DISSERTAÇÃO Versão Final 23072013 Banca

Introdução
1 INTRODUÇÃO
1.1 Papilomavírus humanos
Os papilomavírus humanos ou Human Papilloma Viruses(HPV) constituem uma

família antiga de patógenos que exibem um forte tropismo pelo epitélio escamoso,
infectando, exclusivamente, células epiteliais da pele e das membranas mucosas. O
HPV é um DNA vírus de dupla fita, pequeno, circular, não envelopado, com
capsídioicosaédrico de 72 capsômeros e um genoma contendo 8.000 pares de bases
nitrogenadas. A organização genômica dos papilomavírus humanos é semelhante e
apresenta uma região precoce (E), uma região tardia (L) e uma região reguladora não
codificante (URR).1, 2
Reconhecem-se mais de 200 tipos de HPV associados a diferentes manifestações

clínicas, que são agrupados em cinco gêneros – alfa, beta, gama, um e nu. Os tipos mais
importantes na área médica pertencem ao gênero alfa, conhecidos como genitais ou
mucosos. Os tipos de HPV distinguem-se pela sequência dos ácidos nucléicos de E6, E7
e L1.1
Em relação à classificação, os vírus podem ser classificados de acordo com a

árvore filogenética e a propriedade transformante celular. Os HPV são classificados em
de baixo e alto risco em função do papel transformante da região precoce do seu
genoma (Região E). Os de baixo risco são responsáveis por lesões genitais (condilomas)
e na árvore respiratória (papilomas) benignas, que raramente sofrem malignização,
destacando-se os subtipos 6 e 11. Por outro lado, os de alto risco se associam com
neoplasias intraepiteliais que têm maior chance de evolução para carcinomas invasivos,
especialmente os subtipos 16 e 18.1, 3
O desfecho de uma infecção pelo HPV é determinado, principalmente, por

fatores relacionados ao hospedeiro. Certamente, a maioria das lesões induzidas por este
vírus na pele e em mucosas tem resolução espontânea, enquanto em alguns casos o vírus
não é eliminado e promove uma infecção crônica com persistência e recorrência das
lesões.5
Avaliação imunológica de pacientes com PRR Amorim, NP

1
Introdução
1.2 Papilomatose respiratória recorrente
A papilomatose respiratória recorrente (PRR) é uma doença crônica, benigna, de

etiologia viral, sendo causada pelos papilomavírus humanos (Human Papilloma Viruses
- HPV), predominantemente os subtipos de HPV 6 e 11.4 No sistema respiratório, a PRR
acomete principalmente a laringe, destacando-se a região glótica, mas outros sítios
menos comuns podem ser comprometidos, como fossas nasais, faringe, traqueia,
brônquios e pulmões.10 Caracteriza-se pela proliferação de lesões epiteliais benignas de
aspecto verrucoso ou papilomatoso (Figura 1) que podem ser únicas ou múltiplas,
sésseis ou pediculadas, geralmente confluentes e com tendência à recorrência, podendo
levar à obstrução das vias aéreas superiores.11
Figura 1. Aspecto macroscópico de papiloma laríngeo durante laringoscopia direta.

Realizada em um paciente atendido no serviço de otorrinolaringologia do IMIP – Instituto de
Medicina Integral Prof. Fernando Figueira. Fonte : autora.
Estima-se que ocorram entre 80 e 1.500 novos casos de PRR nos Estados Unidos
da América (EUA) por ano. A incidência neste país é estimada em 4,3/100.000
crianças.4 Adicionalmente, a prevalência da PRR juvenil nas cidades de Seattle e
Atlanta foi, respectivamente, 1,69/100.000 e 2,59/100.000 em 2000, sem diferenças
significativas após estratificação por sexo e raça.12 Não existem estudos na literatura de
incidência e prevalência da PRR no Brasil.

2
Introdução
A história materna de lesões genitais secundárias à infecção pelo HPV

(condilomas) é considerada um dos principais fatores de risco para a papilomatose
respiratória.13 Atualmente, as evidências para transmissão transplacentária do HPV são
consideráveis14 e, embora não haja um consenso na literatura, não há recomendação
atual para indicação de parto cesáreo para prevenção de infecção associadas ao HPV.15
Nesse contexto, uma revisão sistemática foi realizada em 2010 para responder se o parto
cesáreo poderia conferir alguma proteção ao neonato quanto à transmissão do HPV e os
investigadores mostraram que não houve diferença estatisticamente significante entre as
taxas de transmissão de HPV nos partos vaginais e cesáreos.16
Existem duas formas de apresentação e distribuição dos casos de PRR, a forma

juvenil, que acomete crianças e jovens até 18 a 20 anos, sendo mais prevalente e com
evolução clínica mais agressiva, e a forma adulta. As crianças com PRR são mais
frequentemente diagnosticadas entre dois e três anos de idade, não havendo diferença
significativa na distribuição entre os sexos.4
A sintomatologia em crianças traduz-se por choro de fraca intensidade ou rouco

e rouquidão progressiva, seguidos por estridor, tosse e dificuldade respiratória, os quais
podem surgir isoladamente ou em conjunto e, em geral, são progressivos, podendo
evoluir com insuficiência respiratória aguda e necessidade de traqueostomia.4,11 A PRR
é considerada a neoplasia laríngea benigna mais frequente e a segunda principal causa
de rouquidão em crianças. Nos adultos, o sintoma que predomina é a disfonia.4
Apesar de ser uma doença benigna, a PRR tem um curso clínico imprevisível,
com tendência a recorrências sucessivas, com necessidade de vários procedimentos
cirúrgicos, o que provoca um impacto negativo na qualidade de vida de pacientes e
familiares.10,17 Segundo os dados do Registro Nacional de Crianças portadoras de PRR
nos EUA, estima-se uma média de 4,4 cirurgias/ano, o que gera um custo anual de
aproximadamente 150 milhões de dólares.4, 18
1.3 Imunidade contra vírus

3
Introdução
As células natural killer (NK) são componentes da imunidade inata e,

portanto, essenciais na defesa inicial contra os microorganismos. As NK são
responsáveis pela eliminação de células infectadas por vírus por meio do mecanismo de
citotoxicidade mediada pela liberação de perforinas e grazimas presentes nos seus
grânulos.19 Além disso, estas células constituem uma fonte inicial importante de
interferon gama (IFN-γ), citocina essencial para ativação dos macrófagos.20,21 Alguns
autores demonstraram que pacientes com forma grave de PRR apresentam
polimorfismos nos receptores de ativação das células NK, o que pode levar a defeitos
funcionais destas células na PRR.22
Além disso, acredita-se que o hospedeiro desenvolva uma barreira natural anti-
HPV, a qual não se limita à epiderme.6 Este conceito tem como base a
Epidermiodisplasia verruciforme (EV), uma doença genética rara que se associa à
sensibilidade excessiva aos papilomavírus do gênero beta (β-HPV), especialmente
HPV-5.7 Nestes pacientes, demonstraram-se mutações nos genes EVER1/TMC6 e
EVER 2/TMC8, as quais promovem defeitos nas proteínas EVER 1 e EVER 2,
componentes essenciais da imunidade inata, pois fazem parte da defesa inicial contra o
HPV na EV por meio da regulação dos níveis de zinco (Zn2+) nos queratinócitos e,
assim, controlam o ciclo de vida do HPV nestas células.8
Estudo em modelos experimentais demonstrou que os genes EVER são

expressos em diferentes tecidos e especialmente nos linfócitos. Consistente com a
hipótese de que as proteínas EVER podem estar envolvidas na ativação dependente da
homeostase de Zn2+ nos linfócitos, foi demonstrado que a concentração deste íon é
elevada nos linfoblastos de pacientes com deficiência de EVER-2, bem como que o
excesso de Zn2+, nestes casos, bloqueia a ativação e proliferação de células T,
impedindo uma adequada resposta imune anti-HPV.9
A resposta imune celular é mediada por linfócitos TCD4+ e TCD8+, sendo as

células TCD8+ responsáveis pela eliminação principalmente de patógenos intracelulares
facultativos e/ou obrigatórios e de células tumorais.29 A resposta imune celular tem
início a partir da apresentação de antígenos virais pelas células dendríticas aos linfócitos
TCD8+ 30,31, os quais se tornam células efetoras e possuem ação citotóxica caracterizada

4
Introdução
pela presença e eliminação de grânulos contendo perforinas e grazimas que agem

destruindo as células infectadas por vírus.32 Foi descrito recentemente que as células
TCD4+ têm papel importante na resposta imune contra vírus por promover recrutamento
de populações de células efetoras para os órgãos linfóides secundários ou sítios
específicos de replicação viral, bem como por facilitar a interação das células TCD8+
com as células dendríticas nos linfonodos.33
Para que ocorra uma ativação eficaz de células TCD4+e TCD8+, com expansão
e diferenciação de populações efetoras (TCD4+/helper e TCD8+/citotóxica), as
moléculas co-estimuladoras CD28 são fundamentais, uma vez que promovem uma forte
interação entre os receptores de superfície das células T e seus ligantes nas células
apresentadoras de antígenos (B7.1 e B7.2). As moléculas CD28 destacam-se na
coestimulação de células TCD8+, especialmente durante resposta imune contra vírus.34
Uma resposta imune efetiva para infecções virais envolve ativação da imunidade
inata e adaptativa com produção equilibrada de citocinas e quimiocinas do tipo Th1,
Th2 e Th17, e também apropriada sinalização através de receptores e co-receptores de
membrana. Sabe-se que uma desregulação na resposta imune durante a infecção por
HPV pode predispor à cronicidade da infecção, aumento de susceptibilidade à PRR e
pior prognóstico. Isso foi observado por pesquisadores, que demonstraram que
pacientes com PRR apresentam aumento da expressão de linfócitos do tipo Th2, o que
leva a maior produção de citocinas IL-4 e IL-10 e das quimiocinas CCL17, CCL18 e
CCL20.34-37 Além disso, Cotton et al (2007) demonstraram que crianças portadoras de
PRR apresentam valores diminuídos da relação CD4+/CD8+ e da resposta
linfoproliferativa, quando comparados aos de indivíduos controles saudáveis. Estes
autores sugerem que o estado imunológico destas crianças se associava diretamente com
a evolução clínica da PRR.38
Com relação à resposta imune humoral, os anticorpos são os principais

componentes responsáveis pela eliminação e/ou neutralização de microrganismos e
toxinas presentes na circulação sanguínea, fluidos e compartimentos intersticiais. A
resposta humoral contra alguns patógenos virais, especialmente os causadores de
infecção crônica, é geralmente ineficaz devido aos mecanismos de evasão viral capazes

5
Introdução
de subverter a atividade neutralizante dos anticorpos.23 Alguns autores demonstraram

que pacientes com PRR desenvolvem uma resposta imune humoral com produção
detectável de anticorpos anti-HPV24-27, porém surge a hipótese de que o HPV pode
induzir uma resposta humoral abaixo do limiar, o que resultaria numa “ignorância
clonal”, impedindo uma apropriada resposta de anticorpos contra o vírus.28 Faria e
Weiner (2005) demonstraram que os pacientes com PRR desenvolvem uma resposta
imune humoral eficaz no início da infecção por HPV-6 ou HPV-11, porém, a
predisposição genética dos pacientes pode levar ao desenvolvimento de tolerância
imunológica para este vírus, o que impede a efetiva eliminação viral.28
Os pacientes com PRR apresentam uma evolução variável da doença, com casos
não recorrentes após a primeira infecção, enquanto outros têm uma doença de grau leve
com raras recidivas, e outros indivíduos ainda desenvolvem uma doença grave e
recorrente que necessita de remoção cirúrgica rápida e frequente.20 Estima-se que 5% da
população em geral sem evidência de PRR apresente DNA viral (HPV) detectável na
laringe.39 De fato, poucos indivíduos expostos ao HPV desenvolvem a papilomatose,
enquanto uma proporção ainda menor apresenta um quadro clínico agressivo com
manifestações graves da doença. Assim, diante de tantos questionamentos sobre a
fisiopatologia da PRR e também sobre a sua gravidade nos pacientes que apresentam
doença recorrente, estudos foram realizados, visando a entender o sistema imune destes
pacientes e caracterizar o seu perfil imunológico por meio da investigação da
imunocompetência, analisando os principais mecanismos envolvidos na imunidade inata
e adaptativa.
Apesar de todos os estudos imunológicos realizados nos pacientes com PRR,

permanecem incertos os mecanismos que levam o indivíduo a polarizar a resposta
imune para o tipo Th2, não sendo esta a forma mais apropriada para se combater as
infecções virais. Além disso, permanece uma lacuna acerca de como a resposta imune
pode predispor o indivíduo infectado pelo HPV a desenvolver uma doença crônica
relacionada a este vírus, como a PRR. Neste sentido, uma compreensão melhor acerca
da imunocompetência relacionada à PRR será útil para embasar o desenvolvimento de
terapias imunológicas específicas e eficazes para um controle adequado desta doença.

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Introdução
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a resposta imunológica de pacientes com papilomatose respiratória

recorrente.
2.2 Objetivos Específicos
 Realizar a imunofenotipagem de células T, B, NK e subpopulações.

 Determinar a concentração sérica das imunoglobulinas totais (IgA, IgG, IgM e
IgE) e dos anticorpos anti-HBs (resposta vacinal).
 Determinar a concentração de citocinas IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10, IL-2, IL-4,
IFN- e IL-17a e quimiocina IL-8.
 Relacionar os resultados dos testes laboratoriais dos pacientes com os dos
controles saudáveis ou valores de referência de acordo com a faixa etária.

7
Introdução
2 MÉTODOS
3.1 Desenho do estudo
Foi desenvolvido um estudo do tipo série de casos para avaliação imunológica

de pacientes com papilomatose respiratória recorrente juvenil.
3.2 Local do estudo
O estudo foi realizado no ambulatório de Otorrinolaringologia e no Laboratório

de Pesquisa Translacional do Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira
(IMIP). O serviço de Otorrinolaringologia do IMIP é referência para atendimentos
ambulatoriais e cirúrgicos nessa área médica no estado de Pernambuco e em outros
estados do Nordeste, sendo realizadas cerca de 700 consultas ambulatoriais e 70
cirurgias mensalmente. Atualmente estão em acompanhamento cerca de 30
pacientes portadores de papilomatose respiratória recorrente juvenil.
3.3 Período do estudo
O estudo foi desenvolvido no período de abril de 2011 a junho de 2013.
3.4 Amostragem
3.4.1 Procedimentos de amostragem
Foi obtida uma amostra não-probabilística de conveniência, constituída por

todos os pacientes com papilomatose respiratória recorrente juvenil atendidos no
ambulatório de Otorrinolaringologia do IMIP, desde que houvesse concordância do
paciente ou de seu responsável legal para participar do estudo.

