Referencia 1

 Observaciones “in vitro” o en modelo animal, por muy buenos que sean estos modelos, no
significan aplicabilidad directa en humanos. Se requieren estudios clínicos en humanos para

poder sacar algunas conclusiones.
 La mayoría de los estudios se hacen sobre un tipo concreto de cáncer y por tanto los datos y
terapias no serían extrapolables a cánceres de etiología distinta.
 Observar tendencias en un modelo no es curar una enfermedad. En el ejemplo de arriba
tenemos compuestos que en un modelo concreto limitan el crecimiento de tumores (pero
no los elimina), podrían prevenir la aparición masiva de tumores (Pero no evitan su aparición),
limitan la movilidad de células cancerosas (pero no la elimina del todo)
 Se requieren muchos más estudios en este campo para poder llegar a aplicar estos
compuestos en pacientes de cáncer.
Endocannabinoides y Cáncer
Guillermo Velasco, Cristina Sánchez y Manuel Guzmán
Contenido
1. Introducción
.................................................................
. . . . . . . . . . . . . . . . 451
2 El sistema endocannabinoide y el
cáncer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453
3 Actividad Antitumoral
Preclínica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 454
4 Mecanismos de los Efectos
Antitumorales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 454
4.1 Inducción de la muerte de células
cancerosas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4
4.2 Inhibición de la Angiogénesis, Invasión y
Metástasis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459
4.3 Regulación de la inmunidad
antitumoral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459
G. Velasco (*)
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de Biología,
Complutense
Universidad, Madrid, España
Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas
(CIBERNED), Madrid, España
Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos (IdISSC),
Madrid, España
Instituto Universitario de Investigación Neuroquímica (IUIN), Madrid, España
e-mail: gvelasco@quim.ucm.es
C. Sánchez
Complutense
Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre (i + 12), Madrid, España
M. Guzmán
Complutense
Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas
(CIBERNED), Madrid, España
Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS), Madrid, España
© Springer International Publishing Suiza 2015
RG Pertwee (ed.), Endocannabinoids, Manual de Farmacología Experimental
231, DOI 10.1007 / 978-3-319-20825-1_16
449
Página 2
5 Mecanismos de
Resistencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . 460
6 Terapias Combinatorias Basadas en
Canabinoides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
7 Efectos antitumorales clínicos de los
cannabinoides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464
8 Conclusiones y Direcciones
Futuras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
6
Referencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467
Abstracto
Un gran cuerpo de evidencia demuestra que los cannabinoides, además de su
bien-
Efectos paliativos conocidos sobre algunos síntomas asociados al cáncer, pueden
Crecimiento tumoral en modelos animales de cáncer. Lo hacen modulando
células clave
Vías de señalización implicadas en el control de la proliferación de las
supervivencia. Además, los cannabinoides inhiben la angiogénesis y la
proliferación celular
En diferentes tipos de tumores en animales de laboratorio. Por el contrario, poco
se sabe
Sobre el papel biológico del sistema endocannabinoide en la fisiotera-
Patología, y varios estudios sugieren que puede ser sobre-activado en el cáncer.
En esta revisión, discutimos nuestra comprensión actual de los cannabinoides
como
Antitumorales, centrándose en los recientes avances en los mecanismos
moleculares
De acción, incluyendo mecanismos de resistencia y oportunidades de
combinación
Enfoques terapéuticos.
Palabras claves
Angiogénesis • Apoptosis • Autofagia • Cáncer • Canabinoide • Célula
Proliferación • Señalización celular • Terapia combinada
Abreviaturas
2-AG
2 - Araquidonoilglicerol
ALK
Linfoma quinasa anaplásica
ATF-4
Activación del factor de transcripción 4
CB 1
Cannabinoide CB1
CB 2
Cannabinoide CB2 receptores
CBD
Cannabidiol
PICAR
C / EBP proteína homóloga
EGFR
Receptor del factor de crecimiento epidérmico
ER
Retículo endoplásmico
ERK
Quinasa regulada por señal extracelular
MDK
Midkine
MTORC1 Objetivo mamífero del complejo rapamicina 1
MTORC2 Objetivo mamífero del complejo rapamicina 2
THC
Δ 9-tetrahidrocannabinol
TRIB3
Tribbles-homólogo 3
TRPV1
Subfamilia del canal catiónico del potencial receptor del transitorio V miembro 1
VEGF
Factor de crecimiento vascular endotelial
450
G. Velasco et al.
Página 3
1
Introducción
Los preparados de cannabis sativa L. (marihuana) se han utilizado en muchas
Siglos tanto medicinales como recreacionales. Sin embargo, las estructuras
químicas
De sus componentes activos únicos -los cannabinoides- no fueron dilucidados
hasta
Los años sesenta. Tres décadas más tarde, las primeras pistas sólidas sobre la
acción molecular cannabinoide
, Lo que dio lugar a una impresionante expansión de la producción de
cannabinoides básicos
Investigación y un renacimiento en el estudio de los efectos terapéuticos de los
cannabinoides
En diversos campos, incluida la oncología. Hoy en día, es ampliamente aceptado
que,
~ 108 cannabinoides producidos por C. sativa, Δ 9-tetrahidrocannabinol (THC) es el
Más importante debido a su alta potencia y abundancia en preparados vegetales
(Gaoni
y Mechoulam 1964 ; Pertwee 2008 ). El THC ejerce una amplia variedad de
Efectos imitando sustancias endógenas-los endocannabinoides anandamida
(Devane et al. 1992 ) y 2-araquidonoilglicerol (2-AG) (Mechoulam et al. 1995 ;
Sugiura et al. 1995 ) -que se conectan a receptores de cannabinoides específicos
de la superficie celular
(Pertwee et al. 2010 ). Hasta el momento, dos de los principales receptores CB-1-
cannabinoides específicos y
CB 2 -tienen sido clonado y caracterizado a partir de tejidos de mamíferos

(Matsuda
Et al. 1990 ; Munro et al. 1993 ). Además, otros receptores tales como los
transitorios
Receptor de potencial catiónico canal subfamilia V miembro 1 (TRPV1) y el
huérfano G
El receptor acoplado a proteína GPR55 se han propuesto para actuar como
endocannabinoide
receptores (Pertwee et al. 2010 ). La mayoría de los efectos producidos por los
cannabinoides
sistema nervioso y en tejidos no neuronales se basan en la activación del
receptor CB 1. En
Por el contrario, el receptor CB 2 fue descrito inicialmente para estar presente en
el inmune
sistema (Pertwee et al. 2010 ), Pero más recientemente se ha demostrado que se
expresa como
bien en células de otros orígenes (Atwood et al. 2010 ;. Fernández-Ruiz et
al 2007 ).
De nota, la expresión de CB 1 y CB 2 receptores se ha encontrado en muchos tipos
de
Células cancerosas, que no necesariamente se correlaciona con la expresión de
receptores en el tipo de tejido de origen (Fernández-Ruiz et al. 2007 ; Guzman
Et al. 2006 ; Sarfaraz et al. 2008 ).
Los endocannabinoides, junto con sus receptores y las proteínas responsables
Para su síntesis, transporte y degradación, constituyen el endocannabinoide
sistema. Aparte de su actividad neuromoduladora fundamental (Katona y Freund
2008 ), El sistema endocannabinoide ejerce otras funciones reguladoras en el
cuerpo
Como el control del tono cardiovascular, el metabolismo energético, la
inmunidad y
reproducción (Pacher et al. 2006 ; Pertwee 2009 ). Esta actividad miscelánea
Hace que la manipulación farmacológica del sistema endocannabinoide sea
Prometedora estrategia para el manejo de muchas enfermedades
diferentes. Específicamente,
Cannabinoides son bien conocidos para ejercer efectos paliativos en pacientes
con cáncer (Pacher
Et al. 2006 ; Pertwee 2009 ). El uso mejor establecido es la inhibición de
la quimioterapia náuseas y vómitos inducidos (Guzmán 2003 ; Pertwee 2009 ).
Hoy en día, las cápsulas de THC (Marinol) y su análogo sintético nabilona
(Cesamet)
Están aprobados para este fin. Los cannabinoides también inhiben el dolor, y
El extracto normalizado de cannabis (Sativex) ya ha sido aprobado en Canadá y
Está actualmente sujeto de ensayos clínicos de Fase III a gran escala para el
tratamiento de cáncer-
Dolor asociado. Otro posible efecto paliativo de los cannabinoides en la
oncología,
451
Página 4
Apoyado por ensayos clínicos de fase III, incluye estimulación y atenuación del
apetito
De desperdicio. En relación con esto, Marinol actualmente se puede prescribir
para la anorexia
Asociado con la pérdida de peso en pacientes con SIDA.
El potencial terapéutico de los cannabinoides en la oncología puede no estar
Sus acciones paliativas antes mencionadas. Así, numerosos estudios han
proporcionado
Evidencia de que el THC y otros cannabinoides exhiben efectos antitumorales en
variedad de modelos animales de cáncer (Guzman 2003 ; Sarfaraz et
al. 2008 ; Velasco
Et al. 2012 ) Por otra parte, estas observaciones han conducido al desarrollo de
dos
Estudios clínicos para investigar la actividad antitumoral de los cannabinoides en
humanos
pacientes (ver Sec. 7 ). No obstante, algunos estudios han demostrado que, bajo
ciertas
, El tratamiento con cannabinoides puede estimular la proliferación de células
cancerígenas in vitro
(Cudaback et al. 2010 ;. Hart et al 2004 ) e interferir con el supresor de tumores
papel del sistema inmune (McKallip et al. 2002 ; Zhu et al. 2000 ). Asimismo
Son informes contradictorios sobre el papel (supresor de tumores u oncogénico)
de la
sistema endocannabinoide en el cáncer (Malfitano et al. 2011 ) (Cuadro 1 ).
Recuadro 1. Función biológica del sistema endocannabinoide en la generación de
tumores
Y Progresión
Hasta la fecha, poco se sabe sobre el papel biológico de los endocannabinoides
En la fisiopatología del cáncer. Aunque hay algunas excepciones que
Pueden ser específicos del tipo de tumor, tanto los receptores cannabinoides y sus
endoge-
Ligandos están generalmente regulados en el tejido tumoral en comparación con
tejido no tumoral (Caffarel et al. 2006 ; Guzmán 2003 ; Malfitano
Et al. 2011 ; Sánchez et al. 2001 ). Además, diferentes estudios han
Asociados los niveles de expresión de los receptores cannabinoides,
endocannabinoides
Y / o enzimas que metabolizan endocanabinoides con agresividad tumoral
(Malfitano et al. 2011 ; Nomura et al. 2010 ; Thors et al. 2010 ), Lo que sugiere
Que el sistema endocannabinoide puede ser sobre activado en el cáncer y por lo
tanto
pro-carcinogénico (Malfitano et al. 2011 ). En apoyo de esto, en modelos de
ratón
de cáncer, la ablación genética de CB 1 y CB 2 receptores reduce la iluminación
ultravioleta
carcinogénesis inducida por la piel (Zheng et al. 2008 ), y CB 2 receptores exceso
Expresión aumenta la predisposición a la leucemia después de la leucemia virus
infección (Joosten et al. 2002 ).
Por el contrario, y en línea con la evidencia que apoya la hipótesis de que
La activación farmacológica de los receptores cannabinoides reduce el
crecimiento tumoral
(Guzmán 2003 ; Sarfaraz et al. 2008 ), la sobre regulación de endocannabinoid-
Enzimas degradantes ha sido observada en tumores humanos agresivos y
líneas celulares de cáncer (Nomura et al. 2010 ; Thors et al. 2010 ), indicando
que
La señalización endocannabinoide también puede tener un papel supresor de
tumores. En
apoyo de esto, la eliminación de los receptores CB 1 acelera el crecimiento del
tumor intestinal
en un modelo genético de ratón de cáncer de colon (Wang et al. 2008 ),
Aumentado
Los niveles de endocannabinoides disminuyen los niveles precancerosos
inducidos por azoxymethane
(continuado)
452
G. Velasco et al.
Página 5
Recuadro 1 (continuación)
lesiones en el colon de ratón (Izzo et al. 2008 ), Y una reducción en la expresión
De la enzima degradante del endocanabinoide monoacilglicerol lipasa reduce
el crecimiento del tumor en ratones xenoinjertados (Nomura et al. 2010 ).
Otros estudios, incluidos los que analizan la activación de los
Mecanismos de señalización implicados en la regulación de las células inducidas
por cannabinoides
Muerte o proliferación celular por manipulación genética o farmacológica de
El sistema endocannabinoide, son necesarios para aclarar cuáles son los
Determinantes contextuales para que este sistema actúe como guardián o como
Inductor de tumourigénesis o progresión tumoral.
Esta revisión resume estas observaciones y proporciona una visión
Los mecanismos moleculares responsables de la actividad cannabinoide
antitumoral. También
Discute la evidencia experimental que apoya la existencia de mecanismos de
Resistencia a las acciones promotoras de la muerte del THC en ciertos tipos de
cáncer
Las posibles estrategias que se podrían emprender para superar dicha resistencia,
Y los datos preclínicos que apoyan que la administración combinada de
Cannabinoides y otros medicamentos podrían ser útiles en terapias contra el
cáncer.
2
El sistema endocannabinoide y el cáncer
Hasta la fecha, poco se sabe sobre el papel biológico preciso del
endocannabinoide
En la fisiopatología del cáncer. Aunque hay algunas excepciones que pueden
Ser específicos de tipo tumoral, tanto los receptores cannabinoides como sus
ligandos endógenos
Son generalmente reguladas en el tejido tumoral en comparación con el tejido no
tumoral
(Caffarel et al. 2006 ; Guzmán 2003 ; Malfitano et al. 2011 ; Sánchez et
al. 2001 ).
Además, diferentes estudios han asociado los niveles de expresión de
cannabinoides
Receptores, endocannabioides y / o enzimas que metabolizan endocannabinoides
con
la agresividad del tumor (Malfitano et al. 2011 ; Nomura et al. 2010 ; Thors
Et al. 2010 ), Lo que sugiere que el sistema endocannabinoide puede ser sobre-
activado
en el cáncer y por lo tanto pro-carcinogénico (Malfitano et al. 2011 ). En apoyo
de esto, en
modelos de ratón de cáncer, la ablación genética de CB 1 y CB 2 receptores reduce
ultravioleta carcinogénesis de piel inducida por la luz (Zheng et al. 2008 ), Y el
receptor de CB 2
Sobre-expresión aumenta la predisposición a la leucemia después de la leucemia
virus
infección (Joosten et al. 2002 ).
Por el contrario, y en línea con las pruebas que apoyan ese
activación de los receptores de cannabinoides reduce el crecimiento del tumor
(Guzman 2003 ;
Sarfaraz et al. 2008 ), La regulación positiva de las enzimas degradantes de
endocannabinoides
Ha sido observada en tumores humanos agresivos y en líneas celulares de cáncer
(Nomura
Et al. 2010 ; Thors et al. 2010 ), lo que indica que la señalización
endocannabinoide puede también
Tienen un papel supresor de tumores. En apoyo de esto, la supresión de los
receptores CB1
Acelera el crecimiento del tumor intestinal en un modelo genético de ratón de
cáncer de colon
453
Página 6
(Wang et al. 2008 ), el aumento de los niveles de endocannabinoides disminuyen
azoxymethane-
lesiones precancerosas inducidas en el colon de ratón (Izzo et al. 2008 ), Y una
reducción
En la expresión de la enzima de degradación endocannabinoide monoacilglicerol
lipasa reduce el crecimiento del tumor en ratones xenoinjertados (Nomura et
al. 2010 ).
Otros estudios, incluidos los que analizan la activación de la señalización precisa
Mecanismos implicados en la regulación de la muerte celular inducida por
cannabinoides o la
Sobre la manipulación genética o farmacológica de la
Sistema endocannabinoide, por lo que es necesario aclarar cuáles son los
contextos
Determinantes para que este sistema actúe como un guardián o un inductor de
tumourigenesis o
Progresión tumoral
3
Actividad antitumoral preclínica
Desde finales de los años noventa, se ha acumulado una gran cantidad de pruebas
que demuestran que
Varios cannabinoides ejercen efectos antitumorales en una amplia variedad de
Modelos de cáncer, que van desde las líneas celulares de cáncer en el cultivo a la
ingeniería genética
Ratones [revisado por Velasco et al. ( 2012 )]. Múltiples cannabinoides han
demostrado esto
Actividad, incluido el THC; Los endocannabinoides 2-AG y anandamida; Y
difieren
Agonistas de los receptores cannabinoides sintéticos que tienen una afinidad
comparable
CB 1 y CB 2 receptores (por ejemplo, WIN 55212-2 o HU-210), mayor afinidad
por el CB1
(por ejemplo, metanandamida) o mayor afinidad por CB 2 (por ejemplo, JWH-
133). Estos hallazgos
Apoyan firmemente que, aparte del papel desempeñado por el cannabinoide
endógeno
En el cáncer, la estimulación farmacológica de los receptores CB es en la
mayoría de los casos
Antitumoral No obstante, algunos informes han propuesto una estrategia de
efecto de los cannabinoides (Cudaback et al. 2010 ; Hart et al. 2004 ; McKallip et
al. 2002 ;
Zhu et al. 2000 ). Estas observaciones aparentemente contradictorias se discuten
a continuación.
Los cannabinoides alteran la progresión tumoral en diferentes niveles. Su
mayoría preva-
La inducción de la muerte de células cancerosas por apoptosis y la inhibición de
la
Proliferación de células cancerígenas. Al menos una de estas acciones se ha
demostrado en
prácticamente a prueba todos los tipos de células cancerosas (Velasco et
al. 2012 ). Además, in vivo
Los experimentos han demostrado que los cannabinoides afectan la angiogénesis
tumoral y bloquean
Invasión y metástasis.
4
Mecanismos de los efectos antitumorales
4.1
Inducción de la muerte de células cancerosas
Una parte significativa de la investigación realizada hasta ahora sobre el
mecanismo de
La actividad antitumoral de los cannabinoides se ha centrado en las células de
glioma. Estudios iniciales
Mostraron que el THC y otros cannabinoides inducen la muerte apoptótica del
glioma
células a través de CB 1 - 2 y CB estimulación dependiente de la síntesis de novo
de las
pro-apoptótica ceramida esfingolípidos (Blázquez et al. 2004 ; Galve-Roperh
Et al. 2000 ; Gómez del Pulgar et al. 2002 ; Sánchez et al. 2001 ). Estudios
adicionales,
454
G. Velasco et al.
Página 7
Basado en el análisis del perfil de expresión génica de células sensibles y
resistentes a THC
Glioma, dio más información sobre los eventos específicos de señalización aguas
abajo de
ceramida que se activan en las células cancerosas por CB 1 y CB receptor 2 de
cannabinoides
agonistas (Carracedo et al. 2006b ). THC agudamente regula la expresión de la
Regulada por estrés p8 (también llamado NUPR1), un regulador transcripcional
que ha
Han sido implicados en el control de tumourigenesis y la progresión del tumor
(Encinar
Et al. 2001 ), Junto con varios de sus objetivos aguas abajo tales como el
endoplasmático
Factores de transcripción ATF4 y CHOP relacionados con el estrés (ER)
tribbles-homólogas pseudokinase 3 (trib3) (Carracedo et al. 2006b ) (Fig. 1 ).
