Collagen Fibers Orient the Mammary Epithelia

 fibras orientadas Col-I-preceden y

parecen epitelio mamario-dirigir el
Resumen  Epitelial dirección rama está determinada
por la orientación Col-I en la cultura
Durante décadas, el trabajo de los teléfonos y de  Constitutivamente activa Rac1 interrumpe
desarrollo biólogos ha demostrado la capacidad Col-I epitelial co-orientación
de ataque del mesénquima y el estroma para  contracciones mediadas-ROCK RhoA /
instruir a forma y función epitelial en la glándula aumentan orientación Col-I
mamaria [
1
,
2 resultados
,
3
Ramas epiteliales mamarias Co-orientar a
], Pero el papel de moléculas de la matriz
extracelular (ECM) en la especificación patrón fibras alineadas Col-I en el estroma
mamaria no se ha dilucidado. Aquí, se muestra La glándula mamaria es el órgano responsable de
que el colágeno estromal I (Col-I) fibras en la la producción de leche, y que se compone del
almohadilla de grasa mamaria están orientados epitelio del ectodermo derivado y estroma del
axialmente antes de la morfogénesis de mesodermo derivado ( Figura 1 A). Como
ramificación. Tras la pubertad, el epitelio de hembras entran en la pubertad, un pulso de las
ramificación orienta a lo largo de estas fibras, señales hormonales activar excrecencia epitelial
adoptando de este modo un sesgo axial mamaria en el estroma circundante, un proceso
similar. Para establecer una relación causal con conocido como la morfogénesis de
fibra de Col-I epitelial orientación, que inmersos ramificación. Para conocer mejor cómo el
organoides mamarias dentro de geles de fibra epitelio está modelada durante la morfogénesis
Col-I orientadas axialmente y observamos de ramificación, hemos desarrollado un método
dramático epitelial co-orientación. Mientras que para medir la orientación epitelial.
una forma constitutivamente activa de Rac1, una
molécula implicada en la motilidad celular,
impidió una respuesta epitelial direccional de
Col-I orientación de la fibra, la inhibición de la
quinasa asociada a Rho RhoA / (ROCK) vía no
lo hizo. Sin embargo, los estudios de lapso de
tiempo revelaron que, dentro de las matrices Col-
I orientadas al azar, el epitelio alinea axialmente
fibras en los sitios de ramificación a través de
RhoA contracciones / ROCK mediada. Nuestros
datos proporcionan una explicación de cómo la
ECM estromal codifica señales de arquitectura
para orientación rama, así como la forma en la
ramificación interpreta epitelio y refuerza estas
señales a través de procesos de señalización
distintas.

Reflejos
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Figura 1 Axial colágeno I (Col-I) pistas Orient
la ramificación Mamaria Epitelio
Mostrar leyenda completa
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 Figura Visor
 Descargar imagen en alta resolución
 Descargar (PPT)
Las glándulas mamarias se aisló cuidadosamente
y se montan en portaobjetos de vidrio para la
preservación de la arquitectura del tejido. Antes
de formación de imágenes, se utilizó hitos
morfológicos para registrar las muestras de tal
manera que el eje largo de la glándula mamaria
se especificó como 0 ° ( Figura 1 A, las flechas
discontinuas). Para cada glándula mamaria, todo
el epitelio se trazó con ImageJ y la orientación
mide en 50 m segmentos a lo largo cada traza
con el uso de una secuencia de comandos
MATLAB costumbre, produciendo ~100-300
mediciones de orientación epiteliales por
glándula. Orientación epiteliales mamarias se
midió de esta manera en temprano ( Figura 1 A,
Semana 3) y tardía ( Figura 1A la semana 8)
etapas postnatales de la morfogénesis de
ramificación. Hemos observado ningún patrón
orientación estereotipada en las glándulas
mamarias en etapa temprana, con epitelios se
distribuyen aleatoriamente a lo largo ni a corto
( Figura 1 A, ± 90 °) o eje largo ( Figuras 1 A y
1B, 0 °). En contraste, el patrón epitelial de la
última etapa se estereotipado, presentan una
orientación significativa a lo largo del eje largo
de la glándula mamaria ( Figuras 1 A y 1B, 0 °).
