See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/265060657

Aktivitas Antibakteri Sel Amobil Streptomyces Sp-1 dalam Matrik Ca-alginat

dan Ba-alginat terhadap Staphylococcus aureus

Article

CITATIONS READS

0 222

3 authors, including:

Toto Poernomo
Faculty of Pharmacy Airlangga University, Surabaya, Indonesia
26 PUBLICATIONS   9 CITATIONS   

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Fibrinolytic enzyme View project

All content following this page was uploaded by Toto Poernomo on 07 April 2016.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

Aktivitas Antibakteri Sel Amobil Streptomyces Sp-1 dalam Matrik Ca-alginat dan Ba-alginat terhadap
Staphylococcus aureus
Achmad Toto Poernomo, Mirza Lailiana, Isnaeni
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya

Immobilization of Streptomyces sp-1 cells has been performed by using Ca-alginate and Ba-alginate as
matrix, that was prepared by mixing 20 mL of sodium alginate solution 2% (w/v) added by cells of
Streptomyces sp-1 with 50 mL of CaCl2 0.25 M and 50 mL of BaCl2 0.25 M respectively.
The immobilization produces cell beads and their activities against Staphylococcus aureus investigated and
compared for observing capacity of Ca-alginate and Ba-alginate matrix to entrap the cells. Fermentation
processes for producing anti bacterial substances from the cell beads carried out in ISP-4 liquid medium at
30oC and 100 rpm. Activity of the antibiotics produced in the fermentation broth measured by agar
diffusion method, that presents their potency to inhibit the Staphylococcus aureus growth and expressed as
diameter of inhibition zone (mm). The result shows that the activity of Streptomyces sp-1 cell beads of Ca-
alginate is 1.08 folds compare with cell beads of Ba-alginate.

Keywords: Anti bacterial activity, Streptomyces sp-1, immobilized cells, Ca- alginate, Ba alginate,
Staphylococcus aureus

