Asociación de lipoproteínas de baja densidad relacionadas con el receptor.

Polimorfismo de inserción / supresión de genes de proteínas asociadas a proteínas

(LRPAP1) con enfermedad de cálculos biliares

INTRODUCCION
La proteína asociada al receptor (RAP) es una proteína intracelular de 39 kDa que es una
subunidad de la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad
(LRP) .1 RAP interactúa con la LRP y evita la interacción prematura del ligando al mantener
los receptores en un estado funcionalmente inactivo durante su tráfico. .2 El ortólogo
humano del gen RAP es LRPAP1. El gen para LRPAP1 se ha mapeado en el cromosoma
humano 4p16.3.3
El análisis genético de LRPAP1 mostró 22 polimorfismos distintos.1 Varios fenotipos
derivados genéticamente son responsables de la variación en los tipos de lipoproteínas,
que a su vez afectan la concentración de colesterol en la bilis. Muchos genes implicados en
la homeostasis del colesterol han sido implicados en la enfermedad de cálculos biliares
(GSD). Sin embargo, no hay literatura sobre la asociación del polimorfismo del gen LRPAP1
con GSD.

Metodos
El presente estudio se llevó a cabo en 130 pacientes con GSD (edad promedio 44.44 ±
12.05 años) con GSD y 202 sujetos control (edad media 44.45 ± 10.45 años). Los pacientes
habían sido incluidos en la colecistectomía. Todos los sujetos de control se examinaron por
ultrasonidos para detectar la ausencia de cálculos biliares. Los sujetos de control eran
individuos sanos del personal del instituto y la población general de la región. Ninguno de
los controles tenía antecedentes familiares de cálculos biliares. Después de obtener el
consentimiento informado, se extrajeron 5 ml de sangre de los pacientes y los controles en
un vial de ácido etilendiaminotetraacético.
El ADN se extrajo mediante el método de extirpación5. Para el genotipado, la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo utilizando secuencias de cebadores 5 ¢ -
GGTGTT
TCTGGACACAAAGGA-3 ¢ y 5 ¢ -AGTGTGCG TGGAGCCTATG-3 ¢. Alelos (185 pb para
D, 222 pb

RESULTADOS
Frecuencias alélicas del polimorfismo LRPAP1 para D y el alelo I fue 65.77% y 34.23% en
pacientes, 76.24% y 23.76% en controles, respectivamente (Tabla 1). Las frecuencias
genotípicas fueron DD 43.85%, ID 43.85%, II 12.3% en pacientes con GSD y DD 56.93%,
ID 38.61%. II 4.46% en controles. La población estudiada fue en equilibrio de Hardy-
Weinberg. La frecuencia del alelo I fue significativamente mayor (P = 0,003) en pacientes
con GSD que en controles. La diferencia en genotipos homocigotos (DD vs II) también fue
significativa (P = 0,0028). Sin embargo, la diferencia en ID versus DD no fue significativa (P
= 0,10), pero para ID versus II fue significativa (P = 0.045). Esto muestra que el alelo D
podría funcionar de una manera dominante. Para confirmar esto, se realizó la prueba c2
entre II versus ID + DD y II + ID versus DD. La diferencia fue significativa para ambos
grupos, pero fue más prominente para el primer grupo (II vs ID + DD, P = 0.008) que para
el segundo grupo (II + ID vs DD, P = 0.0195), que apoya parcialmente la hipótesis anterior.
Se encontró que el alelo I tiene un riesgo considerable (OR = 1.67, IC 95% 1.184–2.355)
para la enfermedad.
DISCUSIÓN

Los cálculos biliares se han clasificado ampliamente como tipo de colesterol y tipo de
pigmento. En el norte de la India, son principalmente el tipo de colesterol.7,8 La
fisiopatología de la formación de cálculos biliares del colesterol es compleja porque una
gran cantidad de genes regulan la homeostasis del colesterol. Un requisito previo para el
desarrollo de los cálculos biliares de colesterol es la bilis litogénica, que a menudo es el
resultado de una mayor síntesis de colesterol o un tamaño reducido de la reserva de ácidos
biliares, o ambos. La bilis supersaturada de colesterol es necesaria pero no suficiente para
la precipitación de cálculos biliares. Los factores de pronucleating y antinucleating también
juegan un papel importante. Nucleación del colesterol monohidrato. los cristales son un
paso inicial y esencial en el proceso de formación de cálculos biliares.9 La nucleación ocurre
rápidamente en pacientes con cálculos biliares que en los controles normales. La diferencia
resulta de un equilibrio entre los factores de pronucleating y antinucleating. Algunos de
estos factores podrían ser las apolipoproteínas biliares que podrían participar en la
solubilización del colesterol biliar.10 Estas apolipoproteínas son partes integrales de las
lipoproteínas que podrían estar reguladas por la RAP. El gen LRPAP1 que codifica la RAP
influye en los niveles circulantes de colesterol en ratones que carecen del gen LRPAP1 y
muestra un mayor nivel de colesterol en plasma. RAP también regula la cantidad de
receptor de LDL funcional en la superficie celular, que es el principal receptor de la
apolipoproteína E.