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Introdução
3.5 Critérios de elegibilidade
3.5.1 Critérios de inclusão
 Para os casos: pacientes com idade de dois a 20 anos, atendidos no ambulatório

de otorrinolaringologia do IMIP e com diagnóstico de papilomatose respiratória
recorrente confirmado por exame histopatológico.
 Para os controles saudáveis: indivíduos não pertencentes à família dos pacientes,
sem sinais clínicos de infecção ou história de imunodeficiência primária na
família.
3.5.2 Critérios de exclusão
 Diagnóstico conhecido de imunodeficiência primária;

 Uso de medicamentos imunossupressores por período de tempo acima de 90 dias
anterior à data da coleta;
 Diagnóstico conhecido de infecção por HIV ou hepatites virais;
 História familiar de doença autoimune;
 Presença de processo infeccioso durante a coleta de dados.
3.6 Procedimentos de seleção dos pacientes
Foi obtida a listagem completa dos pacientes com PRR atendidos no ambulatório
de otorrinolaringologia do IMIP a partir de 2000 até 2013. A partir dessa listagem,
foram recuperados os prontuários com os endereços e telefones dos pacientes e/ou
responsáveis. O contato inicial com os pacientes/responsáveis foi por meio de
telefonema e/ou telegrama. Os pais ou responsáveis foram convidados a participar de
uma entrevista. Foram incluídos todos aqueles acometidos por PRR que retornaram o
contato aceitando participar da pesquisa e preencheram os critérios de elegibilidade
(Figura 2).

9
Introdução
AMBULATÓRIO DE
OTORRINOLARINGOLOGIA
LISTAGEM DOS PACIENTES

COM PRR (N = 25)
CONTATO POR TELEFONE

OU TELEGRAMA (N = 20)
COMPARECERAM AO NÃO COMPARECERAM

SERVIÇO (N = 6)
(N = 14)
CRITÉRIOS DE Critérios de inclusão

ELEGIBILIDADE 1. Pacientes de dois a 20 anos
com diagnóstico de PRR
confirmado por exame
histopatológico
ELEGÍVEIS (N =14)
Critérios de exclusão
TCLE 1.Diagnóstico conhecido de
NÃO Imunodeficiências primárias
CONCORDARAM CONCORDARAM 2. Uso de imunossupressores
EM PARTICIPAR acima de 90 dias anterior as
EM PARTICIPAR
(N = 14) coletas
(N = 0 )
3.Diagnóstico conhecido de
infecções por HIV e hepatites
virais
PACIENTES INCLUÍDOS 4. História familiar de doença
(N=14) auto-imune
5. Infecções durante as coletas
Figura 2. Fluxograma de seleção dos pacientes

10
Introdução
3.7 População do estudo
3.7.1 Casuística
Pacientes: a casuística compreendeu 14 pacientes com diagnóstico de PRR

confirmado por exame histopatológico.
As característicasdos pacientes, incluindo a idade, o sexo,a raça, a idade de

início dos sintomas e do diagnóstico da PRR, o número de recidivas, as complicações e
comorbidadesassociadas e a necessidade de traqueostomia, encontram-se sumarizadas
na Tabela 1. Os resumos clínicos dos pacientes constam no Apêndice G.
Controles saudáveis: os indivíduos controles saudáveis foram estudantes de

iniciação científica e da pós-graduação do IMIP, sendo incluídos 14 adultos jovens com
idade entre 18 e 28 anos. Para alguns testes laboratoriais, foram utilizados como
parâmetros de comparação, referências da literatura citadas ao longo do trabalho.
Tabela 1. Características dos pacientes com PRR
Pacientes Idade Sexo Raça Idade de Idade de Número Complicações/ Traqueostomia

início diagnóstico de Comorbidades**
dos da PRR* recidivas
sintomas
1 12a5m M Branca 3a11m 4a2m 44 1,2,3,4 Não
2 11a4m F Branca 3a 6a4m 06 - Não
3 6a7m M Branca 6m 1a5m 08 1,2,3 Não
4 15a M Branca 6m 1a9m 31 1,2,3 Não
5 16a F Parda 1a 2a 12 - Não
6 5a1m M Preta 3a 4a 03 1,2,4 Não
7 13a5m F Parda 2a 6a6m 14 1,2,5 Não
8 4a7m F Branca 4m 10m 30 1,2,3 Sim
9 5a10m M Branca 3a 3a7m 06 2,3 Não
10 4a9m M Branca 1a 2a10m 09 2 Não
11 20a M Branca 4a6m 5a 35 1,2,3 Sim
12 4a3m M Preta 1a 3a8m 03 2,4 Não
14 8a6m F Branca 2a 8a2m 03 1,2 Sim
Fonte: ambulatório de otorrinolaringologia do IMIP - Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando
Figueira. * PRR – Papilomatose respiratória recorrente. ** 1-Insuficiência respiratória aguda 2-
Qualidade vocal alterada 3- Rinite 4- Asma 5- Doença cardíaca.
3.8 Coleta de dados

11
Introdução
3.8.1 Instrumento para coleta de dados
Os dados foram coletados através de um formulário padrão (Apêndice A), com

perguntas fechadas e codificados para entrada dos dados no computador.
3.8.2 Procedimentos para coleta dos dados
Os dados foram coletados, bem como a lista de checagem (Apêndice B) para os

pacientes e responsáveis. Posteriormente, aplicou-se o protocolo completo do estudo,
incluindo revisão de prontuários, preenchimento criterioso dos formulários de coleta de
dados, bem como, coleta de amostras de sangue periférico para análise laboratorial,
registrando-se os resultados.
3.8.3 Controle da qualidade das informações
Todos os formulários de coleta de dados foram cuidadosamente revisados pela

pesquisadora responsável, a fim de minimizar falhas no preenchimento e perda de
informações importantes, além de checar sua veracidade e consistência.
3.9 Coleta de amostras biológicas

Após o exame clínico dos pacientes realizado pela mestranda, que é médica
otorrinolaringologista, com o objetivo de verificar as condições clínicas destes
pacientes (presença ou não de infecção), foram coletadas duas amostras de sangue
periférico (10 mL cada) com intervalo de 30 dias.
Para realização da dosagem de imunoglobulinas séricas totais e de anticorpo
específico anti-Hbs foi coletado 5 mL de sangue periférico em tubo sem anticoagulante.
Para o leucograma e as imunofenotipagens, foram realizadas coletas de 5 mL em tubos
com anticoagulante EDTA. Na separação de células mononucleares e cultura celular,
nós utilizamos 10 mL de amostra de sangue coletada em heparina sódica.
3.10 Variáveis laboratoriais

12
Introdução
3.10.1 Contagem global e diferencial de leucócitos
A realização da contagem global e diferencial de leucócitos foi realizada por

automação no laboratório CERPE, localizado no IMIP. As tabelas com valores de
referência da normalidade das populações de leucócitos totais, linfócitos, neutrófilos e
monócitos, de acordo com a faixa etária constam no Anexo A.40
3.10.2 Determinação da concentração sérica de imunoglobulinas totais e anticorpos

anti-HBs
A concentração de anticorpos das classes IgM, IgA, IgG e IgE foi determinada
em amostras de soro por meio do método de nefelometria, utilizando nefelômetro
Behring® (BN - Prospec) com padrões e controles apropriados. As dosagens de
imunoglobulinas foram efetuadas, segundo protocolo de ensaio para nefelômetro
(Behringer®, USA). As amostras de soro dos pacientes foram diluídas conforme
instruções do fabricante (Berhinger®, USA). Os controles, os padrões, a solução
tampão e os diluentes, além dos anticorpos monoclonais utilizados foram obtidos
diretamente do fabricante (Dade Behringer®, USA). A concentração de anticorpos anti-
HBs foi realizada pela técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando o kit
Biolisa anti-HBs (QUIBASA, MG, BR), seguindo instrução do fabricante. As
concentrações séricas de anticorpos IgG, IgM, IgA dos pacientes foram comparadas aos
valores normais de referência da população brasileira, de acordo com a faixa
etária41(Anexo B).
Os resultados da dosagem de IgE sérica total foram comparados aos valores

normais de referência para faixa etária, obtidos a partir de um estudo realizado na
Europa com 448 crianças42 (Anexo C).
3.10.3 Separação de células mononucleares (PBMC) para realização da cultura

celular
As células PBMC foram fracionadas do sangue periférico por meio de gradiente
de densidade descontínua sobre Isolymph® 1077 (SIGMA, St. Louis, MO). Foram

13
Introdução
adicionados lentamente nas paredes do tubo Falcon (BD, Pharmigen, San Diego,
CA)3mL da solução Isolymph® 1077, em seguida, 9 mL da amostra de sangue total. O
tubo foi centrifugado a 250 x g por 30 minutos a 21C. Em seguida, aspirou-se
cuidadosamente com pipeta pauster as interfaces contendo a camada de células PBMC,
e foram colocadas em tubos diferentes. Para lavagem das células, foram adicionados a
cada tubo, 3mL de solução de tampão fosfato (PBS) 1X concentrado (pH 7,4) e
centrifugou-se a 250 x g por 5 minutos a 21C, e o sobrenadante foi descartado. Este
procedimento de lavagem foi realizado três vezes. Após as lavagens, as células PBMC
foram ressuspendidas com 1mL de PBS 1X concentrado (pH 7,4) e a contagem das
células foi realizada na câmara de Neubauer, observando a viabilidade celular com a
utilização de Trypan Blue (SIGMA, St. Louis, MO).
3.10.4 Cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC)
Para cultura de células PBMC foi utilizado meio de cultura RPMI suplementado
com 10% de soro fetal bovino (SIGMA, St. Louis, MO, USA), 100 U/mL de
penicilina (SIGMA, St. Louis, MO, USA), 100 g de estreptomicina (SIGMA, St.
Louis, MO, USA), e 2 mM de L-glutamina (SIGMA, St. Louis, MO, USA). Alíquotas
de 200 uL da suspensão de células PBMC (1 x 106 céls/poço) em RPMI suplementado
foram colocadas em placas de cultura celular de 96 poços (Costar® Cambridge, MA).
As amostras de células foram cultivadas em triplicatas não estimuladas ou estimuladas
com 2 uL/poço de Fitohemaglutinina (PHA - SIGMA, St. Louis, MO, USA) na
concentração final de10 µg/mL, sendo mantidas a 37 oC em estufa de CO2 por 24h.
Após 24 horas, foram coletadas amostras do sobrenadante do poço estimulado e do não
estimulado, e conservadas no freezer -80 ºC para posterior análise de citocinas.
3.10.5 Determinação da concentração de citocinas no sobrenadante de cultura

celular
Para determinação da concentração das citocinas foram utilizados BD TM

CBA –
Humaninflamatory kit (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 eTNF-α) e BD TM
CBA

14
Introdução
TH1/TH2/TH17 (IL-2, IL-4, IL-17a, TNF-α, IL-6, IL-10 e IFN-γ), conforme instrução
do fabricante. A determinação da concentração foi realizada por citometria de fluxo
(FACSVERSE, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). A análise foi realizada no FCAP
Array software (BD BIOSCIENCES, CA).
3.10.6 Imunofenotipagem de células T, B, NK e subpopulações
Para imunofenotipagem, numa alíquota de 200 l de sangue periférico foram

adicionados 50 uL de tampão PBS (Ph 7,4) a 2% de soro humano AB+ e os seguintes
anticorpos monoclonais: 5 uL de anti-CD19 FITC, 5 uL anti-CD45 PE, 5 Ul anti-CD3
PE-Cy5, 5 uL anti-CD27 PE-Cy7, 5 uL anti-CD4 FITC, 5 uL anti-CD8 FITC, 5 uL anti-
CD28 PE-Cy7, 5 uL anti-CD16 PE-Cy5, 5 uL anti-CD56 PE-Cy5(BD, Pharmigen,
San Diego, CA).
A seguir, foram adicionados 1,8 mL de tampão de lise de hemácias 1x

concentrado (FACS® Lysing Buffer, Becton Dickinson, Mountain View, CA) e
incubou-se por 20 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Para lavagem das
células, foram adicionados 2 mL de PBS 1X concentrado (pH 7,4), centrifugou-se a 300
x g por 5 minutos a 21 OC e descartou-se o sobrenadante celular. Esse procedimento foi
repetido duas vezes. Após as lavagens, as células foram ressuspendidas com 400L de
paraformaldeído (SIGMA, St. Louis, MO) a 1% para aquisição no citômetro de fluxo
(FACSVERSE - Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Foram adquiridos 20.000
eventos celulares no gate de linfócitos e as análises dos resultados foram realizadas com
o programa FACSSUÍTE software (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA).
Os resultados referentes às células CD3+/ CD4+, CD3+/ CD8+, CD3-/ CD19+,

CD19+/CD27+,CD3-/ CD56+/ CD16+e à relação CD4/CD8 foram expressos em valores
absolutos, sendo os valores dos pacientes comparados aos valores de referência para
faixa etária.43,44 Os resultados referentes às células CD3+/CD4+/CD28+ e
CD3+/CD8+/CD28+foram expressos em valores percentuais e os valores apresentados
pelos pacientes foram comparados aos dos indivíduos controles saudáveis.

15
Introdução
3.11Variáveis clínicas
3.11.1 Idade de início dos sintomas
Definida em anos completos na ocasião do início dos sintomas, conforme

informação do paciente e/ou responsável.
3.11.2 Idade de diagnóstico

Definida em anos completos na ocasião da confirmação diagnóstica por exame
histopatógico após primeira abordagem cirúrgica.
3.11.3 Sintomatologia inicial
Definida pelo(s) sintoma(s) inicial(is) da doença, destacando, entre eles,

disfonia e dispnéia.
3.11.4 Localização intraoperatória dos papilomas
Definida pela localização das lesões papilomatosasdurante a abordagem

cirúrgica, a saber, na laringe (glote, supraglote e subglote) ou em outras regiões do trato
respiratório (cavidade nasal, faringe, traquéia, brônquios, pulmões).
3.11.5 Número de cirurgias
Definida pelo número de cirurgias para exérese de lesões papilomatosas até a

inclusão do paciente no presente estudo. Em seguida será realizada uma proporção do
número total de cirurgias por ano de doença, para definição de prognóstico.
3.11.6 Intervalo entre as recidivas
Definida pelo número de meses decorridos entre as recidivas das lesões

papilomatosascom necessidade cirúrgica.
3.11.7 Complicações
Definida pela ocorrência de complicação relacionada à PRR, destacando-se a

16
Introdução
insuficiência respiratória aguda com necessidade ou não de traqueostomia e carcinoma

laríngeo.
3.11.8 Prognóstico
Definido um mau prognóstico quando a doença tem comportamento mais

agressivo, destacando-se, idade de manifestação inicial da doença inferior a dois anos,
recidivas frequentes (quatro ou mais cirurgias / ano), presença de lesões
papilomatosasem mais de um sítio anatômico (supraglote, glote e subglote) e/ou com
tendência à obstrução da luz da via aérea superior constatada durante laringoscopia
intraoperatória e disseminação traqueal da papilomatose.
3.12 Análise Estatística

Foi realizada no programa GraphPadPrism 5, calculando-se a mediana para as
concentrações de citocinas e confecção de gráficos de pontos. Para comparação dos
achados laboratoriais imunológicos entre os dois grupos (pacientes e indivíduos
controles saudáveis) foiutilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Foi adotado
o nível de significância de 5%.
3.13 Aspectos Éticos

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa em Seres
Humanos do IMIP sob o número 2787/2012.
O projeto de pesquisa seguiu as recomendações da Declaração de Helsinque e da

Resolução 196/96 do CNS e foi encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos do IMIP para análise, somente tendo início após sua aprovação (no
2787/2012). Todos os participantes e/ou seus pais ou responsáveis legais foram
esclarecidos acerca dos objetivos, dos métodos e da importância do estudo. Somente
foram incluídos no estudo aqueles pacientes que concordaram em participar e/ ou
tiveram concordância dos seus pais ou responsáveis legais e assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndices C e D).

