Sei sulla pagina 1di 33

Istoricul geneticii in agricultura

• Antichitate: fabricarea vinului, a berii, a painii, a produselor lactate, a conservelor, etc.;


• In prezent – ramura noua a biologiei contemporane;
• Sintetizeaza ideile si metodele biologiei celulare si moleculare, biochimiei, geneticii si
ingineriei genetice;
• Are ca ax central tehnologia ADN recombinant – tehnologie de baza a ingineriei genetice.
• 1935 – N.P. Dubinin, prin iradiere cu UV determina modificarea complementului
cromozomal de la Drosophilla melanogaster de la 2n=8 2n=6 (D. willstoni)
• Serie robertsoniana = specii inrudite cu numar diferit de cromozomi, dar numar egal de
brate cromozomale, deci aceeasi cantitate de ADN.
• Ex. D. virilis (2n=12) D. pseudoobscura (2n=10) (1+2)
o D. melanogaster (2n=8) (2+3 si 4+5)
o D. willstoni (2n=6) (1+2, 4+5 si 6+3)
• 1944 – O.T Avery, Mac Leod si Mac Carty – rolul ADN
• 1956 – E. Sears obtine un soi nou de grau – Transfer (rezistent la rugini), prin iradierea cu
raze X a polenului hibridului dintre T. aestivum (2n=42) si Aegilops umbellulata (2n=14).

• 1965 – G. Harris – hibridarea celulelor somatice de la specii indepartate filogenetic (om -


soarece, soarece – hamster, etc.), creste daca se adauga in mediul de cultura virusul
paragripal de tip Sendai, inactivat termic.
• Hibridarea somatica la plante - fuziunea de protoplasti (celule vegetale rezultate dupa
indepartare peretelui celular pectocelulozic cu celulaza si pectinaza) duce la obtinerea unui
calus (masa de celule nediferentiate) si apoi a unor plante intregi – amfidiploizi (hibrizi
parasexuali interspecifici sau intergenerici) care nu pot fi obtinuti pe calea clasica a
incrucisarii sexuate.
• Hibridarea somatica la animale duce numai la formarea de clone celulare hibride si nu de
animale hibride

• Soarecii alofenici
• Microchirurgia ovulelor clone de elita
• linii total homozigote
• 1969 – Beckwith – izoleaza operonul lac de la E. coli;
• 1970 – Khorana – sinetizeaza pe cale chimica gena ce codifica ARNt ce transporta alanina
la locul sintezei proteice, la S. cerevisiae (77pb);
• 1970 – Temin si Baltimore – descopera reverstranscriptaza
• 1977-1978 – Maxam si Gilbert clarifica structura genei eucariote (gena ovalbuminei cu 8
exoni si 7 introni);
• 1977 – Itakura – clarifica structura genei somatostatinei umane;
• 1979 – Goddel - clarifica structura genei insulinei umane;
• 1982 – Kolosov si Gorodeni - clarifica structura genei bradichininei umane;
• Tehnologia ADN recombinant, descoperirea restrictazelor si a ligazelor, folosirea
plasmidelor ca vectori au dus la clonarea genelor si la infiintarea bancilor de gene
• 1981-1982 – Garfinkel si Zambriski incearca clonare unor gene de rezistenta la plante
(rezistenta la metrotexat de la plante necultivate la tutun) utilizand plasmide Ti (de la
Agrobacterium tumefaciens) sau Ri (de la A. rhizogenes). Aceste plasmide contin gene ce
determina malignizarea (boala tuberculilor fuziformi la cartof sau boala radacinilor paroase
la plante), dar prin eliminarea genelor responsabile de malignizare si clonarea unor gene
utile, pot servi ca vectori genetici. S-a incercat astfel clonarea la plante a celor 17 genele
nif (care codifica nitrogenaza) de la Rhizobium leguminosarium. Enzima functioneaza insa
doar in conditii anaerobe, iar celula vegetala este o celula cu metabolism aerob.

