DISSENY EXPERIMENTAL

Tal com us demana el grup de recerca d’Oncologia Molecular de l’Hospital de la Vall

d’Hebron, cal que avalueu l’anti-tumorigènesi d’una molècula derivada de l’Irinotecan. Amb
aquesta finalitat, cal que feu el disseny experimental de l’assaig preclínic que dureu a terme
per avaluar l’efectivitat i la toxicitat d’aquest fàrmac. Així doncs, cal que definiu l’objectiu de
la vostra recerca, identifiqueu (i justifiqueu) les ​tècniques que dureu a terme i nombreu els
materials (cèl·lules i demés) que necessitareu.
Abans, però, cal que llegiu els següents 3 articles per tenir com a referència un disseny
experimental del tipus com us demana el grup de la Vall d’Hebron. Cal, doncs, que
identifiqueu quines tècniques o assajos s’utilitzen per tal d’avaluar l’anti-tumorigènesi d’una
determinada molècula. Llegiu-los i ompliu les taules següents:

Article 1

Therapeutic effects of the euglenoid ichthyotoxin, euglenophycin, in colon cancer

April B. Cabang, Keya De Mukhopadhyay, Sarah Meyers, Jay

Autors/es Morris, Paul V.
Zimba and Michael J. Wargovich

Any 2017

URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5732811/

Objectiu de la recerca

El objetivo del estudio es la investigación de los mecanismos anticancerígenos de la euglena

oficina de E. sanguínea, un euglenoide que contribuye a la proliferación de algas dañinas en
el agua dulce.

Línies cel·lulars estudiades

Las líneas celulares estudiadas son: HCT116, HT29 y SW620.

Tècniques utilitzades

Nom tècnica En què consisteix aquesta tècnica?

Tinción con yoduro de Su función es conseguir la identificación de los distintos tipos

propidio de muerte celular.

Citometría de flujo Es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz

láser, empleada en el recuento y clasificación de células según
sus características morfológicas, presencia de biomarcadores,
y en la ingeniería de proteínas.
Western Blot Es una técnica analítica usada en biología celular y molecular
para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja
de proteínas, tal como la que se presenta en extractos
celulares o de tejidos.

Cultivo de ​E. sanguínea y

aislamiento de euglena
oficina.

Reproducción de células.
Cultivo de células

Cálculo del porcentaje de viabilidad.

Ensayo de células MTT

En el análisis del ciclo celular se observa si el ADN de las

Análisis del ciclo celular
células se ha replicado correctamente.

Es una técnica que sirve para estudiar la efectividad de

Ensayo clonogénico
agentes específicos en la supervivencia y proliferación de
células.

La autofagia se detectó utilizando el kit de detección de

Ensayo de autofagia
autofagia CYTO-ID.

Permite conocer y cuantificar la expresión de los genes en la

Análisis de expresión
célula, mediante la medición de los ARNm que están presentes
génica de marcadores de
en esta en un momento determinado.
autofagia.

Las células HCT116, HT29 y SW620 se cultivaron en placas de

Ensayo de migración
96 pocillos en medio de crecimiento completo en diferentes
celular
densidades.

En esta técnica se cuantifica cuantas proteïnas genera una

Análisis de la expresión de
célula.
proteínas

Se analizó el suero de todos los grupos de tratamiento para

Ensayo de citoquinas y
HCT116, HT29 y SW620.
quimioquinas

Se analizan los datos mediante la prueba t.

Análisis estadístico

Conclusions de l’estudi
Se demuestra que la euglenificina puede ser utilizado como candidato para el cáncer
anticolorrectal.

Sería interesante investigar si la euglenoficina se puede usar como adyuvante para potenciar
la eficacia de los quimioterapéuticos actuales.

Los hallazgos respaldan la inclusión del género Euglena como fuentes de descubrimiento de
fármacos de productos naturales.

El estudio apoya la extensión de los esfuerzos de descubrimiento de fármacos de los

ecosistemas de agua dulce para encontrar posibles prospectos de fármacos con estructuras
químicas o modos de acción únicos.