Dado que la orientación epitelial convirtió
axialmente sesgada después de la excrecencia
sustancial en el estroma mamario previamente
inexplorada, la hipótesis de que una señal de
patrón para la orientación puede estar ya
presente. Debido a Col-I es un componente
estromal común y porque un estudio anterior se
centró en los macrófagos mostraron la presencia
de Col-I fibras proximal al epitelio mamario [
4
], Elegimos Col-I como una señal candidata
patrones. Además, se produce la migración de
células malignas en o alrededor de-Col-I fibras [
5
,
6
], Aunque se sabe poco sobre el papel de los
haces de Col-I orientadas de forma endógena en
la interacción con el epitelio mamario en
desarrollo.
Para analizar la orientación Col-I, hemos aislado
y montado glándulas como se ha descrito
previamente con algunas alteraciones en los
métodos de tinción, obtención de imágenes y
análisis. Col-I fue marcado con Alexa Fluor 594
conjugado con CNA35, una sonda que informó
de alta afinidad para triplicar helicoidal Col-I [
7
Collagen Fibers Orient the Mammary Epithelia
3

]. La microscopía confocal se llevó a cabo en las Para probar si había una relación causal entre las
regiones del estroma distales al epitelio de las fibras de Col-I y orientación epitelial, hemos
glándulas mamarias de etapa temprana ( Figura desarrollado un nuevo método para modelar un
1 C, caja de trazos). Orientación Col-I se midió sesgo axial orientación en matrices Col-I ( Figura
mediante el plugin ImageJ OrientationJ [ 2 A) antes de la inducción de ramificación en
8 cultivos tridimensionales. Pozos maleables se
]. Hemos observado heterogeneidad en Col-I fabricaron a partir de polidimetilsiloxano
intensidad y organización ( Figura 1 C, de mayor (PDMS) y uniaxialmente estiradas ( Figura
a menor). Regiones de alta intensidad eran 2 A). Una mezcla líquida de las células
típicamente proximal a la capa fascial exterior, epiteliales mamarias Col-I y se preparó como se
mientras que las regiones de mediana intensidad describe anteriormente [
forman pistas que se observaron a varias 9
profundidades ( Figura 1 C, XZ). Ambas ] Y agregados en el PDMS pozos pre-
regiones de alta y media intensidad contenían estirados. Tras la polimerización de la matriz
fibras orientadas de manera significativa hacia el Col-I, hemos lanzado suavemente los pocillos de
eje largo ( Figura 1 D). En contraste, la PDMS para generar una compresión
intensidad de la tinción bajo Col-I se localizó en unidireccional modesto (~ 20% de
el estroma en regiones de adipocitos rico que no deformación). La visualización de la matriz de
contienen fibras y no mostró sesgo orientación Col-I por microscopía confocal reflexión,
discernible ( Figuras 1C y 1D, Low). A partir de encontramos que la compresión orientada
estos datos, se concluye que existen pistas de significativamente fibras Col-I en comparación
fibras orientadas Col-I dentro del estroma con el control orientado al azar ( figuras 2 B-
mamario antes de la morfogénesis de 2D). Experimentos suplementarios para evaluar
ramificación en regiones accesibles al epitelio de porosidad ( Figura S2 D) y el estrés residual
crecimiento. ( Figura S2 K) encontrado sólo cambios mínimos
También examinamos organización Col-I en los en la compresión, lo que indica que la
sitios proximales a los epitelios en las primeras compresión en nuestro ensayo orientación
etapas de glándulas mamarias utilizando la principalmente afectado fibra Col-I.