Scurt istoric al cercetărilor de biotehnologie vegetală la


I.N.C.D.A. Fundulea

Cultura de ţesuturi şi celule vegetale ca problematică nouă îşi are începutul în ţara noastră
în anul 1975, iar la Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare Agricolă Fundulea, în 1976.
După o perioadă de cercetări metodologice, au fost obţinute cu succes culturi de calus şi
regenerarea plantelor din celule somatice la principalele specii de cereale, plante tehnice şi furajere.
Cercetările privind extinderea capacităţii de fixare a azotului atmosferic la plante
neleguminoase (cereale şi plante tehnice) au debutat în anul 1977, cu studiul unor asociaţii
fixatoare de azot, între rădăcinile plantelor şi microorganismele diazotrofe, capabile să furnizeze
partenerului vegetal azot asimilabil şi fitohormoni (P a pa c o s t e a şi P o p e s c u , 1977). Ca
rezultat al unui număr mare de experienţe, a fost elaborat un mediu original de cultură (H u r d u
c şi colab., 1980), şi s-au obţinut culturi stabile de calus la mai multe specii de cereale şi graminee
furajere (grâu, triticale, orz, porumb, Elymus sp., raigras), atât din ţesuturi somatice, cât şi din
polen. S-a reuşit, de asemenea, inducerea şi menţinerea de culturi stabile de calus la floarea-
soarelui, lucernă şi soia.
Un interes deosebit a fost acordat simbiozelor asociative la porumb, grâu şi graminee cu
bacteriile din genul Azospirillum, demonstrându-se faptul că aceste sisteme plastice sunt
condiţionate în special de genotipul plantei şi agrofond.
În scopul ameliorării acestor simbioze asociative naturale (rizogeneze diazotrofe) a fost
urmărită reacţia diferitelor genotipuri de porumb şi de grâu la inocularea experimentală cu mai
multe tulpini bacteriene. Concomitent, s-a studiat modul în care asociaţiile bacteriene au asigurat
parţial necesarul de azot prin procesul de fixare biologică, precum şi aportul la creşterea producţiei
(P o p e s c u şi colab., 1981). Paralel cu aceste cercetări au fost iniţiate din anul 1981 şi lucrări
de transfer de informaţie genetică nif la plante neleguminoase (P o p a şi P o p e s c u , 1983).
Regenerarea plantelor din ţesuturi cultivate s-a realizat cu randament satisfăcator atât pe
calea embriogenezei somatice, cât şi prin organogeneză somatică, la urmatoarele specii: Triticum
aestivum, Triticum durum, Triticale, Hordeum vulgare, Oryza sativa, Zea mays şi Lolium
multiflorum, selecţionându-se dintrun inocul iniţial linii din calus embriogen din care s-au regerat
ulterior un număr mare de plante la grâu şi raigras (P a l a d a , 1984 b).
În programele de ameliorare, se remarcă în mod deosebit lucrările privind androgeneza la
orez şi triticale (V e r z e a, şi colab., 1982). Pe această cale, plante haploide şi dublu haploide
(DH) sunt utilizate în programele de ameliorare pentru crearea de noi soiuri de orez şi triticale.
Avantajele aplicării metodei androgenezei experimentale se regăsesc în: scurtarea procesului de
ameliorare cu 5-6 ani prin realizarea homozigoţiei într-o singură generaţie, evidenţierea genelor
recesive, exprimarea plasmagenelor paterne, homozigoţie totală, soiuri uniforme, mare
diversitate genetică şi creşterea eficienţei procesului de selecţie.
În anul 1989, P a l a d a şi colaboratorii au efectuat studii privind optimizarea culturii
anterelor şi obţinerii haploizilor şi dubluhaploizilor prin androgeneză la grâu, triticale şi orez. La
grâu au fost identificate două surse genetice cu capacitate androgenetică şi s-au obţinut plante
homozigote fertile într-o singură generaţie la toate cele trei specii de cereale investigate.
O altă aplicaţie a culturii in vitro este micromultiplicarea clonală a unor genotipuri
valoroase. Acest procedeu a fost folosit la raigrasul aristat în scopul constituirii câmpului de clone
al laboratorului de ameliorare a gramineelor furajere. Prin această metodă biotehnologică, în anii
1984-1985 au fost multiplicate 201 genotipuri realizându-se câmpul de clone de circa 2000 plante
anual. Tot în această perioadă a fost efectuată micropropagarea in vitro – metoda meristemelor şi
a calusurilor meristematice – pentru obţinerea plantelor de lucernă libere de Fusarium (Ţ e r b e
a şi I t t u, 1984).
V e r z e a (1989, 1990), folosind tehnica „embryo rescue” pentru obţinerea hibrizilor
grâu x secară, a concluzionat că metoda aplicată constituie o cale eficientă de obţinere a plantelor
viabile F1.
În anul 1991, P a p a şi colaboratorii au efectuat cercetări în scopul testării potenţialului
regenerativ în cultura de durată (long term culture) la 21 genotipuri de grâu, constatând că
intensitatea procesului de variabilitate somaclonală este direct proporţională cu durata culturii. A
fost, de asemenea, evaluată variabilitatea cromozomală a calusurilor neregenerative menţinute
timp de 150 zile prin subculturi repetate. Rezultatele studiului au evidenţiat faptul că la unele linii
pierderea capacităţii embriogene este asociată cu variaţii numerice şi structurale ale
cromozomilor, prezente în celulele calusale cu frecvenţă vizibilă în funcţie de genotip.
V e r z e a şi colaboratorii (1992) au efectuat numeroase cercetări cu privire la utilizarea
androgenezei experimentale la formele hexaploide de triticale şi rolul unor factori implicaţi în
obţinerea plantelor cu origine polinică. S-a concluzionat că în germoplasma speciei triticale de la
I.N.C.D.A. Fundulea există gene care conferă capacitatea de a parcurge androgeneza in vitro.
Încrucişarea unor linii şi soiuri care posedă această capacitate conduce la obţinerea unor hibrizi
la care se manifestă efectul heterozis pentru acest caracter. În prezent, se obţin anual prin
androgeneză în medie 2000 plante haploide, care sunt utilizate în programul de ameliorare al
speciei Triticale.
Cercetările de androgeneză la forme hexaploide de triticale (B a d e a şi colab., 1992) au
avut drept scop stabilirea influenţei mediilor de cultură şi a genotipului asupra abilităţii
androgenetice. S-au folosit cinci forme de triticale şi 20 hibrizi F1 obtinuţi din încrucişarea lor.
Rezultatele obţinute au evidenţiat faptul că încrucişarea unor linii şi soiuri care posedă capacitate
androgenetică ridicată conduce la obţinerea de hibrizi la care se manifestă efectul heterozis pentru
acest caracter.
C e a l â c u şi colaboratorii (1992) au efectuat studii referitoare la controlul biochimic al
embriogenezei somatice la lucernă şi au evidenţiat specificitatea de soi şi de tip de explant a
peroxidazei la trei soiuri cu potenţial embriogen diferit. Din ţesuturile cultivate in vitro au fost
identificate două tipuri de zimograme caracteristice pentru calusul embriogen, respectiv
neembriogen.
În 1993, V e r z e a şi colaboratorii au studiat embriogeneza somatică la formele parentale
şi hibrizi F1 rezultaţi din încrucişări dialele (6 x 6) la triticale 6x, în vederea identificării
genotipurilor hexaploide care să posede capacitate androgenetică ridicată şi acumularea unor date
care să contribuie la elucidarea unor aspecte privind determinismul genetic al abilităţii
androgenetice. S-a constatat că performanţa per se a părinţilor nu este reflectată într-o performanţă
similară la combinaţiile hibride în care sunt implicate. Selecţia părinţilor pentru programul de
încrucişări trebuie efectută pe baza analizei capacităţii lor de combinare. Diferenţele mari obţinute
în privinţa valorilor înregistrate la hibrizii reciproci sugerează ideea influenţei citoplasmei asupra
intensităţii exprimării diferitelor componente ale capacităţii androgenetice.
Primele informaţii privind rezistenţa la nivel celular la stresul salin, la lucernă, au fost
furnizate de către C e a l â c u şi V a r g a (1994), care au raportat obţinerea de linii celulare
tolerante la salinitate. Studii ulterioare efectuate la nivel biochimic (activitatea peroxidazei,
chitinazei şi conţinut în prolină) au evidenţiat o creştere a toleranţei la salinitate a plantelor
generaţiei R1.
Prin metode biotehnologice (utilizând selecţia in vitro la nivel celular) şi metode clasice de
ameliorare, a fost creat soiul Sigma, soi cu însuşiri superioare de producţie şi calitate superioară a
furajului (distinctivitate, stabilitate, omogenitate) faţă de soiurile martor Adonis şi Selena (V a r g
a şi colab., 1994).
M o r a r u şi R ă d u c a n u (1994) au efectuat studii privind cultura de antere la specia
Triticum aestivum, luând în studiu 10 genotipuri de grâu de toamnă create în România, 5 dintre
ele fiind cunoscute ca fiind purtătoare ale translocaţiei 1B/1R. S-a constatat că genotipurile
purtatoare ale translocaţiei 1B/1R au manifestat o pretabilitate superioară, asigurată statistic, la
toţi parametrii studiaţi, iar frecvenţa plantelor verzi/100 antere cultivate au fost semnificativ
corelate cu frecvenţa anterelor cu răspuns şi rata regenerării, dar nu şi cu producţia de embrioizi
şi frecvenţa plantelor albinotice.
La grâu şi triticale (M or a r u şi colab., 1994) au fost investigaţi diferiţi agenţi selectivi
(NaCl, PEG şi ABA), în vederea testării şi selecţiei pentru rezistenţa la diferiţi factori abiotici de
stres (salinitate, stres termic/hidric). A fost evidenţiată existenţa corelaţiilor pozitive între reacţia
genotipurilor în condiţii in vitro, în prezenţa agenţilor selectivi şi comportamentul plantelor în
condiţii de stres de aceeaşi natură, in vivo.
În perioada 1994-1996, au fost efectuate studii privind elaborarea unor metode de testare
şi selecţie in vitro pentru rezistenţa florii-soarelui faţă de patogenii Sclerotinia sclerotiorum şi
Phomopsis helianthi.
Rezultatele acestor studii s-au concretizat prin elaborarea a doua metode eficiente de
testare/selecţie a materialului de ameliorare, utilizând embriocultura şi drept agent selectiv
filtratul patogenilor respectivi.
În ceea ce priveşte metoda de testare a florii-soarelui pentru rezistenţa la patogenul
Phomopsis helianthi, aceasta este o metodă relativ mai uşor de efectuat (deoarece acest patogen,
spre deosebire de Sclerotinia, nu manifestă forme de atac diferite şi control genetic diferit (în
funcţie de forma de atac), este sigură şi rapidă, putându-se afla gradul de toleranţă al materialului
de ameliorare în maximum 21 de zile. Pentru Sclerotinia sclertotiorum se recomandă utilizarea
amestecurilor de filtrate, atât după forma de atac, dar şi din zone ecologice diferite, deoarece din
aceste studii s-a observat că virulenţa este influenţată şi de factorii de mediu, în funcţie de zona
ecologică de unde s-a prelevat izolatul (R ă d u c a n u, 1996).
În 1992, 1994, 1996, M a x i m şi colaboratorii au efectuat studii privind capacitatea de
regenerare in vitro la peste 40 de soiuri şi linii de orz şi orzoaică de toamnă, utilizând ca explante
embrioni imaturi. Au fost identificate linii cu înalt potenţial embriogen şi capacitate de regenerare.
De asemenea, au fost identificate genotipuri de porumb cu capacitate mare de regenerare in vitro.
Aceiaşi autori au efectuat studii privind toleranţa la ioni de Al3+ a calusului
neembriogen/embriogen de orz şi orzoaică. S-a constatat că variaţia greutăţii calusului după
perioada de selecţie a fost corelată cu tipul de calus utilizat, calusul neembriogen înregistrând
modificări minime, deoarece situsul activ de fixare a ionilor de Al3+ este reprezentat de
membranele celulare şi nucleele celulelor în diviziune activă.
Rezultate ale unui studiu privind potenţialul embriogen la unele genotipuri de grâu comun, linii
şi soiuri româneşti şi străine, în care s-a urmarit identificarea tipurilor de calus embriogen şi
stabilirea unor parametri cantitativi, precum şi expresia izoenzimelor peroxidaza şi esteraza în
timpul embriogenezei somatice au fost raportate de C e a l â c u şi colaboratorii (1996). Autorii
au observat că tipul de calus embriogen, prezent cu frecvenţa cea mai mare, pe parcursul
embriogenezei somatice, a fost calusul de tip II cf. nomenclaturii TCA, iar în urma analizei
electroforetice a peroxidazei şi esterazei, s-a constatat că acestea sunt carateristce fiecărui genotip.
Calusurile embriogene au exprimat un număr mai mare de izoperoxidaze iar esteraza a prezentat
un polimorfism mai accentuat comparativ cu peroxidaza. Variabilitatea manifestată de către
peroxidază sugerează faptul că această enzimă poate fi considerată drept marker al capacităţii
embriogenetice în cultura in vitro, la grâul comun.
În scopul evaluării variaţiei induse la nivelul locilor care codifică gluteninele cu greutate
moleculară mare (beta-amilaza şi fosfataza acidă), ca urmare a regenerării din calusuri cu origine
diferită: microspori şi embrioni imaturi, H a g i ma şi colaboratorii (1996) au efectuat cercetări,
folosind ca material biologic o linie DH de Triticum aestivum, obţinută prin dihaploidizarea unui
haploid obţinut prin cultura de antere, selecţionat pentru aptitudine androgenetică. Rezultatele
obţinute au evideţiat faptul că numărul, frecvenţa şi amplitudinea variaţiilor generate de cultura
in vitro la nivelul markerilor biochimici studiaţi au avut valori diferite, în funcţie de locii implicaţi
în biosinteza componentelor respective şi de originea calusului utilizat. Atât la gametoclone, cât
şi la somaclone a fost înregistrat un singur tip de modificare a compoziţei în subunităţi gluteninice.
În schimb, la gametoclone s-au obţinut două noi tipuri de enzimograme pentru beta-amilază, iar
la somaclone s-au conturat cinci tipuri de enzimograme. În cazul fosfatazei acide nu au fost
evidenţiate modificări induse ca urmare a culturii in vitro sau a regenerării. Regenerarea din
calusuri, prin androgeneză, a determinat o frecvenţă mai mare a variaţiilor pentru subunităţile
glutanice cu greutate moleculară mare, în timp ce regenerarea din calusuri cu origine în embrioni
imaturi a indus o frecvenţă mai mare a variaţiilor enzimogramelor betaamilazei.
Unele rezultate preliminare obţinute în urma hibridărilor interspecifice între speciile
Phaseolus vulgare şi Phaseolus acutifolius, în vederea diversificării materialului iniţial de
ameliorare a fasolei cultivate pentru rezistenţa la arşită, au fost raportate de D i n c ă şi R ă d u c
a n u (1996). Astfel, specia cultivată a fost folosită ca formă maternă iar specia sălbatică,
purtatoarea genelor de rezistenţă la arşiţă, ca formă paternă. Datorită incompatibilităţii între
specii, s-a apelat la tehnica de salvare a embrionilor la 15 zile de la efecturea hibridărilor. Folosind
embriocultura au fost obţinute plante hibride viabile.
M o r a r u şi colaboratorii (1997) au efectuat un studiu, utilizând ca agent selectiv toxina
sintetică ZEN (Zearalenone), embriocultura ca metodă in vitro, 5 genotipuri de grâu de toamnă şi
3 linii consangvinizate de porumb ca material biologic. Rezultatele studiului au evidenţiat faptul
că utilizarea toxinei ZEN a determinat o reducere a greutăţii calusului la toate soiurile de grâu,
comparativ cu varianta martor. Reduceri asigurate statistic s-au înregistrat numai la genotipurile
care au manifestat rezistenţă scăzută şi la testarea în condiţii de câmp.
Un studiu privind frecvenţa inducţiei de calus embriogen din cultura in vitro a embrionilor
imaturi, la cinci specii de cereale de toamnă (grâu comun, grâu durum, triticale 6x, triticale 8x şi
secara), a evidenţiat rolul primordial pe care îl ocupă genotipul, în ceea ce priveşte frecvenţa
inducţiei de calus embriogen, la toate cele cinci specii de cereale folosite în studiu. Valori relativ
mari ale potenţialului embriogen au fost obţinute la genotipurile de grâu comun, triticale 8x şi
triticale 6x. La genotipurile de grâu durum şi mai ales la cele de secară au fost înregistrate valori
reduse ale frecvenţei inducţiei de calus embriogen (V e r z e a şi C e a l â c u, 1997).
Cercetările întreprinse de M a xi m (1998) au demonstrat faptul că utilizarea androgenezei în
ameliorarea orzului şi orzoaicei a fost limitată din cel puţin trei considerente: obţinerea unui
procent relativ scăzut de plante verzi, influenţa mare a genotipului asupra răspunsului
androgenetic şi costul ridicat al mediului de cultură cu Ficoll.
Eficienţa culturii de antere la specia triticale este, în general, mai mică decât la grâu, în
special datorită ratei scăzute de regenerare de plante verzi. În vederea testării potenţialului
embriogenetic, V e r z e a (1998) a iniţiat un studiu pe 11 combinaţii hibride F1 de triticale, folosite
în programul de ameliorare de la I.N.C.D.A. Fundulea. În urma efectuării acestui studiu au fost
identificate cinci combinaţii hibrde F1 de triticale hexaploide, cu valori ale frecvenţei regenerării
plantelor androgenetice de peste două plante verzi la 100 antere cultivate. Randamentul culturii
de antere la formele hexaploide de triticale poate fi mărit semnificativ, prin reducerea substanţială
a numărului de plante albinotice regenerate.
În vederea îmbunătăţirii performanţelor tehnicii de cultură a anterelor in vitro la grâul
comun, V e r z e a (1998) a efectuat un studiu utilizând un sistem de selecţie în trepte. Pentru
regenerare s-au folosit trei medii de cultură: P a u k şi colab. (1991); Z h u a n g şi H u (1983) şi
C h u (1978). Plantele obţinute de pe oricare din aceste medii au fost transferate în vederea
inrădăcinării pe mediul N6-1, suplimentat cu 2,0 mg AIA /l. S-a remarcat faptul că în treapta a
doua şi a treia de regeneare s-a obţinut un număr mai mare de plante decât la prima treaptă şi au
fost identificate câteva combinaţii hibride F1, cu valori de 8,4-18,3 plante verzi la 100 antere
cultivate.
În scopul evaluării variabilităţii genetice a florii-soarelui faţă de patogenul Sclerotinia
sclerotiorum precum şi studiul relaţiei dintre simptomele morfologice, conţinutul de acid oxalic
şi activitatea enzimei SKDH, Ră d u c a n u şi colab. (1999) au efectuat un studiu pe patru hibrizi
de floarea-soarelui cu niveluri cunoscute de rezistenţă faţă de acest patogen. Plantule obţinute
aseptic din germinarea embrionilor imaturi au fost transferate în soluţii hidroponice, suplimentate
cu filtrate de Sclerotinia, şi au fost menţinute timp de 28 zile în condiţii controlate. Analiza
varianţei pentru parametrii conţinut de acid oxalic şi activitatea enzimei SKDH, la variana martor,
a evidenţiat diferenţe asigurate statistic, dar nu şi între genotipuri, pentru caracterele: înălţimea
plantei, diametrul bazei tulpinii, greutatea proaspătă a capitulului. La cele două variante de
tratament s-au semnalat scăderi semnificative pentru toţi parametrii studiaţi; acest fapt ar putea
înlesni selecţia timpurie a genotipurilor rezistente la acest patogen.
M a xi m şi B â g i u (1999) au analizat 11 genotipuri de porumb, folosind ca explante
embrioni imaturi (16-18 zile de la polenizare), în vederea idetificării acelora cu aptitudini
embriogene, în scopul introducerii lor în programul de ameliorare la diferiţi factori de stres. Au
fost identificate patru genotipuri care au format embrioizi cu simetrie bilaterală, asemănătoare
celor zigotici, pe mediu de cultură suplimentat cu sorbitol.
În practica ameliorării curente ca şi pentru cercetările moderne de genetică, generaţii haploide
de plante se obţin prin utilizarea a două categorii de metode biotehnologice; metode bazate pe
embriogeneză somatică (androgeneza, microsporogeneza şi ginogeneza) şi metode bazate pe
embriogeneză zigotică (zigoţi produşi prin hibridarea îndepărtată, urmată de eliminarea
genomului partenerului polinic şi «salvarea embrionului haploid» prin cultură in vitro.
Prin ambele categorii de metode se realizează urmatoarele:
h fixarea variabilităţii genetice utile după primele cicluri de recombinare (F1, F2, F3) prin
homozigotare completă într-o singură generaţie; h accelerarea şi creşterea eficienţei selecţiei
(corespondenţă perfectă/fenotip); h reducerea semnificativă (5-6 ani) a perioadei de obţinere de
noi soiuri; h soiurile cu origine dublu haploidă corespund întru totul criteriilor de diversitate,
uniformitate şi stabilitate genetică (DUS) impuse de UE.
Pe de altă parte, cerinţele aplicării cu succes a unui sistem biotehnologic de producere de
linii DH sunt reprezentate prin: obţinerea unui număr cât mai mare de linii DH la cât mai multe
genotipuri de interes; tehnologia sistemului să nu determine variaţii somaclonale in vitro
(variabilitate intralinie) şi liniile DH cu origine în aceeaşi combinaţie hibridă să manifeste o gamă
cât mai largă de variabilitate genetică.
În cercetările moderne de genetică haploizii şi populaţiile DH constituie materiale
biologice ideale pentru o arie largă de domenii: inducerea de mutaţii la nivel haploid; studii de
genomică şi proteomică (analize cu markeri moleculari şi analize QTL, hartare genetică);
introgresia de gene utile din germoplasma sălbatică; transformarea genetică la nivel haploid etc.
La I.N.C.D.A. Fundulea s-au iniţiat în 1991 cercetări privind aplicarea sistemelor
biotehnologice Zea şi Bulbosum pentru inducerea de haploizi şi obţinere de linii DH la grâul
comun, grâul durum şi triticale, respectiv la orzul şi orzoaica de toamnă şi primavară şi la orzul
golaş (G i u r a şi M i h ă i l e s c u, 2000).
Stabilirea protocolului de lucru pentru utilizarea celor două sisteme în condiţii
experimentale suboptime (seră) s-a realizat pe durata mai multor cicluri de hibridare şi a
determinat creşteri semnificative ale ratelor de succes pentru fiecare din cele 12 faze de lucru ale
protocolului (G i ur a, 1993, 1998, 2006; M i h ă i l e s c u şi colab., 1993, 1994, 1995).
La grâul comun (Triticum aestivum L.), îmbunătăţirile aduse protocolului de lucru au
condus la creşterea valorilor componentelor ce definesc eficienţa producerii de haploizi prin
sistemul Zea. Astfel, numărul de cariopse formate per spic lucrat s-a dublat, ajungând de la o
valoare medie de 9,2 în 1991 la 18,8 în 2002 şi 16,5 in 2005, iar valoarea medie de embrioni la
100 flori polenizate a crescut de la 8,0 în 1991 la 24,7 în 2002 şi, respectiv, 24,1 în 2005. În
perioada 1991-2005 în programul producerii de haploizi pentru ameliorarea grâului comun au fost
cuprinse 265 combinaţii hibride F1 de la care s-au obţinut 58339 embioni haploizi, din care s-au
cultivat in vitro peste 50.000 embrioni. În medie, la grâul comun s-au produs în ultimii ani între
1500 şi 2000 linii dublu haploide într-un singur ciclu anual de hibridare grâu x porumb, de 30-40
zile.
La grâul durum (Triticum durum L.) şi triticale încercările de aplicare a sistemului Zea au
fost pentru început relativ neconcludente din cauza răspusurilor genotipice foarte diferenţiate, cele
două specii fiind considerate uneori refractare la aplicarea sistemului Zea.
Îmbunătăţirea procedeelor de hibridare ca şi aplicarea unor combinaţii hormonale
specifice au condus la creşterea eficienţei producerii de haploizi la aceste două specii (G i u r a ,
2007). Numărul mediu de cariopse formate/spic la grâul durum a crescut de la 11,0 în 1996 la
15,4 în 2004, iar valorile procentuale ale embrionilor haploizi din florile polenizate a variat de la
6,6 în 1996 la 16,7 în 2004. În cazul speciei triticale numărul mediu de cariopse formate pe spic
a crescut de la 9,6 în 1995 la 15,6 în 2004 iar procentul embrionilor haploizi din florile polenizate
de la 6,4 la respectiv 11,9. Este de aşteptat ca perfecţionarea protocolului de lucru să permită
introducerea curentă a sistemului Zea în practica ameliorării şi la aceste două specii. Primul soi
de grâu durum, GRANDUR, obţinut prin aplicarea sistemului Zea, a fost înregistrat în 2005, iar
primele soiuri de grâu comun, FAUR şi GLOSA, cu origine haploidă, au fost înregistrate în 2004,
respectiv, 2005.
La orz, valorile medii anuale ale parametrilor componenţi ai eficienţei producerii de
haploizi (HPE) au crescut constant, reuşindu-se obţinerea de haploizi şi linii DH la scară
industrială. La orzul şi orzoaica de toamnă valorile medii pentru capacitatea de regenerare in vitro
de plante haploide (exprimată prin numărul de haploizi regeneraţi la 100 embrioni cultivaţi) au
fost cuprinse între 4,7 (1992) şi 41,1(1999). Eficienţa producerii de haploizi (numărul de haploizi
la 100 flori polenizate) a crescut semnificativ de la 1,2 (1992) la 16,1 (2006) cu valori maxime de
25,7 la genotipuri de orzoaică de primavară, 27,4 la orzul de toamnă, 31,5 la orzoaica de toamnă
şi 36,6 la orzul golaş de primavară. Numărul de haploizi induşi/spic lucrat a manifestat, de
asemenea, o evoluţie pozitivă. În perioada 1992–1998, valoarea medie pentru acest parametru a
fost de 0,7 crescând până la 2,9 în 2003, iar valorile maxime au fost de 4,7 la orzoaica de
primăvară, 6,7 la orzul de toamnă, 7,0 la orzoaica de toamnă şi de 7,5 la orzul golaş (M i h ă i l e
s c u şi G i u r a, 1998; G i u r a şi M i h ă i l e s c u, 2000).
Sistemul biotehnologic Bulbosum de inducere de haploizi şi producere de linii DH a
devenit, pe baza rezultatelor obţinute, una din componentele principale ale programului de
ameliorare a orzului. În medie, anual se produc între 500800 linii DH linii de orz şi orzoaică de
toamnă incluse în testări preliminare în reţeaua I.N.C.D.A. Fundulea şi în testări finale la I.S.T.I.S.
(jumătate din liniile testate la I.S.T.I.S. au origine haploidă).
Programele de inducere de haploizi şi producere de linii DH prin sistemele Zea şi
Bulbosum la grâul comun, grâul durum, triticale, orzul şi orzoaica de toamnă şi orzul golaş au fost
incluse în Proiectele Naţionale de Cercetare: AGRAL 314, AGRAL 353, BIOTECH 4545,
AGRAL33, AGRAL 316 şi CEEX 2. În perioada 2003-2006 cercetările privind rezultatele
aplicării sistemelor biotehnologice Zea şi Bulbosum au fost încadrate în Acţiunea de Colaborare
Europeană COST 851 («Gametic cells and molecular breeding for crops improvement»).
Începând cu anul 2001, în cadrul Colectivului de Biotehnologie au fost efectuate cercetări
finanţate prin proiecte naţionale. Astfel, R ă d u c a n u şi echipa de cercetare (2001-2003) au
efectuat cercetări privind posibilităţile de «Utilizare a tehnicilor in vitro în ameliorarea lucernei
(Medicago sativa L.) pentru rezistenţa la excesul ionilor de aluminiu din sol» (Proiect BIOTECH.
60), iar M or a r u şi echipa au efectuat studii privind «Utilizarea metodelor biotehnologice pentru
obţinerea de genotipuri noi de grâu cu rezistenţă la stresul termic şi hidric» (Proiect BIOTECH.
55). Ambele proiecte au avut ca obiectv prioritar identificarea şi selecţia in vitro de genotipuri cu
grade sporite de rezistenţă la factorii abiotici studiaţi, respectiv obţinerea de somaclone de lucernă
rezistente la aluminiu şi linii de preameliorare la grâu. Materialul genetic astfel obţinut a fost
introdus în programele de ameliorare al speciilor studiate. Au fost obţinute noi tehnologii de
cultură şi au fost îmbunătăţite cele deja existente în vederea creşterii randamentului de regenerare
şi aclimatizare a plantelor la transferul de la condiţii de cultură in vitro la cele in vivo.
Pentru perioada 2006-2008, se află în derulare proiectul «Studii avansate privind
posibilităţile de prevenire a îmbolnăvirilor produse de unele specii toxigene de Fusarium sp. în
lanţul trofic plante – animal – om», finanţat de Programul CEEX, Agral 74, proiect care se vrea a
fi un «preludiu» pentru accesarea de fonduri din cadrul programului FP7 (Ră d u c a n u şi echipa
de la I.N.C.D.A., parteneri: Universitatea Ovidius Constanţa şi I.N.C.D.O.C. Palas-Constanţa).