Article 2

Anti-tumorigenic activity of five culinary and medicinal herbs grown under greenhouse
conditions and their combination effects

Autors/es Weiguang Yi and Hazel Y Wetzstein

Any 2011

URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21452174

Objectiu de la recerca

1. Evaluar la actividad antitumoral de la selección de 5 hierbas crecidas en condiciones

de invernadero.
2. Comparar la bioactividad de diferentes extractos de hierba.
3. Estudiar los efectos sinérgicos potenciales entre diferentes combinaciones de
extractos de hierbas.

Línies cel·lulars estudiades

Línea celular de adenocarcinoma de colon humano SW-480

Tècniques utilitzades

Nom tècnica En què consisteix aquesta tècnica?

Extracción Esta prueba consiste en triturar hojas frescas de diferentes

plantas en un mortero congelado y sumergir las muestras en
nitrógeno líquido. Posteriormente se extraen los tejidos con
metanol en un agitador orbital repitiendo el proceso 3 veces.
Los extractos restantes se filtran con nylon fi combinan y se
liofilizan con el sistema Labconco. x
Medida de polifenoles Esta técnica se utiliza para determinar los antioxidantes
totales polifenólicos midiendo la cantidad de sustancia analizada
necesaria para inhibir la oxidación del reactivo. La medida de
TPP (total polyphenols) se realiza con el reactivo de
Folin-Ciocalteu. Se diluyen los extractos en metanol y se
mezclan con el reactivo de Folin-Ciocalteu y carbonato de
sodio. Posteriormente se hace la lectura de los resultados en
un espectrofotómetro.

Medida de la capacidad Para realizar esta prueba se usa una solución ABTS. Esta
antioxidante solución se produce con el catión radical ABTS
(ABTS+persulfato de potasio) diluido en etanol. Luego se hace
la lectura en el espectrofotómetro a 734 nm.

Cultivos celulares Se hace un cultivo en una placa con el medio ATCC-formulado

de Leibovitz L-15 medio con 2 mmol L - 1 L- glutamina sin
bicarbonato de sodio, más suero bovino fetal al 10%, se
incuban los cultivos a 37ºC para así poder ver el crecimiento
de las células cancerosas. El medio de cultivo se cambia de 2
a 3 veces por semana.

Ensayo de Es el procedimiento posterior al cultivo celular y la extracción.

anti-proliferación celular
Se inocula una cantidad determinada de células con medio de
crecimiento (1·10⁴ células) en cada pocillo de una placa de 96
pocillos. Posteriormente se cambia el medio de cultivo por
diferentes extractos de hierbas con DMSO. Se incuba durante
48h y se hace la lectura con el ensayo “ATCC MTT” en
570–655 nm usando el “Bio-Rad Model 680 microplate reader”.
La inhibición de la proliferación se calcula con la siguiente
CN c − CN t
fórmula: I = CN c − CN o × 100%

Ensayo de Esta prueba sirve para estimar los efectos aditivos de la

anti-proliferación de
combinaciones de
extractos de hierba
combinación de extractos de hierbas haciendo la comparación
de los valores calculados sobre la base de las hierbas
individuales con los valores reales obtenidos en las muestras
tratadas con combinaciones de hierbas. La fórmula para
realizar el cálculo es la siguiente: Vc = V1 × V2

Análisis isobolográfico Sirve para determinar el índice de combinación usando la

ecuación de isobolograma clásico:

(D)1 (D)2
CI = (Dx)1 + (Dx)2

Conclusions de l’estudi

Los extractos de especies de hierbas (tomillo, romero, salvia, menta verde y menta) pueden
inhibir significativamente el crecimiento de células de cáncer de colon humano.

Las mezclas de extractos de hierbas pueden tener efectos combinados en el crecimiento de

las células cancerosas.

El estudio sugiere que estas cinco hierbas pueden tener beneficios potenciales para la salud
para suprimir el cáncer de colon.

