UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Departamento Académico de Bioquímica

1° INFORME INTEGRADO DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA I

INTEGRANTES
 Arturo Apaza Champi
 George Arias León
 Magallanes Quispe Víctor Rodrigo
 Melgarejo Bendezu Mayra Erika
GRUPO
 G1 (jueves 9:00-12:20 pm)
MESA
 Mesa 1
DOCENTES
 Dra. Amparo Iris Zavaleta Pesantes
 Dra. Karim Jiménez Aliaga
 Mg. Cynthia Esquerre Huallpa

2019
 ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN
II. RESULTADOS
III. DISCUCIÓN
IV. CONCLUSIONES
V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 I. INTRODUCCIÓN

En los organismos vivientes los ácidos y las bases débiles tienen gran importancia ya que, permiten
estabilizar el pH de los fluidos orgánicos y en consecuencia ayudan a mantener la estructura y
actividad de las macromoléculas biológicas1. Por ello es importante conocer los mecanismos por los
cuales los valores de pH de distintos fluidos biológicos se mantienen dentro de sus límites.

Los sistemas biológicos operan bajos ciertos límites de acidez y basicidad. Estos sistemas producen
constantemente ciertas cantidades de ácidos y bases que no causan ningún efecto sobre el
funcionamiento del sistema, debido a que existen mecanismos que pueden controlar estos excesos y
se han denominado complejos amortiguadores o tampones1. También se le denominan buffer, entre
ellos tenemos a los dos más conocidos: el buffer bicarbonato y el buffer fosfato, cada uno
conteniendo a sus pares conjugados ácido-básicos.

El uso de amortiguadores en las investigaciones bioquímicas es de gran importancia debido a que

mantiene la integridad y el funcionamiento celular, de lo contrario no se podría emprender el
estudio de células intactas, partículas celulares o en muchos casos aislar y caracterizar biomoléculas
purificadas, particularmente biopolímeros sin poner atención al control del pH1. El pH de estas
soluciones amortiguadoras se podrá calcular mediante la ecuación de Henderson-Hasselbach.

Los métodos de determinación de proteínas totales están basados en sus características diferenciales
respecto al resto de las biomoléculas presentes en las muestras biológicas. Hay métodos que tienen
su principio en la determinación de la cantidad de nitrógeno presente (método de kjendahl), en la
presencia del enlace peptídico (métodos de biuret, de Lowry y de BCA-ácido bicinconínico), en la
formación de complejos con determinantes agentes (método de Bradford) o en la capacidad de las
proteínas de precipitar en presencia de determinados agentes caotrópicos (nefelometría)2.

El presente trabajo tiene como objetivo en primera instancia ayudar a comprender y comprobar la
capacidad amortiguadora por el cual las soluciones buffer mantienen el pH del medio en el que se
encuentra, así como la preparación de soluciones amortiguadoras utilizando la ecuación de
Henderson-Hasselbach. Por otro lado, se plantea la adquisición de destreza en el manejo de
animales de laboratorio, para el cual se trabajará con una rata albina Rattus novergicus, y
extracción de su material biológico (corazón, hígado e intestino) teniendo en cuenta cada aspecto
durante todo el procedimiento. A partir del material biológico extraído se realizarán análisis de
identificación. En el caso del hígado se determinará la cantidad de proteínas mediante el método
Bradford.
 II. RESULTADOS
PREPARACION DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS:

 Ensayo No1: Preparación de soluciones buffer:

Preparación de Buffer fosfato 100 mM pH 7.4

Peso de fosfato monobásico de sodio y fosfato dibásico de sodio:

Figura 1. Fosfato monobásico de sodio Figura 1. Fosfato dibásico de sodio

(1 − X)
7,4 = 6,83 + log
X
(1 − X)
0,57 = log
X
(1 − X)
100,57 =
X
(1 − X)
3,71 =
X