PENDAHULUAN viabilitas dan aktivitas sel amobil, tidak beracun serta

Kemampuan Actinomycetes aerobik dalam
menghasilkan molekul bioaktif memiliki arti penting di
kalangan para ahli bakteriologi, bioteknologi, genetika dan
ekologi (Pirouz ????, 1999). Salah satu genus
Actinomycetes yang terkenal karena potensinya
memproduksi senyawa aktif adalah Streptomyces, yang
mampu menghasilkan berbagai senyawa aktif dan telah
diproduksi dalam skala industri (Betina, 1983). Salah satu
senyawa aktif tersebut adalah senyawa yang mampu
menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri
patogen baik dari golongan Gram-positif maupun Gram-
negatif, misalnya antibiotika aminoglikosida, tetrasiklin,
aureomisin dan kloramfenikol (Lividans,
http://www.turkuamk.fi/varsta/ lividans. htm ??? ).
Produksi antibakteri melalui proses fermentasi dapat
menggunakan sel utuh (whole cells) atau menggunakan sel
amobil (immobilized cells) (Srinivasulu et al, 2003).
Amobilisasi sel oleh Chibata ??? (1983) didefinisikan
sebagai suatu metoda untuk menjebak atau menempatkan
sel mikroba secara fisik pada suatu ruang tertentu dan pada
kondisi ini sel masih memiliki aktivitas, serta dapat
dipergunakan secara kontinyu dan berulang kali.
Implementasi sel amobil banyak dimanfaatkan baik di
bidang industri obat antara lain untuk produksi antibiotika,
enzim (Kokubu dan Suzuki, 1981) maupun industri
makanan (Groboillot, 1994).
Teknik amobilisasi sel dapat dilakukan dengan tiga
cara, yaitu ikatan dengan carrier, ikatan silang dan
metoda penjebakan (Cibata, 1983). Metoda yang
terakhir ini biasanya dilakukan dalam matrik polimer
dan merupakan metoda yang paling sering dipelajari
untuk dikembangkan. Adapun polimer yang dapat
digunakan adalah kolagen, gelatin, selulosa triasetat,
alginat, K-karrageenan, agar, poliakrilamid, dan
polistiren untuk menghasilkan sel amobil dalam bentuk
manik-manik, kubus atau lembaran (Poernomo, 1997;
Aulanni’am, ???? 1997). Metoda penjebakan dengan
matrik alginat lebih sering digunakan, karena sederhana
dalam pelaksanaannya, dapat mempertahankan
murah dan mudah didapat (Srinivasulu et al., 2003).
Penelitian ini akan difokuskan pada produksi
senyawa antibakteri dari sel amobil Streptomyces sp-1
yang diisolasi dari tanah hutan pinus Lawang Malang.
Proses amobilisasi dilakukan dengan metoda
penjebakan menggunakan matrik Ca-alginat dan Ba-
alginat, yang dibuat dari campuran Na-alginat 2% yang
telah ditambah sel Streptomyces sp-1 dan CaCl2 0,25 M
atau BaCl2 0,25 M. Manik-manik sel yang diperoleh
diproses melalui fermentasi dalam medium ISP-4 cair
pada suhu 30 oC dan kecepatan pengocokan 100rpm. Uji
daya antibakteri kaldu fermentasi dilakukan dengan
metoda difusi agar menggunakan Staphylococcus
aureus sebagai bakteri uji. Aktivitas antibakteri diukur
dan dinyatakan sebagai diameter zona hambatan.
BAHAN DAN METODE
Bahan penelitian. Sebagai mikroba penghasil senyawa
antibakteri digunakan Streptomyces sp-1 isolat tanah hutan
pinus Lawang, Malang yang diperoleh dari Jurusan Biologi
Fakultas MIPA Universitas Airlangga Surabaya. Bakteri
uji digunakan Staphylococcus aureus ATCC 25923 yang
diperoleh dari Laboratorium Bakteriologi dan Mikologi
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga
Surabaya. Media Nutrient Agar - NA (Oxoid) dan Malt
Salt Aga–MSA (Oxoid) masing-masing digunakan sebagai
media uji atau media pertumbuhan dan media selektif
untuk identifikasi Staphylococcus aureus, media
International Streptomyces Project (ISP-4) padat dan cair
masing-masing digunakan sebagai media pertumbuhan
Streptomyces sp-1 dan media fermentasi. Larutan salin
(NaCl teknis 0.9%) digunakan sebagai pengencer
inokulum. Bahan untuk pembuatan matrik amobilisasi
digunakan Na-alginat (Sigma), CaCl2 (pa, Merck) dan
BaCl2 (pa, Merck).
Alat. Thermoshaker (Gerhardt), Jangka sorong (Tricle
Brand), pipet mikro (Soccorex), Ring stainless steel,
Autoclave (Pressure Steam Sterilizer 0,14 Mpa), Laminar
Airflow Cabinet (Dalton).
Metoda kerja
 Peremajaan mikroba. Streptomyces sp-1 dari
persediaan induk diambil satu õse, digesekkan di atas
permukaan media agar miring ISP-4 segar, diinkubasi
pada suhu 30 oC (suhu kamar) selama 2-4 hari.
Staphylococcus aureus dari persediaan induk diambil satu
õse digesekkan di atas permukaan media miring Nutrient
Agar (NA) segar, diinkubasi pada suhu 35 oC selama 24
jam. Sebelum dilakukan peremajaan mikroba uji ditanam
pada media selektif MSA untuk konfirmasi identitas.
Produksi biomassa Streptomyces sp-1. Ke dalam
kultur Streptomyces sp-1 pada media agar miring ISP-4
padat yang telah berumur empat hari ditambah 10 mL
larutan salin steril, divortek untuk melepaskan spora
dari permukaan agar. Inokulum dipindahkan ke dalam
Erlenmayer 250 mL yang berisi 50 mL media ISP-4
cair, dikocok dengan thermoshaker dengan kecepatan
100rpm pada suhu kamar selama 24 jam. Suspensi
biakan yang dihasilkan digunakan sebagai starter.
Sebanyak 100 mL media ISP-4 cair ditambahkan ke
dalam starter, dikocok 100 rpm pada suhu kamar
selama 24 jam. Isi labu dipindahkan secara kuantitatif
ke dalam tabung sentrifus yang telah diketahui beratnya.
Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 3.000 rpm
selama 30 menit untuk memisahkan sel dari
supernatannya. Setelah supernatan dibuang, sel dicuci
secara aseptis dengan larutan salin dan ditimbang
sebagai berat basah.
Pembuatan sel amobil. Ditimbang lebih kurang satu
gram massa sel, ditambah 20 mL larutan Na-alginat 2%
steril. Pembuatan Na-alginat dilakukan dengan mencampur
dua gram Na-alginat ke dalam 100 mL air suling steril
