑔 𝑝𝑢𝑟𝑜𝑠 100 𝑔 𝑖𝑚𝑝𝑢𝑟𝑜𝑠 1 𝑚𝐿

𝑉𝑐 = 500 𝑚𝐿 × × × × ×
1000 𝑚𝐿 1𝐿 1 𝑚𝑜𝑙 100 𝑔 𝑝𝑢𝑟𝑜𝑠 1,05 𝑔 𝑖𝑚𝑝𝑢𝑟𝑜𝑠
𝑉𝑐 = 115 𝑚𝐿
2. Cálculo del pH de una disolución de concentración 4 mol/L de ácido acético,

sabiendo que su constante de acidez a 25 °C es 𝟏, 𝟖 × 𝟏𝟎−𝟓
10−3 𝛼 2
𝐾𝑎 = = 1,8 × 10−5
1−𝑥
Sea la reacción de disociación del ácido acético:
𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐻2 𝑂 ↔ 𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− + 𝐻3 𝑂+
Cinicial (mol/L) 4
Cfinal (mol/L) 4–X X X
[𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− ][𝐻3 𝑂+ ]

𝐾𝑎 = 1,8 × 10−5 =
[𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻]
𝑋2
1,8 × 10−5 =
4−𝑋
Resolviendo,
𝑋 = 0,008476
Determinando el pH
90
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[𝐻3 𝑂+ ]
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[0,008476]
𝑝𝐻 = 2,071
3. Determinación de la concentración del ácido acético con un pH de 3,5.
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[𝐻3 𝑂+ ] = 3,5
10𝑙𝑜𝑔𝑋 = 10−3,5
𝑋 = 0,00031
Mediante la ecuación de la constante de acidez 𝐾𝑎 :
−5
(0,00031)2
1,8 × 10 =
𝑋 − 0,00031
Resolviendo,
𝑋 = 0,005648
Así la concentración aproximada de la solución de ácido acético a un pH de 3,5 es

0,006 mol/L
4. Determinación del volumen de alícuota para preparar una solución de ácido

acético de concentración 0,006 mol/L con un volumen de dilución de 1000 mL.
1𝐿 0,006 𝑚𝑜𝑙 60,05𝑔 1 𝑚𝐿

𝑉𝑐 = 1000 𝑚𝐿 × × × ×
1000 𝑚𝐿 1𝐿 1 𝑚𝑜𝑙 1,05 𝑔
𝑉𝑐 = 0,34 𝑚𝐿
5. Rendimiento del proceso de separación física de la membrana de la cascara.

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑛𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 𝑠𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑑𝑎 (𝐾𝑔)
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = ∗ 100
0.03 ∗ 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑎𝑠𝑐𝑎𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎
91
6. Análisis granulométrico: cálculo del porcentaje de masa retenida.
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑧 (𝐾𝑔)
% 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑧 = ∗ 100
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (1 𝐾𝑔)
7. Procedimiento para la preparación de la solución de acetato de sodio al 1% 2% y

3%
a) Preparación de la solución de acetato de sodio al 1 %
 Disolver 2 g de acetato de sodio anhidro en aproximadamente 100 mL

de agua destilada contenido en un beaker limpio.
 Agitar hasta disolver completamente los cristales.
 Transferir la solución a un balón aforado limpio de 200 ml.
 Enrasar el balón hasta el aforo.
b) Preparación de la solución de acetato de sodio al 2 %