No se conocen las bases moleculares de este LRPAP1, el polimorfismo de inserción /

eliminación del intrón 5. Debido a que este polimorfismo está presente en la región intrónica,
no influye directamente en la estructura de la proteína. Podría tener un papel en la expresión
génica o podría estar en desequilibrio de enlace con otros polimorfismos, ya sea en el
mismo gen o en otros genes cercanos cuya función aún no se conoce. Se ha encontrado
que el alelo D de LRPAP1 aumenta la lipoproteína-colesterol (HDL-C) en plasma de alta
densidad y Apo-AI de manera dominante.
La disminución de la HDL-C en plasma es un factor de riesgo bien conocido para la
hipercolesterolemia y la enfermedad arterial coronaria. El aumento de HDL-C es protector
para la enfermedad de cálculos biliares.
Gonzalez et al. encontraron que un polimorfismo de inserción / supresión de 21 pb en el
intrón 1 del gen LRPAP1 está estrechamente asociado con los niveles elevados de lípidos
en plasma y el riesgo de infarto de miocardio temprano. 13 Sánchez y col. 14 informaron
una asociación significativa del alelo I del intrón 5 con la enfermedad de Alzheimer de la
serie Lateonset. Un estudio reciente mostró una fuerte asociación de un polimorfismo
silencioso (C / T) en el exón 5 del gen LRPAP1 con un síndrome metabólico en pacientes
con enfermedad coronaria femenina15. Aquí se notó que el síndrome también se
caracterizó por niveles disminuidos de HDL. colesterol y esto apoya el papel de LRPAP1
en la homeostasis del colesterol. Por lo tanto, se cree que el gen LRPAP1 tiene un efecto
pleiotrópico en varios procesos metabólicos.
El presente estudio también sugiere que existe una función protectora del alelo D para el
desarrollo de cálculos biliares. La principal contribución a nuestra comprensión actual de
los genes de cálculos biliares se deriva de los estudios en animales, en particular el mapeo
de loci de rasgos cuantitativos en ratones. El gen LRPAP1 ha sido reconocido como uno de
los genes candidatos en el mapa de cálculos biliares murinos.16 Debido a que este es el
primer estudio que muestra esta asociación en humanos, se requieren más estudios de
mayor escala en diferentes poblaciones.
En conclusión, el polimorfismo de inserción / eliminación del intrón 5 de LRPAP1 podría
estar asociado con la GSD en el norte de la India.

Extraccion de ADN

Uno de los obstáculos encontrados al extraer ADN de una gran cantidad de muestras es el
engorroso método de desproteinizar los digeridos celulares con los solventes orgánicos
peligrosos, el fenol y la isocloroformo. Se han publicado varios otros procedimientos de
extracción no tóxicos, pero requieren diálisis extensa (1) o el uso de filtros (2). Se desarrolló
un método rápido, seguro y económico para simplificar el procedimiento de
desproteinización. Este método implica extraer la sal de las proteínas celulares por
deshidratación y precipitación con una solución saturada de NaCl.
Las capas de Buffy de células nucleadas obtenidas de sangre anticoagulada (ACD o EDTA)
se resuspendieron en tubos de centrifugación de polipropileno de 15 ml con 3 ml de tampón
de lisis de núcleos (Tris-HCl 10 mM, NaCl 400 mM y Na2EDTA 2 mM, pH 8.2). Los lisados
celulares se digirieron durante la noche a 37ºC con 0,2 ml de SDS al 10% y 0,5 ml de una
solución de proteasa K (1 mg de proteasa K en SDS al 1% y Na2EDTA 2 mM). Una vez
completada la digestión, se añadió 1 ml de NaCl saturado (aproximadamente 6 M) a cada
tubo y se agitó vigorosamente durante 15 segundos, seguido de centrifugación a 2500 rpm
durante 15 minutos. El sedimento de proteínas precipitado se dejó en el fondo del tubo y el
sobrenadante que contenía el ADN se transfirió a otro tubo de polipropileno de 15 ml. Se
agregaron exactamente 2 volúmenes de etanol absoluto a temperatura ambiente y los tubos
se invirtieron varias veces hasta que precipitó el ADN. Las cadenas de ADN precipitadas
se eliminaron con una espátula o pipeta de plástico y se transfirieron a un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml que contenía 100-200 pl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM,
Na2EDTA 0,2 mM, pH 7,5). El ADN se dejó disolver 2 horas a 37 ° C antes de cuantificar.
El ADN obtenido de esta técnica simple produjo cantidades comparables a las obtenidas a
partir de extracciones con fenol-cloroformo. Las relaciones de 260/280 fueron
consistentemente 1.8-2.0, demostrando una buena desproteinización. Las restricciones se
realizaron utilizando una cantidad de enzimas diferentes que requerían concentraciones
altas, medias o bajas de sal, todas resultando en una restricción completa. Este
procedimiento se ha utilizado en nuestro laboratorio en varios miles de muestras de sangre
para estudios de parentesco, población y estudios forenses. Esta técnica se utiliza con
nuestros procedimientos de hibridación no isotópicos (3) que hacen que todo el proceso de
análisis RFLP esté libre de materiales tóxicos.