FACULTAD DE CIENCIAS DE

INGENIERÍA
E.P. ING. AMBIENTAL Y SANITARIA

COLORACION DE
MICROORGANISMO

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 COLORACION DE MICROORGANISMO

I. INTRODUCCION
La adecuacion y cualidad de la muestra o especime recibidos son de vital
importancia para su analisis en el laboratorio de microbiologia. Si las muestras
son recolectadas de manera inadecuada o son manipuladas sin el debido
cuidado los resultados del laboratorio carecen de validez. En el muestreo no
deben hacerse consesiones en la utilizacion del equipo de muestreo esteril ni
en el empleo de la tecnica aseptica, los cuales deben unirse siempre. Todos los
materiales deben esterilizarse siempre ya sea en autoclave o en el horno

Para poder visualizar a las bacterias se recurre al uso de colorantes, de tal

amnera que se pueda evidenciar ciertas estructuras como pared celular,
flagelos, capsulas, esporas, etc. Generalmente se emplean colorantes en
solucion acuosa en alcohol, y en muchos de los casos se hacen uso de
soluciones mordientes. Entre las colaboraciones mas conocidas tenemos a
Gram, wirtz, maneval, entre otras.

II. OBJETIVOS
 Adiestrar a los estudiantes en la toma de muestras para examenes
microbiologicos.
 Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram.
 Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos.
 Identifcar la morfología (coco, bacilo, etc) y tipo de tinción (Grampositiva
o Gram negativa) de las cepas proporcionadas.
 Diferenciar a las bacterias por su capacidad de retener los colorantes.
 Observar las diferentes formas de las bacterias.

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III. MARCO TEORICO

Las bacterias normalmente se multiplican por fisión transversal binaria. En

muchas especies, las células hijas resultantes de un evento de división por
fisión tienden a dispersarse por separado el medio, debido a la actuación de
fuerzas físicas (movimiento browniano, cizallamiento, corrientes de
convención, etc). Esto hace que al observar al microscopio una población de
estas bacterias veamos mayoritariamente células aisladas. Pero en algunas
especies las células hijas pueden permanecer unidas entre sí(al menos durante
cierto tiempo tras la división de la que proceden) debido a que el tabique sea
incompleto o a la insistencia de campas mucosas que retienen juntos los
productos de la división. La observación a microscopio de las bacterias nos
permite diferencias cuatro formas básicas que son:

COCOS: Estas son células bacterias en forma esférica que se pueden agrupar
individualmente, en parejas (diplococos), formando racimos irregulares en
varios planos de división (estafilococos), formando cadenas (estreptococos),
dos planos perpendiculares (tétradas cuatro células, en un plano) o múltiplos
tres planos ortogonales (sarcinas paquetes pequeños).

BACILOS: Son células en forma de bastón alargados, que a su vez pueden

tener varios aspectos: cilíndricos, fusiformes, en forma de maza, etc.
Atendiendo a los tipos de extremos, estos pueden ser: redondeados (lo mas
frecuente), cuadrados, biselados, afilados y que pueden presentarse
individualmente, en parejas (diplobacilos), formando cadenetas

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(estreptobacilos), bacilos en empalizada o en paquetes de cigarrillos (debido
a giros de 180º), dos bacilos en ángulo (en forma de letra v o l), varios bacilos
formando “letras chinas”.

ESPIRILOS: Al igual que los bacilos tienen un eje mas largo que otro, pero
dicho eje no es recto, sino que sigue una forma de espiral, con una o más de
una vuelta de hélice y que generalmente no se agrupan.

VIBRIOS: proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma, pero

en el espacio suelen corresponder a una forman en espiral con menos de una
vuelta de hélice.

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COLORACIONES SIMPLES:

Los colorantes sencillos permiten apreciar la forma, disposición y tamaño

relativo de las bacterias y en algunos casos alguna estructura que tome una
coloración más oscura, pero no muestran detalles finos de la estructura interna.
Es una solución del colorante en alcohol o en agua, como por ejemplo el azul
de metileno, nigrosina o tinción negativa, azul de lactofenol, etc. La tinción
simple puede ser directa para teñir la estructura microbiana mientras el medio
permanece sin colorear; y tinción simple indirecta, cuyo objetivo es teñir el
entorno que rodea la estructura microbiana mientras esta permanecer sin teñir.
La tinción con azul de metilo puede ser útil para teñir gránulos metacromáticos
(tinción directa). La tinción negativa permite observar las bacterias con color
translúcida sobre un campo oscuro. (tinción indirecta). La tinción con azul de
lactofenol es útil para la identificación de estructuras y esporas de hongos.
(tinción directa).