17
Introdução
Foi devidamente esclarecida a necessidade de punção venosa periférica para

coleta de 10 mL de sangue (duas amostras coletadas com intervalo mínimo de 30 dias)
para avaliação imunológica, sendo um procedimento de baixo risco e realizado por
técnico laboratorial especializado e treinado. Seguiu-se a orientação dada pelo CEP –
IMIP em relação a dois momentos de coleta, uma vez que nossa casuística possui
crianças menores de cinco anos e uma coleta única de 20 mL não seria viável. Assim,
padronizamos duas coletas para todos os pacientes. A quantidade de sangue coletada
não acarreta alteração na volemia e estabilidade hemodinâmica do paciente, sendo
justificada pela necessidade e possibilidade de obter respostas quanto à patogenia da
papilomatose respiratória recorrente.
Ficou claramente resguardado o direito de qualquer paciente se recusar a

participar do estudo, sendo assegurada a garantia de tratamento para todos,
independente de sua participação. Não foi utilizado nenhum recurso que implicasse em
risco de vida ou qualquer dano aos participantes da pesquisa.
A obtenção do consentimento livre e esclarecido (Apêndices C e D) ficou a cargo
da mestranda. Os pacientes e/ou responsáveis foram solicitados a comparecer ao
ambulatório de otorrinolaringologia do IMIP. Com uso de vocabulário adequado e
compreensível, explicou-se a importância da pesquisa, o processo de coleta de dados por
meio de entrevista e revisão de prontuários dos pacientes, garantindo a proteção à
confidencialidade das informações. A seguir também foi explicado que haveria duas
coletas de amostras de sangue periférico de 10 mL cada através de punção venosa
periférica realizada por técnico especializado para análise de variáveis laboratoriais
imunológicas, uma na própria ocasião da entrevista e outra marcada obedecendo a um
intervalo mínimo de 30 dias. Todas as coletas realizadas nas crianças foram
acompanhadas pelos pais ou responsáveis.
Todas as dúvidas dos pacientes e responsáveis foram esclarecidas pela

pesquisadora responsável e esta se colocou à disposição para futuros esclarecimentos que
se façam necessários.
Conflitos de interesses

18
Introdução
Todos os participantes do estudo declaram que não existem conflitos de

interesses com a pesquisa.
4 RESULTADOS
Os resultados desta dissertação são apresentados no formato de um artigo que

deve ser encaminhado para publicação em revista internacional indexada no Medline e
com fator de impacto definido pelo JCR.
O artigo intitula-se “Immunological evaluation of recurrent respiratory

papillomatosis patients”e será submetido ao periódico “Clinical Immunology Journal”
(FATOR DE IMPACTO= 4.046)

19
Introdução
Original paper
Immunological evaluation of Brazilian patients with recurrent respiratory
papillomatosis
Naiara da Paixão Amorim, MD1,2

Fabiana Araújo Sperandio, MD, PhD1
Leuridan Cavalcante Torres, PhD2
1
Otorhinolaryngology Service, Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira
(IMIP), Recife, Brazil
2
Translational Research Laboratory, Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando
Figueira (IMIP), Recife, Brazil
Corresponding author:

20
Introdução
LeuridanCavalcante Torres, PhD

Translational Research Laboratory Prof. C. A. Hart,
Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP),
Rua dos Coelhos, 300, Recife, PE, Brazil.
ZIP Code 50070-550 – Post Office Box: 1393
Tel +55 81 2122-4702
Fax +55 81 2122-4703
E-mail: leuridan.torres@gmail.com
ABSTRACT
Recurrent respiratory papillomatosis (RRP) is an infectious disease caused by Human

Papilloma Viruses (HPV), in particular the subtypes of HPV-6 and 11, characterized by
the growth of the lesions in the respiratory tract, particularly in the larynx, with a
tendency to relapse frequent and even airway obstruction. Few individuals exposed to
HPV develop papillomatosis, while an even smaller proportion presents a clinical
aggressive with severe manifestations of the disease. In recent decades emerged an
increasing interest about how chronic infection by HPV manipulates the immune system
of these patients. In this study, we performed clinical and immunologic evaluation of 14
patients with recurrent respiratory papillomatosis. We found that the majority of these
patients present alterations of number absolute values of T, B and NK cells, reduced
expression of costimulatory molecules CD28 on T cells, and functional disability
cytokine, which is associated with disease severity. However, functional tests are
needed for a better understanding of the immune system in these patients.
KEYWORDS: recurrent respiratory papillomatosis, immunology, cytokines, CD28,

NK cells.
1 Introdução

21
Introdução
A papilomatose respiratória recorrente (PRR) é uma doença crônica, benigna, de

etiologia viral, sendo causada pelos papilomavírus humanos (Human Papilloma Viruses
- HPV), predominantemente os subtipos de HPV 6 e 11.[1] Caracteriza-se pela
proliferação de lesões epiteliais benignas de aspecto papilomatoso geralmente
confluentes e com tendência à recorrência, podendo levar à obstrução das vias aéreas
superiores.[2] No sistema respiratório, a PRR acomete principalmente a laringe,
destacando-se a região glótica, mas outros sítios menos comuns podem ser
comprometidos, como fossas nasais, faringe, traqueia, brônquios e pulmões.[3] Apesar
de ser uma doença benigna, a PRR tem um curso clínico imprevisível, com tendência a
recorrências sucessivas, com necessidade de vários procedimentos cirúrgicos. [3,4]
Uma resposta imune efetiva para infecções virais envolve ativação da imunidade
inata e adaptativa com produção equilibrada de citocinas e quimiocinas do tipo Th1,
Th2 e Th17, e também apropriada sinalização através de receptores e co-receptores de
membrana. Estudos mostram que uma desregulação na resposta imune durante a
infecção por HPV pode predispor à cronicidade da infecção, ao aumento de
susceptibilidade à PRR e ao pior prognóstico.[5,6,7]
Pacientes com PRR são incapazes de produzir uma resposta imune efetiva de
células T HPV-específicas, demonstrando-se por alterações em células TCD8+,
aumento de expressão de linfócitos do tipo Th2, o que promove maior produção de IL-4
e IL-10, em detrimento da alça Th1 e defeitos funcionais de células NK. [8,9]. Este
estudo tem como objetivo a avaliação imunológica de um grupo de pacientes com
papilomatose respiratória recorrente, sendo o primeiro estudo na população brasileira.
2 Métodos
Foi realizado um estudo do tipo série de casos no Instituto de Medicina Integral

Prof. Fernando Figueira – IMIP, Recife, Brasil, no período de abril de 2011 a junho de
2013.
2.1 Casuística

22
Introdução
Pacientes: a casuística compreendeu 14 pacientes com diagnóstico de PRR

confirmado por exame histopatológico. As características dos pacientes, incluindo a
idade, o sexo, a raça, a idade de início dos sintomas e do diagnóstico da PRR, o número
de recidivas, as complicações e comorbidades associadas e a necessidade de
traqueostomia, encontram-se sumarizadas na Tabela 1.
Controles: os indivíduos controles saudáveis foram estudantes de iniciação

científica e da pós-graduação do laboratório de pesquisa translacional do IMIP, sendo
incluídos 14 adultos jovens com idade entre 18 e 28 anos. Para alguns testes
laboratoriais, foram utilizados como parâmetros de comparação, referências da literatura
citadas ao longo do trabalho.
Tabela 1
2.2. Contagem global e diferencial de leucócitos
A contagem global e diferencial de leucócitos foi realizada por automação,

utilizando um contador de células sanguíneas SDH20 (Labtest, USA). Os valores de
referência da normalidade das populações de leucócitos totais, linfócitos, neutrófilos e
monócitos, de acordo com a faixa etária, se baseiam em Klee G, [Thesis] 2004; Natan e
Oski, 1993. [10]
2.3. Determinação da concentração sérica de imunoglobulinas totais e

anticorpos anti-HBs
A concentração de anticorpos das classes IgM, IgA, IgG e IgE foi determinada
em amostras de soro por meio do método de nefelometria, utilizando nefelômetro
Behring (BN - Prospec) com padrões e controles apropriados. As dosagens de
imunoglobulinas foram efetuadas, segundo protocolo de ensaio para nefelômetro
(Behringer, USA). As amostras de soro dos pacientes foram diluídas conforme
instruções do fabricante (Berhinger, USA). Os controles, os padrões, a solução
tampão e os diluentes, além dos anticorpos monoclonais utilizados foram obtidos

23
Introdução
diretamente do fabricante (Dade Behringer, USA). A concentração de anticorpos anti-

HBs foi realizada pela técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando o kit
Biolisa anti-HBs (QUIBASA, MG, BR), seguindo instrução do fabricante.
A concentração sérica de anticorpos IgG, IgM, IgA dos pacientes foram

comparados aos valores normais de referência da população brasileira, de acordo com a
faixa etária[11]. Os resultados da dosagem de IgE sérica total foram comparados aos
valores normais de referência para faixa etária [12].
2.4. Cultura celular de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)
Para cultura de células PBMC foi utilizado meio de cultura RPMI suplementado
com 10% de soro fetal bovino (SIGMA, St. Louis, MO, USA), 100 U/mL de
penicilina (SIGMA, St. Louis, MO, USA), 100 g de estreptomicina (SIGMA, St.
Louis, MO, USA), e 2 mM de L-glutamina (SIGMA, St. Louis, MO, USA). Alíquotas
de 200 uL da suspensão de células PBMC (1 x 106 céls/poço) em RPMI suplementado
foram colocadas em placas de cultura celular de 96 poços (Costar® Cambridge, MA).
As amostras de células foram cultivadas em triplicatas não estimuladas ou estimuladas
com 2 uL/poço de Fitohemaglutinina (PHA - SIGMA, St. Louis, MO, USA) na
concentração final de 10 µg/mL, sendo mantidas a 37 oC em estufa de CO2 por 24h.
Após 24 horas, foram coletadas amostras do sobrenadante do poço estimulado e do não
estimulado, e conservadas no freezer -80 ºC para posterior análise de citocinas.
2.6. Determinação da concentração de citocinas no sobrenadante de cultura

celular
Para determinação da concentração das citocinas foram utilizados BD TM

CBA –
Humaninflamatory kit (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 eTNF-α) e BD TM
CBA
TH1/TH2/TH17 (IL-2, IL-4, IL-17a, TNF-α, IL-6, IL-10 e IFN-γ), conforme instrução
do fabricante. A determinação foi realizada por citometria de fluxo, utilizando
FACSVERSEBecton Dickinson, Sunnyvale, CA). A análise foi realizada no FCAP
Array software (BD BIOSCIENCES, CA).
2.7. Imunofenotipagem de células T, B, NK e subpopulações

24
Introdução
Para imunofenotipagem, numa alíquota de 200 l de sangue periférico foram

adicionados 50 uL de tampão PBS (Ph 7,4) a 2% de soro humano AB+ e os seguintes
anticorpos monoclonais: 5 uL de anti-CD19 FITC, 5 uL anti-CD45 PE, 5 Ul anti-CD3
PE-Cy5, 5 uL anti-CD27 PE-Cy7, 5 uL anti-CD4 FITC, 5 uL anti-CD8 FITC, 5 uL anti-
CD28 PE-Cy7, 5 uL anti-CD16 PE-Cy5, 5 uL anti-CD56 PE-Cy5(BD, Pharmigen,
San Diego, CA).
A seguir, foram adicionados 1,8 mL de tampão de lise de hemácias 1x

concentrado (FACS® Lysing Buffer, Becton Dickinson, Mountain View, CA) e
incubou-se por 20 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Para lavagem das
células, foram adicionados 2 mL de PBS 1X concentrado (pH 7,4), centrifugou-se a 300
x g por 5 minutos a 21 OC e descartou-se o sobrenadante celular. Esse procedimento foi
repetido duas vezes. Após as lavagens, as células foram ressuspendidas com 400L de
paraformaldeído (SIGMA, St. Louis, MO) a 1% para aquisição no citômetro de fluxo
(FACSVERSE - Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Foram adquiridos 20.000
eventos celulares no gate de linfócitos e as análises dos resultados foram realizadas com
o programa FACSSUÍTE software (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA).
Os resultados referentes às células CD3+/ CD4+, CD3+/ CD8+, CD3-/ CD19+,

CD19+/CD27+, CD3-/ CD56+/ CD16+e à relação CD4/CD8 foram expressos em valores
absolutos, sendo os valores dos pacientes comparados aos valores de referência para
faixa etária. [13,14] As análises referentes às células CD3+/CD4+/CD28+ e
CD3+/CD8+/CD28+foram expressas em valores percentuais e os valores apresentados
pelos pacientes foram comparados aos dos indivíduos controles saudáveis, analisados
em paralelo.
2.8. Análise estatística
Foi realizada no programa GraphPadPrism 5, calculando-se a mediana para as

concentrações de citocinas e confecção de gráficos de pontos. Para comparação dos
achados laboratoriais imunológicos entre os dois grupos (pacientes e indivíduos
controles saudáveis) foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Foi
adotado o nível de significância de 5%.
2.9. Aspectos éticos

25
Introdução
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa em Seres

Humanos do IMIP sob o número 2787/2012.
Conflitos de interesses
Os autores do estudo declaram que não existem conflitos de interesses com a

pesquisa.
3 Resultados
3.1 Valores absolutos de leucócitos totais, linfócitos, monócitos e neutrófilos
Na contagem de leucócitos totais, todos os pacientes apresentaram valores

dentro da normalidade, de acordo com faixa etária. Porém, verificou-se que apenas o
paciente 8 apresentou leucocitose na primeira coleta de sangue, mesmo na ausência de
sintomas clínicos de infecção. Com relação à contagem diferencial, os pacientes
apresentaram valores absolutos normais de linfócitos e neutrófilos, exceto o paciente 2,
que apresentou valores relativos e absolutos diminuídos de neutrófilos.
3.2 Concentração sérica de imunoglobulinas totais e de anticorpos anti-HBs
Os pacientes apresentaram concentração sérica de IgA, IgG e IgM dentro dos

valores de normalidade de acordo com a faixa etária. [11], exceto o paciente 2, que
apresentou níveis de IgA sérica abaixo do percentil 3 (Figuras 1 e 2). Em relação aos
níveis séricos de IgE, a maioria dos pacientes (P1, 3, 4, 6, 8, 9, 11 e 12) apresentou
níveis elevados quando comparados ao valores de referência. [12] (Figura 2B).
Figuras 1 e 2
Anticorpos anti-HBs: Os pacientes com PRR foram vacinados com a vacina

para Hepatite B nos postos de saúde, seguindo as normas recomendadas pelo Ministério
da Saúde, constando nas suas carteiras de vacinação, o período vacinal e as doses de
reforço recebidas por eles. A maioria dos pacientes apresentou anticorpos anti-HBs,
com exceção dos pacientes 10, 13 e 14 que apresentaram resultado não reagente para
este anticorpo. Estes pacientes foram encaminhados para o posto de vacinação para que
fossem aplicadas outras doses de vacina para hepatite B.

