EJERCICIO ADICIONAL ACTIVIDAD 3: Problemas sobre enzimología.

Objetivo:
Determinar los parámetrs cinéticos de la enzima Glucosa oxidasa.

La glucosa oxidasa cataliza la siguiente reacción:

D-glucosa + O 2 + H2O --------> acido D-glucónico + H 2O2

Los parámetros cinéticos Km y Vmax de la glucosa oxidasa se calcularán a partir de la

representación gráfica doble recíproca: 1/V ° en función de 1/[S]. Para esto se deberá medir
la actividad enzimática utilizando diferentes concentraciones de glucosa y manteniendo
constante la concentración de enzima.
Se prepararán 4 tubos conteniendo cada uno de ellos distintas concentraciones de glucosa:
Tubo 1: 1 mM
Tubo 2: 2 mM
Tubo 3: 5 mM
Tubo 4: 30 mM

El producto obtenido en cada uno de los tubos será cuantificado a distintos tiempos por
medición espectrofotométrica.

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

tiempo (min) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

0.5 0.006 0.028 0.051 0.045
1 0.028 0.058 0.114 0.14
1.5 0.059 0.111 0.192 0.234
2 0.098 0.168 0.274 0.328
2.5 0.139 0.234 0.364 0.438
3 0.184 0.303 0.458 0.532
3.5 0.23 0.379 0.561 0.639
4 0.278 0.46 0.654 0.751
4.5 0.325 0.533 0.754 0.857
5 0.374 0.612 0.859 0.975

1. Utilizando estos datos y siguiendo las instrucciones a continuación calcule los

parámetros cinéticos (Km y Vmáx) para la enzima Glucosa oxidasa
1.- Grafique D.O. vs. tiempo. Dibuje los 4 tubos en el mismo gráfico. Use una escala
de 0,0 a 5,0 minutos para el eje tiempo y una escala de 0,0 a 1,0 para el eje de D.O.

* Observe la curva obtenida. ¿Obtiene una recta a tiempos cortos? ¿Existe una
desviación a tiempos más largos? Es coherente la pendiente de cada recta teniendo en
cuenta el contenido de glucosa en el tubo?

2.- Trace una recta utilizando los puntos en la zona donde no hay desviación de la
linealidad. Puede haber una desviación a tiempos muy cortos (si esto ocurre no tome en
cuenta esos puntos para trazar la recta). Por qué ocurre esto?
La recta trazada no necesariamente pasará por el origen.
3.- Calcule la pendiente de la recta midiendo el incremento de D.0. [∆ D.O. que
corresponde a un intervalo de tiempo determinado (∆t)], y divídalo por ∆t. Esta será la
velocidad inicial en unidades de D.O./min.
Se obtendrá de esa forma una velocidad para cada concentración de glucosa.
4.- Coloque los valores obtenidos en las siguiente tabla:

Tubo [glucosa] (mM) 1/[glucosa] (mM Vel. inicial 1/V. inicial

- 1) (D.O./min) (min/D.O.)
1 1 1.00
2 2 0.50
3 5 0.20
4 30 0.03

5.- Grafique velocidad inicial vs. concentración de glucosa.

Use una escala entre 0,0 y 50 mM para el eje de [glucosa]. Para el eje de velocidad use una
escala que parta de 0,0 y contenga al máximo valor obtenido para la velocidad.

* Observe la curva obtenida. ¿Cree Ud. que esta enzima sigue la ecuación de Michaelis-
Menten? ¿Puede calcular de esta curva los valores de Vmax y Km?

6.- Calcule los valores de la inversa de la velocidad inicial y colóquelos en el casillero

correspondiente de la tabla de arriba.
7.- Grafique los valores de 1/V en función de 1/[glucosa] (estos últimos se dan ya
calculados en la tabla).
Para este gráfico utilice una escala entre -1 y 1 mM para el eje de 1/[glucosa]. Para el eje de
-1

1/V. utilice una escala que parta de 0,0 y contenga al valor máximo de 1/V. (será el
correspondiente al tubo 1).
8.- Trace la recta que mejor se ajuste a los puntos experimentales.
El valor de la intersección de esa recta con el eje de 1/V. es la inversa de la Vmáx expresada
en min/D.O. El valor de la intersección con el eje de1/[glucosa] es -1/Km en mM . -1

9.- Halle los valores de K y V en unidades de mM y D.O./min respectivamente. Para

M MAX

convertir la variación de D.O./min en ∆mol/min. deberá medir la D.O. de una concentración

conocida de glucosa (standard o testigo [T]), asegurándose que la reacción sea completa.
Suponga que en esas condiciones 0,5 µmol de glucosa genera una D.O. de 0,35, utilizando
este dato transforme los valores obtenidos de V M en unidades de D.O./min a µMoles /min

10.- Complete la siguiente tabla con todos los resultados experimentales:

GLUCOSA OXIDASA
- 1 / KM KM (mM) 1/ VMAX VMAX VMAX
(mM -1) ( min/D.O) ( D.O/min (µmol/ min)
)