3,71 Sal
=
1 Ácido débil

3,71 x + 1 x = 0,1

4,71 x = 0,1

X=0,021M Concentración de NaH2PO2

X2=0,1 – 0,021= 0,079M Concentración de Na2HPO4

Masa NaH2PO2 = 0,021 moles/ 1L x 0,05L x 120 g/mol = 0,126 g

Masa Na2HPO4 = 0,079 moles/ 1L x 0,05L x 142 g/mol = 0,560 g

Valor del pH del buffer fosfato preparado (tiras reactivas) = 7,5

Valor del pH del buffer fosfato preparado (pH metro) = 7,49

  Ensayo No2: Comprobación de la capacidad amortiguadora

pH luego de añadir ____ mL de NaOH

pH Inicial 0.05 M

1mL 2mL 3mL

Solución buffer fosfato 7,49 7,6 7,9 8,3
100mM (10 mL)

Cuadro 1. Resultados de pH del buffer

Figura 3. Resultados de pH del buffer

pH luego de añadir ____ mL de NaOH

pH Inicial 0.05 M

1mL 2mL 3mL

Agua (10 mL) 7 8.5 9.5 12.5

Cuadro 2. Resultados de pH del agua

DETERMINACION TEORICA DE LOS CAMBIOS DE pH

Hallando moles/L de HA y B

7,49= 6,83 + log(B)/(A)

0,66=log (B)/(A)

4,57x/x = (B)/(A)
 5,57x= 0,1M

X=0,01795 moles/L de Acido

X1=0,1-0,01795 = 0,08205 moles /L de Base

Hallando No de moles

HA= 0,01795 moles/L x 0,01L= 1,795 x10-4 moles

B= 0,08205 moles/L x 0,01L= 8,205 x 10-4 moles

Cambio del pH al agregar 1mL de NaOH 0,5 M

NaOH= 0.05Mx0, 001L= 5x10-5

Acido= 1,795x10-4 - 5x10-5= 1,295x10-4

Base= 8,205x10-4 + 5x10-5= 8,705x10-4

pH= 6,83 + log (8,705x10-4) / (1,295x10-4)

pH = 6,83 + 0,8274 = 7,6574

Cambio del pH al agregar 2mL de NaOH 0.5 M:

NaOH= 0.05Mx0, 002L= 1x10-4

Acido= 1,795x10-4 - 1x10-4= 7,95x10-5

Base= 8,205x10-4 + 1x10-4= 9,205x10-4

pH= 6,83 + log (9,205x10-4) / (7,95x10-5)

pH = 6,83 + 1,0636= 7,893

Cambio del pH al agregar 3mL de NaOH 0,5 M:

NaOH= 0.05Mx0, 003L= 1,5x10-4

Acido= 1,795x10-4 – 1,5x10-4= 0,295x10-4

Base= 8,205x10-4 + 1,5x10-4= 9,705x10-4

pH= 6,83 + log (9,705x10-4) / (0,295x10-4)

pH = 6,83 + 1,5171= 8,3471

Cambio del pH al agregar 3mL de NaOH 0,5 M (agua en lugar de buffer fosfato):

N1 x V1 = N2 x V2

0,5 x 3 = N2 x 10

𝑁2 = 0,15

POH = −log[𝑂𝐻 − ] = − log[0,15] = 0,82

pH = 13,18

MANEJO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACION PARA LA OBTENCION DE

MATERIAL BIOLOGICO

PESO DEL RATÓN

(432,82gr)

HÍGADO
(15,46gr)

CORAZÓN
(1,45gr)
 INTESTINO
(4,27gr)

Cuadro 3. Obtención de material biológico

DETERMINACION DE CONTENIDO PROTEICO EN MUESTRAS BIOLOGICAS

ABSORBANCIA REAL DE LOS ST

No Tubo ST (BSA) uL H20 uL Bradford uL Absorbancia Absorbancia

real

1 0 100 900 0,346 -----------------

2 2 98 900 0,440 0,094

3 4 96 900 0,506 0,160

4 6 94 900 0,557 0,211

5 8 92 900 0,634 0,288

6 10 90 900 0,701 0,355

7 15 85 900 0,816 0,470

Cuadro 4. Absorbancia real de la muestra estándar

Figura 4. Resultados de la absorbancia de la muestra estándar

ABSORBANCIA DEL BLANCO Y LAMUESTRA PROBLEMA:

Tubo Dilución de KCL H20 uL Bradford uL Absorbancia Absorbancia

hígado uL 0,5M real
uL

Muestra 5 -------- 95 900 428 101

problema

Muestra -------------- 5 95 900 327 ----------------

en blanco
Cuadro 5. Absorbancia del blanco y la muestra problema

Figura 5. Espectrómetro UV-visible

GRAFICA ABSORBANCIA VS ST uL

CONCENTRACIÓN
M.P en uL
III. DISCUCIÓN
Es importante tener en cuenta el pKa del buffer fosfato en su segunda disociación ya que es de 7.2
(valor muy cercano al pH fisiológico).3 Mientras más cercano sea el valor entre pH y el pKa del
buffer, el valor del logaritmo de las concentraciones entre base conjugada/ácido débil será
aproximado a 1, por lo tanto, sus concentraciones serán similares. De esta manera el buffer podrá
ser más efectivo. El pH del buffer preparado fue de 7.49 el cual es muy cercano al pH fisiológico
(7.4) y funcionará como amortiguador.
Las muestras biológicas se pueden preservar mediante los buffers, siempre y cuando el valor de pH
sea cercano al pH fisiológico. En este caso el pH es cercano, por lo tanto, se puede usar para
preservar las muestras biológicas.
Para la extracción de material biológico, después de hacer dormir al animal en una cámara con éter
dietílico, observamos que una forma eficiente de drenar sangre del cuello de la rata (luego del corte)
es colocándolo boca arriba e inclinando su cabeza hacia abajo, por gravedad la sangre irá fluyendo.
La determinación de proteínas se realizó mediante el método de Bradford, este método se basa en la
formación de un complejo entre el colorante azul brillante de Coomassie G-250 y las proteínas en
solución,4 es un método rápido. Dicha coloración fue observada en las celdas. Mientras más
concentrado era la solución en cuanto a las proteínas, se apreciaba más un color azul. El BSA es un
estándar proteico muy utilizado debido a que es económica y de fácil disponibilidad. Se pueden
utilizar también inmunoglobulina G o lisozima.4 Se debe tener cuidado en la preparación de la
muestra estándar ya que dependiendo de las absorbancias que de como resultado a diferentes
concentraciones se trazará una curva de calibración, la cual servirá para determinar la concentración
de proteínas en la muestra problema (hígado).
IV. CONCLUSIÓN
Se comprobó la capacidad amortiguadora del buffer fosfato comparando con datos teóricos según la
ecuación de Henderson-Hasselbach. Así como también se comprobó la importancia de la ecuación
para preparar una solución buffer ya que se pueden conocer las proporciones del ácido débil y base
conjugada o base débil y ácido conjugado.
Se extrajo con éxito cada muestra biológica (corazón, hígado e intestino), teniendo en cuenta los
cuidados necesarios durante el procedimiento, como lo es la limpieza de materiales, trato del
animal, condiciones en el que se mantendrá al animal y la buena práctica en la realizar la
extracción).

A partir del hígado extraído se determinó la cantidad de proteínas contenidas mediante el método de
Bradford. Se manipuló adecuadamente el espectrofotómetro al medir la absorbancia tanto de la
muestra como del estándar. Al comparar los resultados e interpolar la absorbancia de la muestra
problema en la curva de calibración del estándar se obtuvo un resultado de 5.6 µg/µL de
concentración de la albúmina sérica bovina (BSA).
V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Lemus M., Cortez L. Bioquímica general: Fundamento y análisis de laboratorio. 1ra ed.
Ecuador: Universidad Técnica de Machala; 2015.
2. Roca P., Oliver J., Rodríguez A. Bioquímica Técnicas y métodos. Madrid: Editorial
Helice;2003.
3. Gonzales M. Curso de biomoléculas: Ácido fosfórico. Disponible en
http://www.ehu.eus/biomoleculas/buffers/buffer1.htm
4. Johnson M. Cuantificación de proteínas. New Jersey: Labome. 2012. Disponible en
http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html