El estrés de ER, inducido por diferentes agentes anticancerosos, también puede
conducir a través de
diferentes mecanismos (Verfaillie et al. 2010 ) para la estimulación de la
autofagia, una
Proceso celular esencial que participa en una serie de funciones fisiológicas
dentro de la célula (Mizushima et al. 2008 ; Verfaillie et al. 2010 ). Durante la
autofagia,
Orgánulos y otros componentes citoplásmicos se envuelven dentro de doble-
Vesículas de membrana designadas como autofagosomas. La maduración de
estas vesículas
Su fusión con los lisosomas, lo que conduce a su vez a la degradación de la
autofagosoma componentes de enzimas lisosomales (Mizushima et al. 2008 ).
La autofagia es principalmente un mecanismo citoprotector, aunque su activación
puede
también conducir a la muerte celular (Eisenberg-Lerner et al. 2009 ; Mizushima
et al. 2008 ).
De hecho, la estimulación de la vía regulada con p8 estimulada por THC aumenta
la
Inhibición de TRIB3 con una quinasa pro-supervivencia, AKT, que conduce a
La inhibición del objetivo de mamífero del complejo 1 de rapamicina (mTORC1)
y la
posterior estimulación de la muerte celular mediada por la autofagia-(Salazar et
al. 2009 , 2013 )
(Fig. 1 ). CB 1 y / o del receptor de CB 2 cannabinoide agonistas inducen la
autofagia en
Diferentes tipos de células cancerosas en cultivo, e inhibición farmacológica o
genética
De la autofagia evita la acción antitumoral de estos agentes en diferentes
animales
modelos de cáncer (Fig. 1 ), lo que demuestra que la autofagia es importante para
el
actividad antineoplásica de los agonistas de los receptores de cannabinoides
(Salazar et al. 2009 ; Vara
Et al. 2011 ). Por otra parte, el bloqueo de autofagia previene el agonista de los
receptores de cannabinoides-
Inducida por la apoptosis y la muerte celular, mientras que el bloqueo de la
apoptosis previene la muerte celular
pero no inducida por estos compuestos autofagia (Salazar et al. 2009 ; Vara
Et al. 2011 ). Esto indica que la autofagia está arriba de la apoptosis en el proceso
de receptor cannabinoide la muerte celular inducida por el agonista (Fig. 1 ).
La participación directa de la vía de autofagia mediada por p8 en la vía
antitumoral
acción de THC y otra CB 1 y / o CB 2 agonistas de los receptores ha sido
claramente
Demostrado en células de glioma y células cancerosas pancreáticas y hepáticas
(Carracedo
Et al. 2006a ; Carracedo et al. 2006b ; Salazar et al. 2009 ; Vara et al. 2011 ). Al
menos
Parte de esta ruta de señalización también se ha encontrado para ser regulado
hasta después de cannabinoid
Tratamiento en otros tipos de células cancerosas. Esto sugiere que, con algunas
variaciones,
esto podría ser un mecanismo general por el que la activación de CB 1 y
CB 2 receptores
Promueve la muerte de las células cancerosas.
Sin embargo, otros mecanismos pueden cooperar con los receptores mediados
por p8
vía de la autofagia para evocar la muerte de las células cancerosas (Fig. 1 ). Por
ejemplo, en hepatocel-
células de carcinoma lular, el THC y el agonista del receptor CB2 JWH-015 pueden
desencadenar una
ER estrés dependiente de la activación de AMPK que coopera con el TRIB3
mediada
455
Página 8
Apoptosis
Ceramidas
TRIB3
MTORC1
AKT
ψm
Cannabinoides
Cáncer
Muerte celular
EIF2α
PAG
SPT
AMPK
PICAR
P8
ATF-4
CaCMKKβ
Estrés
Autofagia
(Otros objetivos de AKT?)
MALO
P27
P21
Detención del ciclo celular
PRb
CDKs
MTORC2
CB CB
1, 2
Higo. 1 La apoptosis inducida por cannabinoides se basa en la estimulación del

estrés y la autofagia de la ER.
Esquema que muestra el mecanismo de la apoptosis inducida por cannabinoides
en glioma, páncreas y
Células de carcinoma hepatocelular. Esta ruta de señalización puede constituir el
principal mecanismo de
La muerte celular inducida por cannabinoides, con algunas variaciones inherentes
a los diferentes tipos de células cancerosas.
Agonistas cannabinoides se unen a y / o receptores CB (CBR) para estimular
CB1 2
la síntesis de novo de
ceramida (Carracedo et al. , 2006b ; Galve-Roperh et al. 2000 ; Gómez del Pulgar
et al. 2002 ; Herrera
Et al. 2006 ; Salazar et al. 2009 ), Que desencadena la inducción de un retículo
endoplásmico
(ER) relacionada con el estrés que promueve la regulación positiva del factor de
transcripción p8 y
Varios de sus objetivos aguas abajo, incluyendo la pseudokinase Tribbles 3
(TRIB3) (Carracedo
Et al. 2006b ; Salazar et al. 2009 ). Esto favorece la interacción de trib3 con AKT
(Du et al. 2003 ;
Salazar et al. 2009 ), Conduciendo así a la inhibición del objetivo AKT-mecánico
de la rapamicina C1
(mTORC1) del eje y la posterior inducción de la autofagia (Salazar et
al. 2009 ). Autofagia es
Aguas arriba de la apoptosis mitocondrial intrínseca en el proceso de muerte
celular inducida por cannabinoides.
La importancia de esta vía se resalta por la capacidad de diferentes
Manipulaciones para bloquear la muerte celular inducida por cannabinoides. En
las células de carcinoma hepatocelular, la
Evocación de cannabinoides y ER dependiente del estrés la activación de calcio /
dependiente de calmodulina proteína
Quinasa 2-beta (CaCMKKβ) y AMPK-proteína quinasa activada (AMPK), junto
con
la vía P8-trib3, a la autofagia y apoptosis (Vara et al. 2011 ). El cannabinoide-
evocado
Inhibición de AKT podría promover la detención del ciclo en el cáncer de mama
y las células de melanoma, así como
Apoptosis, a través de mecanismos adicionales, incluyendo la fosforilación
disminuida de la
Proteína pro-apoptótica BCL2-agonista asociado de la muerte celular (BAD)
(Ellert-Miklaszewska
Et al. 2005 ) y la activación de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) proteínas
inhibidoras p21 y
p27 (Blázquez et al. 2006 ; Caffarel et al. 2008 ; Caffarel et al. 2006 ). Esto daría
lugar a la
Posterior disminución de la proteína de retinoblastoma (pRB), que por lo tanto
sería
Activo para detener el ciclo celular. ATF4 que activan el factor de transcripción
4, CHOP C / proteína de homología EBP,
EIF2α traducción eucariótica factor de iniciación 2 alfa, SPT serina
palmitoiltransferasa
456
G. Velasco et al.
Página 9
Inhibición del eje AKT-mTORC1 en la estimulación de la autofagia mediada
la muerte celular (Vara et al. 2011 ). En el melanoma (Blázquez et al. 2006 ),
Carcinoma de mama
(Caffarel et al. 2006 , 2012 ) Y el carcinoma de próstata (Sarfaraz et
al. 2006 células),
Los agonistas de los receptores cannabinoides pueden inducir el paro del ciclo
celular de acuerdo con la apoptosis
(Blázquez et al. 2006 ; Caffarel et al. 2006 ;. Sarfaraz et al 2006 ). Cabe destacar
la
acción antiproliferativa al menos en el melanoma (Blázquez et al. 2006 ) y de
mama
cáncer (Caffarel et al. 2006 ) Las células-2 agonistas de los receptores de THC y CB
también se basa en
Inhibición del AKT.
Del mismo modo, el efecto de los agonistas de los receptores cannabinoides en
los receptores hormonodependientes
Los tumores pueden confiar, al menos en parte, en su capacidad de interferir con
la activación
los receptores del factor de crecimiento (Guzmán 2003 ; Sarfaraz et
al. 2008 ). Esta interferencia
y otros mecanismos (Guindon y Hohmann 2011 ) pueden participar en el
Acción citotóxica de los agonistas de los receptores cannabinoides en diferentes
tipos de cáncer
Junto con la vía de muerte celular mediada por autofagia. Sin embargo,
Se requiere investigación para aclarar esta cuestión (cuadro 2 ).
Recuadro 2. Mecanismo de la muerte de células cancerosas mediada por
receptores cannabinoides: algunos
Preguntas importantes sin respuesta
La investigación llevada a cabo durante los últimos años ha arrojado luz sobre la
Los mecanismos de señalización lular subyacente cannabinoide acción contra el
cáncer. Cómo-
Una serie de observaciones importantes -en particular, relacionadas con la
Papel desempeñado por los receptores cannabinoides en el desencadenamiento de
estas señales,
Quedan por aclararse. Para algunos ejemplos de estos, vea abajo.
- A diferencia de la acción promotora de la muerte de los cannabinoides en las
células cancerosas, la
La viabilidad de las células normales (no transformadas) no se ve afectada o
Condiciones-incluso mejoradas por el desafío de los cannabinoides (Carracedo
Et al. 2006b ; Galve-Roperh et al. 2000 , 2008 ; Gomez del Pulgar
Et al. 2002 ; Salazar et al. 2009 ). Por ejemplo, el tratamiento con THC de
astrocitos
(un tipo de célula que expresa CB 1 receptores funcionales) no da lugar a la
La activación del estrés ER, la regulación positiva de la vía p8, la inhibición
Del eje AKT-mTORC1 o la estimulación de autofagia y apoptosis,
Incluso cuando las concentraciones de THC son más altas que las que promueven
el glioma
se utilizan muerte celular (Carracedo et al. 2006b ; Salazar et al. 2009 ). Similar
Los resultados se obtuvieron con fibroblastos embrionarios primarios (Carracedo
Et al. 2006b ; Salazar et al. 2009 ) Y otros tipos de productos no transformados
Células que expresan receptores cannabinoides funcionales en comparación con
sus homólogos transformados (Blázquez et al. 2006 ; Caffarel et al. 2006 ;
Casanova et al. 2003 ; Chan et al. 1996 ). Así, la estimulación del cannabinoide
Receptores parece estar acoplado a la activación de diferentes señales
En células transformadas y no transformadas. El preciso
(continuado)
457
Página 10
Recuadro 2 (continuación)
Razones moleculares de este comportamiento diferente siguen siendo
Cuestión en el campo canabinoide.
- Otra observación intrigante es que, en algunos tipos de células cancerosas,
como células de glioma, el bloqueo farmacológico de cualquiera de
CB 1 o 2 receptores CB
Previene la muerte celular inducida por cannabinoides con una eficacia similar
(Galve-
Roperh et al. 2000 ; Lorente et al. 2011 ), mientras que en otros tipos de cáncer
células, por ejemplo, de páncreas (Carracedo et al. 2006a ), de mama (Caffarel
Et al. 2006 ) O hepática (Vara et al. 2011 ) Células de carcinoma, antagonistas de
CB 2, pero no de los receptores CB1 inhibir las acciones antitumorales
cannabinoides. Por qué
Los cannabinoides producen sus acciones antitumorales a través de uno u otro
Estos tipos de receptores dependiendo del tipo de célula cancerosa estudiada
estar establesido.
- Algunos agonistas de los receptores cannabinoides promueven la muerte de las
células cancerosas más
Eficientemente que otros agonistas que exhiben una afinidad similar o incluso
mayor
para CB1 o CB2 receptores. Por ejemplo, el THC promueve la muerte celular
un CB 1 y / o CB 2 de manera dependiente a concentraciones más bajas que la
Agonista del receptor cannabinoide sintético WIN-55,212-2, aunque este último
agente muestra una afinidad significativamente mayor para CB 1 y
CB 2 receptores en
ensayos de unión (Pertwee et al. 2010 ).
Otros trabajos dirigidos a investigar, por ejemplo, homo o receptor de CB
Hetero-oligomerización en respuesta a diferentes agonistas cannabinoides, su
Asociación con dominios específicos en la membrana plasmática tales como
balsas lipídicas,
Cambios en la localización subcelular de los receptores CB y la
Para otras proteínas G y otras proteínas de señalización será esencial para
Responder a estas preguntas y definir con precisión el papel desempeñado por
cada
Noid como una plataforma de señalización contra el cáncer.
Cabe destacar que el cannabidiol (CBD), un fito- canabinoide con baja afinidad
por el cannabi-
receptores noid (Pertwee 2009 ), Y otros cannabinoides derivados de la
marihuana (Ligresti
Et al. 2006 ) También se han propuesto para promover la muerte apoptótica de
las células cancerosas
actuando independientemente de CB 1 y CB 2 receptores. El mecanismo por el
cual CBD
Este efecto no se ha aclarado por completo hasta ahora, pero parece
Al menos en parte- su capacidad para mejorar la producción de especies reactivas
de oxígeno en
células cancerosas (Massi et al. 2008 ;. Shrivastava et al 2011 ). También se ha
propuesto
Que CBD puede activar los receptores TRPV2 para promover la muerte de
células de glioma (Nabissi
Et al. 2012 ).
458
G. Velasco et al.
Página 11
4,2
Inhibición de la Angiogénesis, Invasión y Metástasis
En las células cancerosas, los agonistas de los receptores cannabinoides bloquean
la activación de
Factor de crecimiento endotelial (VEGF), un inductor de la
angiogénesis. Especifi-
Diferentes elementos de esta cascada, como el ligando principal (VEGF) y el
Formas activas de sus principales receptores (VEGFR1 y VEGFR2), están
reguladas hacia abajo
tras el tratamiento de carcinomas de piel (Casanova et al. 2003 ), gliomas
(Blazquez
Et al. 2003 ; Blazquez et al. 2004 ) Y los carcinomas de tiroides (Portella et
al. 2003 )
con CB 1 y / o CB 2 agonistas de los receptores. En las células endoteliales
vasculares, CB 1 y / o
CB 2 activación del receptor inhibe la proliferación y la migración e induce la
apoptosis
(Blázquez et al. 2003 ; Pisanti et al. 2007 ). Estos y tal vez otros cannabinoides-
Las acciones evocadas dan como resultado una vasculatura tumoral
normalizada; Es decir, menor y / o
Menos embarcaciones más diferenciadas y menos permeables.
Del mismo modo, CB 1 y / o CB 2 agonistas del receptor reducen la formación de
distante
Tumorales en modelos animales tanto de metástasis inducida como espontánea y
inhibir la adhesión, la migración y la invasión de glioma (Blázquez et al. 2008 ),
pecho
(Grimaldi et al. 2006 ; Qamri et al. 2009 ), Pulmón (Preet et al. 2008 ; Ramer y
Hinz
2008 ), y de cuello uterino (Ramer y Hinz 2008 ) Células cancerosas en
cultivo. Estos efectos
Dependen, al menos en parte, de la modulación de las proteasas extracelulares
[tales como la matriz
metaloproteinasa 2 (MMP-2)] (Blázquez et al. 2008 ) Y sus inhibidores [tales
como
inhibidor tisular de las metaloproteinasas de matriz 1 (TIMP1)] (Ramer y
Hinz 2008 ).
Es de destacar que la inhibición farmacológica de la biosíntesis de ceramida
antitumoral y efecto anti-angiogénico de CB 1 y / o CB 2 agonistas de los
receptores en
Glioma xenoinjertos y disminuye la producción de VEGF por células de glioma
in vitro y
in vivo (Blázquez et al. 2004 ). Asimismo, la inhibición de la expresión de MMP-
2y
La invasión celular de glioma se evita bloqueando la biosíntesis de ceramida y
derribando expresión P8 (Blázquez et al. 2008 ). Aunque se
Aún es necesario definir con precisión los mecanismos moleculares responsables
de estos
Acciones de los cannabinoides, estas observaciones indican que la ceramida / p8-
regulado
Tiene un papel general en la actividad antitumoral de los cannabinoides
CB 1 y CB 2 receptores.
Vale la pena señalar que el CBD, al actuar de manera independiente de
CB 1 y 2 los receptores CB,
Produce un notable efecto antitumoral, incluyendo la reducción de la invasividad
y
Metástasis en diferentes modelos animales de cáncer. Este efecto de la CDB
parece
Se basan-al menos en parte- en la regulación negativa de la transcripción hélice-
bucle-hélice
inhibidor del factor de unión al ADN-1 (ID-1) (McAllister et al. 2011 ;
Soroceanu
Et al. 2012 ).
4.3
Regulación de la Inmunidad Antitumoral
Cabe destacar que la estimulación de los receptores cannabinoides puede dar
lugar a cambios
Procesos que regulan la inmunidad antitumoral. Así, por ejemplo, el tratamiento
de ratones
con el THC desencadena un cambio (de Th1 a Th2) en el perfil de citocinas (Lu
et al. 2006 ;
McKallip et al. 2005 ; Newton et al. 2009 ; Steffens et al. 2005 ) e induce
459
Página 12
la movilización de las células supresoras de origen mieloide (Hegde et al. 2010 ),
Dos eventos
Que juegan un papel crítico en la supresión de la inmunidad antitumoral. En
acuerdo
con esta noción, la estimulación de los receptores CB 2 se ha propuesto en
algunos informes a
Potencian la tumorigénesis al interferir con la vigilancia de los tumores por
sistema (McKallip et al. 2005 ; Zhu et al. 2000 ). Por el contrario, los
cannabinoides también
Mejorar la vigilancia de tumores mediada por el sistema inmune en algunos
contextos:
la acción antitumoral de WIN 55212-2 (un agonista de CB1 / CB2 -mixta) o JWH-133
(un agonista selectivo de CB2) fue más pronunciado en los xenoinjertos de
melanoma generados
En ratones inmunocompetentes comparados con los de ratones inmunodeficientes
(Blázquez et al. 2006 ). Esto también indica que, al menos en este modelo, la
estimulación
de receptores CB 2 inhibe principalmente el crecimiento del tumor a través de
efectos directos sobre el cáncer
En lugar de necesariamente interferir con la función antitumoral normal.