Activitatea băncii de resurse genetice vegetale Suceava


În România, activitatea de colectare şi păstrare a materialului genetic vegetal a început
odată cu debutul preocupărilor de ameliorare ştiinţifică, dar aceste activităţi şi-au conturat
caracterul sistematic, orientat către conservarea genetică a resurselor vegetale pentru alimentaţie
şi agricultura simultan cu înfiinţarea Băncii de Resurse Genetice Vegetale Suceava. La iniţiativa
dr. ing. Mihai Cristea, proiectarea băncii a început în anul 1982, iar construcţia ei a demarat în
anul 1985, proiectul fiind efectuat dupa o documentare temeinică în mai multe bănci de gene
moderne ale perioadei respective.Construcţia propriuzisă s-a desfăşurat în două etape: în anul
1987 s-a definitivat construcţia laboratoarelor, iar în anul 1988 au fost edificate celulele de
conservare.

În perioada 1987-1990 unitatea a funcţionat ca laborator specializat în domeniul resurselor


genetice vegetale, în cadrul Staţiunii de Cercetare-Dezvoltare Agricolă Suceava.

Pe baza Hotărârii Guvernului României nr. 371 din 1990, Banca de Resurse Genetice Vegetale
Suceava a devenit instituţie publică, de sine stătătoare, cu personalitate juridică, având caracter
naţional. Mandatul acesteia, specific majorităţii băncilor de gene de la nivel mondial, fiind
explorarea, colectarea, evaluarea şi conservarea resurselor genetice vegetate, fiind finanţată
integral de la bugetul de stat şi subordonată, direct, Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale.

Începând cu data de 9 decembrie 2009, când HG 1433/2009 a fost publicată în Monitorul Oficial
857, Banca de Resurse Genetice Vegetale Suceava a fost comasată cu Laboratorul Central pentru
Calitatea Seminţelor şi a Materialului Săditor Bucureşti.

 Colectarea resurselor genetice vegetale de la specii aflate în cultură, inclusiv rudele lor sălbatice
şi caracterizarea unor genotipuri de interes pentru agricultura din China şi România (2013 – 2014)

 Identificarea de genotipuri tolerante la stres termic, hidric şi biotic din speciile legumicole
tradiţionale pretabile sistemelor tehnologice specifice agriculturii biologice şi conservative (2011
– 2014)

 Colectarea de populaţii locale de porumb şi alte cereale (grâu, orzoaică, secară, ovăz, mei şi
hrişcă) din Europa de Sud Est (2009 – 2010)

 Structura genetică a populaţiilor de salvie (Salvia officinalis L.): Model de colaborare privind
studiul resurselor genetice aparţinând categoriei de cultură - plante medicinale şi aromatice (2009
– 2010)
 Colectarea şi conservarea ex situ a următoarelor specii furajere: Trifolium pratense L., Festuca
pratensis Huds., Medicago falcata L. şi Dactylis glomerata L. (2009 – 2010)

 Creşterea eficienţei utilizării unui fond important de germoplasmă locală de porumb (2008 –
2011)

 „Evaluarea diversităţii şi colectarea resurselor genetice vegetale în zona de nord şi de est a


Munţilor Carpaţi şi în regiunea Békés” (2008 – 2009)

 Studiul privind calitatea resurselor genetice de Avena spp. pentru consumul uman (2007 – 2011)

 Colectarea şi conservarea ex situ a speciilor Trifolium pratense L. şi Festuca pratensis Huds.


