UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

FACULTAD DE INGENERIA DE PROCESOS

ESCUELA DE INGENERIA QUIMICA

INGENIERIA DE BIOPROCESOS

INVESTIGACION FORMATIVA

TEMA: EXTRACCION DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) A

PARTIR DE LA CIANOBACTERIA Nostoc commune PARA LA
ELABORACION DE PLASTICOS BIODEGRADABLES
DOCENTE: DR. HUGO JIMENES

INTEGRANTES:

 ALEMAN FLORES, MAURICIO DANIEL

 CAYO HIHUALLANCA, TONY

 CONDORI QUISPE, MARIANE VANNESA

 CUMPA PINEDO, MARIA DE LOS ANGELES

 GONZALO CORDOVA, ALDO GONZALO

 ROSAS MENSOZA, MILTON PERCY

Arequipa - perú

2019
 EXTRACCION DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) A PARTIR DE LA
CIANOBACTERIA Nostoc commune PARA LA ELABORACION DE
PLASTICOS BIODEGRADABLES

RESUMEN
Este proyecto tiene por finalidad obtener plástico a partir de la cianobacterias y en este
caso se escogió el Nostoc commune que es conocido comercialmente como murmunta,
del cual se extraerá el phA mediante un proceso microbiológico dentro de un biorreactor
y así poder obtener plásticos biodegradables.
Se escogió como materia prima principal el PHA ya que Los Polihidroxialcanoatos (PHA)
son plásticos biocompatibles y biodegradables sintetizados por una amplia variedad de
microorganismos, que comparten características muy similares con los plásticos de
origen petroquímico.

DESCRIPCION DEL PROBLEMA

La producción excesiva de plásticos a partir de polímeros derivados del petróleo como

el poliestireno y polipropileno ha traído consigo graves problemas ambientales, por lo
que se busca alternativas para suplir este compuesto. Se ha estudiado que los
hidroxialcanoatos presentes en cianobacterias tienen propiedades similares a la de los
polímeros derivados del petróleo, lo cual los hace idóneos para la producción de
plástico, además de que estos biopolímeros presentar mayor biodegradabilidad.
Se propone realizar un estudio de la cianobacteria Nostoc commune, la cual se
encuentra en exceso en el departamento de Puno, cuyo uso es únicamente
gastronómico. El análisis de las condiciones optimas de polihidroxialcanoatos se llevará
a cabo en muestras bajo diversas condiciones, ya que se sabe que bajo un estrés la
cianobacteria produce una mayor cantidad de PHA (Sharma and Mallick, 2004).
El proceso involucra desde el momento del cultivo, selección y desarrollo de la
cianobacteria, pasando por la extracción de PHA y su aplicación en la producción de
bioplásticos, cuyos procedimientos serán detallados en el siguiente punto (Arumugan et
al 2019).
 1. INTRODUCCION
PHA
Los biopolímeros o polihidroxialcanoatos (PHA) son considerados fuertes candidatos para el
reemplazo de los polímeros de origen petroquímico, ya que siendo sintetizados por
microorganismos a partir de sustratos de bajo o nulo valor económico y en general de recursos
renovables, tienen características físicas similares a las de los plásticos derivados del petróleo,
como el polipropileno y polietileno (González et al., 2013; Lee, 1996; Sudesh et al., 2000;
Serrano, 2010), pero tienen la posibilidad de ser degradados a dióxido de carbono y agua en
condiciones aerobias o a metano en condiciones anaerobias (Du et al., 2001), en hábitats tan
diversos como suelo, mar, aguas estancadas o aguas residuales (Barbosa et al., 2005 Carballo et
al., 2003)

Estos, son polímeros de ácidos hidroxialcanoicos que algunos microorganismos acumulan

intracelularmente como material de reserva, para usarlo posteriormente como fuente de
carbono y energía. La polimerización de los ácidos hidroxialcanoicos, por acción de enzimas
intracelulares, tiene lugar mediante condensación del grupo carboxilo de un monómero (ácido
hidroxialcanoico), con el grupo hidroxilo del siguiente, formándose un enlace éster; de ahí que
se han llamados biopoliésteres (Khanna y Srivastava 2005) (Figura 1).

Los PHA son acumulados como polímeros líquidos, móviles y amorfos en forma de gránulos que
se alojan en el citoplasma de los microorganismos, rodeados de una monocapa de fosfolípidos
que contiene enzimas polimerasas y despolimerasas (Figura 2) (Ábalos et al., 2003; Gómez,
2013). Estas bacterias sintetizan los PHA como compuestos de almacenamiento de fuentes de
carbono y energía (Lenz y Marchessault, 2005; Ojumu, et al., 2004) y probablemente cumplen
con otras funciones en la célula bacteriana. De esta manera, constituyen un grupo de materiales
biodegradables de gran potencial biotecnológico (Arcos, 2007).