Ción del sistema inmune. En línea con esta idea, el tratamiento durante 2 años de
inmuno-
Ratas competentes con dosis muy altas (50 mg / kg / día 5 veces a la semana) de
THC
Disminuyeron la incidencia de varios tipos de tumores y mejoraron la
la supervivencia de estos animales (Chan et al. 1996 ). Estas observaciones
pueden estar relacionadas
a la capacidad de THC para reducir la inflamación (Burstein y Zurier 2009 ; Liu
Et al. 2010 ), Un efecto que puede prevenir ciertos tipos de cáncer (Liu et
al.). por
El uso de cannabinoides para tener éxito clínicamente, los efectos antitumorales
tendrán que sobre-
llegado inmunosupresores (efectos potencialmente tumorales
promotoras). BORNE adicional
IES deben aclarar esta cuestión. Por ejemplo, podría ser concebible para estudiar
el efecto
de la administración de cannabinoides en la generación y la progresión de los
tumores
exhibiendo diferente sensibilidad a CB 1 y / o CB 2 agonistas de los receptores y
generado
en ratones inmunocompetentes o inmunodeficientes en los que la expresión de
CB 1
y / o CB 2 receptores en las células del sistema inmunológico ha sido
genéticamente
Manipulado
5
Mecanismos de resistencia
Numerosos estudios han contribuido a nuestro reconocimiento de la
heterogeneidad de
cáncer, por el que cada subtipo de cáncer, e incluso cada tumor individual,
exposiciones
una serie de características moleculares que determina su comportamiento y, en
particular,
su capacidad de respuesta a diferentes medicamentos contra el cáncer. De
acuerdo con esta línea de
razonamiento, son los resultados obtenidos en una investigación reciente sobre
las características moleculares
asociado con la resistencia de una colección de líneas celulares de glioma
humano y
cultivos primarios de cannabinoides acción antitumoral (Lorente et
al. 2011 ). Esta
estudio demostró que, aunque el efecto apoptótico de THC en células de glioma
se basó en
la estimulación de los receptores de cannabinoides y la activación de la p8-
mediadas
vía de la autofagia, las diferencias en la sensibilidad a la muerte celular inducida
por THC
correlacionado con la mayor expresión de un conjunto particular de los genes en
el
células de glioma de THC resistente en lugar de con la presencia de diferente
expresión
niveles de CB 1 o CB 2 receptores (Lorente et al. 2011 ). De interés, sobre
regulación de
uno de estos genes, midquina (MDK), que codifica un factor de crecimiento que
ha sido
previamente asociado con el aumento de la malignidad y la resistencia a
anticanceroso
460
G. Velasco et al.
Página 13
terapias en varios tipos de tumores (kadomatsu 2005 ;. Mirkin et al 2005 ),
se correlaciona con una menor supervivencia global de los pacientes con
glioblastoma (Lorente
Et al. 2011 ). Por otra parte, MDK juega un papel directo en la resistencia a la
acción THC
a través de la estimulación de la quinasa de linfoma anaplásico [ALK (Palmer et
al. 2009 )].
Por lo tanto, la estimulación de ALK por MDK inhibe la autophagy- THC-
evocado
mediada por vía de la muerte celular. Las investigaciones futuras deberían aclarar
si esta nismo
meca- también podría ser responsable de la resistencia de las células cancerosas
que expresan altos
niveles de MDK a otras terapias. Curiosamente, el silenciamiento in vivo de
MDK o
la inhibición farmacológica de ALK en un modelo de xenoinjerto de ratón
suprime el
resistencia al tratamiento de tumores establecidos THC deriva de cannabinoides y
células de glioma resistentes (Lorente et al. 2011 ).
En conjunto, estos resultados apoyan la idea de que la estimulación de la MDK-
ALK eje promueve la resistencia a la acción antitumoral de THC en los gliomas
y podría ayudar
para establecer la base para el uso clínico potencial de THC en combinación con
inhibidores
de este eje (Fig. 2 ). En consonancia con esta idea, los inhibidores de ALK han
comenzado a utilizarse en
ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas
y otros tipos de
(tumores de Bono y Ashworth 2010 ;Grande et al. 2011 ). Las investigaciones
futuras deben
aclarar si este mecanismo de resistencia a la acción de cannabinoides opera en
otro
tipos de tumores. De acuerdo con esta posibilidad, MDK silenciamiento mejoró
la
sensibilidad de las células de cáncer de páncreas cannabinoides resistente a la
celda THC inducida
la muerte (Lorente et al. 2011 ).
La liberación por las células de cáncer de otros factores de crecimiento también
se ha implicado en
el mecanismo de resistencia a los cannabinoides acción antitumoral. Así, el
aumento
la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico ligado a heparina
(EGFR) ligando
anfirregulina se asocia con una mayor resistencia a la acción antitumoral en THC
xenoinjertos de glioma (Lorente et al. 2009 ). Es de destacar, que ilustra que la
dosis de
cannabinoides podrían ser cruciales para su efecto terapéutico óptimo, baja
(Sub-micromolar) concentraciones de THC u otros agonistas cannabinoides
sintéticos
mejorar la proliferación de varias líneas celulares de cáncer in vitro. Este efecto
se basa en
la activación de la proteasa ADAM17, el derramamiento de EGFR unido a
heparina
ligandos, incluyendo anfirregulina, y la posterior estimulación de la extracelular
vías quinasa (ERK) de señal-regulado y AKT (Hart et al. 2004 ). En línea con
esta idea, un informe reciente ha demostrado que el tratamiento con el
cannabinoide sintético,
CP-55940, aumenta la proliferación de células de glioma murino ingeniería
genética para expresar
CB 1 o CB 2 receptores sólo cuando estos receptores se acoplaron a la activación
de AKT
(Cudaback et al. 2010 ). Aunque un efecto pro-carcinogénico no se ha observado
sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumores generado con células de glioma
y se trató con
dosis bajas de THC (Torres et al. 2011 ), Aumento de la expresión de
anfirregulina
promueve la resistencia a la acción antitumoral THC a través de un mecanismo
que implica
la estimulación de EGFR-dependiente de ERK y la posterior inhibición de la p8 y
TRB3 expresión. Del mismo modo, la inhibición farmacológica de EGFR, ERK
(Lorente
Et al. 2009 ) O AKT (observaciones no publicadas de autor) mejora la muerte-
celular
promover la acción de THC en cultivos de células de glioma. Estas
observaciones sugieren
que la orientación de EGFR y la Akt y ERK vías podría mejorar el antitumoral
efecto de los cannabinoides.
Los endocannabinoides y cáncer
461
Página 14
Higo. 2 Posibles estrategias encaminadas a la optimización de las terapias
basadas en cannabinoides contra los gliomas.
El glioblastoma es altamente resistente a las terapias contra el cáncer actuales
(Lonardi et al. 2005 ; Nieder
Et al. 2006 ;Purow y Schiff 2009 ). Específicamente, la resistencia de las células
de glioma a cannabinoides y
la muerte celular inducida se basa, al menos en parte, de la expresión mejorada
de la midkina factor de crecimiento
(MDK) y la posterior activación de la tirosina quinasa del receptor de linfoma
anaplásico (ALK)
(Lorente et al. 2011 ). Del mismo modo, una mayor expresión de la EGFR-
ligando unido a heparina
anfirregulina (AREG) puede promover la resistencia a la acción antitumoral de
THC a través de la estimulación de ERK
(Lorente et al. 2009 ). Combinación de THC con inhibidores farmacológicos de
ALK (o genética
inhibición de la MDK) mejora la acción de cannabinoides en tumores resistentes,
que proporciona la lógica
para el diseño de terapias dirigidas capaces de aumentar la actividad
antineoplásica de cannabinoides
(Lorente et al. 2011 ). Las combinaciones de los cannabinoides con fármacos
quimioterapéuticos clásicos tales
como agente alquilante temozolomida [TMZ; el agente de punto de referencia
para la gestión de
glioblastoma (Lonardi et al. 2005 ;. Stupp et al 2005 )] han demostrado que
producen una fuerte
acción contra el cáncer en modelos animales (Torres et al. 2011 ). La
combinación de los cannabinoides y TMZ es por tanto
una posibilidad muy atractiva para los estudios clínicos dirigidos a investigar los
cannabinoides antitumoral
efectos en glioblastoma. Otras estrategias potencialmente interesantes para
mejorar contra el cáncer cannabinoide
acción (que aún requieren apoyo experimental adicional de los datos obtenidos
mediante preclínica
modelos) podría ser la combinación de los cannabinoides con el estrés del
retículo endoplasmático (ER) y / o
inductores autofagia o con inhibidores de la meta AKT-mecanicista de la
rapamicina C1
(MTORC1) eje. anticuerpos abs, EGFR receptor de factor de crecimiento
epidérmico, extracelular ERK
quinasa regulada por señales, factores de crecimiento GF, RTK tirosina quinasa
del receptor, tribbles trib3
3, VEGF factor de crecimiento endotelial vascular
462
G. Velasco et al.
Página 15
6
Cannabinoide-base Combinacional Terapias
El uso de terapias contra el cáncer combinacionales tiene una serie de teórico
ventajas con respecto a las estrategias de un solo agente basan ya que permiten la
simultánea
la orientación del crecimiento tumoral, la progresión y la difusión a diferentes
niveles. En línea
con esta idea, observaciones recientes sugieren que la administración combinada
de
cannabinoides con otros medicamentos contra el cáncer actúa sinérgicamente
para reducir tumor
crecimiento. Por ejemplo, la administración de THC y temozolomida (el punto de
referencia
agente para la gestión de glioblastoma) ejerce una acción antitumoral fuerte en
xenoinjertos de glioma, un efecto que también es evidente en los tumores
resistentes a la temozolomida
(Torres et al. 2011 ). De interés, no se observó toxicidad en ratones tratados con
combinaciones de THC y temozolomida (Torres et al. 2011 ). Como la mayoría
de los pacientes con
glioblastoma someterse a un tratamiento temozolomida, estos hallazgos indican
que la
administración combinada de temozolomida y cannabinoides podría ser
terapéuticamente
camente explotado para el manejo de glioblastoma (Fig. 2 ).
Del mismo modo, otro estudio ha demostrado recientemente que la
administración combinada de
gemcitabina (el agente de referencia para el tratamiento de cáncer de páncreas) y
diferentes agonistas cannabinoides reducen sinérgicamente la viabilidad de
páncreas
células cancerosas (Donadelli et al. 2011 ). Otros informes indican que la
anandamida y
HU-210 también puede potenciar la actividad anticancerígena de paclitaxel
(Miyato et al. 2009 )
y 5-fluorouracilo (Gustafsson et al. 2009 ), Respectivamente.
Otro enfoque ha sido la combinación de THC con el CDB, un phytocan-
cannabinoides que reduce, aunque en menor medida que el THC-el crecimiento
de
varios tipos de xenoinjertos de tumores a través de un mecanismo todavía mal
definida
(Massi et al. 2006 ;McAllister et al. 2007 ; Shrivastava et al. 2011 ). Conjunto
administración de THC y CBD mejora la actividad anticancerígena de THC y
reduce la dosis de THC necesaria para inducir su actividad inhibidora del
crecimiento del tumor
(Marcu et al. 2010 ; Torres et al. 2011 ). Por otra parte, la combinación de THC y
CDB junto con la temozolomida produce una reducción notable en el crecimiento
de
xenoinjertos de glioma, incluso cuando se utilizan dosis bajas de THC (Torres et
al. 2011 ). De
Tenga en cuenta, CDB también se ha demostrado para aliviar algunos de los
efectos no deseados de THC
administración, tales como convulsiones, descoordinación y eventos psicóticos, y
por lo tanto, mejora la tolerabilidad de los medicamentos basados en el cannabis
(Pertwee 2009 ).
Como se mencionó anteriormente, C. sativa produce ~ 108 cannabinoides
diferentes y, aparte
de CDB, algunos de los otros cannabinoides presentes en la marihuana podría
atenuar la
efectos secundarios psicoactivos del THC o incluso producen otros beneficios
terapéuticos
(Pertwee 2009 ). Por lo tanto, creemos que los estudios clínicos dirigidos a
analizar la eficacia
de los cannabinoides como agentes antitumorales debe basarse en el uso tanto de
pura
sustancias, como el THC y CBD, y de extractos de cannabis que contienen
controlados
cantidades de THC, CBD y otros cannabinoides.
463
Página 16
7
Efectos antitumorales clínicos de los cannabinoides
Aunque la aprobación clínica de los cannabinoides se limita en gran parte a
paliativos
utiliza en diversas enfermedades, a raíz de los datos preclínicos prometedores, el
antitumoral
efectos de los cannabinoides están empezando a ser evaluado clínicamente. En un
piloto de la Fase I
estudio clínico, los pacientes con nueve activamente crecimiento glioblastoma
recurrente que tenía
terapia estándar que ha fallado previamente se sometió a la administración de
THC intracraneal
(Guzmán et al. 2006 ). En estas condiciones, la entrega de cannabinoides era
seguro y
podría lograrse sin efectos no deseados significativos. Además, aunque no
estadísticamente importantes conclusiones pueden extraerse de una cohorte de
nueve pacientes,
los resultados obtenidos en este estudio sugieren que algunos pacientes
respondieron al menos
parcialmente al tratamiento THC en términos de disminución de la tasa de
crecimiento del tumor, tal como se evaluó
mediante formación de imágenes por resonancia magnética (Guzman et
al. 2006 ). Es importante destacar que los análisis de
Las muestras obtenidas de dos pacientes en este estudio antes y después de la
administración de THC
ción indican que el mecanismo molecular de la acción antitumoral de
cannabinoides
delineado en los apartados anteriores, a saber, P8 y trib3 regulación (Carracedo
Et al. 2006b ; Salazar et al. 2009 ), La inhibición mTORC1 (Salazar et al. 2009 ),
estimulación
mento de la autofagia y apoptosis (Carracedo et al. 2006b ;Guzman et al. 2006 ;
Salazar et al. 2009 ), La inhibición de la proliferación celular (Guzman et
al. 2006 ), Disminución
La señalización de VEGF (Blázquez et al. 2004 ) Y MMP-2 baja regulación
(Blazquez
Et al. 2008 ), también opera en pacientes con cáncer. Estos resultados fueron
alentadores y
reforzado el interés en el uso potencial de los cannabinoides en terapias contra el
cáncer.
Sin embargo, también pusieron de relieve la necesidad de seguir investigando el
objetivo de optimizar
el uso de cannabinoides en términos de selección de los pacientes, la
combinación con otro
agentes contra el cáncer y el uso de otras vías de administración (véase el
recuadro 3 ). dos clínica
ensayos que se están realizando actualmente podrían arrojar alguna luz sobre
estas cuestiones. Uno de estos
estudios es una fase I / II de prueba pretende evaluar el efecto combinado de
Sativex
(Un extracto de cannabis oro-mucosa cuyos componentes activos principales son
el THC y
CDB en un ca. relación de 1) y temozolomida en pacientes con glioblastoma
recurrente: 1
multiforme ( http://clinicaltrials.gov/show/NCT01812603 ). El otro es un estudio
Fase II de prueba tiene como objetivo evaluar el efecto de la CDB como
tratamiento único en pacientes
con
sólido
tumores
( http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02255292?
plazo = + sólida del tumor y rango CDB + 1 = ). Con suerte, más ensayos
clínicos en agregarán
un futuro próximo para permitir que estos dos para determinar si los
cannabinoides pueden ser
utilizado, aparte de por sus efectos paliativos, para el tratamiento de pacientes
con cáncer
Recuadro 3. Diferentes enfoques farmacológicos para dirigir células del cáncer
con cannabinoides
agonistas cannabinoides o potenciadores de tono endocannabinoide?
Administración de los endocannabinoides o inhibidores de endocannabinoid-
enzimas de degradación se ha demostrado que reduce el crecimiento de
diferentes tipos
de xenoinjertos tumorales (Bifulco et al. 2001 ;. Ligresti et al 2003 ) y por lo
tanto,
(continuado)
464
G. Velasco et al.
Página 17
Cuadro 3 (continuación)
podría ser una estrategia razonable para la orientación receptores cannabinoides
para anti-
fines de cáncer. Sin embargo, como se analiza en el recuadro 1 , El papel de la
sistema endocannabinoide, incluyendo el endocannabinoide-degradantes
enzimas, en el control de la generación y progresión del tumor no es así
entendido. Dado que la mejora del tono endocannabinoide sólo tiene anti-leve
efectos de tumor en ratones y ya que ningún inhibidor de la degradación de los
endocannabinoides
ha sido aprobado aún para su uso en seres humanos, los estudios clínicos
dirigidos a
el análisis de la eficacia de los cannabinoides como agentes anti-tumorales debe
ser
basado en el uso de agonistas de origen vegetal o sintéticos de cannabinoide
receptores en lugar de en los endocannabinoides o inhibidores de
endocannabinoide
degradación.
extractos de cannabis o cannabinoides puros?
Las propiedades terapéuticas conocidas largo de Cannabis sativa-incluidos
mejora de los síntomas asociados con el cáncer y su quimioterapia
han conducido a la autorización del uso médico de esta planta y sus extractos en
varios países. Como se ha mencionado en el texto, C. sativa produce ~ 108
diferente
cannabinoides, incluyendo THC y CBD. Algunos de los otros cannabinoides
presente en la marihuana puede contribuir a la atenuación de THC
efectos del lado de psicoactiva o incluso para la producción de otros terapéutico
beneficios (Pertwee 2009 ). Sin embargo, los fármacos puros son más propensos
a
normalización de cócteles moleculares complejas. Por lo tanto, sería ideal
que los estudios dirigidos a la investigación de las acciones contra el cáncer de
los cannabinoides en
los pacientes se realizaron comparativamente con las dos sustancias puras y
canna-
extractos bis que contienen cantidades controladas de THC, CBD y otra
Cannabinoides.
¿Qué vías de administración de cannabinoides?
La ruta más ampliamente utilizado de administración de recreo y auto-
la marihuana medicinal es el tabaquismo. A pesar de que el THC y otros
phytocan-
nabinoids se absorben rápidamente por inhalación, el tabaquismo es un poco
atractivo
opción clínica. trabajos preclínicos en modelos animales ha administrado
normalmente
cannabinoides intra-peri tumourally. Asimismo, en el único ensayo clínico en
que un cannabinoide se ha ensayado como un agente anti-tumor, THC era
administrada localmente (entrega intracraneal a los pacientes de glioblastoma)
(Guzmán et al. 2006 ). Sin embargo, esta vía de administración tiene muchas
limitaciones obvias. Actualmente medicamentos basados en el cannabis están
disponibles
se administra en forma de cápsulas o usando un pulverizador de oro-mucosa
(Pertwee 2009 ).
Los modelos preclínicos con animales han producido datos que indican que
sistémica (oral
o intraperitoneal) la administración de cannabinoides reduce eficazmente el
tumor
crecimiento (observaciones no publicadas de autor), por lo que parece razonable
que
futuros estudios clínicos dirigidos a la determinación de la eficacia de los
cannabinoides
como agentes anti-tumorales utilizan rutas orales o oro-mucosas de
administración.
465
Página 18
8
Conclusiones y direcciones futuras
Se cree ampliamente que las estrategias encaminadas a reducir la mortalidad por
cáncer debe
consistir en terapias dirigidas capaces de proporcionar la más eficaz y selectiva
tratamiento para cada tumor y el paciente individual. Por lo tanto, el principal
foco de
el desarrollo de medicamentos contra el cáncer, se ha desplazado
progresivamente de no específica
quimioterapias a inhibidores dirigidos molecularmente. Sin embargo, a pesar de
la enorme
cantidad de literatura preclínica sobre cómo estos compuestos diseñados
racionalmente
el trabajo, el avance de la mayoría de estos medicamentos en la clínica es todavía
limitada.