(2007 – 2008)

 Explorarea, inventarierea şi colectarea de varietăţi tradiţionale aparţinând categorie cerealelor,


păstrate în cultură de comunităţile rurale izolate din zona Munţilor Apuseni (2007 – 2008)

 Inventarierea, colectarea şi asigurarea accesului la resursele genetice de in şi cânepă din


regiunea Europei de Sud-Est (2007 – 2008)

 Explorarea zonelor tradiţionale de cultură a cartofului (2007)

 Inventarierea populaţiilor locale de porumb din Europa de Est (2007)

 Conservarea şi evaluarea diversităţii rudelor sălbatice ale plantelor de cultură aflate pe teritoriul
continentului european (2002 – 2005)

 Caracterizarea resurselor genetice de in din Europa şi transferul informaţiilor în baza de date


internaţională (2002 – 2003)

 Explorarea şi inventarierea diversităţii genetice a varietăţilor tradiţionale, conservate, în mod


dinamic, prin cultivare în grădinile individuale ale ţăranilor din zona de Nord a României (2002 –
2003)

 Infrastructura de informaţii privind resursele genetice vegetale din Europa (EPGRIS) (2001 –
2003)

 Suport pentru Programul Naţional de Resurse Genetice Vegetale (2000 – 2001)

 Evaluarea şi conservarea resurselor genetice de Hordeum vulgare L., în scopul creşterii


randamentului de utilizare în programele de ameliorare desfăşurate în ţările din Europa (1999 –
2002)

 Inventarierea populaţiilor locale de porumb din Munţii Carpaţi (2000 – 2002)


 Studiu comparativ al modificărilor fiziologice la cariopsele de Secale cereale L., în condiţii de
îmbătrânire naturală şi artificială (1998 – 1999)

 Caracterizarea, evaluarea, conservarea şi promovarea utilizării resurselor genetice vegetale în


programele de ameliorare (1998 – 2000)

Metode biotehnologice utilizate pentru ameliorarea


plantelor
Micropropagarea este o metodă de înmulţire foarte testată la măr, încercându-se diferite
variante de mediu (bazate însă pe cel standard, de tip Murashige-Skoog) pentru culturile „in vitro”.
Un sistem eficient de regenerare este o condiţie de bază pentru realizarea transformării şi
obţinerii plantelor transgenice la măr. Factorii care influenţează regenerarea sunt reprezentaţi de
mediul de regenerare, vârsta, genotipul şi orientarea explantului, condiţiile de incubare, iar
explantele se obţin din fragmente de lăstari sau frunze.
Micropropagarea a fost încercată pentru obţinerea pomilor pe rădă-cini proprii, dar se
aplică în practică pentru obţinerea portaltoilor, respectiv a materialului săditor. În ameliorare, poate
fi valorificată variabilitatea somaclonală, naturală sau indusă, care apare în condiţiile înmulţirii „in
vitro”.
Embriogeneza somatică, culturile de embrioni şi culturile de proto-plaşti sunt alte metode
prin care se încearcă obţinerea unei variabilităţi utile procesului de ameliorare a mărului. Markerii
moleculari sunt foarte des utilizaţi la măr, cu atât mai mult cu cât datorită nivelului ridicat de
heterozigoţie şi polimorfismului accen-tuat al mărului, tehnicile izoenzimatice pot fi applicate ca
metode de identificare a cultivarurilor. De asemenea, markerii pot avea o utilitate deosebită în
efectuarea selecţiei în fază timpurie a hibrizilor, fapt care ar simplifica şi ar contribui la scăderea
cheltuielilor necesitate de testarea tuturor plantelor hibride în câmp. Numeroase caracteristici
morfologice sau fiziologice, cu importanţă deosebită în ameliorarea mărului, pot fi identifi-cate la
nivelul ADN-ului, printre acestea numărându-se: rezistenţa la rapăn dată de gena Vf, creşterea
columnară, culoarea antocianică a fructelor, epoca de înflorire. Transformarea genetică la măr a
fost raportată pentru prima dată la soiul Greensleeves de către James şi colab. (1989), citaţi de
Janick şi colab. (1996), fiind mediată prin intermediul bacteriei Agrobacterium.
În prezent, metodele moderne de lucru furnizate de biotehnologii şi ingineria genetică sunt
utilizate intens în ameliorarea mărului. Elaborarea hărţilor genetice pentru gene majore, dezirabile
în ame-liorarea mărului, şi analiza QTL (Quantitative Trait Loci) pentru rezistenţa la rapăn şi
făinare sunt metode aplicate în cele mai avansate programe de creare de soiuri noi (Lespinasse şi
colab., 2000). Prin proiectul D.A.R.E. (Durable Apple Resistance in Europe), se propune
dezvoltarea cunoştin-ţelor, metodelor şi materialului biologic necesare pentru obţinerea unei
rezistenţe durabile a mărului la atacul fungilor patogeni, precum şi evaluarea comportării
cultivarurilor din Europa, vechi sau noi, în diferite condiţii pedoclimatice, la atacul de rapăn şi
făinare. Dintre 800 de soiuri evaluate pentru comportarea lor la atacul de rapăn şi făinare de către
Fischer şi Dunemann (2000), numai 30 de soiuri, toate vechi, au fost mai puţin atacate. Analiza
lor cu ajutorul markerilor nu a indicat existenţa unor gene cunoscute care determină rezistenţa
monogenică la rapăn sau făinare, însă ele pot fi utilizate ca soiuri cultivate în micile grădini sau
livezi particulare, sau ca surse de germoplasmă în vederea transferării rezistenţei poligenice la
descendenţii hibrizi.
În afara creării unor soiuri rezistente la boli, se urmăreşte şi obţinerea unor portaltoi cu o
bună rezistenţă (Soejima şi colab., 2000). Prin transformare mediată cu Agrobacterium, au fost
incorporate gene de rezistenţă la boli de la diferite specii, obţinându-se forme transgenice din care
au fost selecţionate liniile Orin şi JM 7. Linii transgenice rezistente la rapăn şi făinare au fost
obţinute şi de Hanke şi colab. (2000), la soiurile Pinova, Pilot, Pirol, Pingo, Elstar, Liberty, Remo,
Reka etc., prin transformare genetică mediată de Agrobacterium tumefaciens. Integrarea transge-
nică a fost verificată prin analiza PCR, iar expresia markerului nptII prin testul ELISA. Protocoale
eficiente de transformare cu Agrobacterium s-au realizat la soiul Melba (Dolgov şi colab., 1998),
la care frecvenţa de transformare a oscilat între 1,5 şi 13,3%, iar reuşita introducerii genei gusA în
plante a fost confirmată cu ajutorul analizelor PCR, măsurători fluoro-metrice şi analize
histochimice ale ţesuturilor din frunze. Din soiul columnar McIntosh, Norelli şi colab. (2000) au
obţinut linii transgenice (Marshall McIntosh) în care rezistenţa la rapăn a fost corelată direct cu
expresia endochitinazei (Ech42, aceasta reducând şi creş-terea plantelor), linii care se testează în
câmp pentru comportarea la atacul de rapăn, productivitate, calitate a fructelor etc. Tehnica AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism) a fost utilizată de Stankiewicz şi colab. (2001) pentru
identificarea markerilor necesari în vederea aplicării selecţiei asistată de marker pentru rezistenţa
la făinare a hibrizilor de măr. Metoda a fost aplicată pentru amplificarea ADN-ului de la hibrizi şi
identificarea a cel puţin un marker polimorfic pentru rezistenţa la făinare. Urbanietz şi Dunemann
(2000) au constat că diversitatea genetică pentru rezistenţa la făinare a mărului, evaluate prin
metodele RAPD-PCR, a fost foarte scăzută. Vinatzer şi colab. (2000) propun construirea unei hărţi
integrative pentru genomul mărului, combinându-se harta genetică, în care distanţele dintre
markeri şi gene sunt măsurate în cM, cu harta fizică, în care distanţele respective sunt măsurate în
perechi de baze. Kellerhals şi colab. (2000) au utilizat markerii moleculari, la măr, pentru
detectarea locusului Vf care conferă rezistenţă la rapăn, şi a locusului Pl1 care conferă rezistenţa
la făinare. Markerii moleculari au fost folosiţi şi în cazul genei Vbj, provenită de la specia Malus
baccata, în vederea promovării şi dezvoltării selecţiei hibrizilor purtători ai genei res-pective şi a
genei Vf, cu scopul obţinerii unei rezistenţe durabile. Metoda a fost aplicată descendenţilor obţinuţi
din încrucişarea soiului Ariwa, care are încorporată rezistenţa la rapăn, datorită genei Vf, şi la
făinare, datorită genei Pl1, cu selecţia FAW 7630, care se consideră că este purtătoare a genei Vbj,
ce conferă rezistenţa la rapăn. Pentru obţinerea unor rezultate cât mai precise, selecţia genotipică
a fost efectuată simultan cu cea fenoti-pică, fiind calculate şi costurile economice pe care le
presupun folosirea markerilor şi emise considerente referitoare la utilitatea selecţiei asistate de
markeri. Cercetări similare au fost efectuate de Bus şi colab. (2000), care au utilizat markerii
genetici pentru evaluarea rezistenţei mărului la rapăn, făinare şi afide, aplicând selecţia MAS
(Marker Assisted Selection). Ei au identificat markerii pentru unele gene cunoscute anterior (Er1,
Pl2 şi Vm), dar şi pentru unele noi, denumite Er3, Vh2 şi Vh4 şi au discutat eficienţa selecţiei MAS
în ameliorarea piramidală a rezistenţei la boli. Sansavini şi colab. (2003) menţionează faptul că
dintre soiurile rezistente genetic la rapăn nici unul nu a înregistrat un succes comercial
semnificativ, de aceea, introducerea în genomul unor soiuri de foarte bună calitate a unor gene de
rezistenţă la rapăn (ex. Vf) este un deziderat urmărit în multe programe de ameliorare. Plantele
transgenice regenerate (la soiul Gala) au fost verificate prin PCR, dar şi prin infecţii artificiale,
privind încorporarea genei de rezistenţă, aproape 90% din ele având genele HcrVf2 şi nptII.
Tartarini şi colab. (2000) consideră că, la măr, selecţia (screening-ul) pentru rezistenţa
plantelor hibride la rapăn este un pas extrem de impor-tant în alegerea genotipurilor valoroase şi
crearea unor soiuri rezistente, cu atât mai mult cu cât soiurile şi hibrizii de măr manifestă diferite
nivele de rezistenţă sau susceptibilitate la boală. Datele analitice obţinute prin eva-luarea
comportării plantelor la infecţiile cu rapăn, în seră şi câmp, au fost comparate cu cele rezultate în
urma aplicării selecţiei MAS. Ei apreciază că selecţia fenotipică nu prezintă suficientă acurateţe,
comparativ cu selec-ţia MAS, printer altele şi datorită faptului că unele plante (aproximativ 5%)
se dovedesc rezistente în seră, dar sensibile în câmp, la atacul de rapăn. Selecţia asistată de markeri
a demonstrat, pe lângă siguranţa ei ca metodă de lucru, faptul că plantele homozigote pentru gena
Vf sunt mai rezistente decât cele heterozigote. Şi la păr, metodele neconvenţionale de ameliorare
sunt utilizate pentru realizarea aceloraşi deziderate discutate şi la viţa de vie sau la măr.
Dintre aplicaţiile culturii „in vitro” pe termen scurt, la păr, se pot enumera culturile de
rădăcini, de apexuri (meristematice), de ţesuturi, de embrioni imaturi şi de endosperm. Prin culturi
de rădăcini,
realizate în urma germinării aseptice a unor seminţe din care se prelevă vârfurile rădăcinilor şi se
trec pe medii nutritive, se pot regenera plante întregi (via calus). Prin cultivarea pe medii nutritive
a vârfurilor de creştere (apexuri) sau a meristemelor (domul meristematic) se pot înmulţi
cultivarurile şi se poate obţine un material săditor liber de viroze, fără să apară riscul modificării
genotipului la plantele regenerate. În cazul culturilor de ţesuturi (sisteme multicelulare), are loc o
dediferenţiere celulară cu formare de calus, din masa de celule nediferenţiate putând lua naştere
neoplantule la care să se manifeste variabilitatea somaclonală. Prin culturi de embrioni imaturi se
poate valorifica materialul biologic reprezentat de seminţele obţinute din hibridări îndepărtate
(interspecifice sau chiar intergenerice) sau seminţele unor soiuri triploide, cu o slabă capacitate de
germinare; embrionii prelevaţi sunt crescuţi pe medii artificiale „in vitro”, iar plantele obţinute
sunt transplantate „in vivo” după o perioadă de aclimatizare. Se pot obţine plante care încorporează
caracteristici extrem de diferite de la două specii de Pyrus, sau plante cu diferite grade de
aneuploidie rezultate din seminţele unor soiuri triploide. Culturile de endosperm pot fi utilizate
atât în scopul obţinerii unor plante triploide (întrucât, de regulă, ţesutul endospermului este
triploid), cât şi pentru înmulţirea unor soiuri triploide de păr.
La păr, metodele de înmulţire „in vitro” se folosesc şi pentru obţinerea portaltoilor,
respective materialului săditor, liber de boli virotice (virus free), a soiurilor pe rădăcini proprii
(fără prea mare
extindere în practica pomicolă) şi stocarea şi conservarea germoplasmei, inclusiv prin criogenie
(Bell, 1990; Botu I. şi Botu M., 2003).
Dintre aplicaţiile pe termen mediu ale culturii „in vitro”, importanţă în ameliorarea (şi
genetica) părului prezintă variabilitatea care poate fi indusă somaclonal, gametoclonal, precum şi
culturile de antere, obţinerea de haploizi şi linii izogene, culturile de embrioni şi fecundarea „in
vitro”, rezultatele fiind diferite până în prezent în funcţie şi de genotipurile cu care s-a lucrat şi
având o importanţă predominant ştiinţifică (Cociu şi Oprea, 1989; Bouvier şi colab., 2002;
Chevreau, 2002). În cadrul aplicaţiilor pe termen lung ale culturilor „in vitro” se recurge la
următoarele metode: culturile de protoplaşti, fuziunea de proto-plaşti (hibridarea somatică) şi
obţinerea de cibrizi, cultura de suspensii celulare şi de celule, transferul de gene şi transformarea
genetică, respectiv obţinerea plantelor modificate genetic. La păr, protoplaştii pot fi izolaţi din
mezofilul de frunze, din material produs atât „in vitro”, cât şi „in vivo”. Din protoplaştii izolaţi,
după aproximativ trei săptămâni de cultură, se obţin colonii celulare care sunt recoltate şi
subcultivate pentru proliferarea calusului, iar din acesta se pot regenera plante întregi.
Tehnicile noi de lucru furnizate de genetica moleculară şi ingineria genetică sunt utilizate
şi la păr, modul de lucru fiind similar cu cel prezentat la măr. Cu ajutorul markerilor moleculari
(isozyme, RAPD şi RFLP) se efectuează cercetări pentru studiul polimorfismului genetic existent
în cadrul genului Pyrus, a originii unor cultivaruri europene sau asiatice, iar selecţia asistată de
markeri se aplică şi pentru identificarea unor gene dezirabile în ameliorarea părului, responsabile
de rezistenţa plantelor la factori de stres, calitatea fructelor etc. (Chevreau, 2002; Tartarini şi
Sansavini, 2003).
În mare măsură, cercetările de inginerie genetică sunt axate la păr pe introducerea în unele
genotipuri valoroase (soiuri aparţinând speciei P. communis) a unor gene de rezistenţă la boli, în
special la arsura bacteriană, provocată de Erwinia amylovora, tocmai datorită faptului că aceasta
este cea mai periculoasă boală a părului. Aproximativ 20 de gene au fost deja clonate la păr, în
mare parte la P. pyrifolia, majoritatea implicate în coace-rea şi calitatea fructelor,
autoincompatibilitate etc. (Chevreau, 2002).
Prin transformare genetică, Malnoy şi colab. (2000) a obţinut unele clone transgenice de
păr la care expresia genelor „attacin E”, „lysozyme” sau „lactoferrin” a acţionat în direcţia
reducerii semnificative a simpto-melor cauzate de agentul patogen Erwinia amylovora, după
inocularea „in vitro”. Chevreau şi colab. (2000) a obţinut 81 clone transgenice din soiul Passe
Crassane, în care a introdus diferite gene de rezistenţă la Erwinia amylovora. Integrarea
transgenică a fost verificată prin PCR, iar prin inocularea arsurii bacteriene „in vitro” au fost testate
clonele şi identificate câteva de perspectivă prin prisma reacţiei lor la patogen. Prin aplicarea unei
metode semi-cantitativă RT-PCR de verificare s-au constatat diferenţe notabile între clone privind
expresia genei „attacin E”, diferenţe corelate strâns cu acumularea transgenică de „attacin E”
evidenţiată prin metoda „Western Blot Analysis”, dar nu a fost stabilită o corelaţie între expresia
transgenică şi nivelul de rezistenţă. Multe dintre clonele transgenice au fost aclimatizate cu succes
şi testate în seră pentru comportarea la arsură bacteriană, inoculată prin infecţii artificiale. La
soiurile Harrow Sweet, US 309 şi Old Home, prin clonarea şi caracterizarea produşilor PCR cu
ajutorul enzimelor de restricţie, au fost identificate diferite clase de RGA (Resistance Gene
Analogs), demon-strându-se existenţa unor grade de omologie pentru secvenţele de gene care
determină rezistenţa la arsura bacteriană (Dondini şi colab., 2002).