Article 3

Efficient Activation of Apoptotic Signaling during Mitotic Arrest with AK301

Avijeet Chopra, Michael J. Bond, Marina Bleiler, Michelle

Autors/es
Yeagley, Dennis Wright, Charles Giardina

Any 2016

URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4838221/

Objectiu de la recerca

El objetivo de este artículo es la división activa de células.

Línies cel·lulars estudiades

Las líneas celulares son: HT29 y HCT116

Tècniques utilitzades

Nom tècnica En què consisteix aquesta tècnica?

Cultivo de células En una placa de agar o otro medio líquido o sólido se siembran
unas células, para así poder ver su crecimiento y después de
este se puede hacer un subcultivo para así aislar un número de
células en caso de que sea necesario.

Microscopio de El anticuerpo primario es el que reconoce y se une a la

inmunofluorescencia
molécula diana, mientras que el secundario que es el que se
encuentra marcado con el fluoróforo, el cual reconoce al
primario y se une a él. Esta técnica está aplicada a la detección
de anticuerpos específicos en el suero del paciente frente a un
determinado antígeno o a la detección de un antígeno en una
muestra clínica.
 Es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz
Citometría de flujo
láser, empleada en el recuento y clasificación de células según
sus características morfológicas, presencia de biomarcadores,
y en la ingeniería de proteínas.

Esto se hace para saber si las el ADN se ha replicado

Análisis del ciclo celular
correctamente en el ciclo celular.

Ensayo de caspasa-3 Permite una cuantificación rápida y eficaz de la actividad de

esta enzima. ya que esta se usa como mediadora para la
apoptosi.

Western blot Es una técnica analítica usada en biología celular y molecular

para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja
de proteínas, tal como la que se presenta en extractos
celulares o de tejidos.

Análisis estadístico Es utilizada esta técnica para comparar pruebas y corregir.

Conclusions de l’estudi

En este estudio se muestra que el compuesto AK301 es eficaz para inducir una transición de
mitosis a apoptosis en ausencia de un ligando de muerte en células de cáncer de colon
p53-normales.

Hallan que el inhibidor de Aurora B puede reducir los niveles de γH2AX en las células
tratadas con AK301. Comprender cómo se activa de manera óptima la respuesta al daño del
ADN durante la detención de la mitosis podría proporcionar una idea de cómo este evento
podría estar mejor dirigido a las células cancerosas con defectos mitóticos.

El impacto de AK301 en las células es complejo y depende de una gama de factores

genéticos y específicos de tejido. Por ejemplo, las células con un gen p53 normal pero con
un punto de control del ensamblaje del huso débil pueden ser más directamente sensibles a
AK301.

El análisis indica que las células portadoras de una mutación ​APC son más sensibles a
AK301, en comparación con las células mutantes p53 con un SAC robusto que puede
requerir un ligando de muerte para someterse a la apoptosis.

La comprensión de cómo AK301 se dirige a los componentes celulares para inducir un

estado de detención mitótica reversible que incluye niveles elevados de señalización ATM y
la estabilización de p53 podría proporcionar información valiosa sobre cómo los cánceres con
la vulnerabilidad adecuada podrían ser mejor dirigidos.
Un cop fetes les lectures, estem en disposició de crear el vostre propi assaig. Per això,
ompliu la taula següent:

Nom del propi disseny experimental

Efectividad y toxicidad del Irinotecan para el tratamiento de cáncer de colon.

Autors/es Raquel Castillejo, Laura Ferrero, Marc Herrera, Laura Muntané

y Andrea Toribio

Objectiu de la recerca

El objetivo de nuestro diseño experimental es comprobar la eficacia y la toxicidad de nuestra

molécula, el Irinotecan.

Línies cel·lulars amb les que treballareu (han de ser 2!)

1) HT29 (FHC)
​2)​ ​HCT116

Tècniques que fareu

1) En què consisteix aquesta tècnica?

Nom tècnica
2) Amb quina finalitat s’utilitza en aquest estudi?