¿Cómo medicinas a base de cannabinoides encajan en este escenario en
curso? Nos deja
considerar gliomas, el tipo de cáncer en el que el cannabinoide detallada
investigación se ha realizado hasta la fecha. Como se discutió anteriormente, el
acoplamiento de una molecu-
objetivo lar (receptores CB) por una familia de fármacos selectivos (THC y otros
cannabinoides
agonistas) inhibe el crecimiento tumoral en modelos animales a través de una
bien establecida
mecanismo de acción que parece funcionar en los pacientes. Por otra parte, los
cannabinoides
potenciar la eficacia antitumoral de los inhibidores de temozolomida y ALK en
ratones
albergar los gliomas. Estos resultados proporcionan una prueba de concepto de
que "can- preclínica
sensibilizadores de cannabinoides "podrían mejorar la eficacia clínica de
citotóxica clásica
fármacos de glioblastoma (Fig. 2 ) y quizás otros tumores altamente malignos
tales
como el cáncer de páncreas, melanoma y carcinoma hepatocelular. Sin embargo,
además
Se necesita más investigación para definir la diafonía molecular exacta entre los
cannabinoides
y fármacos quimioterapéuticos y para optimizar la farmacología de preclínica
a base de cannabinoides terapias combinadas. De nota, el papel de la
sistema endocannabinoide en la generación y progresión del cáncer hay que
explorar
con más detalle como-dependiendo de la inactivación experimental-modelo
genético de
receptores de cannabinoides pueden aumentar o disminuir la génesis tumoral en
modelos animales
de cáncer. En consecuencia, si la manipulación farmacológica
de
los niveles de endocannabinoides (por ejemplo, mediante el uso de inhibidores de
las enzimas implicadas en la
degradación de estos mediadores locales) podría ser utilizado solo o en
combinación con
otros agentes contra el cáncer como una estrategia contra el cáncer debe ser
aclarada.
En cuanto a la estratificación del paciente, debemos determinar inequívocamente
el que par-
individuos particu- son potencialmente sensibles a la administración de
cannabinoides. Para esto
enfoques propósito, de alto rendimiento deben ser implementados para encontrar
cannabinoide
biomarcadores de terapia asociada en biopsias tumorales o, idealmente, en
fácilmente adquiridos
fluidos que contienen células cancerosas circulantes o mejorar el nivel de
factores de resistencia
que podría haber sido liberados por las células cancerosas. Estos biomarcadores
concebible que lo haría
relacionarse con cannabinoides farmacodinámica-a saber, expresión y actividad
de can-
los receptores cannabinoides y sus efectores aguas abajo que inducen muerte
celular. Esto sería
ser análoga a la evaluación bioquímica de los receptores de estrógeno y ERBB2,
que predicen el beneficio de las terapias endocrinas y trastuzumab,
respectivamente, en
cáncer de mama. marcadores predictivos para definir la sensibilidad de un tumor
particular para
terapias basadas en cannabinoides también podrían incluir el estado de factores
de crecimiento, tales como
MDK en gliomas, así como sus receptores y socios de señalización.
En conclusión, los cannabinoides inducen la muerte de las células tumorales e
inhiben la angiogénesis tumoral
Génesis y de invasión en modelos animales de cáncer, y hay indicios de que
466
G. Velasco et al.
Página 19
hacer lo mismo en pacientes con glioblastoma. Como cannabinoides muestran
una aceptable
perfil de seguridad, los ensayos clínicos probándolos como fármacos únicos o,
idealmente, en combinación
terapias en glioblastoma y otros tipos de cáncer son ambos garantizados y
urgentemente
necesario.
Agradecimientos La investigación en los grupos de los autores es apoyado por
becas de español
Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) (PI12 / 02248, FR2009-
0052 y IT2009-
0053 GV; y PI11 / 00295 al CS), Comunidad de Madrid (S2011 / DMB-2308 a
MG), GW
Productos farmacéuticos (a GV, CS y MG); Fundación Mutua Madrile~na
(AP101042012 a GV) y
Fundació Telemarató (20134031 GV)
Posible conflicto de intereses
Declaramos que GW Pharmaceuticals financió parte de la investigación de
nuestro laboratorio.
Asimismo, parte de los datos obtenidos por los autores en relación con el
antitumoral
la acción de los cannabinoides está incluido en tres solicitudes de patentes
presentadas por GW
Productos farmacéuticos.
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Preparación y caracterización de A
9
-tetrahidrocannabinol
Micropartículas poliméricas biodegradables y su eficacia antitumoral
Sobre líneas celulares de cáncer
Dolores Hernán Pérez de la Ossa 1, María Esther Gil-Alegre 1, 2 Alessia Ligresti,
María del Rosario Aberturas 3,
Jesús Molpeceres 3, Ana Isabel Torres 3, y Vincenzo Di Marzo 2
1 Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid, Madrid,
España,
2 endocannabinoide Grupo de Investigación, Instituto de Química Biomolecular, Pozzuoli, Italia, y 3 Departamento de Farmacia y Productos
Farmacéuticos
Tecnología, Escuela de Farmacia, Universidad de Alcalá, Madrid, España
Abstracto
Los cannabinoides presentan un potencial terapéutico interesante como
antieméticos, estimulantes del apetito en
Enfermedades debilitantes (cáncer, SIDA y esclerosis múltiple), analgésicos y en
el tratamiento de
Esclerosis múltiple y cáncer, entre otras condiciones. Sin embargo, a pesar de su
alta
Potencial, sólo hay disponibles algunas formas de dosificación hasta la fecha.
En este trabajo, el desarrollo de un (THC) microesferas biodegradables
9-tetrahidrocannabinol
Como un sistema de administración alternativo para la administración parenteral

de cannabinoides.
El tetrahidrocannabinol se encapsuló en microesferas biodegradables por el
aceite en agua
(O / w) método de evaporación de disolvente en emulsión. Se prepararon varias
formulaciones usando
Diferentes relaciones fármaco: polímero. La influencia de la concentración de
antioxidante (acetato de α-tocoferol)
Sobre la liberación de THC a partir de las micropartículas. Rendimiento elevado
del proceso y
Se lograron eficacias de atrapamiento. Los estudios de liberación de fármaco in
vitro mostraron que la
Se liberó el fármaco encapsulado durante un período de dos semanas. Como el
THC ha demostrado
Como fármaco anticanceroso, se ensayó la eficacia de las microesferas en
diferentes células de cáncer
líneas. Curiosamente, las microesferas fueron capaces de inhibir la proliferación
de células cancerosas durante la
Período de estudio de nueve días. Todos los resultados anteriores sugieren que el
uso de biodegradables
Microesferas serıa un sistema de suministro alternativo adecuado para la
administración de THC.
Palabras claves
A tetrahidrocannabinol, cáncer,
9
Cannabinoides, administración de fármacos,

Microencapsulación
Historia
Recibido el 10 de marzo de 2013
Aceptado el 23 de mayo de 2013
Publicado en línea 17 Junio 2013
Introducción
La planta Cannabis sativa L. produce más de 421 productos químicos
Compuestos, incluyendo aproximadamente 60 moléculas de terpeno-fenol
Llamado phytocannabinoids que son únicos para él [1, 2].
Entre ellos, se ha prestado más atención a A 9 tetrahidro-
cannabinol (A 9-THC), que es la composición más psicotrópica
Ponent y se une a receptores acoplados a proteínas G específicas
los receptores de cannabinoides llamado (CB 1 y CB 2) [3].
Aunque el cannabis se ha utilizado en medicina
Milenios, la preocupación por los peligros del abuso llevó a
Prohibición de su uso medicinal en la mayoría de los países en la década de 1930.
Sólo recientemente, tiene el valor terapéutico de la marihuana y
Agonistas de los receptores cannabinoides naturales y sintéticos individuales
Y antagonistas, ası como compuestos quımicamente relacionados,
Ha sido reactivado. Agonistas de los receptores cannabinoides individuales
Hicieron su primera entrada en la clínica hace menos de 30 años.
Marinol O (dronabinol) y Cesamet O (nabilona) son orales
Formulaciones que se prescriben como antieméticos para los pacientes
Quimioterapia, y también como estimulantes del apetito, por
Ejemplo, para los pacientes de SIDA que experimentan una
peso corporal. En 2005, el Sativex Õ, un spray sublingual cuales
contiene cantidades aproximadamente iguales de A 9-THC y el
Cannabinoide de plantas no psicoactivas, cannabidiol, recibido
Aprobación para la prescripción para el alivio sintomático de
Dolor neuropático en adultos con esclerosis múltiple y, como
Agosto de 2007, como tratamiento analgésico adjunto para adultos
Pacientes con cáncer avanzado [4]. Más recientemente, el Sativex Õ
También ha sido aprobado para el tratamiento de la espasticidad en
Esclerosis múltiple en varios países europeos.
CB 1 / CB 2 agonistas de los receptores también tienen un número de otro
Potenciales aplicaciones terapéuticas. Estos incluyen el alivio de
Dolor inducido por ciertos trastornos o afecciones además de
Cáncer y esclerosis múltiple; Inhibición de la angiogénesis y
Crecimiento de tumores malignos; Alivio de diversos síntomas de
Esclerosis múltiple, lesión de la médula espinal, enfermedad de Alzheimer y
la esclerosis lateral amiotrófica; Alivio de tics y comportamiento
Problemas experimentados por pacientes con síndrome de Tourette;
Y la gestión del glaucoma, por nombrar sólo unos pocos [4-8].
Dirección de correspondencia: Dolores Hernán Pérez de la Ossa,
Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Escuela de
Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid,
España. Tel: + 44- (0) 78 0735 4583. E-mail: doloreshpo@farm.ucm.es;
Doloreshpo@gmail.com
Diario de Drug Targeting Descargado de informahealthcare.com por 2.31.221.30
el 08/07/13
Sólo para uso personal.
Página 3
A pesar del prometedor potencial clínico de los cannabinoides,
Sólo las tres preparaciones farmacéuticas descritas anteriormente
Están comercialmente disponibles.
Por otra parte, aunque los dos principales modos de cannabinoide
Administración de tabaco de material de planta de cannabis seco y
la ingestión oral de cápsulas de dronabinol (Marinol O), que tienen
Desventajas específicas que impulsan el desarrollo de
Más confiable formas de administración [9 - 15]. Desventajas de
Fumar incluyen contenido variable de drogas, daño en la mucosa,
Inhalación de carcinógenos formados por pirólisis y
Duración del efecto, mientras que los inconvenientes de la ingestión oral
Incluyen inestabilidad de cannabinoides y ácido gástrico pH [16],
Absorción lenta y errática, demora en el inicio de la acción y baja
La biodisponibilidad sistémica [6, 17].
Además, también debe tenerse en cuenta que
La lipofilicidad del THC (solubilidad en agua 2,8 mg / mL, log P
3,78) [18,19], la naturaleza viscosa parecida al alquitrán y la inestabilidad (A 9-THC
Es susceptible de descomposición por oxidación, calor, ácido y
[20, 21] restringir su uso en la mayoría de la preparación farmacéutica
Y algunos experimentos de investigación [14, 22, 23].
Aunque en los últimos años varios modos alternativos de
Cannabinoide han sido investigados, tales como el humo-
Menos inhaladores orales (aerosoles), parches transdérmicos y rectales
Supositorios, la necesidad de formulaciones de cannabinoides adecuadas
Persiste [24].
Por lo tanto, el objetivo de nuestro trabajo de investigación ha sido
Formulaciones alternativas para la administración de cannabinoides
Ción. Los resultados de nuestros estudios con cannabidiol
Ha sido publicado recientemente [25]. El objetivo del presente estudio
Transformar viscoso, alquitrán de resina como el THC en
Microesferas fluidas que podrían ser manejadas fácilmente y
ponderado. Este manuscrito describe el desarrollo y
Caracterización in vitro de las formulaciones. Ya que en
En los últimos años una impresionante eficacia antitumoral del THC
Ha sido descrito [8, 26 - 31], el largo plazo in vitro
Las propiedades antitumorales de los microparti-
Cles (MP) se evaluaron en diferentes líneas celulares de cáncer.
Estos MP están destinados a una liberación sostenida de THC
Después de su administración subcutánea peritumoral, redu-
Frecuencia de dosificación.
materiales y métodos
Materiales
A 9-tetrahidrocannabinol (THC) fue proporcionado amablemente por el THC
Pharm (Frankfurt, Alemania). THC es una solución altamente liposoluble
Viscoso con una distribución muy alta de octanol-agua
Coeficiente, informó ser del orden de 6000 [32, 33].
Se eligió la policaprolactona (PCL) como el polímero para
Preparar las micropartículas descritas en este trabajo porque,
A diferencia de los polímeros y copolímeros basados en lactidos (PLA) y
Glicolidos (PGA), la degradación de PCL no genera y
Ambiente ácido que podría afectar adversamente la estabilidad
De los cannabinoides encapsulados [34, 35].
La poli - "- caprolactona (PCL) (Mw 42 500), Sigmacote, poli -
Alcohol vinílico (PVA) y acetato de α-tocoferol se adquirieron
De Sigma Aldrich (St Louis, MO). Cloruro de metileno
(DCM), dihidrógeno fosfato de potasio (KH 2 PO 4), disódico
dihidrato de fosfato de hidrógeno (Na 2 HPO 4 A2h 2 0) y
Tween -80 Õ se obtuvieron de Panreac (Barcelona, España).
Metanol (grado HPLC) y acetonitrilo (grado HPLC)
Fueron adquiridos de LabScan (Dublín, Irlanda). Doble-
Se utilizó agua destilada. Todos los productos químicos fueron utilizados
Sin purificación adicional.
Métodos
Preparación de microesferas
La metodología de evaporación de disolventes en emulsión o / w ya
Desarrollado para la microencapsulación de cannabidiol [25], se utilizó
Como punto de partida para la preparación de MP cargado con THC.
Brevemente, se disolvieron THC y PCL en 5 ml de metileno
Cloruro para formar la solución orgánica. Entonces, esta solución fue
Lentamente en 250 ml de una solución acuosa que contiene
0,5% de PVA y se emulsionaron a 3000 rpm durante 6 min para formar un
Emulsión o / w estable. Posteriormente, la eliminación del disolvente y
Endurecimiento de las microesferas se consiguió mediante
Agitando a 200 rpm durante un máximo de 3 h. Finalmente, los MP fueron
aislados
Por filtración y se lava con agua destilada varias veces para
Quitar PVA. El PM así producido se liofilizó para
12 h en À60 C, 200 mT y se almacenó a ^ {20} DO.
Se prepararon diferentes formulaciones a partir de varias formulaciones iniciales
De fármaco a polímero, a saber, 15/150, 30/150 y 50/150.
Además, se añadió un antioxidante (acetato de α-tocoferol) a
Diferentes proporciones a la fase orgánica (0,05 ó 5%) en
Para evitar la oxidación del THC.
Las microesferas de placebo se prepararon de una manera similar
Excepto que el THC no fue incorporado.
Caracterización morfológica
La topografía superficial de la MP se estudió mediante escaneo
Microscopía electrónica (SEM) (Jeol JSM-6400, Tokio, Japón).
Las muestras MP se montaron en talones usando doble cara
cinta adhesiva. Los trozos fueron luego recubiertos al vacío con
Oro usando pulverización iónica de capa fina (Emitech K550X, Emitech
Ltd., Reino Unido).
Medidas de tamaño de partícula
El diámetro medio y la distribución del tamaño de partícula fueron
Examinado por difusión de luz láser dinámica utilizando una partícula
(Leeds & Northrup Instruments, Irlanda).
Los MP se suspendieron por primera vez en agua destilada
Sonicación durante 2min. A continuación, se añadió la dispersión al
Muestra que contiene un agitador.
Un contenido de 9-tetrahidrocannabinol y la encapsulación
eficiencia
Para determinar la A 9-THC contenido, 10 mg de MP fueron
Disuelto en 1 ml de DCM y luego 9 ml de HPLC móvil
En esta solución para extraer el THC. los
Anterior se mezcló vigorosamente mediante agitación en vórtex, y
Filtrado a través de filtros PTFE de 0,45 mm (Millipore) para eliminar
Los residuos poliméricos. La solución clara se analizó para
Un contenido de 9-THC por cromatografía líquida de alta resolución.
Las condiciones analíticas fueron las siguientes: columna:
Mediterranea Õ -Mar
C-18
(5 \ mu m, 150 \ mu m 4,6 mm
carné de identidad,
Teknokroma, Barcelona, España); Fase móvil: aceto-
Nitrilo: agua (85: 15v / v); Caudal: 1 ml / min; inyección
Volumen: 20 μl; Detección: 205 nm.
2 D. Hernán Pérez de la Ossa y col.
J Drug Target, Early Online: 1-9
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Página 4
La% de carga de fármaco y el% de eficacia de encapsulación del
MP se calcularon como:
% Carga de fármaco ¼
Peso del fármaco en MP
Peso de MP
100
Ð1Þ
% Eficiencia de encapsulación ðEEÞ¼
% De carga de drogas
% Carga teórica
100
Ð2Þ
Estudios colorimétricos de barrido diferencial
Se realizaron análisis térmicos para investigar los
Estado del fármaco dentro de la MP y evaluar el efecto de
Carga de fármaco sobre la cristalinidad del polímero.
El área del pico de fusión está relacionada con el calor de fusión
Y el grado de cristalinidad de la muestra. Estudiando el
Ubicación y anchura del pico de fusión, la cristalinidad del
Muestra. Los puntos de fusión se consideran
El inicio de la fusión como es la convención en la
Calorimétrico de barrido (DSC).
El calor de fusión (AH) informado para PCL es el valor
Medido normalizado por el PCL porcentual de en la muestra.
El porcentaje de cristalinidad de la fase PCL se determina por:
m ¼
AH
AH U
Ð3Þ
AH, donde U es la entalpía de fusión de un cristal perfecto y
Es de 142,9 J / g para PCL [36].
Las exploraciones DSC se realizaron utilizando un método Mettler-Toledo
Calorimétrico de barrido diferencial DSC820 con un
Intracooler TC100 y gas de purga de nitrógeno. Muestras que pesan
Se sellaron 3 - 5 mg en recipientes de muestra de aluminio. Un vacío
Se utilizó como referencia una bandeja de aluminio sellada. El calentamiento
La tasa fue de 10 C / min en una atmósfera de nitrógeno (caudal:
10 ml / min).
Estudios de liberación de fármacos in vitro
Se suspendieron muestras de MP que pesaban 15 mg en 30 ml
PBS pH 7,4 que contenía Tween - 80 al 0,1% (para mantener el sumidero
Condiciones) y se colocan en viales de vidrio. Estos viales
incubó en un baño de agitación del agua (Clifton U na 5-28, Reino Unido) a
37 C con agitación constante (100 golpes / min). Alícuotas de
El medio de disolución (28 ml) se retiraron a prede-
Utilizando una jeringa provista de un calibre 25
Aguja (para evitar la recuperación de MP). El volumen retirado fue
Con un volumen igual de fresco y precalentado
Tampón a 37ºC Las muestras se filtraron a través de filtros de 0,45 μm
Y se analizaron por HPLC.