Ceapa posedă un genom extrem de amplu, prin cantitatea mare de ADN pe care o conţine,
şi este o specie la care cultura, transformarea şi regenerarea „in vitro” constituie procese dificile
(Cramer
şi Havey, 1999). Până nu de mult, aplicarea tehnicilor de biotehnologie şi inginerie genetică la
ceapă era destul de limitată de puţinătatea markerilor moleculari izoen-zimatici şi de mai slaba
dezvoltare a sistemelor de transformare genetică, cel puţin în comparaţie cu alte specii (Simon,
1993).
Izoenzimele au fost identificate ca markeri biochimici după 1980, aceşti markeri fiind
folosiţi în primul rând pentru compararea speciilor genului Allium cu ceapa comună (A. cepa) şi
pentru identificarea originii unor regiuni cromozomale la hibrizii interspecifici (Havey şi colab.,
1996). În vederea construirii hărţilor genetice la ceapă, o adevărată provo-care la o specie cu un
genom uriaş cum este ceapa, foarte mult se utilizează markerii moleculari. Comparativ cu
polimorfismul
ADN-ului amplificat randomizat (RAPD), polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie
(RFLP) a fost, din punct de vedere tehnic, mai dificil de aplicat, ca metodă de lucru, însă
hibridizarea cADN-ului a relevat nivele ale polimorfismului adecvate realizării hărţilor de genom
(Bark and Havey, 1995).
King şi colab. (1998) au construit o hartă genetică de mică densitate folosind 58 familii F3
provenite din încrucişări între linii din Brigham Yellow Globe şi Alisa Craig, identificând 128 loci
de segregare (112 RFLPs, 14 RAPDs, 2 morfologici), harta constând în 114 loci distribuiţi în peste
11 grupuri de linkage, o pereche de linkage şi 12 markeri nelinkaţi. Harta a acoperit 1064 cM
(centiMorgani), cu o distanţă medie de 9,2 cM între loci. Diferite tipuri de linkage au fost
identificate între markerii RFLP şi loci care afectează caracteristici de interes economic la ceapă.
Locusul ms a fost flancat de markerii RFLP în grupul de linkage B, iar unul dintre locii
care condiţionează culoarea roşie complementară a bulbilor (numit Crb- 1 de către King şi colab.,
1998) a fost linkat cu markerii RFLP în grupul H. Deoarece se caută noi surse de diversificare a
sterilităţii mascule CMS (cu scopul reducerii vulnerabilităţii genetice), markerii moleculari se
folosesc şi pentru studiul ADN-ului existent între diferite provenienţe CMS cu citoplasmă S sau T.
Polimorfismul identificat la sursa CMS indiană Nasik White a fost identic în genomul
cloroplastic şi mitocondrial cu citoplasma S. De asemenea, prin analize RFLP s-a constatat că
populaţiile de ceapă din zonele tropicale şi subtropicale au o diversitate genetică superioară celor
din zonele temperate şi că specia A. vavilovii este un progenitor al cepei cultivate. Predominanţa
locilor RFLP dominanţi şi duplicaţi obser-vaţi în harta genetică de mică densitate a indicat faptul
că duplicaţiile în tandem, intracromozomiale, sunt potenţiale cauze care au contribuit la for-marea
unui genom cu o asemenea mărime la ceapă (King şi colab., 1998).
Lucrările care se efectuează în prezent, prin tehnicile ingineriei genetice şi utilizarea
markerilor moleculari oferă speranţa că procesul de ameliorare a cepei va fi accelerat, iar selecţia
asistată de markeri pentru caracteristici dezirabile în ameliorarea cepei (rezistenţa la boli, calitatea
bulbilor etc.) va putea fi aplicată tot mai eficient în procesul de creare de noi cultivaruri.

Odată cu amplificarea lucrărilor de biotehnologie şi inginerie genetică la plante, tomatele


au devenit un excelent material de studiu pentru biologia moleculară (Fobes, 1987). Tomatele pot
fi uşor regenerate din celule sau protoplaşti, iar selecţia unei singure celule poate duce la obţine-
rea unor linii rezistente la patogeni, erbicide sau factori abiotici de stres pentru plante. Culturile de
embrioane pot fi folosite pentru obţinerea unor hibrizi îndepărtaţi, sporindu-se variabilitatea
genetică necesară lucrărilor de ameliorare. Protoplaştii de tomate pot fuziona cu alţi protoplaşti,
aparţi-nând unor linii de tomate, specii sau chiar genuri diferite. ADN-ul de tomate a fost izolat,
clonat şi s-a efectuat transformarea genetică (începută de McCormick, în 1986), obţinându-se
numeroase linii transgenice. Au fost elaborate diferite metode de transformare folosindu-se
explante din frunze, cotiledoane, hipocotile etc. de la numeroase cultivaruri (şi specii de tomate)
şi diverse medii de cultură MS. Eficienţa transformării (mediată de Agrobacterium tumefaciens),
apreciată prin analiza „Southern blot”, este semnificativ influenţată de genotip, tipul de explant şi
reacţia acestuia la un tratament specific. Într-o inventariere a lucrărilor de transfor-mare genetică
la tomate, Park şi colab. (2003) menţionează că eficienţa transformării a oscilat între următoarele
nivele: 6% (Vidya şi colab., 2000); de la 7% la 37% (Ling şi colab., 1988); 11% (Frary şi Earle,
1996); 9% (Van Roekel şi colab., 1993); 14% (Hamza şi Chupeau, 1993); 25% (Hu şi Phillips,
2001).
Introducerea în cultură a soiurilor de tomate OMG a iscat şi creează în continuare dispute
între susţinătorii acestor tipuri de culti-varuri, obţinute prin metode neconvenţionale, şi adversarii
organismelor modificate genetic. În prezent, multe cercetări de inginerie genetică se efectuează cu
scopul obţinerii unor genotipuri de tomate cu o bună productivitate, care să aibă încorporate gene
de rezistenţă la boli, dăunători, erbicide, insecticide, excesul de sare din sol etc., conţinut ridicat al
fructelor în substanţe utile (materie uscată, vitamine, lycopen etc.). Datorită realizărilor din
domeniul geneticii moleculare, procesul de ameliorare poate fi accelerat (Ho, 2003), selecţia
asistată de markeri având un rol deosebit de important în scurtarea procesului clasic de selecţie,
promovarea pentru verificarea în câmp numai a formelor care prezintă deja anumite caracteristici
dorite, reducerea supra-feţelor de teren necesare, a volumului de muncă în câmp, iar în final, a
costurilor pentru obţinerea unor noi cultivaruri prin mijloacele clasice, convenţionale.
Identificarea şi clonarea unor gene dezirabile în ameliorarea toma-telor, cum sunt cele care
determină rezistenţa la boli, constituie obiective extrem de importante, urmărite în cercetările de
inginerie genetică; ulterior, aceste gene pot fi introduse în genomul unor cultivaruri foarte
valoroase prin productivitatea şi calitatea lor. S-a constatat că genele de rezistenţă la Cladosporium
fulvum, notate Cf4 şi Cf9, provenite de la speciile L. hirsutum şi L. pimpinellifolium, sunt situate
într-un grup de linkage pe Cromozomul 1 şi au fost izolate (Kock şi Brandwacht, 2000). Locusul
respectiv conţine mai multe gene omoloage cu genele Cf, dar a căror funcţie nu este încă cunoscută.
Prin teste de linkage genetic s-au identificat şase accesiuni la care genele de rezistenţă la
Cladosporium sunt linkate strâns cu gena Cf4, la mai puţin de 3 cM, poziţia genelor fiind
confirmată cu ajutorul markeri-lor moleculari.
Au fost identificate trei gene aflate în interacţiune specifică cu proteinele extracelulare
(ECPs) ale
fungului implicat în patogeneză, care ocupă aceeaşi poziţie cu locii Cf. Cunoscându-se organizarea
genomică şi secvenţa omologilor Cf, cu ajutorul primerilor s-ar putea face selecţia formelor care
conţin ADN genomic din sursele de rezistenţă care prezintă genele Cf-ECP.
O hartă genetică a speciei L. chilense a fost construită în scopul izolării genei care
determină rezistenţa la rasa 1 de Fusarium oxysporum (Bonnema, 2000). În mod similar s-a
procedat pentru specia L. hirsutum, iar genele Ol-1 şi Ol-3, provenite de la câteva forme sălbatice
ale speciei, care conferă rezistenţa tomatelor la Oidium, şi ocupă aceeaşi poziţie pe cromozomul
6, au fost clonate, fiind studiată structura, funcţia, specificitatea, organizarea şi evoluţia lor (Yuling
şi Hulst, 2000).
Folosindu-se tehnologia ADN-ului recombinat, în SUA a fost creată linia transgenică 5345,
rezistentă la insectele lepidoptere viermele mugurilor şi viermele fructelor (Heliothis virescens şi
Helicoverpa armigera), la care, singura diferenţă faţă de forma iniţială, nemodificată, constă în
expresia proteinei insecticidale Cry1Ac, encodată de gena cry1Ac de la bacteria Bacillus
thuringiensis. Linia transformată 5345 a fost testată în câmp în SUA, considerându-se că nu
prezintă nici o ameninţare pentru mediu sau om. Riscul interpolenizării cu polen transgenic şi
schimbului de gene cu speciile Solanum lycopersicoides şi S. rickii, sau L. esculentum var.
cerasiforme este extrem de scăzut, atât datorită faptului că cele două specii de Solanum nu apar ca
buruieni în culturile de tomate din SUA, cât şi datorită gradului destul de ridicat de
incompatibilitate sexuală în încrucişările îndepărtate, respectiv nivelului ridicat de autofertilitate a
tomatelor. Selecţia asistată de markeri (RAPD, RFLP etc.) poate fi utilizată în paralel cu cea
fenotipică, completându-se reciproc şi evaluându-se efi-cienţa fiecăreia. Este posibilă utilizarea
markerilor moleculari inclusiv pentru caracteristici organoleptice şi biochimice ale fructelor,
urmărite în crearea unor genotipuri de tomate cu fructe de foarte bună calitate (Bucheli şi colab,
2001; Francis şi colab.,2003).