Figura1: Esquema del gránulo de PHA acumulado intracelularmente

2. METODOLOGIA

DIAGRAMA DEL PROCESO

Enfoque general: Proceso para la obtención de PHA a partir de la biomasa del Nostoc
En general, la producción de los PHAs consiste en tres etapas: (a) Fermentación, (b)
Extracción o recuperación, (c) Purificación. En el proceso de fermentación se produce el
crecimiento de la biomasa y se sintetiza y acumula el polímero. Posteriormente, se
extrae y recupera el polímero de las células, y finalmente se lleva a cabo la purificación
del mismo.

3. EXTRACCION DE POLIHIDROXIALCANOATOS
La metodología reportada más frecuentemente para la extracción de PHA de la biomasa
microbiana ha sido el uso de hidrocarburos clorados, especialmente la técnica utilizando
reflujo con cloroformo (Fuchtenbusch et al. 1996). La solución de PHA resultante se filtra
para remover restos de células, luego se concentra y el PHA se precipita en metanol o
etanol (Fig. 9). Con esta técnica los lípidos de bajo peso molecular se queden en solución
y no interfieren con la determinación. El uso de solventes clorados es más utilizado para
la extracción de PHA de cadena corta como el P3HB, sin embargo, los PHA de cadena
media son solubles en un rango de solventes más amplio. Debido a que el uso a gran
escala de los solventes mencionados anteriormente puede ser costoso, también se han
desarrollado otros procesos de extracción con base en el uso de etileno y propilen
carbonato (Fiorese et al. 2009), así como metodologías que se basan en la liberación del
polímero de las células mediante la ruptura de las mismas usando soluciones de
hipoclorito de sodio, ácidos o bases.
 Figura2: Esquema general de producción de PHA, en el que se indican las
características de los procesos de fermentación, recuperación y procesamiento
del polímero según su uso final (Babel y Steinbüchel 2001).

2.1 Análisis cualitativo

METODO: TINCION CON AZUL DE NILO

Es el método mas adecuado ya que por fluorescencia, los PHA desprenden un
poco de brillo (la materia inorgánica se excita a una determinada longitud de
onda), y se puede establecer una diferencia sin interferencias (López García,
2016).

Descripción:
a) Excitar la muestra por fluorescencia, de modo que resalte los PHB.
b) Fijar por calor unas gotas de la muestra en un portaobjetos.
c) Añadir azul de Nilo al 1% a 55°C por 5 minutos,
d) Limpiar la muestra con una dilución al 8% de ácido acético en agua.
e) Dejar secar.
 f) Observar en un microscopio de fluorescencia.
2.2 Análisis cuantitativo
METODO: CALIBRACION ESPECTROFOTOMETRICA
Es el método mas conocido para hallar la concentración del componente en
estudio del sustrato a partir de su absorbancia (López García, 2016).
Descripción:
a) Extraer cierta cantidad de muestra e introducirla en un tubo de DQO.
b) Añadir 3mL de hipoclorito de sodio al 15% p/v.
c) Añadir 5 gotas de NaOH al 50%.
d) Añadir 3mL de cloroformo.
e) Colocar toda la muestra en baño de agua a 70 – 75°C durante 1 hora y 30
minutos, agitando con el vortex cada 15 minutos.
f) Centrifugar a 4200 rpm por 5 minutos y descartar el sobrenadante.
g) Añadir 3mL de cloroformo, colocar en baño de agua hirviendo esperar a
que se caliente el cloroformo y agitar con vortex 2 minutos.
h) Centrifugar a 4200 rpm por 3 minutos.
i) Extraer el cloroformo y verterlo en un matraz aforado.
j) Añadir 2mL de cloroformo al tubo.
k) Colocar en agua hirviendo, esperar a que se caliente el cloroformo y
agitar con vortex por 2 minutos.
l) Centrifugar a 4200 rpm por 3 minutos.
m) Extraer el cloroformo, verter en matraz y enrrasar.
n) Evaporar el cloroformo.
o) Añadir 10mL de H2SO4 y poner en baño de agua hirviendo durante 10
minutos.
p) Esperar a que enfrie y agitar.
q) Esperar a que el acido quede sin burbujas y medir en el
espectrofotómetro a longitud de onda de 235nm.
r) Extraer varias muestras en distintas fechas y repetir el procedimiento.

4. PURIFICACIÓN DE LA MUESTRA

a) Separar la biomasa del caldo.

b) Añadir un disolvente, para evitar el cloroformo (agente altamente
contaminante) se suele utilizar carbonato de etileno o de propileno, así como
metodologías de digestión química con hipoclorito de sodio, ácidos o bases.
c) Centrifugar la solución resultante y filtrar.
d) Precipitar el polímero en metanol o etanol.
e) Recuperar el polímero por evaporación.
 3.1 Análisis de parámetros de control

 pH: Mediante el potenciómetro. El pH del sistema debe ser neutro entre 7.5
– 8.5.
 Aniones: Corresponden a nitritos, nitratos, fosfatos y sulfatos. El método de
medición es por cromatografía iónica.

