La tecnica en los que se basa el funcionamiento del Espectrofotómetro UV-VIS UV modelo1700

es:

LA ESPECTROFOTOMETRIA

ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA

Dado que la reflexión de la luz es de un interés mínimo en espectrofotometría, se tiene que lo

relevante es la absorbancia y transmitancia de la luz.

El color que vemos en una muestra de solución se debe a la absorción selectiva de ciertas
longitudes de onda de luz visible y transmitancia del resto longitudes de onda. Si una muestra
absorbe todas las longitudes de onda en la región visible del espectro, aparecerá negro; si no
absorbe ninguno de ellos, aparecerá blanco o incoloro. Vemos los distintos colores cuando las
longitudes de onda radiante de la energía golpean nuestros ojos.

Definimos transmitancia como la relación de la cantidad de luz transmitida a la cantidad de luz

que cayó inicialmente en la superficie.

Fig.1 TRANSMITANCIA EN UNA MUESTRA

La ecuación de la transmitancia se define como sigue:

Transmitancia (T) = P / P0

Donde:

 T = Transmitancia.
 P = Intensidad de la luz transmitida.
 P0 = Intensidad de la luz incidente.

La absorbancia se define como el logaritmo negativo de la transmitancia, y se observa que la

absorbancia y la transmitancia tienen una relación inversa, como se muestra a continuación:

Absorbancia(A) = -log (T) = -log ( P ⁄ P0 )

Esto permite que diferentes espectrofotómetros con diferentes fuentes de luz produzcan
lecturas de absorción independientes de la potencia de la fuente de luz.
A continuación, supongamos que hay dos tubos de ensayo, ambos contienen la misma
solución en la misma concentración. La única diferencia es que uno de los tubos de ensayo es
más delgado que el otro, las imágenes se muestran a continuación:

Fig. 2 LONGITUDES DE TRAYECTORIAS DIFERENTES POR DISTINTAS MUESTRAS

Hacemos pasar luz de la misma intensidad (P0) en ambos contenedores. En el primer caso la luz
tiene que viajar sólo en una corta distancia, mientras que en el segundo caso tiene que pasar a
través de una longitud mucho más larga de la muestra. Podríamos deducir que en el segundo
caso más cantidad de la luz será absorbida, ya que la longitud de la trayectoria es mucho más
larga. En otras palabras, la absorbancia aumenta a medida que la longitud de la trayectoria
aumenta.

Las dos observaciones descritas anteriormente (las que se refieren a la relación entre
la absorbancia y la concentración y la absorbancia y la longitud de la trayectoria) constituyen
la Ley de Beer-Lambert, que se muestra a continuación:

A=ε*ι*c

Donde:

 A es un número adimensional.
 ι la constante de proporcionalidad, se denomina coeficiente de extinción molar o
absortividad molar, tiene unidades de litro/mol*cm.
 c tienen las unidades habituales de longitud (cm) y concentración (mol/litro).

El coeficiente de extinción (ε) es una constante para una sustancia dada, siempre que la
temperatura y la longitud de onda son constantes. En la práctica, el coeficiente de extinción
medido también depende de las características del instrumento utilizado. Por esta razón,
normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extinción para análisis
cuantitativo. Para transiciones electrónicas, la diferencia de energía entre los estados
fundamentales y excitados, es relativamente grande. Por tanto, a temperatura ambiente, es
muy probable que todas las moléculas estén en estado electrónico fundamental. La absorción
y vuelta al estado fundamental, son procesos rápidos por lo que el equilibrio se alcanza muy
rápidamente.

Es importante notar que ε es una función de la longitud de onda y por lo tanto la Ley de Beer-
Lambert es verdadera sólo para la luz de una sola longitud de onda o luz monocromática.

La medida cuantitativa de la absorción de la luz en función de la longitud de onda puede

establecer tanto la identidad como la concentración de una sustancia en solución.

MEDICIONES DE TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación entre la muestra

problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje
de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.

SELECCIÓN DE LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO.

La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en la cual la

absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y recibe la denominación de Lambda
máximo (λmax). Para seleccionar el λmax., se hace un espectro de absorción o curva espectral,
y que consiste en una gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de
concentración adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el λmax.
(Fig.3).

Fig. 3. CURVA ESPECTRAL

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera que
absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan
en la zona visible del espectro electromagnético (380 a 800nm). En el caso de sustancias no
coloreadas, las mediciones se realizan en la región ultravioleta del espectro electromagnético
(200 a 380nm).
CURVA DE CALIBRACIÓN

Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una muestra
problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de calibración es una gráfica que
relaciona la concentración de al menos cinco soluciones de estándar de concentraciones
conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max) (Fig.
4).

Fig. 4. CURVA DE CALIBRACION

Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta dicha recta a
través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos cuadrados, la cual relaciona la
absorbancia y la concentración de un analito. La siguiente ecuación matemática corresponde a
dicha función:

A = m*c + n
 A : Absorbancia.
 n : Intercepto de la recta
 m : Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la
muestra y el espesor b de la cubeta.

Luego se mide la absorbancia de la solución problema y se interpola su valor en la gráfica o se

reemplaza en la ecuación, para obtener el valor de concentración del analito. La concentración
de la solución problema debe estar comprendida en el rango de concentración que comprende
la curva de calibración. Si la concentración de la solución problema es menor que la
concentración del estándar más diluido, debe usarse el método de adición estándar, que
consiste en adicionar un volumen determinado de un estándar concentrado a la solución
problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de las
obtenidas para la curva de calibración. En el caso contrario, si la concentración del analito es
mayor que la concentración del estándar más concentrado la solución problema deberá ser
diluida.
 Fig. 5. INTERPOLACION GRAFICA

Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de máxima absorbancia

(λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente y así tener mayor sensibilidad y
precisión al hacer las mediciones. La medición de la absorbancia de la solución problema debe
hacerse a la misma longitud de onda que fue hecha la curva de calibración.