Metode biotehnologice utilizate pentru reproducerea animală


Cercetarea ştiinţifică în domeniul biotehnologiilor şi aplicațiile acestora în practica
agricolă au demonstrat pe deplin legătura reciprocă şi indisolubilă dintre
reproducţia şi producţia zootehnică, în condiţiile creşterii şi dirijării fertilităţii, natalităţii
şi prolificităţii animalelor, ceea ce influenţează direct calitatea vieţii oamenilor, prin
satisfacerea necesităţilor mereu crescânde de proteine animale. Progresele
realizate în creşterea animalelor au fost posibile în urma cunoaşterii fenomenelor
intime ale reproducţiei. Reproducerea animalelor prezintă numeroase aspecte
biologice, tehnologice şi economice, care influenţează direct nivelul cantitativ şi calitativ al
producţiilor animaliere.
Biotehnologia reproducţiei aduce o contribuţia deosebită prin conţinutul
său teoretic şi practic, la sporirea continuă şi îmbunătăţirea calitativă a efectivelor
în zootehnia modernă, de înalt randament şi eficienţă economică.
Cantitatea şi mai ales calitatea producţiei de material seminal reprezintă un
mijloc principal de intensivizare biotehnologică a reproducţiei. Fertilitatea unui reproducător
este strict legată de calitatea materialului seminal. Controlul materialului seminal
scoate în evidenţă activitatea germinativă a testiculului, activitatea endocrină a sa, precum şi
a axului hipotalamo-hipofizo-testicular.
În urma progreselor realizate în domeniul reproducţiei, rezultă că, circuitul
principal hipotalamus-hipofiză-testicul nu este de sine stătător, ci se integrează în
sistemul endocrin, în care echilibrul general se menţine prin coordonarea funcţională
între glande. Dezorganizarea funcţională, la orice nivel, a acestui circuit general va
avea implicaţii tranzitorii sau definitive asupra sferei genitale a masculului şi mai
precis asupra fertilităţii acestuia.
Modificarea dirijată a structurii genetice a populaţiilor de animale în direcţia utilă
omului, reprezintă un proces dinamic şi hotărâtor al progresului în producţia animală.
Nu pot fi ignorate efectele economice benefice ale aplicării unora dintre metode în sensul
creşterii producţiei de lapte, ouă, lână, creşterii în greutate a animalelor, diminuării perioadei
neproductive, introducerii rezistenţei la o serie de boli. Cele mai optimiste gânduri ale
geneticienilor se îndreaptă deja către crearea cirezilor de vaci transgenice clonate, în laptele cărora
să se găsească din abundenţă medicamente de interes extrem.
Tehnologiile reproducerii animale au potenţialitatea de a dezvolta o mare varietate de noi soiuri
pe de o parte, iar pe de altă parte pot creşte productivitatea în zootehnie. Unele biotehnologii au
trecut chiar de la animal la om, ceea ce a condus poate la progrese, dar în multe cazuri au apărut
însă tot mai multe probleme de etică. De aceea accesul la anumite tehnici de acest gen trebuie să
fie limitat pentru a nu se declanşa viitoare mutaţii greu de depăşit pentru specia umana
Transferul de embrioni reprezintă o metodă biotehnologică modernă şi de mare actualitate
în activitatea de ameliorare genetică, fiind o etapă a fertilizării in vitro, constând în esenţă din
pregătirea şi crearea unor condiţii tehnice speciale (donator-receptor), în vederea obţinerii unui
număr cât mai mare de ovule fecundate cu material seminal de la masculi de elită şi transferul
acestora în organismul femelelor receptoare.

Datorită costurilor mai ridicate, de circa 10 ori mai însemnate decât la aplicarea
însămânţării artificiale, tehnologia este încă limitată ca introducere la scară largă. În acelaşi timp
a devenit posibil să se dezvolte sisteme industriale de producere de embrioni bovini in vitro, care
vor diminua treptat cheltuielile.

Importanţa

 sporirea prolificităţii la animale prin provocarea fătării de gemeni în urma transplantului


de doi zigoţi;
 obţinerea unei descendenţe de la femelele devenite sterile
 introducerea unor gene noi la animalele de interes
 studierea unor probleme intime de fiziologie, biochimie, genetică şi imunologie a
reproducţiei;
 metoda oferă posibilitatea studierii embrionului înainte şi după implantare, determinarea
influenţei organismului matern asupra fătului, studierii capacităţii de gestaţie a uterului,
clarificării unor cauze ale sterilităţii la animale prin aplicarea metodei transplantului
reciproc, studierii cauzelor mortalităţii embrionare, influenţei factorilor genetici şi nutritivi
asupra dezvoltării fetale, studiului posibilităţilor transplantului de nucleu din celula
somatică în celula fecundată şi dezvoltarea ei ulterioară;
 posibilitatea utilizării la maximum a unor femele de elită;
 scurtarea intervalului între generaţii prin utilizarea ca donatori a unor femele impubere;
 transferul de embrioni deschide perspective largi în reducerea costurilor de transport,
carantină şi restricţii sanitar-veterinare în comerţul cu animale;
 înmulţirea indivizilor din populaţiile rare de animale de fermă;
 recuperarea patrimoniului genetic al unor animale atinse de maladii
 producerea de organisme libere de germeni patogeni specifici;
 permite studierea influenţei factorilor endogeni şi exogeni asupra embrionului.
Figură embrion în faza de dezvoltare 8-cell gata de transfer după 3 zile de la fertilizare

Tehnologia de lucru în transferul de embrioni

Tehnica transferului de embrioni la bovine constă în inducerea superovulaţiei la o femelă


care posedă calităţi zootehnice superioare şi din însămânţarea artificială a acesteia cu material
seminal de la un taur care are, de asemenea, calităţile dorite. Ovocitele fertilizate sau embrionii
sunt apoi recoltaţi prin spălarea uterului. Embrionii sunt transferaţi în vaci mame primitoare
(receptoare).

Etapele de lucru în transferul de embrioni

Etapa I. Alegerea şi tratarea donatorilor cu FSH ( hormon de stimulare foliculară) pentru


inducerea poliovulaţiei.
Etapa a II-a. Recoltarea, conservarea şi transferul embrionilor.
Fertilizare in vitro

A constituit o adevărată revoluţie în bioştiinţe, căci numai prin amestecarea genelor


purtătoare a caracterelor ereditare reproducerea sexuată este responsabilă de proliferarea şi
diversitatea speciilor. Controlul in vitro al fecundării înseamnă accesul la programe genetice de
prim ordin la animale. Această tehnologie deschide uşa multor manipulări genetice avansate, dar
şi celor potenţial periculoase.
În timpul procesului de FIV, ouăle sunt eliminate din ovare şi fertilizate cu spermatozoizii
în laborator. Oul fecundat (embrionul) este plasat ulterior in uterul femeii.

Fecundarea in vitro are încă o importanţă economică redusă în creşterea animalelor de


fermă, deşi ea poate fi considerată ca o tehnologie integrată în transferul embrionar în cazul
producerii industriale de embrioni bovini. Imediat după realizarea fecundării in vitro urmează
momentul optim pentru introducerea prin microinjecţie a unei gene străine de interes: este vorba
de transgeneza germinală cu multiplele sale aplicaţii pentru a produce molecule recombinate sau
pentru a introduce la animal o genă de rezistenţă la maladii.

Se constată interdependenţa şi complementaritatea tehnicilor aplicate reproducerii animale.


Fecundarea in vitro este prin ea însăşi importantă pentru descifrarea mecanismelor in vivo ale
fecundării.

Este necesar de studiat de asemenea capacitatea de a fi pregătit pentru fecundare a


ovocitului, maturarea acestuia. A fost pusă la punct o complicată şi costisitoare tehnică de maturare
in vitro a ovocitului (MIV) şi de aceea ea nu este interesantă decât pentru animalele cu mare
valoare genetică după superovulaţie.

Un fenomen similar de maturare trebuie să se producă cu spermatozoizii, de unde


necesitatea manipulării lor pentru realizarea maturării in vitro a acestora în medii de cultură special
elaborate. Ambele etape de maturare in vitro a ovocitelor şi spermatozoizilor sunt absolut necesare
fecundării in vitro (FIV).

Tehnica FIV se practică actualmente la majoritatea mamiferelor cu rezultate pozitive de


circa 80%, dar supravieţuirea şi dezvoltarea embrionară in vitro rămân încă limitate.
Transgeneză

Transgeneza și gene targeting sunt două metode directe și puternice pentru analizarea
funcțiilor genelor în organismele superioare. Și mai mult ambele metode pot fi folosite pentru
obținerea de animale cu anumite proprietăți dezirabile pentru industrie sau medicină, cum ar fi
șoareci transgenici purtători de gene pentru anticorpi umani sau animale transgenice care să
producă organe utilizabile pentru transplant uman (xenotransplantare).

Transgeneza este procesul în care se introduce o genă exogenă, numită trangenă, într-un
organism viu pentru ca acesta să manifeste o proprietate nouă pe care s-o transmită generațiilor
viitoare. Aceasta poate fi falicitată de lipozomi, plasmide, vectori virali, microinjecție pronucleară,
fuziune de protoplaști.

Organismele transgenice pot exprima o genă străină, deoarece codul genetic este similar
pentru toate organismele. Transferul de ADN în celulele sexuale corespunde transgenezei
germinale, pe când transferul în celulele somatice constituie transgeneza somatică.

Organismul supus transformării genetice este considerat transgenic atunci când exogena se
inseră stabil în genomul gazdei și este funcțională, în sensul că determină sinteza produsului genic
specific. Pentru a introduce transgena în cât mai multe dintre celulele unui animal, inclusiv în
celulele germinale, transgeneza este realizată în stadiile timpurii ale dezvoltării, incluzând stadiul
de blastocist. La origine, transgeneza reprezintă o metodă științifică care permite analiza genetică
a activității unor gene de interes.