Todos los experimentos se repitieron tres veces, y el promedio
Los valores fueron tomados.
Actividad antitumoral in vitro
Como estudios previos han demostrado que la A 9-THC exposiciones
Efectos antitumorales sobre diversos tipos de células cancerosas [5, 37], el
eficacia de la A 9-THC-cargada MP fue probado en ratas RBL2H3
Células de leucemia basófila, y Caco2 colorectal humano
Células de carcinoma.
Culturas celulares. Las células RBL2H3 se cultivaron en EMEM
(BioWhitaker Õ, Lonza, Velviers, Bélgica), complementado
Con FBS al 10%, penicilina-estreptomicina al 1%, L-glutamina
(200 mM) a 37ºC C en una incubadora humidificada que contiene
5% de CO 2. Caco2 células fueron cultivadas en Dulbecco modificado
El medio de Eagle (DMEM) con 4,5 g / L de glucosa y L-
glutamina (BioWhitaker Õ, Lonza, Velviers, Bélgica).
Se usaron células en una fase de crecimiento exponencial para
Experimentos de citotoxicidad.
Ensayo de proliferación celular. Las células se sembraron a una densidad
De 50000 células / pocillo en placas de cultivo de seis pocillos. Tres horas
Después de la siembra, se añadió tratamiento al medio. los
Una solución de 9-THC se prepara a partir de un stock de etanólico
Que se diluyó adicionalmente con cultivo celular
medio. En todos los casos la concentración final de etanol fue
Por debajo de 0,001%.
Con el fin de evitar la eliminación de MP cuando se cambia la celda
Medio de cultivo, MP se añadieron encima de un tama~no de poro de 3 μm
Insertado en la parte superior de cada pozo. Mientras MP se agregaron sólo
en el día 0, se añadió una solución de 9-THC en el diario. Medio era
Cambiado cada dos días.
Evaluación de la viabilidad celular. El efecto sobre la viabilidad celular
cancerosa
Una de libre MP cargada con fármaco 9-THC y se evaluó utilizando la
Metiltiazolildifeniltetrazolio (MTT) al
Diferentes tiempos. El ensayo depende del
Reducción de MTT por la deshidrogenasa mitocondrial de
Células viables a un producto azul de formazano que puede
Medida espectrofotométricamente. En pocas palabras, el día del
Se añadió MTT (5 mg / ml) a cada pocillo y las células
Se incubaron a 37ºC C durante 3 h. Luego, cristales de formazano azul
Se disolvió a~nadiendo tampón de lisis de pH 4,7 (que contiene
20% de SDS y 45% de DMF). Después de 6 h de incubación a 37ºC C la
Las densidades ópticas se midieron espectrofotométricamente
(PerkinElmer Lambda 12, Boston, MA) a una longitud de onda de
630 nm.
Un estudio preliminar (datos no mostrados) demostró
La falta de efecto citotóxico del placebo MP. Por lo tanto,
Los resultados de viabilidad celular in vitro presentados en el artículo son
Expresado como el porcentaje de viabilidad celular en relación con
Vehículo o placebo MP-tratados pozos.
La tasa de inhibición del crecimiento se calculó mediante la siguiente
fórmula:
Tasa inhibitoria del crecimiento ¼ (valor medio de la DO en el control
Valor promedio de OD del grupo en el grupo de tratamiento) / OD promedio
En el grupo de control 100%.
análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Statgraphics Õ
(Statpoint Technologies, Inc., Warrenton, VA). Todos
Los ensayos se realizaron por triplicado, y los resultados fueron
Expresada como media Æ SD
Los datos de liberación in vitro se ajustaron a diferentes mathem-
Modelos lineales por análisis de regresión lineal. Coeficientes de
de correlación (r 2) se utilizaron para evaluar la precisión del ajuste.
Resultados de viabilidad celular de diferentes formulaciones fueron
Comparado con el ANOVA. Cuando las diferencias en los medios
Fueron significativas, la prueba de un rango múltiple de Duncan fue con-
Ductos Se consideraron diferencias en los valores de p inferiores a 0,05
Estadísticamente significante.
DOI: 10.3109 / 1061186X.2013.809089
A 9 micropartículas poliméricas biodegradables tetrahidrocannabinol-cargado
3
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Resultados y discusión
La técnica de evaporación de disolventes en emulsión o / w es una de las
Métodos más utilizados para la microencapsulación de
Drogas. Estos MP son generalmente lisos, esféricos y proporcionan
Liberación sostenida de fármacos. Sin embargo, las propiedades de estos MP
Están fuertemente influenciados por las características fisicoquímicas
Del fármaco a encapsular, el polímero, el disolvente orgánico
Utilizados en su preparación, y el proceso de emulsión.
Morfología y tamaño de partícula
Micrografías electrónicas de barrido de placebo y THC
PCL MP se muestran en la Figura 1.
En todos los casos el MP preparado era liso, esférico, no-
Poroso, bien separado, con buena fluidez y fácil de
Resuspender en medio acuoso. Sin embargo, los preparados
50/150 proporción de fármaco a polímero (i - j) apareció en grupos.
Esta aglomeración se atribuyó a la viscosidad y pegajosidad
naturaleza similar al alquitrán de A 9-THC, así como a su bioadhesivo
Propiedades [38].
Los resultados del análisis del tamaño de partícula se
Tabla 1. Los tamaños de partícula no fueron significativamente diferentes
De una formulación a la otra (excepto para el 50/150
Formulación, debido a la aglomeración de las partículas).
El diámetro medio de MP fue entre 49 y 60 μm, lo que es
Adecuados para su administración subcutánea.
Carga del fármaco y eficiencia de la encapsulación
Los resultados del rendimiento del proceso, la carga del fármaco, la
encapsulación
Eficiencia (EE) y el análisis de tamaño de partícula de la PM son
Presentado en la Tabla 1.
El rendimiento era razonablemente bueno en todos los lotes, excepto
Preparado con la proporción 50/150.
Figura 1. Imágenes SEM representativas de microesferas de placebo (a); THC -
PCL MP: 15/150 (b, c), 15/150 - 0,05% vit E (d), 15/150 - 5% vit E (e), 30/150
(F), 30/150 - 0,05% vit E (g), 30/150 - 5% vit E (h), 50/150 (i, j).
Tabla 1. Tamaño de partícula, rendimiento, contenido de fármaco y eficacia de
encapsulación de las diferentes formulaciones (n ¼ 10).
Formulación
Tamaño medio de partícula (μm)
Rendimiento (%)
Mg THC / 100 mg MP
EE (%)
Placebo
36,78
86,18 \ Delta 4,04
-
-
15/150
49,18 Æ 21,54
87,34 \ delta 7,29
9,52 \ Delta 0,45
103,78 Æ 5,50
15 / 150-0,05% vit E
54,34 Æ 24,29
75,24
9,084
108,4
15 / 150-5% vit E
44,64 \ pm 20,30
81,48 \ delta 6,20
8,32 \ delta 1,90
84,55 Æ 13,6
30/150
59,46 Æ 24,28
70,57 Æ 4,03
18,43 \ delta 3,94
128,32 Æ 11,88
30/150 - 0,05% vit E
51,77 Æ 23,48
69,04
15,93
113,39
30 / 150-5% vit E
60,11 Æ 24,84
72,34 \ delta 2,78
17,82 \ delta 3,92
119,88 Æ 12,92
50/150
87,88 Æ 27,63
37,42 \ rightarrow 2,21
32,69 Æ 2,4
97,83 Æ 6,21
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La microencapsulación de fármacos poco solubles en agua como
A 9-THC por la técnica de evaporación de disolvente de emulsión o / w
Resultados en altas eficiencias de atrapamiento debido a la baja
Solubilidad del fármaco en la fase acuosa externa. Por esta razón,
Esta técnica se seleccionó para preparar los sistemas poliméricos.
De hecho, como se muestra en la Tabla 1,
Se obtuvieron eficacias de eficiencia. Valores superiores al 100% fueron
Atribuido a una mayor pérdida de polímero que el THC durante
preparación.
Con el fin de aumentar la carga de fármacos de los
Minimizar el volumen total de MPs que se van a administrar, varios
Las formulaciones se prepararon usando diferentes fármacos / polímeros
Proporciones. Curiosamente, como la relación inicial de fármaco a polímero
Aumentó, la carga de fármacos de las microesferas aumentó
Dando lugar a eficacias de encapsulación cercanas al 100%
en todos los casos. Sin embargo, como se representa en la figura 1 (i, j) cuando la
50/150, no se emplearon partıculas de flujo libre
adquirido. Por lo tanto, se concluyó que el 30/150 era el
Proporción más alta que podría utilizarse para preparar
El MP.
Análisis térmico
El comportamiento térmico de la PM desarrollada se estudió utilizando
DSC. El comportamiento de fusión de PCL en bruto y A 9-THC-cargado
MP fue comparado. Dado que los termogramas de la MP
Preparados con antioxidantes (0,05% ó 5%) fueron similares a los
Los obtenidos a partir de la formulación equivalente sin
Antioxidante, la Figura 2 sólo incluye los termogramas de
Formulaciones libres de antioxidantes.
La materia prima de THC mostró una Tg a 9,33 C (termograma no
mostrado). Tal como se ilustra en la Figura 2, cuando la carga de fármaco
aumentó
Punto de fusión del polímero se amplió y se desplazó a
Temperaturas (de 62 C a 54 C), lo que sugiere que PCL
y A 9-THC eran miscibles. Estos cambios en el polímero
la fusión de pico cuando se añade un 9-THC refleja la plastificación
Efecto del fármaco, que dio lugar a una modificación del
Polímero propiedades mecánicas. Estos cambios, junto con
la naturaleza adhesiva de A 9-THC [38] puede explicar por qué en forma de fármaco
Contenido aumentó el MP tiende a aglomerarse, como se observó
Por SEM (Figura 1). Además, estos cambios
Propiedades mecánicas del polímero fueron observadas por una
Polimerización (Tabla 2). Además, como no hay cambios
Sobre cristallidad polimérica se observaron al preparar
Las micropartículas placebo, se concluyó que la disminución
De cristalinidad del polımero no se debıa a la microencapsula-
Sino a la incorporación de la droga.
Estudios de liberación in vitro
La Figura 3 muestra los perfiles de liberación de THC de diferentes
Formulaciones de MP dependiendo del fármaco / polímero inicial
Y la concentración de antioxidantes.
La variabilidad en las cargas de fármacos no tuvo un efecto
Una influencia en 9-THC liberación de la PCL-microportadores
Muestras (Figura 3A], que generalmente mostró un bifásico
Figura 2. Termogramas DSC de materia prima PCL, placebo MP y 15/150,
30/150 y 50/150 THC-cargado MP (n ¼ 3).
Tabla 2. Temperatura de fusión, entalpía y cristalinidad de PCL en diferentes
formulaciones estudiadas por DSC.
Muestra
Tm DO)
H a
m (J / g)
λ (%)
m
PCL sin procesar

66,95 \ delta 1,24
102,09 \ delta 2,36
73,69 Æ 2,56
Miembros del Placebo
62,28 \ delta 0,38
98,84 Æ 4,17
70,85 \ delta 2,99
Diputados THC-PCL 15/150
58,44
77,62
52,65
MPs THC-PCL 15 / 150-0,05% vit E
57,82
70,84
50,78
MPs THC-PCL 15 / 150-5% vit E
57,44
59,25
50,23
MPs THC-PCL 30/150
55,70
71,99
52,61
MPs THC-PCL 30 / 150-0,05% vit E
55,48
73,78
52,90
MPs THC-PCL 30 / 150-5% vit E
54,80
73,48
52,68
MPs THC-PCL 50/150
54.01
68,05
48,78
DOI: 10.3109 / 1061186X.2013.809089
5
el 08/07/13
Página 7
Comportamiento de lanzamiento. Los resultados experimentales fueron ajustados
a
Higuchi, modelos cinéticos de primer orden y Korsmeyer-Peppas.
No hay diferencias entre Higuchi y cinética de primer orden
Se mostraron los ajustes, pero los mejores valores de r
Al modelo de Korsmeyer-Peppas. Los n valores en este modelo
Fueron cercanos a 0,5 en todos los casos (rango 0.35-0.54) lo que sugiere
que el mecanismo involucrado en la liberación THC A 9 de la
Matrices fue la difusión de drogas. De hecho, debido a la semicristal-
Línea de PCL, el agua puede penetrar fácilmente en la
Amorfa del polímero que facilita la liberación del fármaco
Por difusión.
La influencia de la concentración de antioxidantes en la
También se evaluó A 9-THC liberación de la MP
(Figura 3B-C). La comparación de los perfiles de disolución
Realizado utilizando un modelo de método independiente [39].
Los resultados se presentan en la Tabla 3. Las formulaciones con
Acetato de vitamina E al 5% exhibía un perfil de liberación similar al
MP sin antioxidante (f 2 ¼ 74.19 y 69.45), mientras que la liberación
De la droga se redujo en presencia de 0,05% de vitamina
E (f 2 ¼ 30.53 y 37.08). De hecho, cuando el antioxidante al 0,05% fue
Añadió, la liberación máxima fue de alrededor del 60%. Esta capacidad de
La vitamina E para modular la liberación in vitro de fármacos
Observado previamente; Sin embargo, parece depender de la
Polímero, el fármaco y la concentración de antioxidantes. Barcia
Y colegas [40] han informado de que los aditivos grasos, tales como
Tocoferol retardó la liberación de ganciclovir de PLGA MP
Mientras que Martınez-Sancho y colaboradores [41] encontraron la
Efecto opuesto después de 14 días cuando MP del mismo polímero
Se cargaron con aciclovir y 5% de α-tocoferol. Mu y
Feng [42] informó de una liberación de paclitaxel inferior de PLGA
Nanopartículas tras la adición de un derivado de tocoferol (vit
E TPGS) a la matriz polimérica. Según explican los autores
Este efecto podría estar relacionado con la interacción o afinidad
Entre el fármaco hidrófobo y la matriz polimérica.
Forrest y sus colegas [43] incorporaron el altamente lipófilo
α-tocoferol (log P octanol / agua 9,96) en la rapamicina cargada
Micelas de PEG-PCL. Difractometría de rayos X en polvo
Que la adición de α-tocoferol no fue significativamente
Afectan la cristalinidad de los bloques PCL. sin embargo, el
Los puntos de fusión y la viscosidad del núcleo de las micelas disminuyeron
Con cantidades crecientes de α-tocoferol (15% -35%). los
Autores indican que una posible explicación de esta discrepancia
Ancy es α-tocoferol puede formar fases separadas, o bolsillos,
Figura 3. Perfiles de liberación de fármaco in vitro de las diferentes
formulaciones de formulaciones de THC-PCL MP (A) preparadas sin
antioxidante; (B) 15/150 diputados
Preparados con o sin acetato de vitamina E (0,05 y 5%); (C) 30 / 150MPs
preparados con o sin acetato de vitamina E (0,05 y 5%). Los datos son
Representado como media Æ SD (n ¼ 3).
Tabla 3. Influencia de la adición de vitamina E en una nota de a partir
9-THC
El MP.
Formulación
UN
f2
Conclusión
MP THC-PCL
15/150 0,05% vitE
36,75
30,53
No es similar
MP THC-PCL
15/150 5% vitE
4,93
74,19
Similar (diferencia de 2-5%)
MP THC-PCL
30/150 0,05% vitE
27,07
37,08
No es similar
MP THC-PCL
30/150 5% vitE
6,33
69,45
Similar (diferencia <5%)
el 08/07/13
Página 8
Dentro del núcleo de micelas, que todavía permitiría una
PCL cristalino. Cuando se investigó la rapamicina
La incorporación de α-tocoferol ralentizó su
Tasa de liberación. Asociación de fármacos e interacción con el MP
Puede influir en la tasa de liberación del fármaco, por lo que el
Liberación del fármaco de las características del núcleo modificadas por la
adición
De α-tocoferol.
Debido a que la incorporación de α-tocoferol no
encapsulación de un 9-THC en PCL MP (Tabla 1), fue
Postulado que α-tocoferol no tendría una influencia sobre
La velocidad de liberación de THC tal como se observó para la concentración del
5%.
Sin embargo, aunque una baja concentración de α-tocoferol (0,05%),
No cambió el porcentaje de encapsulación de THC en PCL
MP, disminuyó su velocidad de liberación. La tasa de difusión del fármaco
Desde el núcleo depende de factores que incluyen cristalinidad,
Viscosidad y asociación de fármacos. Los estudios DSC mostraron
Cambios significativos ni en la cristalinidad del
Polimérica ni en sus temperaturas de fusión.
Por lo tanto, la restricción a la liberación del fármaco a bajo α-tocoferol
Concentraciones podría estar relacionada con una mayor hidrofobicidad de
El núcleo de MP debido a una interacción entre el antioxidante y
PCL, mientras que en la mayor concentración de antioxidantes podría
Forman fases microseparadas dentro del polímero que no
Afectan la difusión de fármacos a través de la matriz MP. PCL es un semi-
Polímero cristalino con una Tg alrededor de À60 C. Esta temperatura
Tura no fue incluida en nuestros estudios de DSC, por lo tanto
La falta de evidencia de las interacciones de los polímeros antioxidantes sugieren
Estos pueden ocurrir dentro de los dominios amorfos de la
polímero.
Dado que las formulaciones preparadas con 0,05% de antioxidante
No mostraron una liberación completa de fármacos, solo los MP preparados
Con 5% de antioxidantes fueron seleccionados para estudios posteriores.
Culturas celulares
Los estudios de cultivo celular son un método comúnmente usado para
Si la actividad biológica de los fármacos incorporados
Microesferas se conserva después de la encapsulación. Fármaco in vivo
La concentración es dependiente del tiempo y el espacio mientras que la relación
dosis-
Los experimentos de cultivo de células de respuesta se llevan a cabo incubando
Celulares en un entorno espacialmente uniforme con una
Concentración de fármaco extracelular. Por lo tanto, una extrapolación
De los datos de liberación in vitro a la situación de cultivo celular in vitro y
Incluso estos últimos estudios a la situación in vivo es difícil y
Depende del abordaje terapéutico seleccionado. A fin de que
Imitar la situación in vivo lo más posible, y evitar
MPs de succión al cambiar el medio de cultivo celular, MP
Se añadieron encima de insertos de tamaño de poro de 3 $ μ $ m que fueron
Colocado en la parte superior de cada pozo. Se reemplazó el medio de incubación
Cada dos días para simular la eliminación del fármaco
En el tumor debido a la microvasculatura que gotea.