metodología descrita anteriormente, excepto que
la orientación Col-I se representó gráficamente
en relación con la orientación rama ( figura 1 E,
flechas discontinuas). Cerca de yemas terminales,
fibras persistieron aproximadamente 300 m por
delante del epitelio ( figura 1 E), demostrando
que las fibras de Col-I se forman antes de la
asociación epitelial in vivo. Las fibras proximales
Col-I fueron significativamente co-orientados
con dirección brote extremo ( Figura 1 F), inferir
que las fibras actúan como pistas para
excrecencia epitelial. También observamos Col-I
fibras proximal a los conductos epiteliales en las
glándulas en etapa tardía ( Figura S1etiquetado) y
Col-I era alrededor de conductos más
grandes. Estos datos sugirieron que las fibras de
Col-I pueden codificar señales de orientación en
el espacio extracelular de la glándula mamaria
antes de la ramificación del epitelio.
Col-I fibra orientación es suficiente para
dirigir ramificación
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Para determinar si la orientación de fibra de Col-I

fue suficiente para orientación rama directa,
inmersos organoides en ya sea comprimido
(modelado) o sin comprimir (control) matrices
Col-I ( Figuras 2 E-2F). Dado que el eje de
orientación de la fibra Col-I se determina por la
dirección de compresión y la uniformidad en toda
la muestra ( Figura 2 C, flecha verde),
mediciones de orientación de ramificación se
hicieron con el eje de orientación Col-I como 0 °
( Figura 2 F , flecha verde). Considerando
organoides de ramificación en el control de
matrices Col-I no mostraron sesgo orientación, se
observó orientadas axialmente ramificación en
estampadas matrices Col-I ( Figura 2G),
proporcionando una fuerte evidencia de que las
fibras de Col-imparto señales direccionales a la
ramificación células epiteliales mamarias. Hemos
repetido el ensayo in de menor densidad matrices
Col-I ( Figuras S2 E-S2J) donde el ECM fue más
porosa y menos rígida. La preferencia por ramas
epiteliales para alinearse con fibras de Col-I
orientadas permaneció ( Figura S2 J), lo que
sugiere que el proceso no es estrictamente
dependiente de la densidad de la matriz total o
rigidez.
Rac1 Actividad Modula epitelial Co-
orientación de Col-I Fibras
Utilizando nuestro patrón de ramificación ensayo
de Col-I, hemos tratado de identificar los
componentes críticos para co-
orientación. Experimentos de lapso de tiempo
iniciales mostraron protuberancias celulares
frecuentes y repetidos en los sitios de
ramificación proximales a las pistas orientadas
Col-I ( película S1 ), inferir una implicación de la
maquinaria de la motilidad de la célula con
sensor de orientación. Por lo tanto, hemos
Figura 2 Células Epiteliales Siga Col-I fibra elegido para modular este comportamiento
Orientación de una manera dependiente Rac1 mediante la activación de Rac1, una GTPasa
en Cultura demostrado que regulan protuberancias
Mostrar leyenda completa lamellipodial través de la remodelación local,
 Ver imagen grande tanto del citoesqueleto de actina y adhesiones
 Figura Visor focales [
 Descargar imagen en alta resolución 10
 Descargar (PPT) ]. La expresión de una forma constitutivamente
activa de Rac1 (Rac1-CA) rebajado orientación
rama de agregados epiteliales mamarias
Collagen Fibers Orient the Mammary Epithelia
5

significativamente en comparación con el vector aumento en Col-I fibra co-orientación por la

solo ( Figuras 2 H-2J). Morfología Branch etapa tardía ( figuras 3 B-3C). Estos resultados
también fue alterada en agregados Rac1-CA, que indican que, en ausencia de sesgo global en la
aumentaron en el número de ramas orientación de las fibras de Col-I, las células
multicelulares cortos que terminados en epiteliales mamarias pueden localmente generan
protuberancias celulares largos ( Figura 2 I, orientada caminos Col-I a través de las
flecha). Por el contrario, hemos probado si la contracciones.