COLORACIONES DIFERENCIALES O COMPUESTAS:

Eeciben también el nombre de contraste, y se denominan así por que se utiliza

una mezcla de coloraciones simples que permiten diferenciar estructuras
celulares internas, grupos de bacterias, etc, en estas coloraciones se utiliza un
colorante primario que luego es removido de algunas células o estructuras con
una solución (generalmente agua o alcohol), y posteriormente se aplica el
colorante secundario o de contraste.

El método permite distinguir estructuras inter e intracelulares. Por ejemplo :

La coloración de Gram (idea por Cristian Gram en 1884) es una coloración
compuesta porque utiliza un colorante primario (cristal violeta) y otro de
contraste (safranina y fuscina); se llama diferencia porque permite distinguir
dos tipos de bacterias según la composición de la pared celular, las bacterias
Gram positivas quedan teñidas de color violeta y las Gram negativas de color
rojo, se utiliza el lugol (solución de yodo) para formar un complejo cristal
violeta-yodo que es más grande que los poros de la bacterias Gram positiva

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(por la presencia de pectidoglucano en grandes cantidades presentan poros
más pequeños) como para ser arrastrado al aplicar la solución de alcohol-
acetona que desintegra la gran cantidad de líquidos presentes en las paredes
de la bacterias Gram negativas deshidratándolas y haciendo que los poros de
estas permanezcan lo suficientemente abiertos como para adquirir el colorante
de contraste (y de hecho que son más grandes por la baja concentración de
pectidoglucano) y observarse de color rojo.

COLORACIÓN DE ESPORAS:

Esta coloración ayuda a identificar la presencia de esporas (típicas de los

géneros Bacillus sp. y Clostridium sp.) en el interior de la célula y distinguir
su forma y ubicación. Utiliza un colorante primario el verde de malaquita y
uno de contraste, la safranina o fuscina.

COLORACIÓN DE CÁPSULAS:

Permite identificar la presencia o ausencia de una estructura externa que

envuelve a algunas bacterias como por ejemplo de género Klebsiella sp.
Utiliza un colorante primario, la tinta china y otro de contraste la safranina o
fuscina.

TINCIÓN PARA BACILOS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE:

Permite distinguir dos grupos de bacterias unas que se decoloran al aplicar
soluciones ácidas y otras que no se decoloran. Esta técnica utiliza una solución
de fuscina fenicada de Ziehl Nielseen como colorante primario la cual se
aplica sobre el frotis y se somete al calentamiento por cinco minutos sin dejar
secar el colorante, posteriormente se lava con agua destilada varias veces y se
decolora con alcohol ácido por 20 segundos, se lava nuevamente con agua
destilada y se aplica el colorante de contraste el azul de metileno dejándolo
actuar por 30 segundos y lavando nuevamente con agua destilada. De esta
manera los bacilos resistentes al alcohol ácido se tiñen de rojo y los no
resistentes toman el color azul. La diferencia en la coloración no se debe a
reacciones químicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura

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 física de la misma. Los microorganismos pertenecientes al género
Mycobacterium sp. son característicos alcohol ácido resistentes.

TINCIÓN DE FLAGELOS: Permite observar los flagelos bacterianos con

la ayuda de un mordiente especial (dos soluciones) que los hace más gruesos
y por lo tanto visibles al microscopio óptico. Los colorantes ácidos tiñen los
componentes básicos de la célula, por ejemplo la nigrosina. Los colorantes
básicos tiñen componentes ácidos de la célula, por ejemplo: azul de metileno,
cristal violeta, safranina, fuscina y el verde de malaquita.

IV. MATERIAL Y METODO

4.1. MATERIAL.
 Cultivos de diferentes microorganismos
 Sarro dentario
 Laminas portaobjetos
 Asas de siembra
 Microscopio optico
 Torundas o hisopos esteriles
 Tubos de ensayo
 Mecheros
 Colorantes Azul de metileno, fucsina acida, verde de malaquita, cristal
violeta, safranina
 Aceite de cedro, alcohol acetona, alcohol al 70% lugol, alcohol acido
4.2. METODOS.

TOMA DE MUESTRAS

Para tomar las muestras se haran uso de toruntas o hisopos

previamente esteriles, los cuales se introduciran en la region a
examinar.

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 COLORACIONES

Coloraciones simples:

Con 2 grupos de bacterias se prepara alcohol acetona, de 20ml de

acetona y 80ml de alcohol medicinal de 70°.

Limpiear el cubre objeto con alcohol y algudon para realizar los

siguientes trabajos correspondientes.

 Encender el mechero para calentar hace de siembra y luego luego

entruducer al agua de destilada y dar una gota de agua de destilada
sobre cubre objeto, luego tambien hacer calentar hasa de siembra y
esperar 5 minutos desminuer la temperatura y luego realizar un frotis
de la muestra, (de conjunto de microoganismos cultivados en placa
petri) y hacer movimiento en forma circular sobre cubre objeto
juntamente con la gota de agua destilada que posee en cubre objeto.