26
Introdução
3.3 Valores absolutos de células TCD4+, TCD8+ e relação CD4/CD8
Os pacientes 2, 3, 7 e 9 apresentaram valores absolutos diminuídos de células

TCD4+ e TCD8+ quando comparados aos valores de referência de acordo com a faixa
etária.13 O paciente 11 apresentou níveis absolutos diminuídos de linfócitos TCD4+. Os
demais pacientes apresentaram valores de células TCD4+ e TCD8+ dentro dos padrões
de normalidade. Não foi observada alteração na relação CD4/CD8 dos pacientes
(Tabela 2).
3.4 Valores percentuais de células TCD4+/CD28+ e TCD8+/CD28+
Foi realizada a determinação dos percentuais de células TCD4+ e TCD8+ que

expressam co-estimuladores CD28 em 13 pacientes com PRR. Os resultados obtidos
mostram que a maioria dos pacientes apresenta valores diminuídos de células
TCD4+/CD28+e TCD8+/CD28+quando comparados aos dos indivíduos controles
saudáveis (Figura 3). A análise estatística da mediana dos valores percentuais de células
TCD8+/CD28+ mostra que houve diferença significativa entre os grupos dos pacientes e
dos indivíduos controles (*p = 0.02) (Figura 4). Não foi observada diferença estatística
significante no percentual de populações TCD4+/CD28+(p = 0,57)entre os grupos.
Figura 4
3.5 Valores absolutos de linfócitos B e B de memória
Foi observado que oito dos 13 pacientes (P3, 4, 8, 9, 10, 11, 13 e 14)avaliados
apresentaram níveis absolutos de linfócitos B abaixo dos valores de referência de
acordo com a faixa etária.13 Destes, três pacientes (4, 9 e 11) apresentaram níveis de
células B de memória abaixo dos valores de referência para faixa etária14 (Tabela 2).
3.6 Valores absolutos de células natural killer (NK)
Verificou-se que os pacientes 1, 2, 6, 8, 13 e 14 apresentaram valores absolutos

elevados de células NK, enquanto os pacientes 3 e 7 níveis de células NK abaixo do
valor de referência de acordo com a faixa etária13 (Tabela 2).
Tabela 2

27
Introdução
3.7 Determinação da concentração de citocinas IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-

α no sobrenadante de cultura celular
Na análise comparativa das citocinas entre os grupos de pacientes e indivíduos

controles, verificou-se que houve diferença estatisticamente significativa na
concentração TNF-α (*p = 0,02) e IL-1β (*p = 0,04) entre as medianas dos dois grupos
(pacientes e controles) estimulados com PHA. Não foi visualizada diferença entre os
grupos na concentração de IL-6, IL-8 e IL-10 (Figura 5).
Figura 5
3.8 Determinação da concentração de citocinas do tipo Th1 (IL-2,IFN-γ), Th2

(IL-4) e Th17 (IL-17a) no sobrenadante de cultura celular
Na análise comparativa das citocinas entre os grupos de pacientes e indivíduos

controles, verificou-se que não houve diferença estatisticamente significativa na
concentração de IL-2, IFN-γ, IL-4 e IL-17a entre as medianas dos dois grupos
(pacientes e controles) após estimulo com PHA (Figura 6).
Figura 6
4 Discussão
A PRR é uma doença rara, mas com alto potencial de morbidade e com repercussão
negativa em termos de qualidade de vida de pacientes e familiares, uma vez que a
infecção crônica pelo HPV resulta em repetidas cirurgias, e não existe até o momento,
uma terapia eficaz para controle adequado desta doença. [8]
Nas últimas décadas, surgiu um interesse maior acerca do sistema imune destes
pacientes na tentativa de buscar respostas sobre a fisiopatologia da PRR e sobre a
gravidade da evolução clínica nos pacientes que apresentam doença recorrente. Ainda
permanecem lacunas acerca do papel da resposta imune nos indivíduos que
desenvolvem uma doença crônica relacionada ao HPV, como é o caso da PRR. Neste
sentido, realizamos uma triagem imunológica de 14 pacientes com PRR, com a
determinação quantitativa dos principais componentes celulares da imunidade inata e

28
Introdução
celular, como também da concentração de citocinas inflamatórias, anti-inflamatórias e

específicas, sendo este, o primeiro trabalho realizado no Brasil.
As células T são populações de linfócitos que fazem parte da resposta imune celular,
sendo um dos principais mecanismos contra infecções virais. Na investigação dessas
populações nos pacientes com PRR, nós demonstramos que 35% dos pacientes
apresentam valores absolutos diminuídos de células T CD4+ e/ou TCD8+ no sangue
periférico. Os nossos resultados foram diferentes dos apresentados por Bonagura et al
em estudo realizado nos EUA em 1994, uma vez que estes autores não verificaram
diferenças nos parâmetros séricos de células T CD4+ e TCD8+ nos pacientes (n = 19)
com PRR quando comparados aos dos controles (n = 10) saudáveis.[15] Acreditamos
que isso seja devido a forma de análise utilizada, já que no presente trabalho
comparamos os valores absolutos de células T, TCD4+ e TCD8+ dos pacientes com os
valores de referência para população brasileira, de acordo com a faixa etária[12],
enquanto Bonagura et al (1994) analisaram comparativamente as médias dos valores de
células T entre pacientes e controles saudáveis.
Na literatura mundial, está bem consolidado o conhecimento que as células T CD8+

são primordiais para o reconhecimento e destruição das células infectadas por patógenos
intracelulares, [16] sendo assim, indispensáveis no combate às infecções virais. [17,18]
Quatro dos 14 pacientes analisados apresentam uma deficiência quantitativa de células
TCD8+, o que justificaria a infecção crônica pelo vírus HPV, já que os linfócitos TCD8+
efetores (T citotóxicos) são de suma importância para eliminação viral. No entanto, se
faz necessário realizar os testes funcionais das células T citotóxicas para averiguar se
além dos defeitos numéricos, existem defeitos funcionais destas células nos pacientes.
Para que ocorra uma ativação eficaz de células TCD8+e TCD4+, com expansão e
diferenciação de populações efetoras (TCD4+/Thelper e TCD8+/citotóxica), as
moléculas co-estimuladoras CD28 desempenham um papel importante, pois são
responsáveis pelo segundo sinal necessário para completa ativação de linfócitos T
naive, como foi demonstrado em modelo animal [18-21]. Além disso, essas moléculas
são capazes de promover a manutenção e a viabilidade das células TCD8+ de memória
contra a infecção viral. [22,23] Com relação à molécula CD28, nós verificamos valores

29
Introdução
percentuais diminuídos de células TCD8+/CD28+ nos pacientes quando comparados aos

indivíduos controles saudáveis, e que principalmente os pacientes 6, 7 e 9 apresentaram
valores percentuais muito baixos de TCD8+/CD28+. Diante disso, sugerimos que esse
pode ser considerado um relevante mecanismo de evasão do vírus HPV, o que contribui
para cronicidade da infecção pelo HPV na PRR. Vários estudos já demonstraram que os
baixos níveis de populações de células TCD8+/ CD28+ estão presentes nas infecções
virais crônicas, tais como HIV [24,25], vírus Epstein-Barr[26,27] e vírus da hepatite
C.[28] Entretanto, ainda não existem na literatura estudos que mostrem uma relação
consistente das moléculas CD28 nessas população de células com a infecção pelo HPV.
Bonagura et al, 1999, demonstraram, in vitro, que após duas semanas de co-
incubação de PBMC com fragmentos teciduais de papiloma autólogo, contendo
proteínas do HPV, havia uma redução na taxa de células TCD8+, que foi definida pela
expressão diminuída da molécula co-estimuladora CD28. Assim, esses autores
concluíram que a população de células TCD8+/CD28- era maior nos papilomas
comparada ao sangue periférico e isso era um fator preditivo de gravidade da
doença.[7]. Não detectamos alterações das populações TCD4+/CD28+ nos pacientes
quando comparados os valores percentuais encontrados nos indivíduos controles
saudáveis.
Foi evidenciada uma redução do número de células B total na maioria dos pacientes
estudados, mesmo com valores normais de imunoglobulinas séricas, o que pode levar a
hipótese que eles apresentem alterações nos níveis de anticorpos anti-HPV. Essa
alteração pode ser responsável pela indução de uma resposta humoral específica
limitada para o vírus, levando à resposta imune antiviral pouco efetiva, o que impede o
controle adequado da infecção [29]. Apesar disso, sabemos que em se tratando de um
patógeno intracelular, a imunidade humoral tem um papel secundário. Em relação às
concentrações de imunoglobulinas séricas totais (IgA, IgM e IgG), nossos achados estão
de acordo com o trabalho de Robin Cotton et al(2007), que mostrou que as
concentrações de imunoglobulinas séricas totais em crianças com PRR foram
semelhantes a dos indivíduos controles saudáveis, não sendo correlacionadas à evolução
clínica da doença.[30] Detectamos ainda que a maioria dos pacientes apresentou
concentração sérica elevada de IgE, sendo esta imunoglobulina envolvida nos processos

30
Introdução
alérgicos. Isso pode explicar o quadro clínico de asma brônquica e rinite crônica
observado nestes pacientes.
Ainda no contexto do elevado nível sérico de IgE apresentado pelos pacientes, nós
verificamos que existem imunodeficiências primárias descritas na literatura, como a
deficiência do gene DOCK8, a qual exibe alguns achados clínicos e laboratoriais que
sugerem uma correlação do defeito deste gene com a PRR. Engelhardt et al relataram
que os pacientes com defeito de DOCK8 tem maior susceptibilidade a infecções virais,
como herpes simples, HPV, molusco contagioso e varicela zoster [31], bem como,
demonstram elevados níveis séricos de IgE, deficiência numérica e funcional de células
TCD4+ e TCD8+ e produção reduzida de IFN-γ e TNF-α. Por outro lado, enquanto a
maioria dos pacientes do nosso estudo apresenta redução de células B e aumento de
células NK, aqueles com mutação DOCK8 evidenciam valores normais destas células,
porém com alteração funcional de NK. [32,33, 34].
No que se refere às imunodeficiências primárias, sabe-se que aquelas associadas a

infecções por HPV graves e recorrentes, destacam-se o defeito no gene GATA-2, o qual
está envolvido na formação e função das células hematopoiéticas, sobretudo da
linhagem linfóide e mielóide. Mutações neste gene causam monocitopenia e deficiência
de células B e NK e se caracterizam clinicamente por maior susceptibilidade a infecções
por micobactérias, fungos e vírus, destacando-se principalmente infecção por HPV.
[35,36] Fica evidente que nossos pacientes não possuem critérios clínicos para o
diagnóstico de defeito em GATA-2, entretanto não podemos descartar a possibilidade
de a PRR ter uma etiologia genética associada e representar um espectro desta doença.
Nesse contexto, a realização do sequenciamento genético destes pacientes é de extrema
relevância para a descoberta dos possíveis genes envolvidos na etiologia da PRR.
Na produção de anticorpos específicos, é importante ressaltar que a maioria dos

pacientes apresentou concentração sérica protetora de anticorpos IgG anti-HBs, o que
evidencia que os pacientes com PRR apresentam uma boa resposta vacinal. Isso
demonstra que apesar das alterações encontradas em nível de citocinas inflamatórias e
específicas, os pacientes conseguem ter uma resposta imune eficiente com produção de

31
Introdução
anticorpos específicos para antígenos T-dependentes, o que significa que houve

interação de células B – T importante para produção de anticorpos de memória.
Na análise de populações celulares da imunidade inata, verificamos que a maioria

dos pacientes apresentou valores absolutos elevados de células NK, o que se justifica
pela infecção crônica pelo HPV com reativações frequentes. Presume-se que alterações
numéricas de células NK estejam relacionadas à infecção crônica ou a não efetiva
eliminação viral, devido a possíveis alterações funcionais destas populações celulares,
que podem interferir nos mecanismos intrínsecos de apoptose celular, levando à perda
de homeostase do sistema imune. Na literatura, existem estudos que demonstram
defeitos na resposta imune inata em pacientes com PRR por disfunção de células NK, as
quais apresentam diminuição na síntese de citocinas e da sua atividade citolítica para
matar células infectadas associadas ao complexo de histocompatibilidade principal
classe I (MHC I).[6,37]
Interessantemente, ainda no aspecto da resposta imune inata contra o vírus HPV,

Lazarczyk et al., relatou que o hospedeiro desenvolva uma barreira natural anti-HPV, a
qual não se limita à epiderme.[38] Este conceito tem como base a Epidermiodisplasia
verruciforme (EV), uma doença genética rara que se associa à sensibilidade excessiva
aos papilomavírus do gênero beta (β-HPV), especialmente HPV-5.[39] Estes autores
demonstraram que mutações nos genes EVER1/TMC6 e EVER 2/TMC8, leva a
defeitos na síntese de proteínas EVER 1 e EVER 2, componentes essenciais da
imunidade inata, pois fazem parte da defesa inicial contra o HPV na EV por meio da
regulação dos níveis de zinco (Zn2+) nos queratinócitos e, assim, controlam o ciclo de
vida do HPV nestas células.[40] Por sua vez, estudo em modelos experimentais
demonstrou que os genes EVER são expressos em diferentes tecidos e especialmente
nos linfócitos. Consistente com a hipótese de que as proteínas EVER podem estar
envolvidas na ativação dependente da homeostase de Zn2+ nos linfócitos, foi
demonstrado que a concentração deste íon é elevada nos linfoblastos de pacientes com
deficiência de EVER-2, bem como o excesso de Zn2+ nestes casos, bloqueia a ativação e
proliferação de células T, impedindo uma adequada resposta imune celular anti-
HPV.[41]