Crearea unui animal transgenic

De exemplu, se dorește să se obțină clonarea unui factor de coagulare a sângelui într-o


vacă. Esențial este ca gena ce codifică factorul de interes să fie legată de un promotor specific unei
proteine din lapte. Se asigură astfel exprimarea genei numai în laptele animalului. După aceea se
face o transfecție cu combinația genă-promotor. Tehnica folosită se numește injecție pronucleară
și permite introducerea de ADN direct în ouăle fertilizate cu ajutorul unui vârf de sticlă foarte
subțire. Totuși tehnica nu este suficient de sigură dpdv al integrării în genom, deoarece rata de
obținere a unui animal transgenic este de 1-5 din 100 născute.

Se speră că transgeneza somatică la om va permite dezvoltarea unei adevărate terapii genice


pentru tratarea unor boli devastatoare şi vindecarea maladiilor ce au la origine deficienţe genetice.

Prima reuşită a noii biotehnologii ce a revoluţionat genetica, conducând chiar la impunerea


în avangarda ştiinţei a noii discipline ştiinţifice ingineria genetică a fost realizarea şoarecilor
transgenici uriaşi (1982). O genă responsabilă de producerea hormonului de creştere la şobolan a
fost introdusă într-o plasmidă bacteriană, capabilă de autoreplicare, reproducere autonomă în
celula gazdă. Soluţia de plasmide modificate este microinjectată în pronucleul masculin al
ovocitelor fecundate de şoarece. Ouăle sunt în final transplantate la femele purtătoare. Şoarecii
rezultaţi sunt de dimensiuni duble, dar majoritatea animalelor ce supravieţuiesc au serioase
probleme de fertilitate.

Ea are numeroase aplicaţii de valoare economică, ştiinţifică şi socială excepţionale. În


primul rând ea a contribuit la evoluţia cunoaşterii fundamentale, permiţând studiul rolului genelor
în diverse procese genetice şi chiar boli. Metoda a fost folosită şi pentru realizarea de animale
transgenice bolnave (cu deficienţe genetice), de folosit ca modele ale patologiei umane. În acest
mod pot fi studiate tratamente prin terapie genică a maladiilor ce au la origine unul sau mai multe
defecte apărute într-o singură genă. O altă aplicaţie de la care se speră mult în viitor, este
producerea de substanţe terapeutice de către animale domestice transgenice: întrucât încep să fie
cunoscute genele ce codifică biosinteza unor proteine transgenice de mare interes, şi dimensiunile
lor crescute nu permit inserarea lor în ADN-ul cromozomial al celulelor de microorganisme, aceste
molecule recombinante pot fi produse de animalele domestice transgenice (de extras din lapte de
capră, vacă, oaie cu conţinut ridicat în produse cu valoare adăugată mare).

În sfârşit ameliorarea calităţilor zootehnice ale animalelor de fermă prin introducerea unor
exemplare transgenice este încă de domeniul speculaţiilor. Pot fi fixate totuşi unele obiective:
creşterea cantităţii de carne obţinută de la animalele de fermă, scăderea concentraţiei de colesterol
a cărnii şi ouălelor, realizarea de porci cu mai puţină grăsime, creşterea cantităţii de lapte cu
digestibilitate crescută prin diminuarea conţinutului de lactoză.

Un exemplu de aplicație în medicină este reprezentat de drojdiile transgenice, care produc


vaccinuri eficiente (de exemplu, vaccinul împotriva hepatitei B). Vaccinurile ar putea fi produse
și de către plante transgenice; în felul acesta, efectul curativ al vaccinului ar fi stimulat de efectul
psihologic al metodei, întrucât ingerarea unei semințe care conține principiul activ este mai
suportabilă decât injectarea vaccinului clasic care, în plus, trebuie conservat în condiții speciale.
O aplicație spectaculoasă a transgenezei în industrie o reprezintă producerea proteinei specifice
pânzei de paianjen de către capre transgenice. Proteina este prezentă în laptele produs de aceste
capre, de unde este purificat și utilizat pentru fabricarea de veste antiglonț, care sunt mai ușoare și
mai rezistente decât cele produse din oțel.

Clonare

Clonarea este procesul de izolare din clon a indivizilor care vor deveni cap de linie pentru
noi generații. Sau altfel spus crearea de copii identice. Aceasta poate fi de trei tipuri:
• clonare moleculară- crearea de copii ale fragmentelor de ADN

• clonare celulară – crearea de copii ale celulelor

• clonare de organisme

CLON s. n. / s. m. (biol.) ansamblu de celule sau organisme (bacterii, virusuri, plante) cu


structură ereditară identică, care provin dintr-un ascendent unic. (< engl., fr. clone)

Pentru realizarea unei clonări sunt utilizate: controlul ciclului sexual, maturarea ovocitară
in vitro, diagnosticul preimplantatoriu in vitro, congelarea embrionilor, transferul embrionar ca şi
noile metode de diagnostic şi monitorizarea gravidităţii.

Apariţia gemenilor adevăraţi pe căi naturale (dezvoltaţi din acelaşi zigot-ou fecundat) este
destul de rară la mamifere. Au fost studiate diverse metode de laborator pentru obţinerea acestor
urmaşi, având în mod riguros acelaşi patrimoniu ereditar pornind de la un genitor de mare valoare.

În general, pentru clonarea reproductivă se folosește transferul nuclear de celule somatice


(SCNT). Acest proces presupune transferul nucleului de la donor, o celulă adultă, la o celulă-ou
fără nucleu. Dacă celula începe să se dividă normal, atunci este transferată în uterul mamei-surogat.
Aceste clone nu sunt perfect identice, deoarece celulele somatice pot conține mutații în ADN-ul
nuclear. În plus, ADN-ul mitocondrial este în întregime de la celula-ou, deci genomul mitocondrial
nu este la fel cu cel al celulei donoare din care provine nucleul. Acest lucru poate avea implicații
serioase în cazul transferului între specii, când incompatibilitatea celor două genoame poate duce
la moarte.

O altă metodă de clonare este scindarea embrionului sau duplicarea embrionului, când
embrionul este divizat în procesul de maturare înainte de transferul embrionar. Momentul optim
de efectuare este stadiul de dezvolare 6-sau 8-cell, în care poate fi folosit ca o extindere a FIV
pentru a crește numărul de embrioni disponibili. Dacă ambii embrioni sunt un succes, aceștia dă
naștere la gemeni monozigoți.

Clonarea embrionară a lui Dolly a avut loc prin transferul de nuclei. Obiectivul zootehnic
al acestei tehnici este obţinerea unui mare număr de copii riguros conforme aceluiaşi individ de
valoare genetică ridicată. Aceste copii se numesc clone (descendenţii sunt din punct de vedere
genetic riguros identici cu genitorul). Pentru Dolly s-au
utilizat 277 de ovule pentru a obține o sarcină reușită,
recoltând ovule de la circa 40 de oi donatoare.

Pașii tehnicii:

• unor embrioni fecundaţi şi dezvoltaţi o perioadă de


vreme, conţinând un număr limitat de celule, li se
prelevează nucleii;
• fiecare dintre aceşti nuclei este introdus în câte o celulă de
ovocite din care aufost eliminaţi proprii nuclei în
prealabil;
• noul ou obţinut este activat prin electrofuziune şi
începe a se divide pentru a da naştere unui viitor embrion ce
va fi transplantat într-o femelă gazdă.

După Dolly a urmat clonarea de vaci, porci, maimuțe și șoareci. Prin clonare se pot obține
organisme cu calități programate. De exemplu, la Institutul Roslin s-au desfășurat experimente
pentru a se ajunge la vaci care să producă lapte foarte apropiat, din punct de vedere al compoziției,
de cel uman. Savanții au luat în calcul și posibilitatea ca prin clonare să fie înlocuite animalele de
casă care au murit sau să fie refăcute speciile amenințate.
Până acum s-au întreprins experiențe cu cinci specii de animale, iar rata foarte mare de
eșecuri a dat naștere multor semne de întrebare privind succesul clonării umane. Doar 1% din
clonările animale efectuate până în prezent au avut un rezultat pozitiv, dar și dintre acestea
covârșitoarea majoritate a suferit serioase disfuncții: ficatul nu funcționa bine, sângele nu avea o
tensiune normală, plămânii erau nedezvoltați, apăreau grave deficiențe ale sistemului imunitar.

Partizanii clonării umane atrag atenția că nu trebuie neapărat să urmărim nașterea unui
organism uman complet dezvoltat. Clonarea ar putea fi soluția pentru o serie de boli în prezent
netratabile. De exemplu, Marea Britanie a legalizat utilizarea embrionilor umani pentru cercetările
care sunt îndreptate în direcția vindecării unor maladii ca Parkinson și Alzheimer.
Se face deosebirea între clonarea reproductivă și cea terapeutică, aceasta din urmă
reprezentând o șansă uriașă pentru medicina contemporană. Probabilitatea mai mare de realizare
o are clonarea terapeutică, mai accesibilă din punct de vedere al tehnicii, dar și mai puțin
problematică moral. Plecând de la ADN-ul bolnavului putem obține un embrion-clonă care nu mai
este apoi introdus într-un uter, ci este utilizat drept cultură de celule stem (celulele stem fiind
nediferențiate, capabile să formeze orice tip de țesut, constituind astfel materialul ideal pentru
refacerea țesuturilor necrozate). Unica soluție pentru refacerea numărului de celule pierdute de
către organismul bolnavului, pare a fi inlocuirea cu celulele stem. Mai mult, pornind de la celulele
pacientului, prin clonare se va elimina pericolul respingerii materialului transplantat, acesta fiind
în mod natural acceptat de către organism.

Chinezii au afirmat că au clonat embrioni umani, la Colegiul Medical Xiangya, dar nu


există documente care să ateste aceste afirmații.

O noua tehnologie de clonare poate fi prezentată astfel: nu se îndepărtează nucleul ovulului,


ci se injectează nucleul unei celule aparținând celui pe care dorim să-l clonăm, se așteaptă un timp
și cele două nuclee sunt lăsate împreună pentru a se produce un fel de acomodare. Numai după
aceea se aplică denuclearizarea și, ulterior, stimulul necesar pentru ca acest complex să-și înceapă
divizarea. Punctul slab este că nici așa nu pot fi evitate pierderile, estimându-se că numai 5% din
embrioni au atins nivelul de blastocite. Celulele stem, prin urmare, nu și-au continuat înmulțirea,
timpul lor de viață fiind prea scăzut.

Controversa organismelor modificate genetic


În legislaţia din România privind regimul de obţinere, testare, utilizare şi comercializare a
organismelor modificate genetic, acestea sînt definite destul de neclar ca reprezentând orice
organism, cu excepţia celui uman, al cărui material genetic a fost modificat altfel decât prin
încrucişare şi/sau recombinare naturală sau orice entitate biologică capabilă de reproducere sau
de transferare de material genetic1.

Transferul de gene apare şi în agricultura convenţională, dar, spre deosebire de ingineria


genetică, acesta are loc numai între indivizi aparţinând aceleiaşi specii sau între specii înrudite.
Marea diversitate a speciilor de plante şi de animale existente astăzi atestă faptul că întotdeauna s-
au produs modificări în zestrea genetică a acestora. Însă, de notat, toate modificările s-au produs
treptat, în mod firesc, de-a lungul unor perioade foarte mari de timp şi, un fapt care iarăşi trebuie
reţinut, de la sine, fără intervenţia omului.

Prin tehnicile de inginerie genetică, materialul genetic „de interes“ este transferat de la organismul
donor la cel acceptor, în scopul obţinerii de organisme cu caracteristici noi, utile. Aceste tehnici
sînt următoarele:

• tehnici de recombinare a acizilor nucleici, care implică formarea de noi combinaţii ale
materialului genetic, prin inserţia moleculelor de acizi nucleici (obţinute prin diferite tehnici în
afara unui organism) într-un virus, o bacterie sau alt sistem vector şi încorporarea acestora într-un
organism gazdă, în care nu există în mod normal, dar care este capabil să continue propagarea;

• tehnici care implică introducerea directă într-un microorganism a materialului ereditar preparat
în afara microorganismului;

• tehnici de fuziune celulară sau tehnici de hibridizare, în care celulele vii cu noi combinaţii de
material genetic ereditar sînt formate prin fuziunea a două sau mai multe celule, prin metode care
nu au loc în mod natural.

