OBJETIVO DEL CEPARIO

 Preservar la diversidad biológica

 Facilitar el uso prolongado de sus componentes
 Distribuir equitativamente los beneficios obtenidos por usar dichos recursos.
 Conservar genotipo (mantener recurso genético)

CEPARIO

 Su viabilidad en estado inactivo, puro y homogéneo

 Condiciones que aseguren la estabilidad microscópica, macroscópica, bioquímica. Fisiológica y genética.
 Sin variaciones fenotípicas ni mutaciones.

CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DEL MÉTODO

 Viabilidad
 Pureza
 Costos del proceso
 Cantidad del cultivo
 Frecuencia de uso

PERIODO DE TIEMPO

 Pueden ser de corto y largo plazo

 Subcultivos periódicos o medios frescos
 Se van acumulando productos tóxicos de metabolismo, lo que causa envejecimiento y muerte celular.
1) La probabilidad de mutaciones
2) La pérdida de la calidad de estos cultivos para el manejo sostenido
3) Espacio requerido

MÉTODOS

 Liofilización
 Ultracongelación
 Eliminación del agua de las células entre los que se pueden citar desecación en papel filtro, en suelo, arena,
silicagel, en esferas de alginato o sal

FACTORES

 Edad de las células

 Velocidad en la congelación y descongelación
 Temperatura de almacenamiento
 Empleo de agente crioprotectores
 La eliminación del agua de una sustancia congelada por sublimación del hielo bajo vacío.
 Precongelación del producto para asegurar una estructura completamente congelada.
 El secado secundario con el que se remueve el agua que queda ligada.

Tipo de cepa Método eficaz

Salmonella spp Liofilización
Salmonella con construcciones Liofilización y conservación a -80 ºC
genéticas ej (TA 97, 98, 100,
102, 1535, etc)
E. coli, E. coli recombinante E. Liofilización y conservación a -80 ºC
coli con construcciones
genéticas
 Streptomyces spp
Vibrio cholerae
Bacillus cereus
Bacillus subtilis
Bacillus turigiensis
Bacillus sphaericus
Enterobacter sp
Enterococcus faecalis
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Shigella flexneri
Levaduras generales
Kluyveromyces marxianus
Saccharomyces cerevisae
Candida albicans
Altemaria spp
Penicillum spp
Penicillum citrinum
Aspergillus spp
Liofilización y luego conservación a 4 ºC
Conservación -80 ºC
Liofilización
Liofilización
Liofilización
Liofilización
Congelación -20 ºC y método simple a temperatura ambiente
Congelación -20 ºC y método simple a temperatura ambiente
Congelación a -20 ºC
Congelación a -20 ºC
Congelación a -20 ºC
Métodos alternativos
Congelación -20 ºC
Liofilización con 16 h de tiempo de deshidratación
Crioconservación -70 ºC en glicerol
Liofilización
Liofilización
Liofilización
Liofilización

CEPARIO
 Construir una base de datos del cepario
 La caracterización bioquímica
 Número de ingreso
 Acrónimo de identificación de la cepa
 Nombre científico (género y epíteto específico)
 Procedencia de la cepa (persona o institución que la aisló)
 Fecha de ingreso al cepario
 Fecha de resiembra
 Fuente de aislamiento (sustrato o huésped de donde proviene la cepa)
 Características biológicas
 Medios de cultivo usados para el aislamiento
 Medios de cultivo para la preservación y condiciones
 Existencia de duplicado
 Aplicaciones (dependiendo de sus características y propiedades)
 Literatura (publicaciones donde se describe el uso de la cepa)

¿Qué estrategia utilizaría para recuperar por separado un conjunto de microorganismos que coexisten en una
muestra de agua encarcada para luego conservarlos?

2. El genoma procarionte

2.2 El cromosoma bacteriano y elementos genéticos extracromosomales (Plásmidos)

GENOMA BACTERIANO

 Constituido de un solo cromosoma

 Bicatenario y haploide
 No enlazado a histonas
 Constituido de DNA y RNA
  80% de constitución de bases nitrogenadas (A, G, C y T), unidas a puentes de hidrógeno.
 Codifica aprox. Para 4700 genes

PLÀSMIDOS

 Porción de DNA el cual podemos manipular.