32
Introdução
No trabalho em questão, verificamos que os pacientes apresentaram concentração

baixa de citocinas inflamatórias, anti-inflamatórias e específicas quando comparada a
dos indivíduos controles saudáveis. Na análise comparativa das citocinas entre os
grupos de pacientes e indivíduos controles, verificou-se que houve diferença
estatisticamente significativa na concentração de TNF-α e IL-1β. A maioria dos
pacientes apresentou alteração nos níveis de citocinas e sabe-se que uma resposta imune
efetiva para infecções virais envolve ativação da imunidade inata e adaptativa com
produção equilibrada de citocinas e quimiocinas do tipo Th1, Th2 e Th17, e também a
apropriada sinalização através de receptores e co-receptores de membrana. Assim, uma
desregulação na resposta imune durante a infecção por HPV pode predispor à
cronicidade desta, além de pior prognóstico da PRR. Alguns autores demonstraram que
a PRR é uma doença caracterizada pela expressão de um perfil citocinas do tipo Th2
tanto nos linfócitos que infiltram os papilomas como nas PBMC expostas a tecido
papilomatoso autólogo. [5,7] Nesse contexto, evidenciou-se elevada concentração de
citocinas IL-4 e IL-10, quando comparado aos níveis de IFN-γ e IL-18 nos papilomas
[42] e no sangue periférico [43] de pacientes com PRR.
Apesar do exposto acima, não visualizamos produção elevada de IL-4 e IL-10 pelas
células mononucleares dos pacientes estimuladas com PHA, talvez por termos avaliado
células mononucleares do sangue periférico, enquanto Bonagura et al., demonstraram a
produção destas citocinas por células mononucleares presentes nos fragmentos de
papilomas removidos durante abordagem cirúrgica. Além disso, devido às diferenças do
local de coleta das amostras biológicas, supõe-se que na cultura de células
mononucleares dos fragmentos do papiloma encontram-se células T efetoras anti-HPV,
por isso estes autores utilizaram antígenos específicos do vírus HPV.
A associação entre uma concentração muito baixa de citocinas e uma evolução mais
grave da PRR é bem evidente nos pacientes 1 e 8, sugerindo que uma deficiência
significativa de citocinas pró-inflamatórias, Th1 e imunoreguladoras da resposta imune
pode ser um fator determinante para um pior prognóstico da PRR.
Pode-se arguir que este estudo apresentou algumas limitações, dentre elas, destaca-
se, sobretudo pela não realização de ensaios de linfoproliferação para mitógenos e

33
Introdução
antígenos, dosagem de citocinas após estímulo com HPV, avaliação funcional das
células T citotóxica e NK. Porém, alguns testes funcionais estão em andamento no
nosso laboratório para brevemente ser publicado. Este estudo contribui para ampliar o
conhecimento cientifico a respeito das possíveis alterações envolvidas nos principais
mecanismos da resposta imune na PRR.
5 Conclusões
A maioria dos pacientes com papilomatose respiratória recorrente apresenta
alterações numéricas de células T, B e NK, expressão reduzida de moléculas co-
estimuladoras CD28 nas células TCD8+ e deficiência na produção de citocinas,
sobretudo de citocinas inflamatórias.
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Introdução
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38
Introdução
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Tabelas

39
Introdução
Tabela 1. Características dos pacientes com PRR
Pacientes Idade Sexo Raça Idade de Idade de Número Complicações/ Traqueostomia

início diagnóstico de Comorbidades**
dos da PRR* recidivas
sintomas
1 12a5m M Branca 3a11m 4a2m 44 1,2,3,4 Não
2 11a4m F Branca 3a 6a4m 06 - Não
3 6a7m M Branca 6m 1a5m 08 1,2,3 Não
4 15a M Branca 6m 1a9m 31 1,2,3 Não
5 16a F Parda 1a 2a 12 - Não
6 5a1m M Preta 3a 4a 03 1,2,4 Não
7 13a5m F Parda 2a 6a6m 14 1,2,5 Não
8 4a7m F Branca 4m 10m 30 1,2,3 Sim
10 4a9m M Branca 1a 2a10m 09 2 Não
11 20a M Branca 4a6m 5a 35 1,2,3 Sim
12 4a3m M Preta 1a 3a8m 03 2,4 Não
14 8a6m F Branca 2a 8a2m 03 1,2 Sim
Fonte: ambulatório de otorrinolaringologia do IMIP - Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando
Figueira. * PRR – Papilomatose respiratória recorrente. ** 1-Insuficiência respiratória aguda 2-
Qualidade vocal alterada 3- Rinite 4- Asma 5- Doença cardíaca.

40
Introdução
Tabela 2. Valores absolutos de células T (CD3+), T CD4+, T CD8+, relação CD4+/CD8+, células B (CD3-
/CD19+), B de memória (CD19+/CD27+) e células NK (CD3-/CD16+/CD56+) de pacientes com PRR
Patient Total T cells T CD4+ T CD8+ Ratio B cells Memory B NK cells

(P) Lymphocytes (CD3+) (CD3+CD4+ (CD3+CD8+ CD4+/CD8+ (CD19+) cells (CD3-
) )
(CD19+/CD27+ /CD16+/CD56+
)
)
P1 2,534 1,799 1,133 486 2.3 456 356 532

(1,200- 5,200) (1,161-2,077) (630-1,182) (332-776) (460-1,143) (50-200) (114-446)
P2 1,869 598 299 209 1.4 523 308 784
(1,500-6,500) (1,280-2,413) (618-1,348) (390-1,024) (471-1,031) (50-200) (127-515)
P3 2,848 1,623 990 405 2.4 570 57 142
(1,500-6,500) (2,156-5,004) (1,360-3,066) (560-1,803) (811-1,792) (60-230) (164-801)
P4 1,667 1,167 595 338 1.7 333 40 217
(1,200-5,200) (1,161-2,077) (630-1,182) (332-776) (460-1,143) (50-200) (114-446)
P6 3,673 2,204 1,168 727 1.6 992 169 808
(1,500-7,000) (1,515-3,701) (780-2,086) (453-1,700) (631-1,283) (60-230) (135-601)
P7 1,320 541 357 146 2.4 502 276 92
(1,200-5,200) (1,161-2,077) (630-1,182) (332-776) (460-1,143) (50-200) (114-446)
P8 3,801 2,204 1,234 837 1.4 342 184 874
(1,500-7,000) (1,515-3,701) (780-2,086) (453-1,700) (631-1,283) (50-390) (135-601)
P9 1,504 677 223 217 1.0 451 54 210
(1,500-7,000) (1,515-3,701) (780-2,086) (453-1,700) (631-1,283) (60-230) (135-601)
P10 4,532 2,538 1,523 761 2.0 590 189 1269
(1,500-7,000) (1,515-3,701) (780-2,086) (453-1,700) (631-1,283) (50-390) (135-601)
P11 1,794 825 404 322 1.2 125 22 395
(900-2,900) (844-1,943) (476-1,136) (248-724) (138-544) (30-170) (134-545)
P12 3,195 1,917 920 728 1.3 671 611 351
(1,500-7,000) (1,515-3,701) (780-2,086) (453-1,700) (631-1,283) (50-390) (135-601)
P13 2,449 1,641 771 476 1.6 490 240 833
(1,500-7,000) (1,515-3,701) (780-2,086) (453-1,700) (631-1,283) (50-390) (135-601)
P14 3,367 2,525 1,692 656 2.6 438 123 1,145
(1,500-6,500) (1,280-2,413) (618-1,348) (390-1,024) (471-1,031) (60-230) (127-515)
Entre parênteses constam os valores de referência de absolutos de linfócitos (células/ mm3) de acordo
com a faixa etária para a população brasileira. (Klee G, [Thesis]2004; Natan e Oski, 1993; Moraes-Pinto
et al, 2006 e Piatosa et al, 2010). Em negrito os valores alterados em relação aos valores de referência
para cada faixa etária. FALTA A SETA PARA CIMA OU PARA BAIXO COMO SUGERIDO POR
BOSCO
Figuras

41
Introdução
A) 600
P3
P50
500 P97
P1 P10
P2 P11
400 P3 P12
IgM (mg/dL)
P4 P13
P5 P14
P6
300
P7
P8
P9
200
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12,9 Adultos
Idade (anos)
B)
2.250
P3
P50
2.000
P97
1.750 P1 P10
P2 P11
P3 P12
IgG (mg/dl)
1.500
P4 P13
P5 P14
1.250 P6
P7
P8
1.000 P9
750
500
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12,9 Adultos
Idade (anos)
Figura 1: Concentração sérica de imunoglobulinas de 14 pacientes com PRR. A) IgM, B) IgG. Os

gráficos de IgM e IgG representa as curvas dos percentis 3, 50 e 97, de acordo com os
valores de referência para cada idade (Fugimura, 1991).

42
Introdução
A)
500
P3
P50
P97
400
P1 P10
P2 P11
IgA (mg/dl)
P3 P12
300
P4 P13
P5 P14
P6
P7
200 P8
P9
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12,9 Adultos
Idade (anos)
B)
10.000
Valores de Referência
P1 P10
1.000
P2 P11
P3 P12
IgE (UI/ml)
P4 P13
P5 P14
100 P6
P7
P8
P9
10
1
0 1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Adultos
Idade (anos)
Figura 2:Concentração sérica de imunoglobulinas de 14 pacientes com PRR. A) IgA e B) IgE. O

gráfico de IgA representa as curvas dos percentis 3, 50 e 97, de acordo com os valores de
referência para faixa etária (Fugimura, 1991). O gráfico de IgE representa os valores
normais de referência para faixa etária (Dati e Ringel, 1982).

43
Introdução
NS *p=0,02
100 100
TCD4+ / CD28+ (%)
TCD8+ / CD28+ (%)

80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
Patient Control Patient Control
Figura 3:Valores percentuais de populações TCD4+/CD28+ e TCD8+/CD28+ de 13 pacientes e

8indivíduos controles saudáveis. Análise estatística foi realizada entre as medianas do
grupo dos pacientes e indivíduos controles (*p = 0,02). NS – Não significativo
*p=0,04 NS

44
Introdução
Figura 4: Concentração de citocinas IL1β, IL6, IL8, TNF-α e IL10 (pg/mL) do sobrenadante de cultura
de PBMC, estimulada com PHA e sem estímulo (S/E). Os gráficos representam a análise das
medianas da concentração de citocinas de 14 pacientes com PRR e 14 indivíduos controles
saudáveis. Diferença estaticamente significativa na concentração de TNF-α (*p = 0,02) e IL-
1β (*p = 0,04) entre as medianas do grupo dos pacientes e indivíduos controles. NS- não
significativo.

45
Introdução
a) b) NS
3000
NS
200
IL17A (pg/ml)
2000
IFN- (pg/ml)
100
1000
0 0
c) d)
NS 1000 NS
1500
800
IL2 (pg/mL)
IL4 (pg/mL)
1000 600
400
500
200
0 0
Figura 5: Concentração de citocinas IL17a, IFN-γ, IL2 e IL4 (pg/mL) do sobrenadante de cultura de
PBMC, estimulada com PHA e sem estímulo (S/E). Os gráficos representam a análise das
medianas da concentração de citocinas de 14 pacientes com PRR e 14 indivíduos controles
saudáveis. NS – não significativo

46
Introdução
5 CONCLUSÕES
Em pacientes com papilomatose respiratória recorrente, verifica-se:
1. Alteração numérica de células do sistema imune – células T, B e NK
2. Expressão reduzida de moléculas co-estimuladoras CD28 nas células TCD8
3. Concentração normal de imunoglobulinas séricas totais – IgA, IgM e IgG

(exceto paciente 2, que apresentou nível baixo de IgA) e concentração sérica
elevada de IgE na maioria dos pacientes
4. Deficiência na produção de citocinas inflamatórias, anti-inflamatórias e

específicas.

47
Introdução
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Pode-se arguir que este estudo apresentou algumas limitações, dentre elas, destaca-
se, sobretudo pela não realização de ensaios de linfoproliferação para mitógenos e
antígenos, dosagem de citocinas após estímulo com HPV, avaliação funcional das
células T citotóxica e NK. Porém, alguns testes funcionais estão em andamento no
nosso laboratório para brevemente ser publicado. Este estudo contribui para ampliar o
conhecimento cientifico a respeito das possíveis alterações envolvidas nos principais
mecanismos da resposta imune na PRR.
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Introdução
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Introdução
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53
Introdução
APÊNDICES
APÊNDICE A
FORMULÁRIO DE COLETA DE DADOS
TÍTULO PROJETO: AVALIAÇÃO IMUNOLÓGICA DE PACIENTES COM

PAPILOMATOSE RESPIRATÓRIA RECORRENTE
Número do formulário:
Pesquisador ___________________________
Local ________________________
Data da coleta de dados ____/____/_____
Data da 1ª. Revisão ____/____/_______ Revisor: _____________
I. IDENTIFICAÇÃO:
Nome _________________________________________Registro

54
Introdução
(preencher a lápis)
Data da admissão ____/_____/_____ Data de nascimento _____/_____/_______
Endereço: ___________________________________________________________
RuaNº. Bairro Cidade
Telefone: _________________________
II. CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS:
Idade (anos):
Sexo: 1. Masculino2. Feminino
Cor:1. Branca2. Negra3. Parda4. Amarela5. Indígena
III. CARACTERÍSTICAS SÓCIO-DEMOGRÁFICAS:
Procedência: 1. RMR 2. Outras cidades
Procedência: ___________________________________
Número de crianças na família:
IV. CARACTERÍSTICAS OBSTÉTRICAS E DA AMAMENTAÇÃO:
Idade materna na gravidez (anos)
Idade gestacional no parto (semanas)
Lesões condilomatosas na gravidez e no 1. Sim 2. Não

parto

55
Introdução
Tratamento das lesões condilomatosas 1. Sim 2. Não

durante a gravidez
Tipo de parto 1. Vaginal 2. Cesárea
Amamentação 1. Sim 2. Não
Aleitamento materno 1. Exclusivo 2. Misto
Duração do aleitamento materno

exclusivo (meses)
Duração do aleitamento materno misto

(meses)
V. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS:
Idade de início dos sintomas

(anos)
Sintomatologia inicial 1. Disfonia 2. Dispneia 3. Outros sintomas

________________
Número de cirurgias
realizadas
Intervalo entre as recidivas

(meses)
Complicações 1. Sim 2. Não 3. Especificar ___
Traqueostomia 1. Sim 2. Não
Tempo de traqueostomia
(meses)