expresión de fascin-1, un factor de aguas abajo
de Rac1 que estabiliza algunos salientes basadas
en actina por firmemente la agrupación de actina
[
11
], Podría aumentar Col-I fibra co-
orientación. Cuando los agregados que expresan
fascin-1 fueron incorporados en matrices Col-I
estampadas ( Figuras 2 K-2 M), se observó una
modesta, aunque no significativa, la mejora en la
detección de la orientación Col-I. A partir de
estos datos, se deduce que la actividad Rac1
puede modular la sensibilidad del epitelio de
fibras orientadas Col-I.
Las contracciones mediada por ROCK se
requieren para la Generación-No-Sensing
Col-I fibra Orientación
Durante los experimentos iniciales de lapso de
tiempo, también se observó contracciones
significativas de la matriz Col-I por agregados de
ramificación ( película S2 ), lo que sugiere que
las contracciones de células activas podrían
desempeñar un papel en la orientación local Col-
I. Para estudiar más a fondo esta interacción,
hemos realizado experimentos de lapso de
tiempo en organoides mamarias incrustados en
matrices Col-I orientadas al azar y utilizó la
microscopía confocal capaz de visualizar
simultáneamente excrecencia epitelial y la
organización matriz Col-I. Hemos establecido
una ventana de tiempo para la comparación de la
orientación Col-I en una etapa temprana antes de Figura 3 Las contracciones Rock-dependientes
la ramificación, cuando la matriz Col-I todavía están involucrados en la generación, pero no
está orientado al azar ( Figura 3 A, 28 h), a una Sensing-Col-I fibra Orientación
etapa tardía en la que se había producido Mostrar leyenda completa
ramificación sustancial ( figura 3B, 39  Ver imagen grande
h). Visualización de fibras Col-I por microscopía Figura Visor
de reflexión confocal, se observó contracciones  Descargar imagen en alta resolución
locales iniciales en los sitios de ramificación en  Descargar (PPT)
la primera etapa ( Figura 3 A, recuadro) que se
propagó a través del tiempo, lo que lleva a un
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Ante la sospecha de que la orientación generada
por células Col-I implicado RhoA / contracciones
de actomiosina mediada por ROCK [
12
], Se inhibió la actividad de roca con Y-27632,
un inhibidor de molécula pequeña que
confirmamos contracciones interrumpidas en
nuestro ensayo ( Figura S3 ). El tratamiento de
los agregados epiteliales mamarias con Y-27632
interrumpido significativamente la orientación
local de las fibras de Col-I en las sucursales
epiteliales dentro de matrices Col-I orientadas al
azar en comparación con el vehículo solo
( Figuras 3 D-3F). Estos datos demuestran que de
ramificación células epiteliales mamarias son
capaces de aumentar Col-I co-orientación a
través de contracciones mediada por ROCK.
Para estudiar el papel de las contracciones
mediadas-ROCK RhoA / en la generación
orientadas Col-I pistas, realizamos los
experimentos anteriores ( Figuras 3 A-3F) en
matrices Col-I orientadas al azar. Para determinar
si estas contracciones también estaban
involucrados en la detección de orientación de la
fibra Col-I, que en lugar inmersos células
mamarias en matrices Col-I preorientados. En
este contexto, la orientación rama no fue
significativamente diferente entre Y-27632 (20?
M) y el tratamiento con vehículo ( figuras 3 G-
3I). Además, se inhibió la actividad de RhoA a
través de la expresión de una forma dominante
negativa de RhoA (RhoA-DN). No se encontró
ningún cambio significativo en la orientación
rama entre los agregados expresar RhoA-DN y el
control de vectores ( figuras 3J-3L), en
consonancia con los resultados de experimentos
de Y-27632. A partir de estos datos, así como a
partir de estudios en los que inhibió moléculas de
aguas abajo en la ruta de RhoA / ROCK ( Figuras
S3 F-S3H), llegamos a la conclusión de que,
durante la morfogénesis de ramificación, el papel
de las contracciones de actomiosina se limita a la
mejora de la Col-I fibra orientación proximal a
los sitios de ramificación.