 No asociado a proteínas
 Elementos genéticos que proporcionan mecanismos adicionales para el cambio de material genético
 Autoreplicantes de DNA
 1 y 5% del cromosoma bacteriano
 Usados como vectores en la ingeniería genética.

CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS

 Plásmido o factor F: permite que la célula tenga la capacidad de conjugación.

 Plásmidos R: sus genes codifican enzimas que proporcionan resistencia frente a los antibióticos. Estos
genes pasan de las células madres a las hijas, pero también pueden ser transferidos al cromosoma
bacteriano, a los virus y a otras bacterias.
 Plásmidos degradativos
 Plásmidos virulentos: convierten la bacteria en un patógeno.

CUADRO COMPARATIVO

CROMOSOMA PLÁSMIDO
Posee información genotípica Vector para nuevas características
Asociado a proteínas no histónicas No asociado a proteínas
Posee ADN doble circular Posee ADN doble circular
Haploide Se replica de forma extracromosomicamente
Sin membrana nuclear Posee genes no esenciales
Bicatenario y antiparalelo Pueden ser circulares o lineales de 1 kpb hasta 1 Mbp
Posee secuencia de bases nucleotídicas (ADN) Están superenrrollados (forma más compacta que
existe de DNA)
Posee 2 cadenas con bases complementarias (A- 1-3 copias por célula
T y G-C) unidas por puentes de hidrógeno
4000 kpb Resistencia a antibióticos
Adhesión celular

2.3 Mecanismos de transferencia genética bacteriana

Recombinación genética
Intercambio de genes entre dos moléculas
de ADN (cromosoma)
Fragmentos de ADN (A y B)
Entrecruzamiento
Parte del ciclo sexual de un organismo
Fuente de variación en la evolución
Transferencia genética
Vertical: los genes pasan de un organismo a su
descendencia
Horizontal: transferencia de un fragmento de ADN de la
célula dominante a la célula receptora
2.6 Transformación experimental

FASES DE LA REPLICACIÓN DE DNA

Las bacterias, a diferencia de las células eucariotas, son capaces de replicar su ADN a lo largo de todo su ciclo
celular.
Se denomina replicón a cada unidad de replicación del ADN que contiene todos los elementos requeridos para
regular este proceso. El cromosoma bacteriano se replica a partir de un único origen que se mueve linealmente
hasta completar la duplicación total de la molécula, por lo que constituye un replicón. Esto facilita la regulación
que está centrada en la etapa de iniciación; una vez que la replicación del cromosoma se inicia en su origen,
todo el cromosoma será duplicado. Los plásmidos, constituyen replicones independientes del cromosoma,
generando una replicación por ciclo celular que se coordina con la replicación genómica (plásmidos unicopia) o
permitir varias replicaciones por ciclo (plásmidos multicopia).
El sitio de ADN que se está duplicando, se llama horquilla de replicación. La replicación puede ser unidireccional
o bidireccional, según se formen una o dos horquillas en el origen.
Generalmente, los cromosomas bacterianos tienen replicación bidireccional, mientras que algunos plásmidos
pueden replicarse unidireccionalmente. En la replicación unidireccional, una horquilla sale del origen y progresa
a lo largo del ADN. En la bidireccional, se forman dos horquillas que se alejan del origen en direcciones opuestas
hasta que se encuentran completando la duplicación. Esto permite a la bacteria duplicar su ADN más rápido
que si el proceso fuera unidireccional, pudiendo replicar más de mil pb por segundo. Es importante destacar
que, aunque la velocidad de replicación es muy elevada, la fidelidad de la misma también es grande, siendo la
frecuencia de mutaciones espontáneas del orden de una cada 107 a 1011 pb replicados.
La replicación es semiconservativa porque cada molécula de ADN posee una cadena del ADN original y una
nueva. Esto resalta la importancia de la complementariedad de bases en la estructura del ADN (ver figura 3).
Las enzimas encargadas de catalizar el proceso de replicación, se denominan ADN polimerasas. Si bien en E.
coli se conocen tres tipos distintos, la responsable de la mayoría de los procesos de replicación es la polimerasa
III, mientras que las polimerasas I y II cumplen principalmente funciones de reparación de rupturas o de errores
en las moléculas de ADN.
También participan otras enzimas, como las helicasas responsables de “desenrollar” el ADN en el origen o cerca
de él, paso indispensable para iniciar la replicación.