hangat, kemudian sel disuspensikan dengan bantuan mixer
selama 3 menit untuk memperoleh konsistensi yang seragam
tanpa adanya gumpalan. Suspensi Na-alginat dan sel yang
telah dicampur diteteskan ke dalam 50 mL larutan CaCl2
0,25 M steril dingin melalui pipet tetes steril sambil diaduk
dengan kecepatan konstan. Manik-manik sel yang terbentuk
berdiameter 2-3mm, didiamkan selama 1 jam pada suhu 4oC
untuk proses curing, selanjutnya dicuci dengan air steril dan
dipisahkan dari larutan CaCl2 dengan penyaringan
menggunakan Büchner (Chibata, Tosa, and Sato, 1986).
Amobilisasi sel dalam Ba-alginat dilakukan sama
seperti amobilisasi dengan Ca–alginat, kecuali larutan
CaCl2 0,25 M diganti larutan BaCl2 0,25 M. Selanjutnya
manik-manik dalam kedua matrik siap digunakan
sebagai bahan fermentasi.
Fermentasi sel amobil. Manik-manik sel
dipindahkan ke dalam labu Erlenmayer 250 mL yang
berisi 50 mL media ISP-4 cair, diinkubasi dalam
thermoshaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 30
o
C selama tujuh hari. Setiap 24 jam dilakukan
pengambilan sampel untuk dilakukan uji aktivitas.
Uji aktivitas antibakteri
Penyiapan media dasar. Media uji terdiri dari
media dasar dan media perbenihan. Media dasar
disiapkan dengan cara menimbang media Nutrient agar
(NA) sebanyak 6,5 gram, dilarutkan dalam 100 mL air
suling, disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 oC
selama 15 menit. Sebanyak lebih kurang 10 mL media
steril yang bersuhu 45 oC dituang ke dalam petri steril,
dibiarkan memadat.
Penyiapan media perbenihan. Media perbenihan
disiapkan sama dengan media dasar dengan volume 7 mL
yang kemudian ditambah inokulum bakteri uji. Penyiapan
bakteri uji dilakukan dengan cara: ke dalam biakan
Staphylococcus aureus yang berumur 24 jam dalam media
NA miring ditambahkan 10 mL salin, divortek sampai
seluruh koloni terlepas dari permukaan agar. Kerapatan
optik suspensi inokulum diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 580 nm, bila perlu dilakukan
pengenceran dengan larutan salin sampai diperoleh
transmitan 25%. Sebanyak 7 L inokulum dimasukkan ke
dalam 7 mL media NA cair bersuhu 45oC, dikocok
homogen, dituang ke dalam petri di atas permukaan media
dasar yang telah memadat, selanjutnya didiamkan sampai
memadat. Dibuat sumur pada media agar padat sebagai
pencadang larutan uji dengan ukuran tinggi 3 mm dan
diameter 0,8 cm. Metoda yang digunakan merupakan
modifikasi metoda standar USP 28.
Pelaksanaan uji. Dari setiap labu fermentasi diambil
sebanyak 50L kaldu fermentasi, dimasukkan ke dalam
pencadang pada media uji dalam cawan petri, kemudian
diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 jam (Isnaeni,
1998). Diameter zona hambatan diukur, selanjutnya
dibuat kurva yang menunjukkan hubungan antara waktu
fermentasi (hari) dengan diameter zona hambatan (mm).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Spesifikasi Streptomyces sp-1 dalam media ISP-4
nampak sebagai koloni liat seperti kulit, berwarna abu-abu
berbau khas geosmin (bau tanah), dan dalam media cair
pada pengamatan di bawah mikroskop terlihat bentuk
noktah dengan diameter bervariasi. Ciri morfologi
Streptomyces sp-1 sama dengan ciri umum Streptomyces sp.
(Izaguirre et al., 1982), namun pada penelitian ini belum
dilakukan identifikasi sampai tahap penentuan spesies. Hasil
identifikasi Staphylococcus aureus pada media selektif Malt
Salt Agar (MSA) juga menunjukkan karakter sesuai dengan
ciri standar Staphylococcus aureus (USP, 1995).
Karateristik manik-manik sel amobil yang diperoleh
menunjukkan bentuk seperti tersaji pada Gambar 1. Manik-
manik berbentuk bulat dengan diameter 3-5mm, berwarna
putih keruh seperti susu. Untuk memperoleh bentuk manik-
manik yang seragam dan bulat sempurna, diperlukan
pengaturan kecepatan penetesan dan pengadukan larutan
penampung (CaCl2 atau BaCl2), sehingga diperoleh kondisi
yang optimal.
Konsistensi diameter pipet yang digunakan juga
merupakan salah satu faktor penentu keseragaman diameter
manik-manik sel. Tekstur manik-manik dipengaruhi oleh
porositas yang juga dipengaruhi oleh konsentrasi Na-alginat
(Srinivasulu, 2003), sehingga mempengaruhi aktivitas sel
amobil. Menurut Smidsrod (1974), manik-manik dapat
bertambah kekuatannya sebanding dengan afinitas kation
divalen yang ditambahkan. Untuk gel alginat, kekuatannya
akan meningkat sebanding dengan besar afinitas kation
divalen. Adapun urutan besar afinitas kation divalen sebagai
berikut: Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Mg2+, sehingga gel alginat yang
dibuat dari BaCl2 lebih kuat dibandingkan gel yang dibuat
dari CaCl2.
Hasil penimbangan berat basah sel Streptomyces sp-1
sebelum diamobilisasi dan data hasil uji aktivitas masing-
masing tersaji pada Tabel 1 dan Tabel 2. Data dalam Tabel 1 Gambar 1. Manik-manik sel amobil Streptomyces sp-1
menunjukkan harga SD untuk matrik Ca-alginat berbeda dalam matrik Ca-alginat (A) dan Ba-alginat (B)
0,02 satuan dibandingkan harga SD untuk Ba-alginat, tetapi
waktu alur fermentasi yang tersaji pada Gambar 2 dan Tabel 1. Hasil penimbangan berat basah sel
Gambar 3 serta Gambar 4 menghasilkan profil yang sama. Streptomyces sp-1
Berdasarkan hasil uji Q (Values of Rejection Quotion)
diperoleh harga Q hitung 0,43 lebih kecil dari Q Tabel Matrik Berat basah sel (g) Rerata SD
(0,94), sehingga dapat disimpulkan bahwa perbedaan berat Ca-alginat-1 0,809
basah antar repliksi tidak bermakna atau seluruh data dapat Ca-alginat-2 0,702 0,690 0,124
dipergunakan untuk perhitungan. Ca-alginat-3 0,561
Ba-alginat-1 0,885
Ba-alginat-2 0,724 0,739 0,140
Ba-alginat-3 0,607