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 Fijar el color moderado del mechero.

 Colorear con azul de metileno.

 Enjuagar con agua de caño a chorro suave, eliminando el exceso de
colorante

 Secar el preparado en cubre objeto a calor suave del mechero con un

movimiento muy lento sobre la temperatura.

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  Observar a menor o mayor aumento, para observar a mayor aumento
usar aceite de cedro.

Resultado: se obervan las bacterias de un solo color (azul).

COLORACION DE GRAM

 Realizar la preparacion, extenderla, secarla y fijarla.

 Agregarle cristal violeta por aproximadamente 1 minuto.
 Enjuagar con agua de caño a chorro suave.
 Cubrir el prepreparado con safranina por 30 segundos.
 Enjuajar con agua de caño y chorro suave.
 Secar y examinar al microscopio.
 Observar con el objetivo de inmersion usando aceite de
cedro.

Resultado:

bacteria Gram. positivas: color azul

Bacterias gram. negativas: color Rojo

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V. RESULTADOS
 Se pudo observar en microscopio mimicroorganismos: cocos, diplococos y
algunos bacilos en las muestras obtenidos al verlas por el microscopio.

 en microscopio se puede observar con objetivo de 40x y 100x

 los cocos se agrupan en cadenas, pares, racimos, y tetradas.
 Basilos se agrupan en cadenas en palizada o letras chinas o no pueden tener
agrupacion
 Cocobasilos y los aspirilos no presentan una agrupacion caracteristica los
bacterias de color morado o azul son de grampositivas y de color de rojo son
gramnegativas.

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VI. DISCUSION O COMENTARIO
 Los resultados sobre un estudio de gran positiva o negativa es
realmente importante para el diagnostico y buen tratamiento de la
patologia relacionada microorganismo es necesario saber como
influye en las manifiestaciones clinicas las diferencias existentes entre
la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en
su detencion y en el tratamiento. Porque existen componentes de la
pared celular que contribuye a la virulencia de las bacterias
protegiendolas de las respuestas inmunitarias. En el laboratorio se
desearia eliminar de forma selectiva las bacterias Gran positivas de
una mezcla de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
 Los fundamentos de las tecnicas se basan en las diferencias entre las
paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
 La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa
de peptidoglicano, ademas de los clases de acidos teicoicos: anclado
en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmatica,
se encuentra el acido lipoteicoico, y mas en la superficie, el acido
teicoico que esta anclado solamente en el peptidoglicano.
VII. CONCLUSIONES
 El tamano de las bacterias difculta su visión al microscopio, por eso la
tinción de estas en la microbiología es un tema sumamente
trascendente.
 Es una tincion diferencial que emplea secuencialmente dos colorantes
para destinguir 2 tipos de microorganismo en funcion de sus
diferencias en la pared celular
 La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere rigidez
a la pared celular bacteriano

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  La diferencia que observa en la resistencia a la decoloracion, se debe a
que la membrana externa de las gram negativa en soluble es solventes
organicos
 Las bacterias Gran positivas se visualizan de color azul violeta y de las
gran negativas de color rosado
 Metodo de gran utilidad pero debe ser valorado con precausion
 La reaccion puede variar según la edad de las celulas cultivos viejos de
bacterias Gran positivas pueden perder capas de peptidoglicano y
tenerse como Gran negativo
 Al decolorar por un l muy prolongado se puede correr el riesgo que
bacteria Gran positivo se tiñen como gran negativo

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

IX. elgado A., Polanco A. & Prieto S. (2001). Manual de laboratorio clínico
básico “Microbiología”. España: Mc Graw
X. García M., Fernández T. & Paredes S. (2005) Microbiología clínica práctica.
España: Repeto
XI. López T. & Torres C. (2006) Microbiología General. Argentina
XII. Ramón P. & Juárez A. (2002). Bioquímica de los microorganismos.
España:Editorial Reverté
XIII. Rodríguez C., Gamboa C. & Hernández Ch. (2005). Bacteriología
General:Principios y prácticas de laboratorio
XIV. . Costa Rica. Uberoa F. (1981) Medios de cultivo para microbiología.
Barcelona: ADSA

Actividad: ¿Cual es el fundamento de la tincion de Gram?: investigacion 3 tipos de

tincion para bacteriologia. Exceptuando la de Gram, como se realizan y para que
micoorganismo son aplicables.

 ¿Cual es el fundamento de la tincion de Gram?:

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 La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción
diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre
todo en muestras clínicas.
 investigacion 3 tipos de tincion para bacteriologia.

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a

una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que
las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se
encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento
previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

 Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.


 Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células
bacterianas o
 Exceptuando la de Gram, como se realizan y para que micoorganismo son
aplicables.

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