Para los ensayos de viabilidad de las células cancerosas, las pruebas 15/150 y
30/150
MP fueron seleccionados. Los efectos del PM cargado con THC
THC libre (control positivo) se muestran en la Figura 4. Cuando
Placebo PCL MP se probaron no se observó citotoxicidad
(datos no mostrados). Como se muestra en la Figura 4, A 9-THC cargado MP
Inhibieron el crecimiento celular de ambas líneas celulares de cáncer durante la
9 días de exposición debido a las propiedades de liberación sostenida
Mostrado en la Figura 3. No hay diferencias en la inhibición del crecimiento
celular
Entre las formulaciones preparadas sin
Con acetato de vitamina E al 5%. El tiempo de exposición no puede ser
Debido a las limitaciones de la técnica, es decir, las células
En los pozos de control estaban llegando a confluencia y, por lo tanto,
Desprenderse y morir a partir de entonces. Los resultados obtenidos
confirme que el 9-THC Un liberado de la MP mantuvo su
Figura 4. Efecto antitumoral de TH libre y TH cargado con THC en células
RBL2H3 (A) y Caco2 (B). Un asterisco representa un estadísticamente
significativo
diferencia entre '' libre '' A y A MP
9-THC (p <0,05).
9-THC-cargada
DOI: 10.3109 / 1061186X.2013.809089

7
el 08/07/13
Página 9
actividad biológica. Sin embargo, después de 7 días de incubación, el
Efecto de las formulaciones MP que, a diferencia de la "libre"
A 9-THC, se les administró sólo al comienzo de la
Ensayo, comenzó a disminuir, de acuerdo con los resultados de
Los estudios de liberación in vitro (Figura 3).
De hecho, cuando se añadió THC en solución, se añadió un fármaco constante
Concentración de 20 μM se mantuvo en toda la
Ción. Por el contrario, cuando A 9-THC cargado MP eran
incorporada en el inserto, A 9-THC se libera lentamente para
la médium. Según los estudios de liberación in vitro, el 50% de los
El fármaco sería liberado dentro de los dos primeros días, un total de
84 μg de THC que representaría aproximadamente una célula total
Una exposición de 88 μM día según el área bajo la
Concentración-tiempo en comparación con 40 μM día en la
solución. Posteriormente, se reemplazó el medio de cultivo y se añadieron 34 μg
de THC serían liberados adicionalmente en la siguiente 2
días. Suponiendo que el primer orden cinética de liberación de drogas de drogas
la exposición sería de 36 M Â día entre los días 2 y 4 de
incubación. El siguiente intervalo de cantidades de una exposición de células de
42 mM de un día y, finalmente, desde el día 7 hasta el día 9 de incubación, la
la exposición fue menor (día 9 Â M). De hecho, un 9 -THC en libertad
Del MP presenta una mayor actividad inhibitoria en el día 4, y
retrasado con respecto a la exposición máxima que sugiere cierta
una especie de mecanismo de fase de latencia. De acuerdo con el fármaco in vitro
resultados de liberación, la exposición total de drogas fue comparable en
ambos casos, siendo 175 mM día a Con THC-MP con o
sin 5% acetato de vitamina E frente a 180 M al día con
solución de THC. Sin embargo, diferentes resultados de viabilidad celular fueron
adquirido. Esto puede ser debido a una liberación THC diferente
de MP en el experimento de cultivo de células con respecto a la
estudios de liberación del fármaco. En otros estudios usando MP, una
significativa
Se observó una reducción no puede de las velocidades de liberación in vitro
in vivo [44].
Con respecto a las células Caco2, después de los dos primeros días del
efecto inhibidor con THC en MP era comparable a la
conseguido con el fármaco en solución. Como se muestra en la Figura 4 (B), una
tendencia general hacia una menor efecto inhibidor de la incubación
Se observó el tiempo, de acuerdo a la disminución progresiva de la
comunicado de THC.
conclusiones
A pesar del potencial farmacológico prometedor de canna-
binoids, su elevada lipofilia restringe su uso en la mayoría
preparaciones farmacéuticas y algunos experimentos de investigación.
De hecho, A 9 -THC es una resina viscosa oleosa que es muy pegajosa en
condiciones ambiente por lo que es difícil de manejar y de
ponderar con precisión pequeñas cantidades y para preparar suspensiones
inyección. En el presente trabajo, A 9 -THC era eficiente
encapsulado en PCL MP. Esto representa la primera formulación
mento desarrollado para aprovechar las propiedades antitumorales de este
compuesto. El MP de flujo libre obtenido era esférica
dar forma y tenía un tamaño medio inferior a 100 micras, lo que permite su
la administración subcutánea a través de una aguja convencional.
Altos rendimientos de proceso y eficiencias de encapsulación eran
adquirido. El MP obtenido mostró una liberación sostenida de
A 9 -THC durante un período de 2 semanas. Cáncer Además, in vitro
estudios de viabilidad celular revelaron que el fármaco encapsulado
mantiene sus propiedades antitumorales. Además, era
demostró que una sola administración de la MP mostró
un efecto antiproliferativo durante los 9 días del experimento.
Estos resultados sugieren que MP polimérico podría considerarse
como un sistema de entrega alternativo para A 9 administración de THC,
no sólo para los estudios farmacológicos, sino también para un futuro
aplicacion clinica. Por otra parte, cuando los tratamientos a largo plazo son
previsto, por ejemplo, como fármacos antitumorales, estos sistemas
reduciría la frecuencia de dosificación y mejorar cumplimiento del paciente
Ance En curso en estudios in vivo establecerá aún más la
potencial antitumoral de la MP desarrollado. En el futuro, estos
sistemas podrían ser utilizados en combinación con otros contra el cáncer
fármacos o terapias convencionales con el fin de aumentar la tera-
eficacia tera-.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen al Sr. Marco Allara`, endocannabinoide
Grupo de Investigación, CNR, Italia para la asistencia técnica.
Declaración de interés
Los autores reportan ningún conflicto de intereses. Sólo los autores
son responsables por el contenido y la redacción del documento.
Los autores desean agradecer al Ministerio español de
Ciencia e Innovación para la beca FPU a D. Hernán
Pérez de la Ossa. Este trabajo fue parcialmente apoyado por una beca
de la Universidad Complutense (PR1 / 06-14474-B) al Prof. ME
Gil-Alegre.
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Página 2
Los cannabinoides ejercen la mayor parte de sus acciones
Y la activación de receptores específicos acoplados a proteína G. A
la fecha, dos receptores cannabinoides CB, es decir, 1 y CB 2,
Han sido clonados y caracterizados a partir de mamíferos
Tejidos, siendo la principal diferencia entre ellos la
Patrón de expresión de tejido. Así, mientras que CB 1 receptores son
Localizados ubicuosamente, con su más alta presencia
en el sistema nervioso central, la expresión de CB 2 receptor
Se restringe en su mayor parte a elementos
sistema inmunológico [5, 6 ]. Durante la última década, la evidencia
Se ha acumulado sugiriendo que los cannabinoides podrían ser
Útil para el tratamiento del cáncer. Estos compuestos
Ejercen acción anti-proliferativa, pro-apoptótica, anti-angiogénica,
Y efectos anti-invasivos en diferentes cultivos celulares y ani-
modelos animales de cáncer [7 , 8]. Aquí, hemos utilizado un genéticamente
Modelo animal modificado de ErbB2-conducido metastásico
Cáncer de mama (el ratón MMTV-neu) para analizar el
Antitumoral de los cannabinoides en este
Patología agresiva. Estos animales expresan la rata
El oncogén ErbB2 (neu) bajo el control del hor-
Mone-sensitive mouse virus del tumor mamario-largo plazo-
repetición inal (MMTV-LTR) [9] . Selectivo
Sobreexpresión de neu en el epitelio mamario
Resultados en el desarrollo espontáneo de la
tumores María después de una larga latencia (5-12 meses) [9 ] .
Los resultados presentados aquí (i) muestran que ErbB2-positivo
tumores de mama humanos invasivos expresan receptores CB 2, (ii)
demostrar que Δ 9-tetrahidrocannabinol (THC) y
la no psicoactivo CB 2 agonista de los receptores cannabinoides
JWH-133 reducen significativamente la progresión tumoral
Clínicamente relevante modelo de ErbB2-positivo metastásico
Cáncer de mama, y (iii) arrojar luz sobre el mecanismo de
acción antitumoral in vivo de cannabinoides.
Resultados
Tumores de mama ErbB2 positivos humanos expresan CB 2
Receptores cannabinoides
Primero se analizó si ErbB2-positivas de mama humano
Los tumores expresan objetivos cannabinoides (es decir, cannabinoides
Receptores). Se realizó una inmunohistoquímica ana-
lisis de CB 1 y CB 2 receptores en 87 grado 3 invasiva
Carcinomas ductales mamarios y 6 tumores mamarios no tumorales
Muestras de microarrays de tejidos. CB 1 inmunoreactividad
Fue detectado en sólo el 14% de los tumores (12/87), y no
Correlación entre esta expresión del receptor
y la expresión de ErbB2 (p = 0,198, Fig. 1) . A la inversa,
CB 2 receptores tinción fue evidente en el 72% de la carcinogénesis
Mas (63/87) y se asoció significativamente con
ErbB2 expresión, ya que se observó en el 91% de la
Tumores ErbB2 positivos (21/23, p = 0,018, Fig. 1 ). Más-
más, se detectó ninguna significativa CB1 o CB2 receptores
Inmunoreactividad en el tejido mamario no transformado
(datos no mostrados).
Los cannabinoides ejercen un efecto antitumoral en el MMTV-
Neu modelo de cáncer de mama
A continuación, se analizó el efecto de los cannabinoides en el tumor
Progresión en un grupo bien establecido y clínicamente relevante
Modelo animal de cáncer de mama metastásico impulsado por ErbB2,
El ratón MMTV-neu. Primero observamos que nuestro
La colonia MMTV-neu desarrolla tumores de mama después de un largo
período de latencia similar a la que se informó anteriormente [ 9] . En
En particular, el 50% de las mujeres tenían tumores a la semana 36
(Archivo adicional 1 : Fig. S1 A). Sobreexpresión de la rata
El transgén ErbB2 (neu) en los tumores se verificó mediante
-PCR cuantitativa en tiempo real (archivo adicional 1 : Fig. S1B).
Tratamiento con cannabinoides, ya sea THC, el principal
Cannabinoides derivados de la marihuana en términos de abundancia
y la potencia, o JWH-133, un sintético CB 2 receptor-
Agonista selectivo, ralentizó fuertemente el crecimiento del tumor
(Fig. 2A ), que conduce a lesiones más pequeñas en el extremo de la
Tratamiento (archivo adicional 1: Fig. S2). Estos compuestos,
Sin embargo, no cambió las características histomorfológicas
De los tumores. Así, las tres
Grupos generados focal, ductal, sólido, bien vascularizado
Tumores mamarios rodeados por un tumor no invasivo
UN
segundo
100
100
CB +
1
CB -
1
CB +
2
CB -
2
80
60
40
20
0
ErbB2-
ErbB2 +
% De tum
O
Rs
80
60
40
20
0
ErbB2-
ErbB2 +
% De tum
O
Rs
Figura tumores de mama humanos 1 ErbB2-positivas expresan
Receptores cannabinoides. (A) Imágenes representativas de la mama humana
tumores negativos (fila superior) o positivos (fila inferior) para
CB1, CB2
Y receptores ErbB2 (marrón). Barras graduadas: 200 μm; Insertos: 100

μm. (SEGUNDO)
Porcentaje de tumores marcados como positivos o negativos para
Cannabinoide entre los receptores ErbB2-negativos (n =
64) y ErbB2-positivo (n = 23).
Página 2 de 11
Página 3
epitelio mamario hiperplásico (Fig. 2B ). Nosotros también
observadas tumores que derivan MMTV-neu-CB expreso 1
y CB ARNm del receptor 2 de cannabinoides (determinado por
PCR cuantitativa en tiempo real, datos no mostrados) y proteína
(Archivo adicional 1: Fig. S3).
De interés, los cannabinoides no sólo alteraron el
el crecimiento, pero la generación de tumor también bloqueado per se. Así,
Mientras que el 41% de los animales tratados con el
Más tumores (hasta 6), animales tratados con cannabinoides
nunca se desarrolló más de 3 tumores (Fig. 2C , p <0,05).
En consecuencia, la carga tumoral total fue sorprendentemente
disminuido por los cannabinoides (Fig. 2D) . También hubo
Demora en la aparición de los tumores
estos animales. Así, la latencia media de los géneros
Ción de un segundo tumor en un vehículo tratado con THC
Y los animales tratados con JWH - 133 fue de 33, 46 y 54 días,
respectivamente. Como se menciona en la sección Métodos, sólo
El primer tumor en cada animal fue tratado peritumoralmente
Con cannabinoides. Sin embargo, hemos detectado una
Efecto inhibidor del crecimiento de los cannabinoides en esos tumores
aparecido en el segundo lugar (Fig. 2E) .
Los cannabinoides afectan la proliferación de células tumorales, células
tumorales
Supervivencia y angiogénesis tumoral
A continuación se analizó el potencial proliferativo del cáncer
Y se encontró que se redujo tanto por el THC y
JWH - 133, como se indica por una disminución del número de Ki67 -
células positivas en tumores tratados con cannabinoides (Fig. 3A) .
La administración de cannabinoides también aumentó el número de
De células caspase 3-positivas clivadas (activas) dentro de la
Tumores, lo que indica que estos compuestos inducen cáncer
la muerte celular por apoptosis (Fig. 3B ). Vascularización tumoral
También fue afectada por los cannabinoides, tanto como THC como
JWH-133 disminuyó el número de vasos sanguíneos en la
tumores, tal como se determina por tinción de CD31 (Fig. 3C ). A
Evaluar la posible contribución de la inmunidad
Respuesta a la acción antitumoral cannabinoide, analizamos
Por inmunofluorescencia el grado de infiltración inmune
En los tumores. El porcentaje de CD45 positivo
(Células hematopoyéticas diferenciadas excepto eritro-
Cytes y plaquetas) dentro de los tumores fue muy baja en
Todas las muestras analizadas y sin diferencias significativas
se detectaron entre los grupos experimentales (Fig. 3D) .
Estos datos sugieren que el tratamiento con cannabinoides no
Afectan la infiltración de células inmunes en el tumor
parénquima.
Los cannabinoides disminuyen las metástasis del cáncer de mama
livianos
Se ha informado previamente que un alto porcentaje de
Los animales MMTV-neu portadores de tumores desarrollan metástasis
en los pulmones [ 9 ]. Específicamente, hemos detectado metas-
tases (Fig . 4A ) en el 67% de nuestra MMTV- tratado con vehículo
animales neu (Fig. 4B ). La morfología celular, el tumor
Arquitectura y sobreexpresión del transgén neu
MRNA en estas estructuras pulmonares confirmó la metástasis
Naturaleza de las lesiones (Figs. S1C y D). THC reducido
El porcentaje de animales con metástasis pulmonares (Fig.
4B ). Aunque JWH-133 no disminuyó esta proporción,
Ción, redujo significativamente la magnitud de la
Lesiones. Así, la mitad de las metástasis en este experimento
Grupo fueron detectables sólo por análisis microscópico (Fig.
4B) . Como se observó para los tumores de mama primario,
Yo c
metro
3)
Veh (n = 15)
4
5
6
7
THC (n = 6)
JWH - 133 (n = 8)
UN
segundo
Tiempo de tratamiento (días)
Tumor v
O
Lu
0
1
2
3
0
20 40 60 80 100
20
40 60 80 100
20 40
60 80 100
do
Los tumores /
animal
1
2
3
4 o más
Controlar
(N = 12)
25%
8%
25%
41%
THC
(N = 6)
50%
17%
33%
0%
JWH 133
peso de tumor
(do
metro
3)
P = 0,0005
P = 0,001
10
8
6
4
2
re
Tumor v
O
Lu
yo
(do
metro
3)
P = 0,04
5
4
3
2
1
JWH-133
(N = 6)
33%
50%
17%
0%
mi
Veh
(N = 10)
THC
(N = 6)
JWH-133
(N = 6)
Tota
L2
0
Final
Veh
(N = 4)
THC
(N = 1)
JWH-133
(N = 3)
1
0
Figura 2 Los cannabinoides inhiben el crecimiento del tumor de mama in vivo y
El número de tumores generados por animal. (A) Tiempo-
En cada animal apareció el primer tumor (escala bar: 1 cm) del primer tumor.
(B) Imágenes representativas (tinción de H & E) de la histopatología de
Los tumores mamarios derivados de MMTV-neu. Barras de escala (de izquierda
a
Derecha): 200 μm, 100 μm y 50 μm. (C) Porcentaje de animales con
1, 2, 3, 4 o más tumores al final del tratamiento (90 días) en
Cada grupo experimental. (D) Carga tumoral total (tumor total
Volumen por animal) determinado 90 días después del cannabinoide o
Vehículo. (E) El volumen de los tumores apareció en segundo lugar,
Tercera o posteriores, 40 días después de su aparición. los
Pequeño de los grupos tratados con cannabinoides se debe a los muy pocos
Segundo o tercer tumor apareció lo suficientemente temprano como para durar
40 días en
Animales antes del final del tratamiento (90 días después de la
Aparición del primer tumor).
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Página 4
El tratamiento con cannabinoides no alteró la histopatología
De las metástasis, y los tres grupos experimentales
Presentaron adenocarcinomas sólidos similares (Archivo
1 : Fig. S1C). No se detectó ningún signo de metástasis en ninguna
De los otros órganos analizados (cerebro, bazo, hígado, riñones
Por análisis histológico y huesos por rayos X) en cualquiera de
Los grupos experimentales (datos no mostrados).
La degradación de la matriz extracelular es un paso crucial
En el proceso metastásico, especialmente durante las células tumorales
intravasación y extravasación [ 10 ]. Matriz metalopro-
Teinasas (MMPs) se han asociado durante mucho tiempo con este pro-
Debido a su capacidad para degradar los componentes de
La matriz extracelular. Para analizar si los cannabinoides
La administración afecta la actividad de MMP que llevamos a cabo gela-
Zimografías de estaño. MMP2 actividad se redujo en THC-
Y JWH-133 tratados, mientras que la actividad MMP9 fue
mejorada por el tratamiento de cannabinoides (Fig. 4C ). Este THC-
Y la reducción inducida por JWH - 133 en la actividad de MMP2
Acompañado de una disminución de los niveles de mR2 MMP2
(Archivo adicional 1: Fig. S4A). Por el contrario, los cannabinoides
No cambió la cantidad de transcripciones de MMP9 (Addi-
Archivo internacional 1: Fig. S4A) y aumentó sus niveles de proteína
(Archivo adicional 1 : Fig. S4B), lo que indica que regulan
MMP9 después de la transcripción.