A B

Tabel 2. Hasil pengamatan diameter zona hambatan pada uji aktivitas antibakteri kaldu fermentasi sel amobil dengan
matrik Ca-alginat dan Ba-alginat terhadap Staphylococcus aureus

Waktu Diameter zona hambatan (mm)

fermentasi Matrik Ca-alginat Matrik Ba-alginat
(hari)
Repl. Repl. Rerat
Repl.1 Repl. 1 Repl. 2 Repl. 3 Rerata
2 3 a
1 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0
18,
3 0 0 - 0 0 0 0
3
24, 23, 23,
5 24 22,7 21,8 21,6 22,0
5 9 5
26, 24,
6 27 26 24,9 24,3 23,5 24,2
4 7
27, 26, 26, 26,
7 26,3 25,4 24,2 25,3
3 4 5 7
27, 27, 27,
8 27 26,8 26,7 25,7 26,4
8 7 5
28, 28, 28, 28,
9 26,8 26,4 26,5 26,6
9 7 1 7
28, 27, 27, 27,
10 26,4 25,5 26,3 26,1
4 9 4 9
26, 25, 26,
12 27 24,1 25,1 25,0 24,7
7 5 4
26, 26, 25,
13 26 24,4 24,9 24,6 24,6
2 5 2
25, 25, 25,
14 26 24 24,8 23,2 24
4 2 5
24, 24, 24, 24,
15 23,5 24,1 23,3 23,6
3 4 2 2
 305
Gambar 4. Perbandingan alur fermentasi sel amobil
dengan matrik Ca-alginat dan Ba-alginat dalam media
Diameter zona hambatan (x 0.1 mm)