5. SINTESIS DE BIOPLASTICO

La norma ASTM- 5488-944, define la biodegradabilidad como la capacidad de un

material en descomponerse en CO2, metano, agua y componentes orgánicos,
por acción de microorganismos.

Clasificación
 Plásticos biodegradables a base de almidón: Se crea una mezcla entre
almidón y plástico (almidón-polietileno).
 Polihidroxialcanoatos: (PHA) Son polímeros 100% biodegradables
producidos por microorganismos.
 Mezclas de polímeros biodegradables: Como los polivinilalcohol (PVOH)
+ Policaprolactonas (PCL)
 Pullulano. Formado por unidades de maltotriosa. (tres unidades de
glucosa unidos por enlace α-1, 4). Las maltotriosas están unidas por
enlace α-1, 6.
PHA:
Los polihidroxialcanoatos más comunes son el P3HB (ácido polihidroxibutírico),
el PLA (Poliácido láctico o poliláctida), el PGA (Ácido poliglicólico), el P3HV (poly
3-hidroxivalerato) y el P(3-HHx) poli 3-hidroxihexanoato (Koller, Vadlja et al
2017).
 6. METODOLOGIA PARA ELABORAR EL BIOPASTICO A PARTIR DE PHA
El método más empleado es el cultivo por lote alimentado. En el cultivo de bacterias con
producción de PHA asociada al crecimiento, se utiliza un sistema de lote alimentado en
una sola etapa en la que se proporciona un medio enriquecido en nutrientes. En cambio,
para el cultivo de bacterias que requieren la limitación de algún nutriente esencial, el
método más empleado es el cultivo por lote alimentado en dos etapas. La primera etapa
se lleva a cabo en un medio enriquecido en nutrientes para favorecer el crecimiento
celular, y en la segunda etapa se limita la concentración total o parcial de un nutriente
esencial para promover la síntesis de PHA. En esta segunda etapa, el incremento en
biomasa se debe a la acumulación intracelular del polímero (Khanna y Srivastava, 2005).
También se han estudiado métodos de cultivos mixtos por lote alimentado en dos
etapas, en los que se usan dos tipos de microorganismos diferentes. Uno de los
microorganismos transforma la fuente de carbono barata en sustratos asimilables para
que el otro microorganismo los utilice para producir PHA (Tanaka y cols., 1993) Después
del proceso de fermentación, para la recuperación de la biomasa, el caldo de cultivo se
centrifuga y la biomasa precipitada se filtra. Para la extracción del polímero del interior
de las células se usan normalmente disolventes clorados, especialmente por reflujo con
cloroformo. Debido a que los disolventes clorados son altamente agresivos para el
medio ambiente y para la salud humana, se han desarrollado otros procesos de
extracción basados en el uso de carbonato de etileno o de propileno, así como
metodologías de digestión química que se basan en la liberación del polímero mediante
la ruptura de las células usando soluciones de hipoclorito de sodio, ácidos o bases. Una
vez añadido el disolvente, la solución resultante se centrifuga y se filtra para eliminar
restos de células. Posteriormente, el PHA se precipita normalmente en metanol o etanol
y se recupera el polímero por evaporación del disolvente (Fiorese y cols., 2009)

7. CONDICIONES ADECUADAS PARA EL CULTIVO DE MURMUNTA

Aldave (2015) asegura que el “cushuro” crece en ecosistemas que contienen cloruro de
calcio, sulfatos de magnesio y otros elementos que están en forma natural en las lagunas
y que existen medios de cultivo para industrializar el Nostoc en laboratorio (Ver Tabla
1).
Tabla 1: Medio de cultivo para la industrialización de Nostoc sp en laboratorio.
 A) Tratamiento para la Utilización de Murmunta
Se utilizó colonias de cianobacterias Nostoc commune “murmunta”, adquiridas en un
mercado local, hidratadas por 24 h en agua destilada y mantenidas en contenedores de
polietileno de alta densidad en medio hidropónico y temperatura ambiente hasta su
empleo. Las colonias fueron mantenidas con fotoperiodos de luz indirecta de 10 a 12 h
por día (López García, 2016).
B) Condiciones de crecimiento en el Biorreactor
Se desarrolló en un biorreactor, que contenía las células algales del Cushuro, el medio
de cultivo y la fuente de carbono, con dos luminarias a 50 µmol de fotones (3700 lux
ambas luminarias), durante 12 horas (12 horas de luz, 12 horas de oscuridad), a una
temperatura de 10 ± 2 °C, con constante suministro de aire. Las fuentes de carbono
fueron: dióxido de carbono, bicarbonato de sodio y etanol (López García, 2016).

8. REFERENCIAS:

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microbiano/ Gonzales García/ (2013) Recuperado de:
http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v29n1/v29n1a7.pdf