Akt downregulation está involucrado en el cannabinoide
Acción antitumoral
El objetivo siguiente fue caracterizar el mecanismo sub-
Mentir cannabinoide efecto antitumoral. Está bien
Que varios tipos de cánceres humanos son
Asociado con la desregulación de la señalización vía ErbB
UN
Veh
THC
JWH-133
7
-positiv
E células (%)
P = 0,107
P = 0,002
35
25
30
15
20
10
Ki6
7
Veh
(N = 8)
THC
(N = 4)
JWH-133
(N = 4)
5
0
segundo
P = 0,015
un
Ve
D-caspasa 3-
Sitiv
E células (%)
P = 0,0005
35
25
30
15
20
10
Veh
THC
JWH-133
Cle
un
correos
S
Veh
(N = 3)
THC
(N = 4)
JWH-133
(N = 5)
5
0
do
Sangre v
mi
Ssels
Mber / tumor sección)
P = 0,045
P = 0,007
25
15
20
5
10
Veh
THC
JWH-133
(norte
Usted
Veh
(N = 3)
THC
(N = 4)
JWH-133
(N = 5)
0
-positiv
mi
zona (%)
10
6
8
4
12
re
Veh
THC
JWH-133
P = 0,31
P = 0,44
CD4
5
-
Veh
(N = 3)
THC
(N = 4)
JWH-133
(N = 4)
2
0
Figura 3 Los cannabinoides inhiben la proliferación de células de cáncer, inducir
apoptosis de células de cáncer, y la angiogénesis tumoral in vivo impair.
(A) células positivas para Ki67 (rojo), (B) células activas de caspasa-3 activas
(rojo),
(C) células CD31 positivas (verde) y (D) áreas CD45 positivas en el
Tumores. Barras graduadas: A, 60 μm; B, 40 \ mu m; C y D, 100 \ mu
m. Núcleos celulares
Están en azul. Las cuantificaciones de células Ki67-positivas (A), caspasa-
3-positivas (B), el número de vasos sanguíneos (C) y CD45-
Positivo (D) en los tumores se muestran en el
Gráficos.
segundo
UN
Imanes
Con metástasis (%)
*
*
70
60
50
40
30
20
10
Lesiones macroscópicas
Lesiones microscópicas
Un
Veh
(N = 9)
THC
(N = 6)
JWH-133
(N = 6)
0
do
Vehículo tratado
Tumores
Tratado con THC
Tumores
ordenador personal
Pro-MMP9
Pro-MMP2
MMP9
MMP2
controlar
5
controlar
2,5
§
Tumores
Tumores
ordenador personal
Vehículo tratado
Tumores
Tratamiento JWH-133
Tumores
Pro-MMP9
Pro-MMP2
MMP9
MMP2
re
controlar
THC
*
*
Densidad óptica
(un
.u).
Pro-MMP9
Pro-MMP2
MMP9
MMP2
*
4
3
2
1
0
controlar
JWH
Densidad óptica
Au
Pro-MMP9
Pro-MMP2
MMP9
MMP2
*
2,0
1,5
1.0
0,5
0
Figura 4 Los cannabinoides inhiben la metástasis del cáncer de mama a la
pulmones en vivo. (A) Nódulos pulmonares metastáticos (señalados por
flechas). (SEGUNDO)
Porcentaje de animales con metástasis pulmonares. Macroscópico
Las metástasis eran visibles a simple vista y las lesiones microscópicas
Fueron detectables sólo por tinción de H & E. Estas últimas lesiones fueron
Encontrado sólo en animales tratados con JWH-133. (C) Las zimografías de
gelatina de
Tumores tratados con vehículos y cannabinoides. Cuatro representantes
Los tumores se muestran por grupo experimental. PC: control positivo
(Medio condicionado de células H71080 estimuladas con el forbol
Éster PMA). Las flechas apuntan a la MMP latente (pro-MMP) y activa
Bandas de acuerdo con el control positivo y el MMP esperado
Pesos moleculares. Las partes no contiguas del mismo gel son
mostrado. Los gráficos muestran el análisis densitométrico de MMP2 y
MMP9 actividades. Los datos se expresan en unidades arbitrarias. *, P <0,05 vs
Tumores tratados con vehıculos; §, p = 0,068 vs tumores tratados con vehículo.
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miembros [1] . En particular, la sobreexpresión ErbB2
Por ejemplo, con el tamaño del tumor, aumento de la
Potencial, y grado histológico más alto, lo que implica que
ErbB2 confiere una fuerte proliferación y supervivencia
Tage a las células tumorales [11 ]. Evaluar si los cannabinoides
Modulan la expresión de ErbB2 endógeno y de
La rata ErbB2 ortologue neu, que es ectopically
Expresado en nuestro modelo animal, se realizó en tiempo real
Cuantitativa PCR determinaciones sobre THC y JWH-
133 tratamiento. Sin embargo, no se produjeron cambios significativos
detectado (Fig. 5A) .
Una vía de señalización intracelular central activada por
ErbB2 es el camino PI3K / Akt, cuya importancia en
El cáncer de mama es corroborado por estudios clínicos
Akt activación en la mayoría de ErbB2-overexpressing tumores
[ 11 ]. Hemos observado una disminución en la activación de Akt en THC-
tumores MMTV-neu tratados (Fig. 5B ) así como dismi-
De la proteína ribosomal S6 fosforilada [a
Para la activación del objetivo de Akt / mamífero de
rapamicina (mTOR) vía [12 ] ] (Fig. 5C). A
Determinar la importancia de la inhibición de la Akt en
Acción antitumoral, realizamos diferentes experi-
Con la línea celular N202.1A, que se aisló de
un tumor MMTV-neu de mama [ 13 ]. THC y JWH-133
disminución de la proliferación celular N202.1A (Fig. 6A ) en una
CB manera 2 dependiente del receptor, como se indica por la
prevención de la acción de los cannabinoides ejercida por el CB 2
Antagonista selectivo del receptor SR144528, pero no
CB 1 receptor selectivo antagonista SR141716 (Fig. 6B) .
Asimismo, la tasa de crecimiento de los xenoinjertos derivados de N202.1A
Fue significativamente disminuido por THC y JWH-133, y
este efecto fue impedido por SR144528 (Fig. 6C ). THC
También disminuyó la proliferación celular de dos diferentes ErbB2-
Sobreexpresando líneas celulares de cáncer de mama de origen humano
(Archivo adicional 1: Fig. S5), lo que sugiere que humanos
Las células tumorales de mama positivas a ErbB2 pueden ser
Cannabinoide antitumoral también. N202.1A
Mostró una reducción dependiente de la dosis en la activación de Akt
(Fig. 6D ). De interés, la sobreexpresión de un producto miristoilado
forma (es decir, activado de forma constitutiva) de Akt (Fig. 6E ) pre-
ventilado THC efecto antiproliferativo (Fig. 6F ). Para
Apoyar la importancia de la Akt en el antitu-
Acción moral, se generaron xenoinjertos subcutáneos
En ratones desnudos con células N202.1A que expresan de forma estable myr-
Estoilado Akt o el correspondiente vector vacío
(PBABE). Como se muestra en la Fig. 6G ( panel izquierdo), significativamente
THC
El crecimiento de pBABE-transfectadas
Tumores derivados de N202.1A. Por el contrario, la sobreexpresión de
Akt activó el efecto THC en el progreso del tumor.
sión (Fig. 6G , panel derecho). Se observó el mismo efecto
con JWH-133 (Fig. 6H) .
Discusión
La expresión y / o función de ErbB2 aberrante producen
Tumores agresivos, con mayor resistencia a las
Quimioterapia terapéutica y malos resultados. Aunque el
Uso del anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 Trastuzu-
Mab mejora notablemente la supervivencia de estos pacientes,
Sólo el 25% responde a este tratamiento y la mayor parte de
los respondedores finalmente recaída [ 14 ]. Además, el
Uso de este anticuerpo se ha asociado con importantes
Efectos secundarios cardiotóxicos (insuficiencia cardiaca congestiva grave
y la disminución de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo) [ 14] .
En consecuencia, deben realizarse esfuerzos
Nuevos fármacos para el tratamiento de la mama ErbB2-positiva
Tumores. Nuestros resultados demuestran que, de forma espontánea
Los tumores de mama que sobreexpresan ErbB2, cannabi-
Noides inhiben la generación de tumores, crecimiento, vascularización,
Y metástasis. Aunque un cannabinoide basado en mono-
La terapia puede ser potencialmente efectiva para el tratamiento con ErbB2
positivo
Los tumores de mama, sería interesante analizar la
Efecto de estos compuestos en combinación con otros
Tratamientos anticancerosos. Por lo tanto, vale la pena señalar que
Trastuzumab, la terapia dirigida más relevante para
UN
Ratón ErbB2
UN
ex
Presión (au)
1,5
1.0
0,5
UN
ex
Presión (au)
Rat ErbB2 (neu)
2,5
2,0
1,5
1.0
segundo
1
2
3
4
Densidad tica
Au
P = 0,015
Pato
Akt
Veh
(N = 9)
THC
(N = 5)
JWH-133
(N = 6)
señor
norte
UN
0
señor
norte
UN
Veh
(N = 9)
THC
(N = 5)
JWH-133
(N = 6)
0,5
0
P-S6
Tina
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Veh
THC
Densidad óptica
Au
P = 0,046
Vehículo tratado
Tumores
Tratado con THC
Tumores
0
Veh
(N = 7)
THC
(N = 6)
Op
T
Vehículo tratado
Tumores
Tratado con THC
Tumores
do
(N = 6)
(N = 5)
Figura 5 THC inhibe Akt in vivo. (A) ErbB2 de ratón y (B) rata
ErbB2 (transgén neu) expresión de ARNm en vehículos y
Los tumores tratados con cannabinoides, según se determina mediante
quatitativos en tiempo real
PCR. (B y C) Western blot y análisis densitométrico de fosfo-
Akt (B) y fosfo-S6 ribosomal proteína (C) en los niveles de MMTV-neu-
Derivados de los tumores tratados con vehículo o THC. Ocho representantes
Se muestran tumores. Total Akt (B) y a-tubulina (C) se utilizaron para
normalización. Se muestran partes no contiguas del mismo gel.
Las densidades ópticas se expresan en unidades arbitrarias.
Página 5 de 11
Página 6
segundo
UN
**
*
150
THC
140
120
*
**
**
Celda v
Responsabilidad
(%)
[Cannabinoide] (\ mu M)
125
100
50
25
0
0
6
9
12
15
3
**
**
75
JWH-133
Celda v
Responsabilidad
(%)
THC -
++++-
-
-
-
-
-
-
JWH-133 -
-
-
-
-
++++-
-
-
100
60
40
20
0
SR1 -
-
+-
+-
+-
++-
+
**
*
**
*
##
##
##
80
120
Veh
THC
SR2
THC + SR2
metro
Ov
O
Lume (aumento del pliegue)
**
12
10
8
6
4
14
**
do
Veh
JWH-133
SR2
JWH-133 + SR2
Ov
O
Lu
Yo (aumentar el pliegue)
12
10
8
6
4
14
****
SR2 -
-
-
++-
-
++-
++
BEBÉ
BEBÉ
Pato
Akt
Tina
re
Pato
Akt
[THC] (\ mu M)
04560456
16 h
24 h
S6
mi
F
vía
segundo
Ilidad
(%)
*
**
**
#
##
#
140
120
100
80
60
Tiempo (días)
Tu
metro
2
0
0
7
14
21
****
****
Tiempo (días)
Tum 2
0
0
7
14
21
****
****
PBABE pBABE-
Myr-akt
Tina
P-S6
GRAMO
0456
0 4 5 6 [THC] (μM)
PABABE-myr-Akt
Pabezón
Ce
Ll v
**
**
60
40
20
0
Pablo
Pabeb_thc
Ld aumento)
30
25
20
PABABE-myr-Akt_Veh
PBABE-myr-Akt_THC
O
Ld aumento)
30
40
Pablo
2500
Tiempo (días)
Tumor v
O
Lu
Yo
*
*
**
** **
15
10
5
0
0
7
14
21
MARIDO
PABABE-myr-Akt Veh
3000
Tumor v
O
Lu
Yo
20
10
0
0
7
14
21
Tiempo (días)
Pablo
PBABE_JWH-133
Tiempo (días)
Tumor v
O
Lu
Yo m
metro
3)
2000
1500
1000
500
0
0
7
14
21
**
******
****
pag
Y
_
PBABE-myr-Akt_JWH-133
Tiempo (días)
Tumor v
O
Lu
Yo m
metro
3) 2500
2000
1500
1000
500
0
0
7
14
21
Y
Figura 6 Akt downregulation está involucrado en la acción antitumoral de
cannabinoides. (A y B) Viabilidad de células N202.1A en respuesta a (A)
aumento
Concentraciones de THC o JWH-133 o (B) 6 μM de THC o 10 μM de JWH-133
con o sin 2 μM de SR141716 (SR1) y / o SR144528 (SR2) durante 48 h. Datos
Se expresan como% de células tratadas con vehículo, fijadas al 100%. (C)
Crecimiento de xenoinjertos derivados de N202.1A tratados con THC (panel
izquierdo) o JWH - 133 (derecha
Panel) con o sin SR2. (D) niveles de proteína fosfo-Akt y fosfo-S6 ribosomal (p-
S6) en células N202.1A desafiadas con THC, según se determinó
Por Western blot. Para la normalización se utilizaron los niveles totales de Akt y
a-tubulina. (E) Fosfo-Akt y niveles de Akt total en células N202.1A
retroviralmente
Transduced con Akt myristoylated (pBABE-Myr-Akt) o el vector vacío
correspondiente (pBABE). (F) La viabilidad celular de pBABE- o myr-Akt-
transduced
N202.1A en respuesta a la exposición a THC durante 72 h. (G y H) Tiempo
recorrido del volumen de pBABE-N202.1A derivados (paneles de la izquierda) y
myr-Akt-
Los tumores derivados de N202.1A (paneles de la derecha) tratados con THC
(G), JWH-133 (H) o el vehículo correspondiente. *, P & lt; 0,05; **, P
<0,01 vs tratado con vehículo
Células o tumores; #, P & lt; 0,05; ##, P <0,01 frente a células tratadas con
cannabinoides solos (B) o contra las células transducidas con pBABE tratadas
con THC (F).
Página 6 de 11
Página 7
Hasta ahora, los tumores positivos para ErbB2 tienen una mediana modesta
Respuesta global cuando se utiliza como agente de primera línea,
Que se mejora claramente cuando se utiliza en combinación
con otros agentes quimioterapéuticos [14 ] . Adicionalmente,
La sobreactivación de Akt se ha detectado en una
Porcentaje de cánceres primarios de mama humano, en
Está asociada a una mayor resistencia al Trastuzumab
[ 14 , 15]. Nuestros resultados muestran que downregulation de Akt es
Involucrados en la acción antitumoral cannabinoide. Esta quinasa
Es el nodo central de la señalización PI3K / Akt / mTOR
Vía, que activa procesos cruciales tales como
Supervivencia, crecimiento celular, proliferación celular, angiogénesis y
la migración celular y la invasión [ 12 ]. Este camino está ahí,
Un objetivo atractivo para los agentes anticancerosos y, como
De hecho, los ensayos clínicos han sido o están siendo
canalizado con inhibidores de mTOR, PI3K y AKT [3 ] .
El potencial antitumoral de los cannabinoides ha sido
documentado tanto in vitro como en modelos animales de can-
cer [ 7 , 8]. Estos compuestos inhiben las células de cáncer de mama
proliferación in vitro a través de procesos que incluyen células
la detención del ciclo [16 -21], hormonas y factores de crecimiento recepción
tor de modulación [ 18, 22,23], y la inducción de la apoptosis
[ 17 , 20,21]. Los enfoques in vivo seguido hasta ahora han
ha basado principalmente en modelos de xenoinjertos [ 20, 21], los cuales
Son herramientas útiles pero limitadas. Estos modelos
Propagación de líneas celulares de cáncer en pacientes inmunodeficientes
Ratones en sitios ectópicos o ortotópicos y carecen de
Turas de los tumores de los pacientes, tales como el
Tección y las interacciones con el tumor
Microambiente (incluido el medio ambiente no
Vascular y las células inmunitarias) y disminuir la
ISHED heterogeneidad genética [ 24 ]. En contraste con
Xenografted animales, en los ratones mutantes utilizados en este
Los tumores de estudio aparecen espontáneamente y
Períodos de latencia, reclutar y generar vasos sanguíneos, y
Penetrar en la vasculatura dando lugar a distantes metas-
tases [9 ]. Estas características son paralelas a la patología humana
Mucho más cerca y hacer que los ratones MMTV-neu
Clínicamente relevante modelo de cáncer de mama impulsado por ErbB2.
Notablemente, esto es, a nuestro leal saber y entender,
Primer informe apoyando que los cannabinoides no
Sólo el crecimiento tumoral, sino también la generación de
tumores. Recientemente,
Qamri y compañeros de trabajo y DuBois y compañeros de trabajo, por
Utilizando dos modelos genéticos diferentes de cáncer,
JWH-133 demora la aparición de la
tumores [21 ] y que la pérdida de CB 1 receptores acelera
crecimiento adenoma intestinal [25 ] , respectivamente, y Izzo
et al. Observó que los niveles altos de endocannabinoides y los
Agonista cannabinoide HU-210 reducen el desarrollo de
lesiones precancerosas del colon de ratón [ 26 ]. Estos y
Nuestros datos sugieren que el sistema endocannabinoide tiene un
Función protectora fisiológica contra la tumorigénesis,
En línea con la idea general de que este sistema contribuye
mantener la homeostasis en la salud y la enfermedad [6 ] .
Los datos presentados aquí muestran que los cannabinoides modu-
Actividad tardía de MMP. En particular, se informa de una inhibición
De MMP2 y una activación de MMP9 por cannabinoides.
Aunque las MMP se han asociado tradicionalmente a
Metástasis debido a su capacidad para degradar la extracelu-
Se ha demostrado recientemente que varios miembros de la
De esta familia proporcionan un efecto protector en diferentes
etapas de la progresión del cáncer [ 27 ]. Uno de estos antitu-
MMP9 es MMP9, que es activado por el cannabi-
Noides en nuestro sistema. Aunque esta MMP puede promover
El cambio angiogénico en algunos tumores experimentales [por ejemplo,
[ 28 ]], los estudios clínicos han establecido una correlación
Entre la sobreexpresión de MMP9 y el buen pronóstico
cáncer de mama [ 29] . Este efecto protector podría derivar
Desde su capacidad para generar inhibidores de la angiogénesis
tales como angiostatina y tumstatin [ 27] . La inhibición de
MMP2 por los cannabinoides mostrados aquí, en línea con eso
Previamente reportado por Bifulco y compañeros de trabajo en tiroides
las células del cáncer [30 ] y nuestro grupo en los gliomas [31], puede ser
De especial relevancia teniendo en cuenta que los altos niveles de tumores
De esta metaloproteinasa se han correlacionado con
pronóstico en el cáncer de mama [ 32 ]. Además,
Los niveles de MMP2 en los tumores de mama están asociados con
Amplificación y / o sobreexpresión [gen ErbB2 33] .