Replikasi 1
290
ISP-4 pada suhu 30 oC, dan kecepatan 100 rpm
Replikasi 2
Replikasi 3
275 Perbandingan alur fermentasi sel amobil dengan
matrik Ca-alginat dan Ba-alginat yang tersaji pada
260 Gambar 4 ternyata menunjukkan profil yang sama,
namun hasil analisis data statistik dengan program SPSS
245 menunjukkan perbedaan yang bermakna. Aktivitas
antibakteri yang dihasilkan sel amobil dengan matrik
230
Ca-alginat 1,08 kali lebih besar dibandingkan aktivitas
5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 dalam matrik Ba-alginat (Gambar 5).
Waktu (hari)

Gambar 2. Alur fermentasi sel amobil dengan matrik

Ca-alginat dalam media ISP-4 pada suhu 30oC, dan
kecepatan 100 rpm
275
Replikasi 1
Diameter zona hambatan (x 0.1 mm)

Replikasi 2
260
Replikasi 3

245

230

215

200
5 6 7 8 9 10 12 13 14 15
Waktu (hari)

Gambar 3. Alur fermentasi sel amobil dengan matrik Gambar 5. Hasil uji daya hambat sel amobil dengan
Ba-alginat dalam media ISP-4 pada suhu 30 oC, dan Matrik Ca-alginat (A) dan Ba-alginat (B) terhadap
kecepatan 100 rpm S. aureus pada hari ke- 8

305 Hasil ini sesuai dengan penelitian Srinivasulu et al

Ca-alginat (2003), bahwa konsentrasi antibiotika lebih rendah pada
Diameter zona hambatan (x 0.1 mm)