 Iniciación

La primera se produce desde el origen del replicón donde se forma la o las horquillas de replicación, gracias a
la acción de las helicasas que “desenrollan” el ADN.
De esta forma se constituye una porción monocatenaria de ADN que estará en condiciones de formar un
complejo con proteínas de unión al ADN, encargadas de estabilizar la cadena sencilla, evitando la formación de
puentes de hidrógeno. sintetiza un corto oligonucleótido de ARN con un grupo 3´ oxidrilo libre, que actuará
como cebador o primer, en el cual la ADN polimerasa agrega los nucleótidos.

 Elongación

La elongación consiste en el avance de la horquilla de replicación, conforme se va agregando nucleótidos a la

nueva cadena, siguiendo un orden establecido por las reglas de complementariedad de bases (A con T y C con
G), entre la cadena “molde” y la nueva. En esta etapa participa fundamentalmente la ADN polimerasa III. Todas
las polimerasas conocidas agregan nucleótidos en dirección 5´- 3´ para el crecimiento de la cadena y requieren
una cadena de ADN molde, un cebador y los nucleótidos.

 Terminación

La terminación se produce después de que ambas horquillas de replicación han atravesado la mitad del
cromosoma en direcciones opuestas y se encuentran en la región terminal del genoma. En esta región, existen
secuencias de ADN que actúan como bloqueadores para el avance del las horquillas, por lo tanto se asegura
que la replicación termine en esa pequeña porción del genoma.
 Enzimas importantes en la replicación, la expresión y la reparación del DNA.
DNA girasa Relaja el superenlloramiento por delante de la horquilla de replicación
DNA ligasa Forma enlaces covalentes para unir las cadenas de DNA, une los fragmentos de Okazaki y
los nuevos segmentos de reparación por escisión
DNA polimerasa Sintetiza DNA, corrige y repara DNA
Endonucleasas Corta el esqueleto de DNA en una cadena de DNA, facilita la reparación y las inserciones
Helicasa Corta el DNA desde un extremo expuesto del DNA, facilita la reparación
Metilasa Desenrrolla las dos cadenas del DNA
Fotoliasas Utiliza la energía de la luz visible para separar los dimeros de piridimina inducidos por la luz
UV
RNA polimerasa Copia RNA a partir de un molde de DNA
Topoisomerasa Relaja el superenrollamiento por delante de la horquilla de replicación separa los círculos de
DNA al final de la replicación del DNA
Transposasa Corta el esqueleto de DNA y deja “extremos cohesivos” formados por una sola cadena
TRANSFERENCIA DE GENES ENTRE BACTERIAS