56
Introdução
VI. ANAMNESE IMUNOLÓGICA
Sistema renal e urinário:

Infecções do trato urinário: 1 =Presente 2 = Ausente 3= Indeterminado
Outras doenças renais adquiridas: 1= Presente2= Ausente3= Indeterminado
Pele e anexos:
Quelóides: 1=Presente (descreva a causa e a região, pós-lesão, queimadura, pós-

operatório, espontâneo, outros)2=Ausente3= Indeterminado
Cicatrização: 1= Excelente2= Boa 3 = Ruim
Infecções respiratórias recorrentes: 1= Presente 2= Ausente 3 = Indeterminado
Febre: 1= Presente 2= Ausente 3= Indeterminado
Temperatura da febre (0C):
Duração da febre (dias):
Otite média: 1= Presente2 = Ausente 3= Indeterminado
Idade (anos): ,
No de episódios:
Sinusites: 1 = Presente2= Ausente 3= Indeterminado
Idade (anos): ,
No de episódios:
Tumores: 1= Presente (especificar o local)2 = Ausente 3= Indeterminado
História de tumores na família: 1= Presente (especificar o local e o grau de

parentesco)2 = Ausente 3= Indeterminada
Tipos:__________________________________________________

57
Introdução
Doenças Autoimunes: 1= Presente2 = Ausente 3= Indeterminado
Presença de Doença Autoimune na família: 1= Presente2 = Ausente
3= Indeterminado
Tipos:__________________________________________________
VI. CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS
Imunidade inata
Contagem global de
leucócitos
Contagem diferencial 1.Neutrófilos 2.Linfócitos 3.Eosinófilos 4.Monócitos
de leucócitos(valor
absoluto)
Contagem diferencial 1.Neutrófilos 2.Linfócitos 3.Eosinófilos 4.Monócitos

de leucócitos (%)
Imunidade humoral
Concentração sérica 1. IgA 6 IgG 7 IgM 4. IgE
Igs (mg/ dl)
, , , ,
Imunofenotipagem de CD19+
células B totais (%)
,
Imunofenotipagem de 1.CD19+/
células B –
CD27+
subpopulações (%)
,
Imunidade celular
Imunofenotipagem de CD3+
células T totais (%)
,

58
Introdução
Imunofenotipagem de 1.CD3+/CD4+ 2.CD3+/CD8+ 3.CD4+/CD8+

células T – , , ,
subpopulações (%)
4.CD4+/CD28+ 5.CD8+/CD28+
, ,
Concentração de 1. IL-2 2. IL-4 3. IL-6 8 IL-8

citocinas (pg/ ml)
, , , ,
9 5.IL-10 10 TNF-α 11 IFN-γ 12 IL-17a
, , , ,
9. IL-1β

59
Introdução
APÊNDICE B
LISTA DE CHECAGEM
TÍTULO PROJETO: AVALIAÇÃO IMUNOLÓGICA DE PACIENTES COM
PAPILOMATOSE RESPIRATÓRIA RECORRENTE
Registro nº. Formulário no.
Paciente: __________________________________________________________
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO  SIM  NÃO
Pacientes com diagnóstico de papilomatoserespiratória recorrente

SIM NÃO
confirmado por exame histopatológico
Pacientes com idade entre dois e 20 anos, acompanhados no IMIP SIM NÃO
Indivíduos controles saudáveis não pertencentes à família dos

pacientes, sem sinais clínicos de infecção ou história de SIM NÃO
imunodeficiência primária na família
CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO SIM NÃO
Diagnóstico conhecido de imunodeficiências primárias SIM NÃO
Uso de medicamentos imunossupressores SIM NÃO
Diagnóstico conhecido de infecção por HIV e hepatites virais SIM NÃO
História familiar de doença auto-imune SIM NÃO

60
Introdução
Presença de processo infecciosodurante a coleta de dados SIM NÃO
CONCLUSÃO
Elegível 
Não elegível 
SE ELEGÍVEL, CONCORDA EM PARTICIPAR? SIM NÃO

61
Introdução
APÊNDICE C
INSTITUTO DE MEDICINA INTEGRAL PROF. FERNANDO FIGUEIRA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Dados de identificação
Título do Projeto: PERFIL IMUNOLÓGICO DE IRMÃOS COM E SEM PAPILOMATOSE
RESPIRATÓRIA RECORRENTE: UM ESTUDO CASO-CONTROLE
Pesquisador Responsável: Naiara da Paixão Amorim
Instituição a que pertence o Pesquisador Responsável: IMIP
Telefone para contato: (81) 21224756
Nome do voluntário: ____________________________________________________
Idade: anos R.G.
O (A) Sr. (ª) está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa PERFIL IMUNOLÓGICO DE
IRMÃOS COM E SEM PAPILOMATOSE RESPIRATÓRIA RECORRENTE: UM ESTUDO CASO-
CONTROLE, de responsabilidade da pesquisadora Naiara da Paixão Amorim.
Essa pesquisa tem o objetivo de determinar o perfil clínico e imunológico de irmãos com e sem
papilomatose respiratória recorrente, bem como relacionar a manifestação da doença com as características da
gravidez, parto e amamentação.
Essa é uma doença que tem grande repercussão para a vida dos pacientes e familiares, com necessidade
de acompanhamento regular e cirurgias frequentes. Além disso,entender o papel do sistema imunológico na
origem e evolução da papilomatose respiratória será fundamental para o possível desenvolvimento de
tratamentos específicos e efetivos para o controle da doença, visando a melhorar o quadro clínico e qualidade
de vida desses pacientes.
Serão chamados para participação neste estudo um paciente com diagnóstico de papilomatose
respiratória recorrente e um irmão mais jovem saudável e sem manifestação clínica da doença. A pesquisa
envolverá tanto a análise de prontuários como entrevistas com os pacientes e/ou responsáveis para
62
Introdução
complementação dos dados. Em dois momentos, um após a entrevista e outro marcado com no mínimo 30 dias,
serão coletadas amostras de sangue, 10mL cada. Esta coleta será realizada através de punção venosa por técnico
de laboratório especializado, sendo garantido um desconforto mínimo. Haverá ainda coleta de cinco mililitros
de saliva, também realizada por técnico laboratorial especializado. Todas as coletas serão acompanhadas pelos
pais ou responsáveis.
Todos os irmãos serão submetidos à avaliação pelo médico otorrinolaringologista no ambulatório do

IMIP e realizarão exame de vídeo da garganta para avaliação.
A participação na pesquisa é voluntária e não haverá nenhum tipo de pressão por parte do pesquisador
ou do médico que acompanha o paciente. Qualquer participante pode desistir em qualquer momento, mesmo
depois de assinar este termo, sem que isso comprometa seu atendimento no IMIP.
As informações pessoais prestadas ao pesquisador serão confidenciais, preservando-se o anonimato.
O voluntário poderá tirar todas as dúvidas acerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos
relacionados à pesquisa ou com o tratamento individual em qualquer momento, ficando a cargo do pesquisador
responsável essa função (contatos deixados acima).
Se for do interesse de algum participante, esse pode ter acesso aos resultados dessa pesquisa assim que a
mesma for finalizada.
Haverá ressarcimento integral de gastos para participação do voluntário na pesquisa, incluindo as

despesas com transporte e alimentação, ficando também a cargo do pesquisador responsável.
Eu, _________________________________________, RG nº ,
declaro ter sido informado/a e concordo em participar, como voluntário, no projeto de pesquisa acima descrito.
Recife, _____ de ____________ de_______
________________________________
Assinatura do Voluntário
________________________________
Assinatura do Pesquisador

63
Introdução
APÊNDICE D
INSTITUTO DE MEDICINA INTEGRAL PROF. FERNANDO FIGUEIRA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Dados de identificação
Título do Projeto: PERFIL IMUNOLÓGICO DE IRMÃOS COM E SEM PAPILOMATOSE
RESPIRATÓRIA RECORRENTE: UM ESTUDO CASO-CONTROLE
Pesquisador Responsável: Naiara da Paixão Amorim
Instituição a que pertence o Pesquisador Responsável: IMIP
Telefones para contato: (81) 21224756
Nome do voluntário: ____________________________________________________
Idade: anos R.G.
Responsável legal: _____________________________________________________
R.G. Responsável legal:
O (A) Sr. (ª) está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa PERFIL IMUNOLÓGICO DE
IRMÃOS COM E SEM PAPILOMATOSE RESPIRATÓRIA RECORRENTE: UM ESTUDO CASO-
CONTROLE, de responsabilidade da pesquisadora Naiara da Paixão Amorim.
Essa pesquisa tem o objetivo de determinar o perfil clínico e imunológico de irmãos com e sem
papilomatose respiratória recorrente, bem como relacionar a manifestação da doença com as características da
gravidez, parto e amamentação.
Essa é uma doença que tem grande repercussão para a vida dos pacientes e familiares, com necessidade
de acompanhamento regular e cirurgias frequentes. Além disso, entender o papel do sistema imunológico na
origem e evolução da papilomatose respiratória será fundamental para o possível desenvolvimento de
tratamentos específicos e efetivos para o controle da doença, visando a melhorar o quadro clínico e qualidade
de vida desses pacientes.
64
Introdução
Serão chamados para participação neste estudo um paciente com diagnóstico de papilomatose
respiratória recorrente e um irmão mais jovem saudável e sem manifestação clínica da doença. A pesquisa
envolverá tanto a análise de prontuários como entrevistas com os pacientes e/ou responsáveis para
complementação dos dados. Em dois momentos, um após a entrevista e outros marcado com um intervalo de no
mínimo 30 dias, serão coletadas amostras de sangue, 10mL cada. Esta coleta será realizada através de punção
venosa por técnico de laboratório especializado, sendo garantido um desconforto mínimo. Haverá ainda coleta
de cinco mililitros de saliva, também realizada por técnico laboratorial especializado. Todas as coletas serão
acompanhadas pelos pais ou responsáveis. Todos os irmãos serão submetidos à avaliação pelo médico
otorrinolaringologista no ambulatório do IMIP e realizarão exame de vídeo da garganta para avaliação.
A participação na pesquisa é voluntária e não haverá nenhum tipo de pressão por parte do pesquisador
ou do médico que acompanha o paciente. Qualquer participante pode desistir em qualquer momento, mesmo
depois de assinar este termo, sem que isso comprometa seu atendimento no IMIP.
As informações pessoais prestadas ao pesquisador serão confidenciais, preservando-se o anonimato.
O voluntário poderá tirar todas as dúvidas acerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos
relacionados à pesquisa ou com o tratamento individual em qualquer momento, ficando a cargo do pesquisador
responsável essa função (contatos deixados acima).
Se for do interesse de algum participante, esse pode ter acesso aos resultados dessa pesquisa assim que a
mesma for finalizada.
Haverá ressarcimento integral de gastos para participação do voluntário na pesquisa, incluindo as

despesas com transporte e alimentação, ficando também a cargo do pesquisador responsável.
Eu, _________________________________________, RG nº ,
responsável legal por ______________________________________________________________________,
RG nº declaro ter sido informado/a e concordo com a sua participação,
como voluntário, no projeto de pesquisa acima descrito.
Recife, _____ de ____________ de _______
_________________________________
Assinatura do Responsável
________________________________
Assinatura do Pesquisador

65
Introdução
APÊNDICE E
Valores absolutos e relativos de leucócitos totais, neutrófilos, linfócitos e monócitos dos pacientes com
PRR
LEUCÓCITOS NEUTRÓFILOS LINFÓCITOS MONÓCITOS

TOTAIS VR (%) VA VR (%) VA VR (%) VA
P1(1ºCOLETA) 3900 64.2 2504 26.0 1014 8.3 324
P1(2ºCOLETA) 7200 56.7 4082 35.2 2534 3.4 245
P2(1ºCOLETA) 3700 41.2 1524 43.7 1617 10.3 381
P2(2ºCOLETA) 3700 32.7 1210 50.5 1869 8.6 318
P3(1ºCOLETA) 5800 55.3 3207 34.0 1972 7.1 412
P3(2ºCOLETA) 6400 47.9 3066 44.5 2848 4.9 314
P4(1ºCOLETA) 6200 51.2 3174 36.8 2282 4.7 291
P4(2ºCOLETA) 5500 56.6 3113 30.3 1667 7.7 424
P5(1ºCOLETA) 8100 67.8 5492 22.2 1798 6.9 559
P5(2ºCOLETA) NR NR NR NR NR NR NR
P6(1ºCOLETA) 6900 47 3243 50 3450 1 69
P6(2ºCOLETA) 11300 59.4 6712 32.5 3673 5.8 655
P7(1ºCOLETA) 6900 64.9 4478 18.3 1263 8.6 593
P7(2ºCOLETA) 6000 63.3 3798 22.0 1320 6.9 414
P8(1ºCOLETA) 15800 61.5 9717 28.2 4456 6.6 1043
P8(2ºCOLETA) 8600 46.6 4008 44.2 3801 6.0 516
P9(1ºCOLETA) 7400 40.6 3004 44.7 3308 6.8 503
P9(2ºCOLETA) 7300 61.6 4497 20.6 1504 12.9 942
P10(1ºCOLETA) 8800 39.0 3467 50.8 4470 2.5 220
P10(2ºCOLETA) 11000 48.9 5379 41.2 4532 4.9 539
P11(1ºCOLETA) 8300 60.4 5013 32.6 2706 4.0 332
P11(2ºCOLETA) 7600 67.6 5138 23.6 1794 5.3 403
P12(1ºCOLETA) 5300 39.1 2072 39.7 2104 15.9 843
P12(2ºCOLETA) 9000 45.1 4059 35.5 3195 15.8 1422
P13(1ºCOLETA) 6600 44.2 2917 49.7 3280 5.1 337
P13(2ºCOLETA) 7900 61.5 4859 31.0 2449 5.7 450
P14(1ºCOLETA) 8100 36.4 2948 51.6 4180 7.1 575
P14(2ºCOLETA) 9100 48.4 4404 37 3367 9.2 837
Fonte: pesquisa IMIP. VR – Valor relativo; % - Percentual; VA – Valor absoluto.

66
Introdução
APÊNDICE F
Valores da concentração sérica de anticorpos totais – IgM, IgG, IgA e IgE dos pacientes com PRR
Pacientes IgA IgG IgM IgE

(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (KU/L)
P1 126 1180 91 188
P2 68 1120 77 74.8
P3 134 1440 158 126
P4 217 1020 119 1004
P5 138 1380 278 115
P6 207 1660 87 236
P7 125 1080 134 89.9
P8 50 1180 196 304
P9 130 980 90 190
P10 124 1340 238 38.7
P11 246 1060 91 419
P12 49 1060 122 3164
P13 75 792 91 7.2
P14 243 1050 136 7,4
Fonte: pesquisa IMIP.