Susţinătorii tehnicilor de modificare genetică afirmă că utilizarea acestora aduce numeroase


avantaje, însă aceasta este valabil, din păcate, numai pentru producătorii şi comercianţii de plante
transgenice:

• reducerea costurilor, deoarece nu mai este necesară tratarea culturilor cu îngrăşăminte chimice;
consumatorii pot fi însă păgubiţi prin efectele pe termen lung ale alimentării cu produse obţinute
din aceste culture

• creşterea rezistenţei la acţiunea dăunătorilor; nimeni nu a putut însă documenta pe termen lung
fenomenul, împreună cu implicaţiile sale asupra lanţului trofic

• obţinerea unor sporuri importante ale recoltelor; întrebarea este, însă, dacă nu cumva lipsurile
cantitative sînt de preferat prejudiciilor cauzate de impunerea plantelor modificate genetic

• îmbunătăţirea caracteristicilor organoleptice ale produselor (gust, culoare, formă); această


mutaţie forţată aduce un câştig aparent, în raport cu nişte pierderi sigure...

• prelungirea termenului de valabilitate a produselor, prin creşterea rezistenţei la păstrare; profitul


este, în realitate, al producătorilor

Astfel, în teorie totul sună minunat: plantele transgenice nu mai trebuie tratate cu substanţe
chimice, ele fiind rezistente la acţiunea dăunătorilor; în acest fel, se obţin sporuri importante ale
recoltelor, dar şi produse care nu sînt toxice, ele nefiind tratate chimic. Pe de altă parte, în
ameliorarea clasică, prin diverse încrucişări şi hibridări, transferul genelor are loc în cadrul unui
proces natural, ce durează ani mulţi, în timp ce prin tehnicile de inginerie genetică, transferul
genelor se face artificial, direct, rezultatul fiind doar aparent acelaşi, adesea plantele MG fiind
adevăraţi monştri de care nici nu ştim cum să ne păzim.

Modificările genetice generează numeroase efecte adverse asupra sănătăţii umane şi a


mediului4:

• efecte alergice şi toxice asupra oamenilor; majoritatea culturilor modificate genetic sînt
concepute să reziste la aplicări fără limită de ierbicide. Două dintre cele mai folosite chimicale,
bromoxynil şi glyphosat (Roundup TM) sînt asociate cu tulburări de creştere ale fetuşilor, cu
tumori, carcinoame, limfoame non-Hodgkin. Se consideră că soiul de porumb modificat genetic
numit StarLink declanşează reacţii alergice precum voma, diareea şi şocul anafilactic. Unii
consultanţi ştiinţifici din SUA consideră că toate proteinele din porumbul modificat genetic (36%
din producţia SUA) ar putea acţiona ca agenţi antigenici şi alergenici.

• efecte alergice şi otrăvitoare asupra plantelor şi animalelor

În această privinţă, cercetătoarea dr. biolog Irina Ermakova a efectuat un experiement la


Institutul de Neurofiziologie şi Studiul Activităţii Nervoase Superioare de pe lângă Academie
Rusă de Ştiinţă.

Nouă femele de cobai au fost împărţite în 3 grupe de câte 3: un grup de control, un grup în a cărui
hrană s-a adăugat făină de soia modificată genetic şi un grup care a consumat alimente amestecate
cu făină de soia obişnuită. Au fost numărate femelele care au născut şi numărul de cobai născuţi
şi morţi. După primul stagiu, cobaii au fost împărţiţi în două grupe, una hrănită cu făină de soia
modificată genetic, cealaltă hrănită cu făină de soia obişnuită. A rezultat un număr anormal de
mare de decese printre urmaşii femelelor hrănite cu soia modificată genetic. În plus, 36% dintre
aceiaşi cobai cântăreau mai puţin de 20 de grame, fapt care evidenţia starea lor de extremă
slăbiciune. Acesta este primul studiu care a demonstrat o dependenţă clară între hrănirea cu
alimente modificate genetic şi starea de sănătate a urmaşilor.

Morfologia şi structurile biochimice ale cobailor sînt foarte asemănătoare cu cele ale oamenilor,
ceea ce este extrem de îngrijorător în ce priveşte efectele asupra mamelor şi bebeluşilor nenăscuţi,
mai ales în contextul în care se urmăreşte introducerea de cât mai multe OMG în alimentaţia
umană, din raţiuni comerciale, a declarat în concluzie Ermakova.

Puteţi vedea, în mod sintetic, rezultatele experimentului în tabelul de mai jos:

Femele care au născut Cobai născuţi Cobai morţi în 3 săpt. Procent Cobai în viaţă
Grup de control (4 din 6) 44 3 6,8% 41
Cu soia MG (4 din 6) 45 25 55,6% 20
Cu soia comună (3 din 6) 33 3 9% 30
În imagine, doi cobai din acelaşi grup de vârstă . Cel de jos este un cobai din grupul hrănit cu soia
modificată genetic, în mod vizibil extrem de debilitat. Aviz celor care cred, cu naivitate, că OMG
nu prezintă nici un pericol...

Unul dintre nenumăratele studii cu rezultate negative făcute pe mâncarea modificată genetic a fost
realizat de cercetătorul de origine maghiară Dr. Árpád Pusztai, care a hrănit cobai cu cartofi
modificaţi genetic. Experimentul său a demonstrat că astfel hrăniţi, cobaii ajungeau să aibă
creierul, ficatul şi testiculele mai mici, precum şi sistem imunitar deficient.

S-a mai observat şi prezenţa unui număr ridicat de celule precanceroase în mai multe ţesuturi ale
organismului.

La două zile după publicarea rezultatelor studiilor sale, Dr. Puszai a fost dat afară din postul pe
care îl ocupa la Rowett Research Institute, în urma unui telefon, se spune, primit direct de la primul
ministru britanic Tony Blair. Echipa sa de cercetători a fost desfiinţată şi s-a început târârea
membrilor ei într-o serie de procese care urmăreau intimidarea acestora şi stoparea dezvăluirii a şi
mai multe adevăruri cumplite.

Jeffrey Smith, renumit susţinător al campaniei împotriva mâncării modificate genetic, susţinea în
cartea sa „Seeds of Deception: Exposing Industry and Government Lies About the Safety of the
Genetically Engineered Foods You're Eating“, apărută în 2003, că cercetătorii din FDA care şi-au
exprimat îngrijorarea cu privire la mâncarea modificată genetic „au primit normative clare de a
păstra pe viitor tăcerea referitor la acest subiect, sub ameninţarea de a fi daţi afară din post“.

• efecte dăunătoare asupra dinamicii populaţiei de specii în mediul gazdă şi asupra


diversităţii genetice a fiecăreia dintre aceste populaţii; plantele modificate genetic sînt specii
exotice, capabile să pună stăpânire pe noi teritorii, eliminând alte culturi şi creînd supergândaci şi
superburuieni, care obligă la folosirea a şi mai multe chimicale toxice. Plantele modificate genetic
pot poleniza încrucişat cu plantele culturilor similare, fenomen care a provocat deja distrugerea
multor ferme organice, ale căror standarde nu permit folosirea seminţelor modificate genetic.

• sensibilitatea modificată a agenţilor patogeni, facilitând răspândirea bolilor infecţioase sau


crearea de noi vectori;

• diminuarea acţiunii tratamentelor profilactice sau terapeutice medicale, veterinare sau


fitofarmaceutice prin transferul genelor care conferă rezistenţă la antibioticele utilizate în
medicină; deoarece modificarea genetică este o ştiinţă cât se poate de inexactă, „specialiştii
geneticieni“ folosesc o genă-marker pentru a stabili dacă inserţia genelor în organisme a reuşit.
Adesea, gena-marker este tocmai una dintre cele care codează rezistenţa la antibiotice. Organizaţia
Mondială a Sănătăţii a avertizat în 2001 că oamenii manifestă deja niveluri de rezistenţă la
antibiotice care îi fac mai vulnerabili la maladiile mortale.

• efecte asupra biogeochimiei, prin schimburi în descompunerea în sol a materialului organic.

Pornind de la ameninţările pe care OMG-urile le reprezintă pentru sistemul imunitar uman şi


pentru biodiversitatea planetei, cercetătorii din diverse domenii ale cunoaşterii (patologia,
agronomia), precum şi organizaţiile ecologiste au creat un puternic curent de opinie împotriva
producerii plantelor transgenice, dar cu toate acestea, marile companii cultivă OMG-urile la scară
largă în lume, în dispreţul opiniei publice.

Principalii producători de organisme modificate genetic

Ţările care produc organisme modificate genetic ar trebui să dispună de reglementări clare şi
responsabile şi de organe autorizate care să garanteze că riscurile sînt analizate într-o manieră
ştiinţifică şi că toate măsurile de securitate posibile sînt adoptate, pe baza testelor realizate înainte
de difuzarea produselor rezultate în urma aplicării biotehnologiilor. De asemenea, se impune o
monitorizare atentă odată ce aceste produse au fost diseminate.

Teoretic, în Uniunea Europeană nu se cultivă plante modificate genetic, astfel că, din punct de
vedere oficial, acestea ajung în consumul populaţiei doar prin intermediul importurilor. Cu toate
acestea, se ştie că organismele modificate genetic sînt comercializate nu doar în Europa, ci chiar
în întreaga lume prin intermediul alimentelor procesate, cum ar fi ciocolata, hrana bebeluşilor,
pâinea, îngheţata şi hrana pentru animale.

Cea mai mare suprafaţă cultivată cu OMG se află în SUA, aproximativ 42,8 mil ha, reprezentând
63% din întreaga suprafaţă cultivată cu OMG pe plan mondial. De altfel, SUA alocă fonduri
impresionante pentru cercetare în domeniul ingineriei genetice.

Pe locul doi se situează Argentina, cu o suprafaţă de aproximativ 14 mil. ha (21% din total
suprafaţă cultivată cu OMG), urmată de Canada cu 4,4 mil. ha (6%), Brazilia cu 3 mil. ha
(aproximativ 5%), China cu 2,8 mil ha (4%). Restul suprafeţei, reprezentând 1% din total este
cultivată de următoarele ţări: Australia, Spania, Uruguay, România, Columbia, Honduras, Filipine,
India, Indonezia.

Suprafaţa cultivată cu OMG în 2003 la nivel mondial

(Sursa: Ministerul Agriculturii, Pădurilor, Apelor şi Mediului)

SUA 63%

Argentina 21%

Canada 6%

Brazilia 5%

China 4%

Alte ţări 1%

Cele patru mari culturi de plante modificate genetic cultivate în anul 2003 pe plan mondial sînt:
soia (41,4 mil ha), porumb (15,5 mil ha), bumbac (7,2 mil ha) şi rapiţă (3,6 mil ha).

Principalele specii de plante modificate genetic cultivate în anul 2003 la nivel mondial

(Sursa: Clive James, 2003)

Soia 61%

Porumb 23%

Bumbac 11%

Rapiţă 5%

Soiurile modificate genetic, înregistrate în Catalogul oficial al României sînt: cartoful, soia, sfecla
de zahăr şi porumbul.

Soiurile modificate genetic testate şi înregistrate în Catalogul oficial al României

Specia Scopul modificării genetice

1 Cartof Rezistenţă la gândacul de Colorado

2 Soia Toleranţă la glifosat

3 Sfeclă de zahăr Toleranţă la glifosat


4 Porumb Toleranţă la glufosinat de amoniu şi la glifosat, rezistenţă la Ostrinia nubilalis

(Sursa: C. Sin – Organisme modificate genetic, Seminarul „Rolul instituţiilor europene în


monitorizarea eliberării deliberate în mediu a organismelor modificate genetic“, Ministerul
Integrării Europene, 2004)

Bibliografie
http://en.wikipedia.org

http://www.stiintasitehnica.ro/index.php?menu=8&id=521
http://www.ziare.com/magazin/specie/cele-mai-interesante-animale-hibride-galerie-foto-
1013104
http://nfs.unipv.it/nfs/minf/dispense/immunology/trgen.html
http://www.scq.ubc.ca/the-new-macdonald-pharm/
www.telelearning.ro/z/index.html
Dumitrescu, I. - Reproducţia la bovine. ed. Ceres, 1976, Bucureşti.
Tănase, D. - Biotehnici şi biotehnologii de reproducţie în zootehnie. ed. "Ion Ionescu de la Brad",
200 Iaşi.
http://www.ecolife.ro/articole/stiinta/71-controversa-organismelor-modificate-
genetic.html

http://www.incda-fundulea.ro/anale/75/75.2.pdf
http://www.svgenebank.ro/history_ro.asp