Además, Massagué y sus compañeros de trabajo han
MMP2 como uno de los genes de la firma que
media la metástasis del cáncer de mama a los pulmones [ 34] , la
En nuestro modelo animal.
Posibles terapias antitumorales basadas en el uso de
Los cannabinoides podrían estar limitados por su bien conocida
Las acciones chotrópicas como mareos, boca seca,
Debilidad muscular, euforia, mialgias y
palpitaciones [ 6 , 35]. Aunque la relación beneficio / riesgo es
Potencialmente altas para las terapias basadas en cannabinoides,
Deben adoptarse estrategias para evitar o al menos mini-
Mizar sus efectos secundarios. Dado que la mayoría de los
Psicoactivos de los cannabinoides son producidos por
la activación de los receptores CB1 centrales [ 5 , 6], uno razonables
enfoque poder podría hacerlo a receptores CB 2
Selectivamente. Aquí, hemos demostrado que el CB 2 -
Agonista selectivo JWH-133 es tan efectivo como THC (un
CB 1 / CB 2 agonista -mixta) en la reducción de la generación del cáncer
Y progresión. Además, nuestros resultados también (i) muestran
Que un elevado porcentaje de ErbB2-positivo de alto grado
tumores de mama humanos CB Express 2 receptores, y (ii)
que una fracción muy baja de ellos expresan receptores CB1.
Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la activación de
CB 2 en esta población de pacientes en particular sería
Una estrategia eficaz para tratar los tumores de mama sin
Efectos psicoactivos. Una correlación entre
la agresividad del tumor y la expresión del receptor CB 2 en
Cáncer de mama se ha informado previamente: los tumores carecen de
Receptores de estrógeno o progesterona, que están asociados
Ciated a bajas tasas de respuesta a terapias adyuvantes,
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expresar altos niveles de CB 2 que los esteroides receptor positivo
lesiones [17 ]. Además, los tumores positivos para ErbB2 también tienen
aumento de los niveles de mRNA del receptor de CB 2 en comparación con sus
Menos agresivo y más sensible ErbB2-negativo
homólogos [17 ] . De interés, este receptor es escasamente
Expresado en tejido mamario no transformado [datos
presentado aquí y [17 , 21]].
Conclusiones
En resumen, nuestros resultados, que se obtuvieron en un
Camente modelo animal relevante de la mama ErbB2-positiva
Cáncer, sugieren que estos niveles altamente agresivos y
Los tumores sensibles a la respuesta podrían tratarse eficazmente con tumores
no-
CB psicoactiva 2 selectivos agonistas sin afectar a la
Tejido sano circundante.
Métodos
Análisis de microarray de tejidos
Ochenta y siete carcinomas ductales invasivos de grado 3
Y 6 no tumorales tejidos mamarios se fijaron en el 10%
Paraformaldehide (PFA) y embebido en parafina.
Dos núcleos de tejido representativo (1 mm de diámetro) de
Cada uno se incluyó en un microarray de tejido. los
Principales patologías clínicas y características moleculares
serie había sido descrito previamente [ 36] . Tissue sec-
Sometidas a una recuperación de antígeno inducida por calor
Antes de la exposición al anticuerpo primario. Anti-
Anticuerpo del receptor CB 1 fue generosamente donado por Dr.
Ken Mackie, la Universidad de Indiana, Indiana, y anti-CB 2
Receptor de anticuerpos procedía de Affinity Bioreagents /
Thermo Fisher Scientific, Rockford, Illinois. ErbB2
Expresión se evaluó utilizando un HercepTest (Dako,
Carpenteria, CA) según las instrucciones del fabricante
Ciones. La inmunodetección se realizó utilizando la
LSAB (DAKO) con DAB como cromógeno.
En los controles negativos, se omitió el anticuerpo primario
o sustituido con un anticuerpo irrelevante. Los casos fueron
revisado por dos patólogos independientes (JP y
GM-B) y se anotó como positivo para cannabinoides
receptores cuando más de 25% de la célula neoplásica
mostraron inmunotinción intensa para el correspondiente
anticuerpo. ErbB2-tinción se puntuó de acuerdo a las Mujeres-
las directrices del fabricante: Los resultados de cepTest 0 y 1+
fueron considerados como negativos, y 2+ y 3+ como positivos
para ErbB2 sobreexpresión.
Animales y tratamientos
Todos los procedimientos con animales se realizaron con
la aprobación de la Universidad Complutense de Animales
Comité de Experimentación de acuerdo con la europea
las disposiciones oficiales. FVB / N-Tg (MMTVneu) 202 Mul / J
ratones (designado más comúnmente como ratones MMTV-neu)
se obtuvieron del Laboratorio Jackson (Bar Har-
bor, Maine). Las hembras se palpan dos veces por semana para
nódulos de la glándula mamaria y el tratamiento cannabinoide
se inició cuando la primera tumor en cada animal se
Detectado. Δ 9 -tetrahidrocannabinol (THC, La Salud
Concepto, Richelbach, Alemania) y JWH-133 (amablemente
donado por John W. Huffman, Universidad de Clemson,
Carolina del Sur) se prepararon en DMSO (0,2 mg / l
y 0,02 mg / l, respectivamente) y se diluyó en PBS apoyo
complementada con 5% de BSA (100 l / dosis para los tumores ≤
1000 mm 3 y 200 l / dosis para los tumores> 1000 mm 3 ).
peritumoral tratamiento cannabinoide (0,5 mg de THC o
0,05 mg JWH-133 / animal / día, dos veces por semana) fue man-
contenida durante 90 días, y sólo el primer tumor en cada ani-
mal fue tratado. Los tumores se midieron rutinariamente
durante este periodo con el calibrador externo, y el volumen era
calculado como (4π / 3) x (anchura / 2) 2 x (longitud / 2). En el
final del tratamiento, animales fueron sacrificados y
Se recogieron los tumores y los órganos. Los tumores se dividen
en cuatro porciones de 1) la preparación de secciones de tejido para
tinción de inmunofluorescencia [congelado en Tissue-Tek
(Sakura Finetek Europa, Zoeterwoude, El Bajos
tierras)], 2) la preparación de secciones de tejido para hematoxy-
tinción lin-eosina (fijo en tamponada 4% PFA), 3) proteínas
extracción (congelaron rápidamente) y 4) el aislamiento de ARN (complemento
fro-
Zen), y se almacenaron a -80 ° C hasta el análisis (excepto
fracciones de tumores, que se mantuvieron a temperatura ambiente PFA-fijo
tura). Cerebro, el bazo, el hígado, los riñones y los pulmones eran
fijo en PFA. Para los experimentos de xenoinjerto, subcutánea
Los tumores se indujeron en el 6 semanas de edad, hembra atímicos
los ratones (Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona, España) por
inyección subcutánea de 5 x 10 5 células N202.1A. Cuando
tumores alcanzaron ca . 100 mm 3 , que fueron tratados con
THC (0,5 mg / animal / día), JWH-133 (50 g / animal / día),
SR144528 (50 mg / animal / día), una combinación de canna-
binoid y SR144528 o vehículo durante 3 semanas, 3 veces
semanas, medida y procesada como se describe anteriormente. por
experimentos relacionados Akt-, la mitad de los animales eran
inyectados con células que expresan establemente N202.1A myristoy-
RELAClONADAS Akt (N202.1A-pBABE-myr-Akt), y el otro
la mitad con las células que expresan de forma estable el N202.1A pondiente
corres- vector vacío (N202.1A-pBABE). Los tumores eran
tratados con THC, JWH-133 o vehículo y se procesó como
descrito para xenoinjertos N202.1A.
la detección de metástasis
órganos recogidas se analizaron visualmente para macroscópica
metástasis. metástasis microscópicas fueron determinados por
El análisis histológico de PFA-fijo incluido en parafina
hematoxilina-eosina secciones teñidas. Las radiografías fueron
a fin de evaluar la presencia de metástasis óseas usando
un equipo de rayos X convencional (Diagnost 93, Philips
Medical Systems, Eindhoven, Países Bajos), y
cassette de la mamografía (Kodak Min-R CAS pantalla 2000
Sette) y la película (película Kodak Min-R S) (Eastman Kodak
Company, Rochester, Nueva York).
Caffarel et al . Molecular del Cáncer de 2010, 9 : 196
http://www.molecular-cancer.com/content/9/1/196
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Página 9
Cultivo de células y la viabilidad
N202.1A células fueron amablemente a cargo del Dr. Vincenzo Bronte
(Istituto Veneto Oncológico, Padova, Italia). Esta célula
la línea se estableció a partir de un tumor derivado de MMTV-neu
[ 13 ]. BT474, MDA-MB-231, MCF-7 y SKBR3 humana
células de cáncer de mama, las células leucémicas humanas Jurkat, y
células de glioblastoma humano U373 eran de ATCC-LGC
(Barcelona, España). Todas las líneas celulares se mantuvieron en
DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal
(FBS). Las células se transfirieron a un mínimo (0,5%) - FBS MEDLINE
IUM inmediatamente antes de la exposición de cannabinoides. via- celular
bilidad se determinó por el 3-4,5-dimetiltiazol-2,5-
difeniltetrazolio tiazol prueba azul (Sigma,
St. Louis, Missouri) de acuerdo con el fabricante del
instrucciones.
Plásmidos, transfecciones e infecciones
La expresión estable de myr-Akt se logró mediante retroviral
infección. N202.1A células fueron transducidas durante 4 h con
sobrenadantes obtenidos a partir de células ecotropic Phoenix pre-
viamente transfectadas con un vector retroviral que lleva HA-
etiquetados myr-Akt (amablemente proporcionado por el Dr. P. Pier Pandolfi,
La Universidad de Harvard, Boston, Massachusetts) o el correspondiente
respondiendo construcción vacía (pBABE). Las células infectadas
se seleccionaron con puromicina.
El análisis de inmunofluorescencia
secciones de tumor embebidas Tissue-Tek se fijaron en PFA
y se incubaron con anti-CB 1 receptor, anti-CB 2 receptor,
anti-CD31 (Pharmingen / BD Biosciences, San Jose, Cali-
fornia), anti-CD45 (Pharmingen / BD Biosciences), anti-
Ki67 (Neomarkers / Vision Lab, Fremont, California) o
anti-caspasa 3 escindida-(Cell Signaling Technology, Dan-
vers, Massachusetts) anticuerpos. Secundario anti-conejo
anticuerpos AlexaFluor 594 y 488 eran AlexaFluor
de Invitrogen (Carlsbad, California). Los núcleos celulares fueron
teñido con Hoescht 33342 (Invitrogen). Fluorescencia
las imágenes fueron adquiridas utilizando Metamorph Premier Desconectado
software (Molecular Devices, Sunnyvale, California).
el tamaño de los vasos sanguíneos se calculó con el software ImageJ.
Cuantitativa en tiempo real PCR (RTQ-PCR) y inversa
transcriptasa PCR (RT-PCR)
Se aisló el ARN con el reactivo Trizol (Invitrogen),
que incluye una etapa de digestión con DNasa, con el Kit real de la estrella
(Durviz, Valencia, España), y el ADNc se obtuvo con
Transcriptor de la transcriptasa inversa (Roche Applied
Science, Penzberg, Alemania). Los cebadores utilizados para
RTQ la amplificación por PCR fueron: CB ratón 1 del receptor,
sentido 5'-GGGCAAATTTCCTTGTAGCA-3 ', antisentido
5'-GGCTCAACGTGACTGAGAAA-3 '; CB ratón 2
receptor, el sentido 5'-ATTCAGGAGATCTGTTAAGA
CAAGG-3 ', 5'-antisentido GACATCTATGAAGTTGAG
GCAGTG-3 '; MMP2 ratón, el sentido 5'-GCGCTTTTC-
TCGAATCCAT-3 ', 5'-antisentido GGGTATCCATCTC
CATGCTC-3 '; MMP9 ratón, el sentido 5'-ACGACATA
GACGGCATCCA-3 ', 5'-antisentido GCTGTGGTTCA
-GTTGTGGTG-3 '; rata ErbB2 (neu), el sentido 5'-GCTCA
GAGACCTGCTTTGGA-3 ', 5'-antisentido AGGAGGAC
GAGTCCTTGTAGTG-3 '; ratón ErbB2, el sentido 5'-
AACAGCTCGGAGACCTGCTA-3 ', 5'-antisentido
GTAGTGGGCACAAGCCTCA-3 '. Las sondas eran de
la Biblioteca de la sonda universal (Roche Applied Science).
Múltiples especies de ARN 18S se utilizó como referencia (sentido 5'
GCTCTAGAATTACCACAGTTATCCAA-3 ', antisentido
5'-AAATCAGTTATGGTTCCTTTGGTC-3 '). El PRI-
meros utilizan para la RT-PCR fueron: la MMP-2 de ratón, el sentido 5'-
TCTGCGATGAGCTTAGGGAAAC-3 ', 5'-antisentido
GACATACATCTTTGCAGGAGACAAG-3 '; ratón
MMP9, el sentido 5'-GGACGACGTGGGCTACGT-3 ',
antisentido 5'CACGGTTGAAGCAAAGAAGGA-3 '.
GAPDH se utilizó como referencia (sentido 5'-GGGAAGCT
CACTGGCATGGCCTTCC-3 ', 5'-antisentido CATGTG
GGCCATGAGGTCCACCAC-3 ').
Análisis de Western Blot
Los lisados celulares de tumores y líneas celulares se sometieron a
SDS-PAGE, y las proteínas se transfirieron a polivinilideno
membranas de fluoruro. Las transferencias se incubaron con el guiente
Lowing antibodiess: anti-CB 1 receptores, anti-CB 2 receptores
(Affinity Bioreagents), anti-MMP9 (Chemicon Interna-
cional INC, Temecula, California), anti-ErbB2 (Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California), anti-fosfato
pho-Akt (Ser473), anti-Akt, anti-fosfo-S6 ribosomal
proteína (Señalización Celular) y anti-a-tubulina (Sigma).
Luminograms se obtuvieron con el Amersham
Kit de detección de quimioluminiscencia (GE
Healthcare, Uppsala, Suecia) y el análisis densitométrico
se realizó con software Quantity One (Bio-Rad).
ensayo de actividad de MMP
MMP-2 (gelatinasa A) y MMP9 (gelatinasa B) actividad
dades se determinaron mediante zimografía de gelatina. Brevemente,
SDS-PAGE se realizaron en presencia de 0,1% de gelatina,
se lavó con un tampón que contenía Triton X-100 2,5%, y
se incubaron durante la noche a 37 ° C en Tris 50 mM pH 7,5, 150
NaCl mM, 10 mM CaCl 2 , 0,1% de Triton X100. Los geles se
luego teñidas con Coomassie azul y bandas digeridos
cuantificados por análisis densitométrico, como se describe anteriormente.
análisis estadístico
ANOVA con un análisis post hoc de Student-Nuevo-
se utilizó rutinariamente prueba hombre-Keuls. Para el análisis de
metástasis y el número de tumores por animal, una
Pearson Х 2 se utilizó la prueba. Para determinar la correlación
entre inmunohistoquímica (CB 1 y CB 2 expresión
sión) y los datos de patología clínica (ErbB2), el Х 2 pruebas
con corrección de Yates o la prueba exacta de Fisher, se utilizó.
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El programa SPSS para Windows (SPSS, Inc., Chicago,
IL, versión 17.0) se utilizó para este análisis. Todos los valores de P
fueron de dos caras. A menos que se indique lo contrario, los datos son
expresado como media ± SEM
Material adicional
Archivo adicional 1: figuras S1-S5. Adicional Figura 1: MMTV-neu
ratones desarrollan espontáneamente tumores de mama y metástasis pulmonares.
Adicional Figura 2: Los cannabinoides inhiben el crecimiento del tumor de
mama in vivo
Adicional Figura 3: tumores derivados de MMTV-neu cannabinoide expreso
receptores Adicional Figura 4: Los cannabinoides modulan la expresión
de MMP2 y MMP9 Adicional Figura 5: Human ErbB2-positivo
líneas celulares de cáncer de mama son sensibles a los cannabinoides
Expresiones de gratitud
Estamos en deuda con el Dr. Vincenzo Bronte (Istituto Veneto Oncológico,
Fondazione IRCCS, Padova, Italia) para el tipo de donación de las células
N202.1A.
También nos gustaría dar las gracias a los miembros de nuestros laboratorios,
especialmente
María Salazar, Sonia Hernández-Tiedra y Marta Cifali, para el apoyo técnico
y la discusión crítica sobre este trabajo. Este estudio fue apoyado por becas
del Fondo de Investigaciones Sanitarias (PI080253 al CS y PI086080971
JP), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2006-00918 a MG, SAF2007-
63075 a GMB y SAF2008-00649 a SM), RETICS (RD06 / 0020/0013 a JP),
Fundación Mutua Madrileña (al CS y al GMB), Consejería de Innovación
Junta de Andalucía (JP), la Fundación Marató TV3 (053.132 a SM) y
GW Pharmaceuticals / Otsuka Pharmaceuticals (CS). MMC fue el destinatario
de una beca de la Fundación Ferrer para la Investigación.
Detalles del autor
1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de Biología, Complutense
Universidad, Madrid, España. Departamento de Inmunología y Oncología,
2
Centro
Nacional de Biotecnología, Madrid, España. Departamento de Bioquímica,
3
Facultad de
Medicina, Universidad Autónoma-Instituto de Investigaciones Biomédicas
"Alberto Sols", IdiPAZ, Madrid, España. Cirugía Departamento de Animales y
4
Medicina,
Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid,
España. Servicio de
5
Anatomía patológica, Hospital Virgen del Rocío, Sevilla, España. actual

6
Dirección: MMC, Departamento de Patología, Universidad de Cambridge, Reino

Unido;
CC, Dept. Ciencias de la Vida, la Open University, Milton Keynes, Reino Unido.
Contribuciones de los autores
MMC participó en el diseño de los experimentos y lleva a cabo los animales
tratamientos, recolección y procesamiento de las muestras (ensayos de actividad
de MMP,
PCR cuantitativa, análisis de Western blot, inmunofluorescencia experimentos
y el cultivo celular se acerca) y los análisis estadísticos. CA y EP-G
participado en los tratamientos de los animales, la recogida de muestras, PCR
cuantitativa y
análisis de Western blot. EM participado en el diseño del estudio y
llevado a cabo experimentos de inmunofluorescencia. CC participó en animales
tratamientos y experimentos de inmunofluorescencia. JMF llevó a cabo la
análisis histopatológicos de tumores animales y las metástasis. GM-B
realizado y analizado los microarrays de tejidos de muestras humanas. IG-R
metástasis analizadas en ratones MMTV-neu por resonancia magnética. JP
llevado a cabo la caracterización histopatológica de muestras de mama humanos.
SM participó en el diseño del estudio. MG contribuido a la
concepción y diseño del estudio y la revisión crítica del manuscrito. CS
concibe el estudio, elaborado su diseño, coordinó la investigación y
escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Recibido: 26 Enero 2010 Aceptado: 22 Julio 2010
Publicado: 22 Julio 2010
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