67
Introdução
APÊNDICE H
Resumos clínicos dos pacientes com PRR
Paciente 1 (P1) – W.W.L.S., masculino, raça branca, nascido em 13/11/2000,

procedente de Palmares – PE. Produto da primeira gestação materna aos 19 anos. Pais
saudáveis e não consanguineos. A mãe é GV PV A0 (partos normais, sem
intercorrências), realizou pré-natal completo sem intercorrências e não apresentou
diagnóstico de lesões condilomatosas vulvovaginais durante a gravidez ou parto.
Nasceu a termo de parto vaginal, saudável, pesando 3400g. Aleitamento materno
exclusivo dois meses e misto seis meses. DNPM: dentro da normalidade. Evolução
clínica: apresentava rouquidão e dispneia recorrente desde os 3 anos 11 meses. Foi
encaminhado para a emergência pediátrica do IMIP em 28/01/2005 por estridor
associado à dispnéia grave, feita avaliação otorrinolaringológica e exame laringoscópico
por nasofibroscopia que mostrou lesões vegetantes no vestíbulo laríngeo, sendo
realizada microcirurgia laríngea para exérese das lesões em 03/02/2005, com posterior
confirmação histopatológica do diagnóstico de papiloma escamoso. As cirurgias
ocorreram a um intervalo mensal durante os primeiros dois anos após o diagnóstico, em
seguida esse intervalo passou a ser bimestral ou trimestral, totalizando 44 cirurgias. Não
ocorreu nenhuma intercorrência relacionada à dispnéia ou insuficiência respiratória
aguda nesse período e mantém acompanhamento regular. A avaliação imunológica
mostra deficiência sérica quantitativa significativa de citocinas inflamatórias, anti-
inflamatórias e específicas.
Paciente 2 (P2) – A.R.L., feminino, branca, nascida em 14/12/2001, natural e

procedente de Recife – PE. Produto da primeira gestação materna aos 21 anos de idade.
Pais saudáveis e não consanguineos. A mãe é GII PII A0, realizou pré-natal completo,
sem intercorrências e não apresentou diagnóstico de lesões condilomatosas
vulvovaginais durante a gravidez ou parto. A criança nasceu a termo de parto vaginal,
saudável, pesando 2900g. Teve aleitamento materno misto até os cinco meses. DNPM:
dentro dos padrões de normalidade. Evolução clínica: apresentava rouquidão
progressiva desde os três anos de idade, sendo encaminhada para o ambulatório de

68
Introdução
otorrinolaringologia do IMIP em 30/04/2008. Foi realizada avaliação clínica e exame

laringoscópico por nasofibroscopia, em que foram visualizadas lesões papilomatosas em
região glótica, ocupando ambas as pregas vocais (porção membranosa). A paciente
realizou sua primeira cirurgia em maio de 2008, tendo confirmação histopatológica do
diagnóstico de papiloma escamoso. Manteve acompanhamento otorrinolaringológico
periódico no IMIP com avaliação laríngea por nasofibroscópio e procedimentos
cirúrgicos recorrentes que ocorreram a um intervalo médio de cinco meses, no período
de maio de 2008 a maio de 2010, totalizando seis cirurgias. Não ocorreu nenhuma
intercorrência relacionada à dispneia ou insuficiência respiratória aguda nesse período.
Não apresenta recidivas das lesões desde então e mantém acompanhamento
ambulatorial semestral. A avaliação imunológica demonstra níveis séricos reduzidos de
IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10, INF-γ e IL-17a; demais citocinas avaliadas apresentaram
concentrações normais.
Paciente 3 (P3) – T.P.B.S., masculino, raça branca, nascido em 05/09/2006, procedente

de Igarassu – PE. Produto da primeira gestação de mãe aos 13 anos de idade. Pais
sadios e não consanguíneos. A mãe é GII PII A0 (partos normais, sem intercorrências),
realizou pré-natal completo, sem diagnóstico de lesões condilomatosasvulvovaginais
durante gravidez e parto. A criança nasceu a termo de parto vaginal, saudável, pesando
3800g. Aleitamento materno misto durante dois anos. DNPM: dentro dos padrões de
normalidade. Evolução clínica: criança apresentava choro rouco desde seis meses de
vida. Houve piora progressiva da rouquidão e dispneia associada a partir de um ano,
sendo encaminhada para a equipe de otorrinolaringologia no IMIP em 2008, a qual
realizou nasofibrolaringoscopia que mostrou lesões papilomatosas em região glótica. A
primeira cirurgia aconteceu em 19/02/2008, com exérese de lesões em região glótica e
subglótica, seguida de confirmação histopatológica de papiloma escamoso de via aérea.
As abordagens cirúrgicas ocorreram a um intervalo médio de quatro meses, até outubro
de 2010, totalizando sete cirurgias. Desde então, mantém acompanhamento regular
semestral, sem recorrência das lesões. A avaliação imunológica evidencia redução na
concentração sérica de IL-1β e TNF-α.
Paciente 4 (P4) – V.C.S., masculino, branco, nascido em 06/01/1998, procedente de

Lajedo – PE. Produto da primeira gestação materna aos 16 anos. Pais saudáveis e não
consanguíneos. A mãe é GV PV A0, realizou pré-natal completo, sem intercorrências e

69
Introdução
não apresentou diagnóstico de lesões condilomatosas vulvovaginais durante a gravidez

ou parto. Nascido a termo de parto vaginal, saudável, pesando 3600g. Aleitamento
materno exclusivo durante um mês. DNPM: dentro dos padrões de normalidade.
Evolução clínica: a criança apresentava choro rouco e fraco desde os seis meses de
idade, evoluindo com dispneia progressiva a partir de 1 ano e 6 meses. Foi encaminhada
para o ambulatório de otorrinolaringologia do IMIP em outubro de 1999, sendo
submetida à microcirurgia laríngea para exérese de lesões papilomatosas e posterior
confirmação histopatológica do diagnóstico de papiloma escamoso. As cirurgias
ocorreram a um intervalo quinzenal ou mensal durante os primeiros três anos após o
diagnóstico, em seguida esse intervalo passou a ser trimestral ou semestral até junho de
2010, totalizando 30 cirurgias. Não ocorreu nenhuma intercorrência relacionada à
dispneia ou insuficiência respiratória aguda nesse período. Fez avaliação por
videolaringoscopia em janeiro de 2013, que mostrou lesões papilomatosas em região
glótica a nível de comissura anterior, com programação cirúrgica para abril de 2013.
Mantém acompanhamento ambulatorial anual. A avaliação imunológica mostra níveis
séricos diminuídos apenas de IL-1β e IL-17a.
Paciente 5 (P5) – T.C.O., feminino, parda, nascida em 13/04/1997, procedente de

Limoeiro – PE. Produto da primeira gestação materna. Realizou pré-natal, sem
intercorrências. Ausência de lesões condilomatosasvulvovaginais materna durante
gravidez e parto. Nasceu de parto vaginal a termo, saudável, com peso de 2900g.
Aleitamento materno exclusivo por seis meses e misto até os dois anos de idade.
DNPM: dentro dos padrões de normalidade. Evolução clínica: apresentava choro rouco
e fraco desde o primeiro ano de vida, evoluindo com dispneia progressiva associada.
Fez acompanhamento em serviço especializado em otorrinolaringologia com
diagnóstico relatado de papilomatose laríngea e de orofaringe, tendo realizado seis
cirurgias. Foi encaminhada para o IMIP em fevereiro de 2008 para dar seguimento ao
tratamento. Apresentava lesões papilomatosas em laringe e orofaringe, sendo submetida
a cirurgias recorrentes de março de 2008 a julho de 2011, com intervalo médio de seis
meses entre as recidivas. Mantém acompanhamento anual em nosso serviço, mas com
seguimento irregular. A avaliação imunológica evidencia níveis séricos reduzidos de
TNF-α e bastante elevados de IL-17a.
Paciente 6 (P6) – F.W.S.N., masculino, raça preta, nascido em 02/03/2008, procedente

70
Introdução
de Lagoa de Itaenga - PE. Produto da primeira gestação de mãe de 17 anos. Pais

saudáveis e não consanguineos. A mãe é GII PII A0, realizou pré-natal sem
intercorrências e não apresentou lesões condilomatosas durante gravidez e parto.
Nasceu a termo de parto vaginal, saudável, pesando 2800g. Aleitamento materno misto
por dois meses. DNPM: dentro da normalidade. Evolução clínica: apresentava
rouquidão progressiva desde os três anos, sendo encaminhado ao ambulatório de
otorrinolaringologia no IMIP em abril de 2012, onde foram evidenciadas lesões de
aspecto papilomatoso em região glótica ao exame de laringoscopia por nasofibroscópio.
A criança se submeteu a microcirurgia laríngea em junho de 2012 com posterior
confirmação histopatológica de papilomatose respiratória. Perdeu seguimento por
problemas familiares e retornou ao ambulatório em novembro de 2012 com rouquidão e
estridor em repouso, sendo indicada cirurgia de urgência. Mantém acompanhamento
ambulatorial mensal, foi submetido a três cirurgias até o momento. A avaliação
imunológica demonstrou concentração sérica reduzida de IL-1β; demais citocinas
avaliadas com quantitativo adequado.
Paciente 7 (P7) – G.P.S., feminino, parda, nascida em 26/11/1999, procedente de

Goiana – PE. Produto da primeira gestação materna aos 20 anos. Pais saudáveis e não
consanguineos. A mãe é GV PIV AI (partos normais, sem intercorrências). Realizou
pré-natal completo, não teve diagnóstico de lesões condilomatosas vulvovaginais
durante gravidez e parto. A criança nasceu a termo de parto vaginal, com malformação
cardíaca compensada, com peso de 2500g. Aleitamento materno misto até os quatro
meses. DNPM: dentro dos padrões de normalidade. Evolução clínica: apresentava
rouquidão e voz de fraca intensidade desde os dois anos de idade, que foi progredindo
lentamente. Fez cirurgia cardíaca para correção de CIV (comunicação interventricular)
com um ano de idade. Aos sete anos evoluiu com dispneia grave, sendo transferida para
o IMIP, onde a equipe de otorrinolaringologia, através de avaliação clínica e laríngea
por nasofibroscopia flexível, sugeriu o diagnóstico de papilomatose. Foi realizada
cirurgia para remoção das lesões laríngeas em 2006, com posterior confirmação
diagnóstica histopatológica de papilomatose respiratória. As abordagens cirúrgicas
aconteceram de 2006 a 2009, com intervalo médio de um a dois meses, sendo realizadas
13 cirurgias nesse período. Manteve-se sem lesões por três anos. Em novembro de 2012
houve descompensação do quadro cardiológico e piora significativa da rouquidão e
dispneia. Realizou microcirurgia laríngea e em seguida cirurgia cardíaca nesse mesmo

71
Introdução
mês, com boa evolução. Mantém-se estável, sem queixas respiratórias, em

acompanhamento regular cardiológico e otorrinolaringológico. A avaliação imunológica
evidencia concentração sérica diminuída de IL-1β, TNF-α e IFN-γ; demais citocinas
avaliadas com concentração normal.
Paciente 8(P8) – G.G.V.R., feminino, raça branca, nascida em 22/08/2008, procedente

de Uauá – BA. Produto da última gestação de mãe aos 26 anos de idade. Pais sadios e
não consanguíneos. A mãe é GIV PIV A0 (partos normais, sem intercorrências),
realizou pré-natal completo, tendo sido submetida, durante a última gestação, a
tratamento de lesões condilomatosasvulvovaginais com cauterização ácida tópica. A
criança nasceu a termo de parto vaginal, saudável, pesando 3700g. DNPM: dentro dos
padrões de normalidade. Evolução clínica: desde os quatro meses de idade apresentava
choro rouco e dispneia leve, que a pediatra diagnosticou como infecções virais
recorrentes e fez tratamento sintomático. Apresentou piora progressiva da dispneia,
sendo então encaminhada para o IMIP em junho de 2009, quando teve o diagnóstico por
otorrinolaringologista de papilomatose respiratória, sendo posteriormente submetida à
primeira cirurgia para remoção das lesões papilomatosas laríngeas e posterior
confirmação diagnóstica através de exame histopatológico. Nessa primeira abordagem,
foi necessária traqueostomia associada à cirurgia laríngea, dada a obstrução grave de via
aérea superior, a qual foi decanulada com 30 dias. As cirurgias ocorreram a um
intervalo semanal ou quinzenal durante os primeiros seis meses após o diagnóstico, em
seguida esse intervalo aumentou para 30 ou 60 dias, até julho de 2010, quando a
paciente teve piora importante do padrão respiratório e foi operada de urgência, sendo
novamente necessária traqueostomia. A partir desse momento a paciente realizava
acompanhamento otorrinolaringológico periódico no IMIP com avaliação laríngea por
nasofibroscópio e procedimentos cirúrgicos recorrentes, que em cinco ocasiões se
associou à aplicação intralesional laríngea do antiviral cidofovir, sendo obtido um
aumento no intervalo entre as recidivas e abordagens cirúrgicas. A criança se submeteu
a um total de 30 cirurgias, tendo sido a última em Abril de 2012. Não apresenta
recidivas das lesões desde então e mantém acompanhamento ambulatorial bimestral. A
decanulação traqueal ocorreu em 22/01/2013, totalizando um tempo de traqueostomia
de 2 anos e 6 meses. A paciente encontra-se bem desde a última avaliação realizada em
25/03/2013. A avaliação imunológica demonstra uma concentração baixa de citocinas
inflamatórias, anti-inflamatórias e específicas.