c) Preparación de la solución de acetato de sodio al 3 %

92
ANEXOS
93
Anexo A. Tabla de registro del peso de las partículas de cáscaras secas.
Tamiz Abertura Peso retenido (Kg) (1) Peso retenido (Kg) (2) Peso retenido (Kg) (3)
3 6.680 0.000 0.000 0.000
3 1/2 5.600 0.002 0.001 0.001
4 4.750 0.025 0.011 0.013
5 4.000 0.062 0.042 0.055
6 3.350 0.205 0.153 0.160
7 2.800 0.354 0.600 0.560
8 2.360 0.038 0.018 0.017
10 2.000 0.063 0.038 0.023
12 1.397 0.038 0.025 0.027
16 0.991 0.155 0.080 0.092
20 0.850 0.041 0.020 0.030
25 0.710 0.004 0.003 0.005
30 0.597 0.006 0.002 0.004
35 0.500 0.003 0.001 0.002
40 0.425 0.001 0.002 0.001
Resto 0.001 0.001 0.001
Fuente: Casadiego y García, 2018
Anexo B: Termogravimetría Derivada (DTG) de las muestras obtenidas a través de la

primera derivada de la curva de peso en función de la temperatura.
94
8
Diferencia de temperatura (°C) 4
-2
-4 33AI
32AI
31AI
-6 AH comercial
Ac. de sodio
-8
100 200 300 400 500 600

4
Diferencia de temperatura (°C)
-2
33SE
32SE
-4 31SE
AH comercial
NaCl
-6
100 200 300 400 500 600
95
Anexo C: Registro fotográfico del proceso de separación física de la membrana de la
cáscara de huevo de gallina.
Cáscaras de huevo Lavado y trituración Trituración

manual mecánica
Membranas separadas
Secado de membranas
Membranas
pulverizadas
96
Anexo D: Registro fotográfico del equipo empleado para la molienda de la membrana seca.
Molino de bolas
Bolas de cerámica Equipo completo de molienda
Anexo E: Registro fotográfico de lavado del sólido precipitado con soluciones de acetato
de sodio.
Sólido precipitado Lavado con solución de

acetato de sodio
97
Anexo F: Equipo empleado para la centrifugación de la solución en frio.
Anexo G: Registro fotográfico del equipo de Liofilización.
Liofilizador con
muestra incorporada
Condiciones de trabajo del liofilizador
98
Anexo H: Sistema de secado al vacío, tiene incorporado una bomba, una trampa de vacío y
un horno.
Anexo I: Sistema de filtrado al vacío.
99

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UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL POLITÉCNICA

“ANTONIO JOSÉ DE SUCRE”

EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE

LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE GALLINA (Gallus gallus

Barquisimeto, Enero 2019

EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE

LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE GALLINA (Gallus gallus

Barquisimeto, Enero 2019

Todo mi esfuerzo se lo dedico a Dios, a mi

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Al Ing. Vladimir de Amicis, Personal Asociado a la Investigacion (PAI) del Laboratorio de

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A mi madre Ana Córdoba, pilar fundamental en mi vida, mi ejemplo a seguir, te agradezco

A mis compañeros y amigos en especial a Willianny y Natascha, por acompañarme en cada

A mi compañera Enderlys García, gracias por tenerme paciencia, confianza y brindarme tu

Agradezco a mi amiga, María Elena Vásquez, quien me ha ayudado y acompañado en este

Agradezco a mis compañeros de Polifolklore y Unexpo Gaita, especialmente al Maestro

ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................................... xii

Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas del Ácido Hialurónico .............................................. 17

Tabla 2. Constituyentes proteicos típicos de las membranas testáceas de la cáscara de

Tabla 3. Resumen de variables involucradas en el proceso de investigación. .................... 42

Tabla 5. Pesos de las cáscaras y membranas empleadas en el proceso ............................... 57

Tabla 6. Rendimiento del proceso de separación de las cáscaras y membranas. ................ 57

Tabla 7. Porcentaje de retención en los tamices de la serie Tyler. ...................................... 58

Tabla 8. Resumen de muestras del producto final obtenido y otras. ................................... 62

Tabla 9. Porcentajes en pérdida de masa por extracción de humedad y descomposición en

Tabla 10. Porcentajes en pérdida de masa por extracción de humedad y descomposición en

Figura 1. Unidad de repetición de ácido hialurónico que comprende ácido D-glucurónico y

ATR "Attenuated total reflectance" (reflectancia total atenuada)

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EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE LA

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