Instrumentación Bioquímica (Bioq215)

PROBLEMAS ESPECTROFOTOMETRIA

1. El FMN posee 4 bandas de absorción en la región de UV/visible:

445 nm (e = 12.500 M-1 cm-1)
373 nm (e = 10.400 M-1 cm-1)
265 nm (e = 31.800 M-1 cm-1)
218 nm (e = 25.700 M-1 cm-1)
Una solución de FMN en agua tiene una absorbancia de 1,300 a 445 nm (cubeta de 1 cm de camino
óptico). Calcule la concentración de la solución.
¿Cuál será la absorbancia de la solución a 218 nm? Compare la intensidad de un haz de luz de esta
longitud de onda que llega al detector de un espectrofotómetro después de haber atravesado la cubeta
con la solución de FMN con la intensidad de la luz que llega al detector si la misma cubeta
contiene agua.
Ud. desea obtener el espectro del FMN en la región del UV/visible y posee la
solución descrita, ¿Cómo procedería?

2. Una sustancia de PM 460 se disolvió en benceno en una concentración de 20 mg/ml. La absorbancia

de la solución a 600 nm en una cubeta de 0,5 cm de camino óptico es de 0,620.
¿Cuál es el coeficiente de extinción molar de la sustancia esta longitud de onda, según esta
determinación?

3. El hexano puro apenas presenta absorbancia en el ultravioleta por encima de 200 nm, Una disolución
preparada disolviendo 25,8 mg de benceno (C6H6, MF 78,11) en hexano, y diluyendo a 250,0 ml.,
presenta un pico de absorción a 256 nm, y una absorbancia de 0,266 en una cubeta de 1,000 cm. Hallar
la absortividad molar del benceno a dicha longitud de onda.

4. Se midió la absorbancia de dos soluciones en una cubeta de 1 cm a 280 nm.

Se obtuvo: Solución 1: A = 0,900
Solución 2: A = 0,300
Las soluciones contienen cromóforos diferentes.
Se mezclaron 2 ml de la solución 1 con 0,5 ml de la solución 2.
¿Cuál es la absorbancia que la mezcla debería presentar a 280 nm, si se usa la misma cubeta?
¿Es posible que al medir la absorbancia de la mezcla el valor real (experimental) no corresponda al valor
calculado? Explique.

5. Se desea preparar una solución 1 mM de un compuesto higroscópico P. Según la literatura para P: 

máx = 395 nm ( = 14.000 M-1 cm-1) PM de P: 456.
¿Cómo procedería Ud.?
Describa el procedimiento experimental en detalle, con valores concretos.

6. El cromóforo A posee bandas de extinción cuyos máximos se encuentran a 300 nm y a 550 nm. El
cromóforo B no absorbe en la región visible. ¿Cómo podría Ud. determinar la concentración de A en
presencia de B? ¿Podría Ud. determinar la concentración de A y B en mezcla si B posee una banda de
absorción en el UV que se superpone a la banda de A.?
7. Se adjunta el espectro visible del cromóforo C. El espectro se realizó con una solución de
concentración 12,4 mg/l en una cubeta de 1 cm. PM de C: 882. Describa las propiedades
espectroscópicas del cromóforo C, según este espectro (tabla:  máx, ). Describa cómo se puede
efectuar la determinación absorciométrica de C. Haga una estimación del límite inferior
para la concentración de C determinable por espectrofotometría.

8. Los datos experimentales preliminares para una curva de calibración

de una determinación espectrofotométrica son:

Concentración (mM) A
0,2 0,105
0,4 0,209
0,6 0,300
0,8 0,355
1,0 0,370

En base a estos datos indique en que rango de concentraciones se puede utilizar este método. Sabiendo
que una muestra problema tiene una concentración aproximadamente igual a 0,9 mM ¿Cómo
determinaría su concentración exacta?

9. Con el fin de determinar acetona en fluidos biológicos con una reacción

colorimétrica, se preparó la curva de calibración correspondiente,
obteniéndose los siguientes resultados:

Concentración de acetona A a) Calcule el factor de calibración.

mg/100 ml b) Se analizaron muestras de sangre y de orina de un
Blanco 0,046 individuo normal y de un paciente cetónico, procediendo
0,5 0,058 en forma idéntica que con las soluciones estándar. Se
1,0 0,070 obtuvieron los siguientes resultados:
2,0 0,093 Sangre normal: A = 0,068; sangre cetónica: A = 0,189
4,0 0,138 Orina normal: A = 0,097; orina cetónica: A = 0,198
6,0 0,183 (Dilución: 25 veces, para todas las muestras).
8,0 0,230 Calcule la concentración de acetona en cada muestra

10. Con el objetivo de determinar la concentración de proteínas de una muestra se efectuó el ensayo de
Biuret, como se describe a continuación. Se diluyó la muestra mezclando 0,5 ml con 4,5 ml de agua.
Posteriormente se mezcló en tubos de ensayo lo indicado en la tabla. Se esperó el tiempo requerido
para el desarrollo del color y se midió la absorbancia a 540 nm, calibrando con el blanco (tubo 0).
Calcule la concentración de la muestra usando los datos y resultados de la tabla. La concentración de la
solución estándar de BSA (albúmina de suero bovino) era 5 mg/ml.

Nº Tubo Agua Estándar BSA Muestra dil React. Biuret A

ml ml ml ml
0 1 -- -- 4 0
1 -- 1 -- 4 0,430
2 -- 1 -- 4 0.422
3 -- -- 1 4 0,388
4 -- -- 1 4 0,399