72
Introdução
Paciente 9 (P9) – A.H.L.D., masculino, raça branca, nascido em 08/06/2007,

procedente de Recife – PE. Produto da primeira gestação materna aos 19 anos de idade.
Pais sadios e não consanguineos. A mãe é GI PI A0, realizou pré-natal completo, tendo
sido submetida a tratamento de lesões condilomatosas vulvovaginais no último trimestre
gestacional com cauterização ácida tópica. A criança nasceu a termo de parto vaginal,
saudável, pesando 3050g. Aleitamento materno misto um mês. DNPM: dentro dos
padrões de normalidade. Evolução clínica: apresentava rouquidão desde os três anos de
idade. Após avaliação pelo pediatra em posto de saúde, foi encaminhada para avaliação
otorrinolaringológica no IMIP em janeiro de 2011, ocasião em que foi realizado exame
laríngeo com nasofibroscópio que mostrou lesões papilomatosas na região glótica. A
primeira cirurgia foi realizada em 25/01/2011, com posterior confirmação
histopatológica de papilomatose respiratória. Mantem acompanhamento
otorrinolaringológico periódico no IMIP com avaliação laríngea por nasofibroscópio e
procedimentos cirúrgicos recorrentes que ocorreram a um intervalo médio de quatro
meses, no período de janeiro de 2011 a fevereiro de 2013, totalizando seis cirurgias. Nas
duas últimas abordagens cirúrgicas procedeu-se à aplicação intralesional laríngea de um
antiviral chamado cidofovir, sendo obtido um aumento relativo no intervalo entre as
recidivas e abordagens cirúrgicas, que passou para sete meses. A avaliação imunológica
mostra uma concentração baixa de citocinas inflamatórias, anti-inflamatórias e
específicas.
Paciente 10 (P10) – J.G.T.M., masculino, raça branca, nascido em 23/07/2008,

procedente de Recife – PE. Produto da segunda gestação de mãe aos 22 anos de idade.
Não foi realizado acompanhamento pré-natal. Mãe GIV PIII A0. O menor é criado
pelos avós paternos. Nasceu de parto vaginal a termo, com peso de 3440g. Aleitamento
materno misto por um mês. DNPM: desenvolvimento motor e intelectual normal.
Atraso no desenvolvimento da linguagem. Evolução clínica: apresentava choro rouco e
fraco desde o primeiro ano de vida, dificuldade na linguagem, falava poucas palavras
com voz bastante rouca e tinha estridor durante infecções virais de vias aéreas
superiores. Aos 2 anos e 10 meses de idade, em maio de 2011, chegou ao ambulatório
de otorrinolaringologia do IMIP, onde foi realizada laringoscopia através de
nasofibroscópio que mostrou lesão papilomatosa em pregas vocais obstruindo a glote
membranosa. O paciente foi submetido à microcirurgia laríngea para exérese das lesões
e em seguida foi confirmado o diagnóstico de papiloma escamoso por exame

73
Introdução
histopatológico da peça cirúrgica. As cirurgias têm ocorrido a um intervalo bimestral

após o diagnóstico, totalizando nove cirurgias. Não ocorreu nenhuma intercorrência
relacionada à dispnéia ou insuficiência respiratória aguda nesse período. Mantém
acompanhamento regular a cada dois meses com realização de nasofibrolaringoscopia
para monitorização do crescimento das lesões papilomatosas, tendo sido submetido à
última cirurgia em 22/01/2013. O atraso da linguagem vem sendo acompanhado por
equipe de fonoaudiologia especializada. A avaliação imunológica evidencia níveis
séricos reduzidos de IL-1β, IL-10, IFN-γ e IL-17a; demais citocinas avaliadas
apresentaram níveis séricos normais.
Paciente 11 (P11) – L.G.S., masculino, raça branca, nascido em 07/05/1991, procedente

de Recife – PE. A mãe é GII PII A0. Produto da segunda gestação materna aos 30 anos.
Não realizou acompanhamento pré-natal. Nascido a termo de parto vaginal sem
intercorrências, com peso de 3350g. Sem aleitamento materno. DNPM: dentro dos
padrões de normalidade. Evolução clínica: apresentava rouquidão e dispnéia
progressivas desde 4 anos e 6 meses de idade, sendo encaminhado para o ambulatório
de Otorrinolaringologia do IMIP em 1996, ocasião em que se submeteu a sua primeira
abordagem cirúrgica para remoção de lesões papilomatosas laríngeas, tendo posterior
confirmação histopatológica de papilomatose respiratória. Manteve acompanhamento
otorrinolaringológico periódico no IMIP, sendo submetido a procedimentos cirúrgicos
recorrentes que ocorreram a um intervalo médio de 30 dias, entre os anos de 1996 e
2002, totalizando 33 cirurgias. Em uma ocasião de emergência foi realizada
traqueostomia por insuficiência respiratória aguda, com posterior abordagem cirúrgica
para remoção de papilomas laríngeos, sendo a decanulação traqueal realizada após um
mês. Em 2002 entrou em fase de remissão da doença, que durou cerca de dez anos. Em
maio de 2012, quando houve piora significativa da rouquidão e dispnéia associada,
voltou ao serviço de otorrinolaringologia para avaliação e foi confirmada a presença de
lesões papilomatosas obstrutivas na laringe, sendo submetido à microcirurgia laríngea
para remoção das mesmas em 21/05/2012. O paciente mantém acompanhamento
semestral e foram realizadas duas cirurgias desde a última recidiva. A avaliação
imunológica evidencia uma concentração sérica diminuída apenas de IL-1β.
Paciente 12 (P12) – J.A.M., masculino, raça preta, nascido em 15/01/2009, procedente

de Capoeiras – PE. Produto da terceira gestação materna aos 24 anos. Pais saudáveis e

74
Introdução
não consanguíneos. A mãe é GIV PV A0. Realizou pré-natal sem intercorrências. A

criança nasceu a termo de parto vaginal, saudável, com peso de 3000g. Aleitamento
materno misto até os três meses de idade. DNPM: dentro dos padrões de normalidade.
Evolução clínica: apresentava rouquidão desde um ano, que foi se agravando e se
associou a dispnéia progressiva, sendo encaminhado para avaliação
otorrinolaringológica no IMIP em setembro de 2012, ocasião em que foi realizada
laringoscopia por nasofibroscopia, que mostrou lesões papilomatosas em região glótica
e subglótica. Foi realizada microcirurgia laríngea em 25/09/2012 com remoção das
lesões e posterior confirmação histopatológica de papilomatose escamosa. A criança
mantém acompanhamento ambulatorial regular para avaliação clínica e laringoscópica,
tendo sido submetida a três cirurgias até o momento, com intervalo médio de recidiva
trimestral. A avaliação imunológica demonstra uma concentração de citocinas
inflamatórias, anti-inflamatórias e específicas semelhante aos controles saudáveis.
Paciente 13 (P13) – J.P.A.R., masculino, branca, nascido em 25/09/2008, procedente de

Patos – PB. Produto da primeira gestação materna aos 20 anos. Pais saudáveis e não
consanguineos. A mãe é GII PII A0 (partos normais, sem intercorrências). Realizou pré-
natal completo, não teve diagnóstico de lesões condilomatosas vulvovaginais durante
gravidez e parto. A criança nasceu a termo de parto vaginal, saudável, com peso de
3985g. Aleitamento materno exclusivo por seis meses e misto até os nove meses de
idade. DNPM: dentro dos padrões de normalidade. Evolução clínica: apresentava
rouquidão desde o início da fala, por volta de um ano, que se tornou progressiva e
algumas vezes se associou a episódios de dispnéia que foram tratados na urgência
pediátrica de sua cidade como bronquite aguda. Em março de 2013, dada a piora da
rouquidão e associação com estridor constante e dispnéia, realizou avaliação
otorrinolaringológica em Patos – PB, ocasião em que teve o diagnóstico presuntivo de
Papilomatose Respiratória, após realização de nasofibrolaringoscopia. Foi encaminhada
para o serviço de otorrinolaringologia do IMIP, tendo sido submetido à cirurgia para
exérese das lesões em 26/ 03/ 2013, com posterior confirmação histopatológica do
diagnóstico. Orientado acompanhamento mensal da criança. A avaliação imunológica
evidenciou níveis séricos reduzidos de IL-10, TNF-α e de citocinas específicas.
Paciente 14 (P14) – N.F.A., feminino, branca, nascida em 23/10/2004, procedente de

Araripina – PE. Produto da primeira gestação de mãe aos 18 anos. Pais saudáveis e

75
Introdução
consanguineos. A mãe é GIII PIII A0 (partos normais, sem intercorrências). Realizou

pré-natal completo, não teve diagnóstico de lesões condilomatosas vulvovaginais
durante gravidez e parto. A criança nasceu a termo de parto vaginal, saudável, com peso
de 2500g. Aleitamento materno dois meses. DNPM: normal. Evolução clínica:
apresentava rouquidão desde os dois anos de idade, sem histórico de infecções de
repetição. Em dezembro de 2012 houve piora progressiva da rouquidão que se associou
a dispnéia grave, sendo encaminhada para emergência pediátrica em Petrolina, onde foi
realizada traqueostomia e, em seguida, encaminhada para o serviço de
otorrinolaringologia do IMIP, onde foi realizado exame laringoscópico por
nasofibroscopia que evidenciou grande quantidade de lesões papilomatosas laríngeas
obstruindo a luz glótica. Foi realizada microcirurgia laríngea para remoção das lesões
em 19/12/2012 com posterior confirmação diagnóstica histopatológica de papilomatose
respiratória. A decanulação traqueal ocorreu imediatamente após a cirurgia. Mantém
acompanhamento mensal com realização de exame laríngeo, tendo sido submetida a três
cirurgias após o diagnóstico. A avaliação imunológica demostrou uma concentração
sérica diminuída de IL-1β, IL-10 e de citocinas específicas.

76
Introdução
ANEXOS
ANEXO A

77
Introdução
ANEXO B
Valores de referência da contagem global e diferencial de leucócitos, de acordo com a faixa etária.
Idade Leucócitos totais /mm3 Neutrófilos /mm3) Linfócitos /mm3) Monócitos /mm3)
01 a 02 anos 6.000 – 11.000 1.500 – 8.500 1.500 – 7.000 0 - 800
03 a 05 anos 4.000 – 12.000 1.500 – 8.500 1.500 – 7.000 0 - 800
06 a 11 anos 3.400 – 9.500 1.500 – 8.500 1.500 – 6.500 0 - 800
12 a 15 anos 3.600 – 9.100 1.800 – 8.000 1.200 – 5.200 0 - 800
Adulto 3.500 – 10.500 1.700 – 8.000 900 – 2.900 300 - 900
(Klee G, Thesis 2004; Natan eOski, 1993).
ANEXO C
Valores de referência da concentração sérica de imunoglobulinas séricas totais (IgM, IgA, IgG) e
subclasses de IgG, de acordo com a faixa etária.
Idade IgM (mg/dl) IgA (mg/dl) IgG (mg/dl) IgG1 (mg/dl) IgG2 (mg/dl) IgG3 (mg/dl) IgG4 (mg/dl)
02 a 2,9 anos 43 a 194 11 a 192 540 a 1.116 350 a 786 37 a 187 10 a 76 7 a 31
03 a 3,9 anos 43 a 158 29 a 142 513 a 1.046 169 a 818 18 a 272 01 a 87 05 a 34
04 a 4,9 anos 58 a 176 28 a 215 564 a 1318 288 a 857 58 a 247 15 a 118 3 a 67
05 a 5,9 anos 59 a 166 50 a 191 564 a 1318 306 a 834 27 a 242 19 a 140 10 a 30
06 a 7,9 anos 49 a 218 47 a 267 665 a 1465 204 a 1.065 89 a 261 19 a 110 19 a 63
08 a 9,9 anos 67 a 139 70 a 311 672 a 1537 439 a 917 95 a 331 28 a 105 0 a 75
10 a 11,9 anos 65 a 134 113 a 248 739 a 1475 256 a 844 86 a 368 19 a 104 16 a 66
12 a 13,9 anos 46 a 152 113 a 254 680 a 1611 252 a 1.011 106 a 368 21 a 82 8 a 84
Adulto 81 a 167 84 a 354 739 a 1390 256 a 877 180 a 372 12 a 92 13 a 78
Fujimura, 1990. Tese de Doutorado, Departamento de Pediatria, FMUSP.

78
Introdução
ANEXO D
Valores de referência da concentração sérica de IgE, de acordo com a faixa etária.
Idade Concentração (UI/ml)
1 a 5 anos < 60
6 a 9 anos < 90
10 a 15 anos < 200
Adultos < 100
Dati eRingel .ClinChem 1982; 28:1556.

79
Introdução

80

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Introdução

1.1 Papilomavírus humanos

Os papilomavírus humanos ou Human Papilloma Viruses(HPV) constituem uma

Reconhecem-se mais de 200 tipos de HPV associados a diferentes manifestações

Em relação à classificação, os vírus podem ser classificados de acordo com a

O desfecho de uma infecção pelo HPV é determinado, principalmente, por

Avaliação imunológica de pacientes com PRR Amorim, NP

1.2 Papilomatose respiratória recorrente

A papilomatose respiratória recorrente (PRR) é uma doença crônica, benigna, de

Figura 1. Aspecto macroscópico de papiloma laríngeo durante laringoscopia direta.

Avaliação imunológica de pacientes com PRR Amorim, NP

A história materna de lesões genitais secundárias à infecção pelo HPV

Existem duas formas de apresentação e distribuição dos casos de PRR, a forma

A sintomatologia em crianças traduz-se por choro de fraca intensidade ou rouco

1.3 Imunidade contra vírus

Avaliação imunológica de pacientes com PRR Amorim, NP

As células natural killer (NK) são componentes da imunidade inata e,

Estudo em modelos experimentais demonstrou que os genes EVER são

A resposta imune celular é mediada por linfócitos TCD4+ e TCD8+, sendo as

Avaliação imunológica de pacientes com PRR Amorim, NP

pela presença e eliminação de grânulos contendo perforinas e grazimas que agem

Com relação à resposta imune humoral, os anticorpos são os principais

Avaliação imunológica de pacientes com PRR Amorim, NP

de subverter a atividade neutralizante dos anticorpos.23 Alguns autores demonstraram

Apesar de todos os estudos imunológicos realizados nos pacientes com PRR,

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2.1 Objetivo Geral

Avaliar a resposta imunológica de pacientes com papilomatose respiratória

2.2 Objetivos Específicos

 Realizar a imunofenotipagem de células T, B, NK e subpopulações.

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3.1 Desenho do estudo

Foi desenvolvido um estudo do tipo série de casos para avaliação imunológica

3.2 Local do estudo

O estudo foi realizado no ambulatório de Otorrinolaringologia e no Laboratório

3.3 Período do estudo

O estudo foi desenvolvido no período de abril de 2011 a junho de 2013.

3.4.1 Procedimentos de amostragem

Foi obtida uma amostra não-probabilística de conveniência, constituída por

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3.5 Critérios de elegibilidade

3.5.1 Critérios de inclusão

 Para os casos: pacientes com idade de dois a 20 anos, atendidos no ambulatório

3.5.2 Critérios de exclusão

 Diagnóstico conhecido de imunodeficiência primária;

3.6 Procedimentos de seleção dos pacientes

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LISTAGEM DOS PACIENTES

CONTATO POR TELEFONE

COMPARECERAM AO NÃO COMPARECERAM

CRITÉRIOS DE Critérios de inclusão

Figura 2. Fluxograma de seleção dos pacientes

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3.7 População do estudo

Pacientes: a casuística compreendeu 14 pacientes com diagnóstico de PRR

As característicasdos pacientes, incluindo a idade, o sexo,a raça, a idade de

Controles saudáveis: os indivíduos controles saudáveis foram estudantes de

Tabela 1. Características dos pacientes com PRR

Pacientes Idade Sexo Raça Idade de Idade de Número Complicações/ Traqueostomia

3.8 Coleta de dados

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3.8.1 Instrumento para coleta de dados

Os dados foram coletados através de um formulário padrão (Apêndice A), com