Cultivos celulares Se hace un cultivo en una placa con el medio ATCC-formulado

de Leibovitz L-15 medio con 2 mmol L - 1 L- glutamina sin
bicarbonato de sodio, más suero bovino fetal al 10%, se
incuban los cultivos a 37ºC para así poder ver el crecimiento
de las células cancerosas. El medio de cultivo se cambia de 2
a 3 veces por semana.

Siembra de células sanas y tumorales en placas en diferentes

Estudio de toxicidad
concentraciones del fármaco derivado del Irinotecan.
La finalidad es encontrar la concentración más conveniente de
fármaco que sea efectivo y que no mate a nuestras células.
Las técnicas utilizadas para determinar estos parámetros
serían la Western blot, para obtener el número de enzimas, la
MTT para cuantificar las células que se ven afectadas por el
fármaco etc.

La autofagia se detectó utilizando el kit de detección de

Ensayo de autofagia
autofagia CYTO-ID. Se monitoriza la autofagia en células vivas
mediante microscopía de fluorescencia, citometría de flujo y
lector de microplacas.
La finalidad en este estudio es la comprobación de la
capacidad de nuestra molécula para desencadenar o activar la
 capacidad autofágica de las células.

Ensayo de caspasa-3 Esta enzima se usa como medidora de la apoptosi de las

células.
Nos permitirá la cuantificación rápida y eficaz de esta enzima,
permitiéndonos saber cuántas células están en apoptosi.

Citometría de flujo y Consiste en el recuento y clasificación de células según sus

análisis del ciclo celular. características morfológicas.
Como finalidad el análisis del ciclo celular, las células se
analizaran para determinar el contenido de ADN.

La tinción con yoduro de Nos permite identificar distintos tipos de muerte celular.
propidio Como finalidad nos sirve para poder hacer un análisis celular.
La observación se llevaría a cabo mediante una citometría de
flujo.

Cálculo del porcentaje de viabilidad.

Ensayo de células MTT
Como finalidad nos servirá para saber el número de células
que se pueden utilizar.
El kit de ensayo de proliferación de células MTT es un método
sensible para la cuantificación de células viables en ensayos
de proliferación y citotoxicidad.

Ensayo de Se inocula una cantidad determinada de células con medio de

anti-proliferación celular
crecimiento (1·10⁴ células) en cada pocillo de una placa de 96
pocillos. Posteriormente se cambia el medio de cultivo por el
fármaco derivado del Irinotecan. Se incuba durante 48h y se
hace la lectura con el ​ensayo “ MTT” en 570–655 nm usando el
“Bio-Rad Model 680 microplate reader”. La inhibición de la
proliferación (I) se calcula con la siguiente fórmula:

CN c − CN t
I= CN c − CN o
× 100%

El método se basa en agua soluble compuesto de MTT

(bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) en
un producto de formazán insoluble. Las células viables con
metabolismo activo convierten el MTT en formazán, sin
embargo, las células muertas pierden esta capacidad. Así, la
formación de color sirve como un marcador útil y conveniente
de solo las células viables. La absorbancia medida (590 nm) es
proporcional al número de células viables.

Medida de la capacidad Para realizar esta prueba se usa una solución ABTS. Esta
antioxidante solución se produce con el catión radical ABTS es un substrato
que produce un producto final soluble de color verde y que se
 mira a 405 nm en el espectrofotómetro. (ABTS+persulfato de
potasio) diluido en etanol. Luego se hace la lectura en el
espectrofotómetro a 734 nm.

Conclusions de l’estudi a les quals preteneu arribar

La molécula de del fármaco nuevo derivado del Irinotecan tiene un efecto autofágico efectivo
como tratamiento para el cáncer de colon.

El nuevo fármaco derivado del Irinotecan induce a una apoptosis de las células tumorales
para combatir el cáncer de colon.

El nuevo fármaco tiene una alta efectividad contra el cáncer de colon.

Comprobaremos si ralentiza la proliferación de células cancerosas y si la molécula deriva del

irinotecan tiene propiedades antioxidante.