Discusión
La cuestión de si las señales de modelado están
presentes en el estroma epitelial antes de la
morfogénesis de ramificación no se ha resuelto, a
pesar de la evidencia acumulada que demuestra
la importancia de las interacciones entre el
epitelio y el estroma durante el desarrollo [
1
,
2
,
3
,
13
,
14
,
15
,
16
]. Aquí, se muestra que las fibras de Col-I se
orientan en la almohadilla de grasa mamaria
mucho antes de la iniciación de la morfogénesis
de ramificación. Esta observación sugiere la
intrigante posibilidad de que la arquitectura
epitelial puede ser prepatterned en el
microambiente del estroma in vivo.
El trabajo publicado ha mostrado la importancia
de la interacción celular con Col-I durante la
morfogénesis de ramificación. Por ejemplo, se
requieren regulados adecuadamente las
interacciones-Col-I para la ramificación [
17
] Así como la dirección del tejido [
18
] -Y por células polaridad [
19
]. La matriz Col-I también presenta barreras
físicas a la migración [
20
] Y cambios a Col-I estructura alterar
significativamente las propiedades mecánicas de
la ECM [
21
,
22
]. Sin embargo, a pesar de los informes en la
literatura que la mayoría de Col-I es generada por
las células del estroma [
23
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7
, factores requeridos para la morfogénesis de
24
], Presumiblemente, para señalar a-o-para dar
forma a los epitelios, hasta donde sabemos,
ningún estudio concluyente que los detalles de la
generación y el patrón de Col-I en la glándula
mamaria se ha publicado. Un estudio anterior
mencionó la posible participación de los
macrófagos en Col-I fibrilogénesis proximal al
epitelio de ramificación [
4 ( Figuras S2 A-S2C). Rac1 ha sido implicado en
]. Aunque estos estudios informaron que la
deficiencia de macrófagos lleva a extremo
terminal aberrante morfología brote [
4 ,
], No explorar si la fibrilogénesis mediada por
macrófagos dirigida la orientación epitelial. La
hipótesis de que el prepatterned Col fibras
proximales a-de- y por delante del epitelio
ramificación eran probables contribuyentes
importantes a direccionales señales para el
epitelio.
Utilizando un modelo de cultivo tridimensional
en el que una matriz de Col-I se modela
axialmente por la aplicación de tensión mecánica,
demostramos que la orientación del estroma fibra
Col-I dirige ramificación epitelial. Estudios
previos que caracterizan la estructura de matriz
de Col-I en la cultura [
25
, disminución en el número de filopodios, la
26
] E in vivo [
27
] Mostró relaciones lineales entre las
perturbaciones mecánicas y alineación de las
fibras, pero nuestro método muestra que
aproximadamente el 20% de deformación era
suficiente para alinear fibras y observar
diferencias significativas en la orientación
rama. Nuestro ensayo, en combinación con
estudios de ramificación en matrices Col-I
orientadas al azar, fue suficiente para discernir
“camino-hallazgo” de mecanismos “de
generación de trayectoria” durante la
morfogénesis de ramificación.