290
Ba-alginat manik-manik alginat yang dibuat dengan penambahan
275 ion barium (Ba) dan strontium (Sr). Fenomena ini dapat
260 dijelaskan melalui konsep kekuatan gel, bahwa semakin
kuat gel alginat, semakin rendah porositas pada gel Ba-
245
alginat, sehingga penetrasi nutrisi dan oksigen ke dalam
230 sel menjadi berkurang. Produksi antibiotika atau
senyawa aktif lain dalam proses fermentasi dipengaruhi
215
oleh ketersediaan nutrisi yang memadai di dalam media
200
5 6 7 8 9 10 12 13 14 15
Waktu (hari)
 fermentasi (Bushell, 1988). Aktivitas akan menurun
apabila suplai nutrisi terhambat.
Menurut Doran (1986), amobilisasi juga berpengaruh
terhadap pertumbuhan sel yang terikat pada matrik gel
selama proses fermentasi. Dibandingkan dengan
aktivitas sel utuh (Aulia, 2005), sel amobil Streptomyces
sp-1 menunjukkan fasa stasioner lebih panjang, yaitu
mulai hari ke-6 sampai hari ke-14 dengan puncak
aktivitas pada hari ke-9. Produksi antibiotika oleh
Streptomyces sp. biasanya terjadi pada fasa stasioner
(Szabo et al., 1985) untuk melindungi hifa yang masih
muda dari pengaruh lingkungannya. Fenomena ini dapat
menjelaskan kelebihan teknik amobilisasi dan dijadikan
sebagai landasan untuk mengembangkan produksi
senyawa antibakteri dari sel amobil pada kultur
kontinyu (continuous culture) dalam suatu bioreaktor.
Kesimpulan. Aktivitas antibakteri yang dihasilkan
sel amobil dengan matrik Ca-alginat 1,08 kali lebih
besar dibandingkan aktivitas dalam matrik Ba-alginat.
Saran. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
tentang aktivitas antibakteri pada penggunaan ulang
(reuse cycle) sel amobil Streptomyces Sp-1 dalam
matrik Ca-alginat
DAFTAR PUSTAKA
Aulanni’am, B.C., Warsito, A.P. dan Mahdi, C. (1997).
Optimasi Medium Shake Flask Culture Untuk
Produksi Enzim Selulose Dari Trichoderma Viride
Bebas Dan Amobil. Jurnal Penelitian Ilmu-Ilmu
Teknik (Engineering), Vol.9, No.1, hal.27-28.
Hapsari, A.D. (2006). Pengaruh konsentrasi ampas tahu
dalam media fermentasi antibiotika dari
Streptomycews sp-1, Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Airlangga, 2006
Betina, V. (1983), The Chemistry And Biology Of
Antibiotics, Pharmacochemistry Library, 5, Elsevier
Scientific Publishing Company, New York, 121, 221-227
Bushell, M.E., (1988) Growth, Product Formation And
Fermentation Technology, dalam Good fellow (Ed),
Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press.,
New York, pp. 208-209
Chibata, I., Tosa, T. and Fujimura, M. (1983).
Immobilized Living Microbial Cells. Annu. Rev.
Biophys. Bioeng., 6: 1.
Chibata, I., Tosa, T., and Sato, T. (1986). Methods of
Cell Immobilization in: Demain (ed.), Manual Of
View publication stats
Industrial Microbiology And Biotechnology, pp. 217-
229.
Doran, P.M. and Bailey, J.E. (1986). Effects of
Immobilization on Growth Fermentation Properties
and Macromolecular Composition of Saccharomyces
cereviceae Attached to Gelatin. Biotech. Bioeng. 28.
pp 73.
Groboillot, A., Boadi, D.K.; Poncelet, D. and Neufeld,
R.J. (1994). Immobilized of cells for application in
the food industry in: Steward, G.G. and Russhell
(Eds.). Special Issue on Immobilized Cells
Technology in Food Processing Crit. Rev. in Biotech.
Vol. 14/issue 2. CRC. Press., pp. 75-107.
http://www.turkuamk.fi/varsta/lividans.htm), 2005
Isnaeni, 1998 Mutasisntesis Antibiotika Mutan
Streptomyces griseus ATCC 10137, Disertasi, ITB,
Bandung, pp. 43-46.
Izaguirre, G., Hwang, C.J., Krasner, S.W. and
McGuire, M.J. (1982), Geosmin and 2-Methyl-
isoborneol from Cyanobacteria in Three Water
Supply System, Appl. Environ. Microbiol., 43,3,707.
Kokubu, T. and Suzuki, S. (1981), Protease Production
by Immobilized Mycelia of Streptomyces fradiae, J.
Biotechnol. Bioeng., 23, 29-39.
Pirouz, T., Karbasian, M.A. and Goodfellow, M.,
(1999), Isolation Of Some Aerobic Actinomycetes
Species from the Soil of Zahedan Country, South-
east of Iran, J. Med Sci., No.24 (1&2), pp. 65-67.
Poernomo, A.T. (1997). Streptomyces griseus ATCC
10137. Amobil Dan Karakter Proteasenya. Tesis.
Niversitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Hal. 2,11-
23,33.
Szabo, I., Benedek, A. and Barabas, G. (1985). Possible
Role of Streptomycin Release From Spore Cell Wall
of Streptomyces griseus, J. Apll. Bacteriol., 50,
pp.438-440.
Srinivasulu, B., Adinarayana, K., and Ellaiah, P. (2003).
Investigations on Neomycin Productions with
Immobilized Cells of Streptomyces marinensis Nuv-
5 in Calcium Alginate Matrix. AAPS Pharm.
Sci.Tech. 4 (4) Article 57
(http://www.aapapharmscitech.org).
Smidsrod, O. (1979) Faraday Discuss. Chem. Soc.
57:263.
The United States Pharmacopoeia 28, United States
Pharmacopoeia Convention, Rockville, MD, 2004,
pp. 2748-2751