Transformación

La transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas competentes), son capaces de incorporar
ADN exógeno proveniente de otras bacterias, que está libre en el medio.
La virulencia del Streptococcus pneumoniae está relacionada con la presencia de una cápsula polisacarídica a
su alrededor. Las bacterias con cápsula tienen un aspecto liso (S) cuando se cultivan en placas de agar y son
capaces de matar a los ratones que son inyectados experimentalmente con una suspensión bacteriana. Las
colonias con bordes rugosos (R) de S. pneumoniae, carecen de cápsula y no son letales al infectar ratones.
Frederick Griffith en 1928 observó por primera vez la transformación cuando mezcló bacterias S muertas con
bacterias R vivas y encontró que al inyectar la mezcla en ratones, también resultaba letal. De esto concluyó que
las cepas R habían sido transformadas en bacterias S, ahora capaces de fabricar el polisacárido capsular
virulento.
La capacidad de captar el ADN exógeno, conservarlo en forma estable e interaccionar con él, se denomina
competencia. Este fenómeno depende de la presencia de un sistema de captación de ADN específico asociado
a la membrana. (Ver figura 7). Ejemplos de bacterias con competencia natural son Haemophilus influenzae,
Neisseria sp., Streptococcus pneumoniae y ciertas especies de Bacillus. Aunque la mayoría de las bacterias no
presentan capacidad natural para captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia, generando
por distintos medios distorsiones en la membrana celular; por ejemplo con pulsos eléctricos (electroporación) o
con cambios osmóticos y térmicos. Estos procedimientos son muy usados para introducir experimentalmente
ADN extraño, por ejemplo un plásmido, en una bacteria y así transformarla para que adquiera un fenotipo de
interés. Las bacterias también pueden ser transformadas con ADN viral, en cuyo caso el proceso se llama
transfección.

Transducción

La transducción es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un bacteriófago. Existen
dos formas de transducción la especializada y la generalizada. La primera ocurre cuando un fago temperado
porta genes bacterianos adquiridos durante un ciclo infeccioso anterior y al infectar una nueva bacteria e integrar
su genoma al cromosoma bacteriano, incorporará a éste la información genética correspondiente a la bacteria
infectada previamente. La transducción generalizada se produce por partículas virales defectuosas que se
originan como cápsides vacías durante la replicación viral y que luego incorporan ADN de una bacteria; así, al
infectar una nueva bacteria podrá introducir en ella dicho material genético.
Conjugación

La conjugación se basa en el intercambio unidireccional de información genética desde una bacteria donante a
otra receptora mediante un contacto real. (Ver figura 8). Los plásmidos son los elementos genéticos que con
mayor frecuencia se transmiten de esta forma. La capacidad de conjugación depende de la presencia en la
bacteria de plásmidos conjugativos que contienen los genes necesarios para tal proceso. Un ejemplo muy
conocido de plásmido conjugativo es el plásmido F de E. coli que codifica las proteínas necesarias para la
conjugación, incluyendo el pili sexual. Éste, es una estructura especializada esencial para el contacto entre la
bacteria donadora y la receptora. Generalmente, los plásmidos conjugativos solamente causan la transferencia
de su propio material genético pero en ocasiones el plásmido puede integrarse al cromosoma bacteriano y en
el momento de conjugar se transferirá no solo a sí mismo, sino también a los genes cromosómicos que se
encuentran tras él. Teóricamente todo el cromosoma podría ser transferido lo que requeriría más de dos horas,
pero la unión entre las bacterias por medio del pili persiste menos tiempo. Las cepas bacterianas con el plásmido
F tienen gran capacidad de recombinación por lo que se denominan cepas hfr por su sigla en inglés (high
frecuency of recombination). Debemos recordar que este es un mecanismo muy efectivo para la transferencia
de genes de resistencia antibiótica.
2.7 Aplicaciones de la biología molecular en procariontes

2.7.1 Sondas moleculares

SONDAS MOLECULARES

Son moléculas de DNA de cadena sencilla marcadas mediante radiación o agentes químicos, con el fin de ser
utilizadas para la detección de secuencias complementarias de DNA.

2.7.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR)

 Sirve para amplificar in vitro secuencias específicas de ADN.

 Se caracteriza por amplificar material a partir de cantidades mínimas.
 Consiste en aprovechar determinadas características fisicoquímicas del ADN: desnaturalización cuando
baja la temperatura, y replicación en presencia de la enzima ADN polimerasa y nucleótidos.

2.7.3 Electroforesis en gradiente de geles desnaturalizantes (DGGE)

ELECTROFORESIS EN GRADIENTE DE GELES DESNATURALIZANTES (DGGE)

Es un tipo de electroforesis que permite la separación de fragmentos de ADN del mismo tamaño, pero con
diferentes secuencias de nucleótidos.

ARTÍCULOS

Evaluación microbiológica del arroyo San Roque de Tuxtla Gutiérrez, Chiapas