Identificamos Rac1 como modulador de la Col-I
de detección de la orientación que actúa durante
la morfogénesis de ramificación. Aunque otros
ramificación, tal como β1 integrina [
28
,
29
], También podría estar involucrado en la
detección de la orientación Col-I, fuimos
incapaces de determinar un fenotipo orientación
cuando ramificación producido ningún medible,
como en el caso de ITGB1 desmontables
la persistencia direccional durante de células
colectiva de una y la migración [
30
31
,
32
], Al igual que varios de sus efectores aguas
abajo [
33
,
34
,
35
]. Mientras que nosotros encontramos fascin-1
sobreexpresión no aumentó significativamente la
orientación rama en nuestro ensayo,
desmontables de fascin-1 en células de
carcinoma de colon humano dio lugar a una
rotación de adhesión focal, y la persistencia de
dirección [
33
]. Otros efectores Rac1 implicados en la
migración direccional regulan organización de
los microtúbulos. El trabajo sobre la migración
de células epiteliales de riñón se encontró que los
resultados Rac1 activación en el reclutamiento de
la IQGAP1 efector al borde de ataque, que forma
un complejo con APC y CLIP-170, que une
citoesqueleto de actina a la dinámica de
microtúbulos [
34
]. Una pantalla de RNAi automatizado de
efectores Rac1 implicados en la dinámica de
microtúbulos encontró que MAP / microtúbulos
afinidad de regulación de quinasa 2 (MARK2)
era necesario para la orientación de los
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microtúbulos en lamellipodial y direccional demostrado que yemas terminales expresan P-

migración [ 190B [
35 39
]. Curiosamente, nuestro análisis de un perfil de ], Un factor que inhibe la actividad de RhoA; por
expresión génica publicado previamente de la lo tanto, las contracciones más probable ocurren
ramificación epitelio mamario [ proximal a-o dentro-ductal epitelio, donde se
36 requiere la actividad de RhoA para la
] Reveló un aumento significativo de los genes repolarización.
en el eje Rac1 en yemas terminales frente a los Nuestro estudio proporciona una fuerte evidencia
conductos (aumentos doble: S100A6 , de que la orientación epitelial se prepatterned por
3,22; STMN1 , 2,68; Fscn1 , 2,1; IQGAP1 , estromales fibras Col-I antes de la iniciación de
1,7; Racgap1 , 2,5; ITGA5 , 1,7; y Sdc1 , 2.7). La la morfogénesis de ramificación. Se demuestra
expresión sesgada de estos genes en las yemas que la maquinaria empleada por el epitelio para
terminales apoya la participación de la detectar orientación de las fibras Col-I es
señalización de Rac1 en la morfogénesis de molecularmente diferentes de los que generan
ramificación en la parte delantera migratorio alineación Col-I. Nuestros hallazgos enfatizan
donde Col-I detección presumiblemente se que los patrones del estroma, así como detección
produce. de orientación del medio extracelular son
A pesar de las publicaciones anteriores, la procesos críticos en la determinación de la
función de señalización de RhoA / ROCK en la arquitectura de los tejidos epiteliales. El trabajo
morfogénesis de ramificación sigue siendo poco futuro tendrá como objetivo caracterizar cómo se
clara. Los estudios que usan modelos de cultivo generan tales patrones de fibra de colágeno y que
demostraron la participación de ROCK en la tipos de células están implicados en la
detección de Col-I rigidez, así como patrón morfogénesis del estroma.
tubular auto-ensamblaje [
12
,
37
], Mientras que estudios in vivo donde RhoA se
inactivó en el epitelio mamario fallaron para
inhibir la ramificación [
38
]. Al separar los procesos de modelado de fibra
de detección de la orientación, hemos comenzado
a conciliar estas observaciones aparentemente
disonantes. Nuestros resultados demuestran que
las contracciones mediadas-ROCK RhoA / no
son necesarios para detectar orientación de las
fibras Col-I. Sin embargo, se observó que estas
contracciones mejoran Col-I proximal
orientación de las fibras en el epitelio
mamario. Por lo tanto, la capacidad del epitelio
mamario para generar contracciones de
actomiosina podría ser importante para el
refuerzo de las decisiones de dirección durante la
morfogénesis de ramificación. El trabajo futuro
es necesario para confirmar esta posibilidad en
vivo y para determinar dónde se producen a lo
largo de las contracciones del epitelio. Se ha