Transformación genética de brotes micropropagados de Pinus radiata D.

Don

Resumen

Mensaje clave Se usó Agrobacterium tumefaciens para transformar brotes de pino radiata y para
producir de manera eficiente plantas de pino genéticamente modificadas estables.

Resumen Los explantes de brotes micropropagados de Pinus radiata D. Don se utilizaron para
producir plantas transgénicas estables mediante la transformación mediada por Agrobacterium
tumefaciens. Usando este método, cualquier genotipo que pueda ser micropropagado podría
producir líneas transgénicas estables. Como más del 80% de los genotipos de P. radiata probados
pueden ser micropropagados, esto efectivamente significa que cualquier línea elegida para
características superiores podría transformarse. Existen protocolos bien establecidos para hacer
progresar este germoplasma hacia el despliegue en el campo. Aquí utilizamos líneas de semillas
polinizadas abiertas y de control y clones embriogénicos. El método desarrollado fue más rápido
que otros métodos desarrollados previamente con cotiledones maduros. Los brotes de PCR
positivos podrían obtenerse dentro de los 6 meses posteriores al cultivo de Agrobacterium en
comparación con los 12 meses para los métodos de cotiledón. Los brotes transformados se
obtuvieron utilizando kanamicina o geneticina como gen marcador seleccionable. Los brotes se
recuperaron de la selección, se probaron y no fueron quiméricos, lo que indica que la presión de
selección fue óptima para este tipo de explante. La GFP se usó como un marcador vital, y el gen
bar, (para la resistencia al herbicida Buster®) se usó para producir líneas que podrían usarse en
aplicaciones comerciales. Como se esperaba, se identificaron una variedad de fenotipos de
expresión para estos dos genes informadores y los análisis para la expresión fueron relativamente
fáciles.

Palabras clave pino radiata, Agrobacterium tumefaciens, regeneración de brotes, transformación

eficiente y estable, coníferas.

Introducción

Pinus radiata D. Don (pino radiata, pino de Monterrey) es una importante especie forestal de
plantación en el hemisferio sur, particularmente en Nueva Zelanda, Australia y Chile. La madera de
pino y la pulpa se utilizan ampliamente en las industrias de la construcción y el papel de periódico.
Los avances en la productividad de los bosques de plantación se han logrado gracias a los avances
en las prácticas silvícolas y al mejoramiento genético del stock de plantación mediante el
fitomejoramiento tradicional. Al igual que con otras especies forestales que se cruzan, la ingeniería
genética ofrece la oportunidad de modificar rasgos de calidad en un marco de tiempo más corto
que el de la cría tradicional.

La modificación genética de las coníferas se ha basado en el bombardeo con microproyectiles y,

más recientemente, en los métodos mediados por Agrobacterium tumefaciens en combinación
con la embriogénesis somática de embriones cigóticos inmaduros cultivados para producir árboles
transformados (Larix kaempferi x L. decidua: Levée y otros (1997); Pinus radiata; Walter y otros
(1998), Cerda y otros (2002); Pinus strobus: Levee y otros (1999); Picea abies: Wenck y otros
(1999), Brukhin y otros (2000), Klimaszewska y otros (2001); Picea glauca, P. mariana:
Klimaszewska y otros (2001).

Los explantes de cotiledón de embriones de Pinus radiata maduros se han transformado con éxito
con Agrobacterium tumefaciens, y se han producido plantas transgénicas a partir de una gama de
genotipos de P. radiata a partir de semillas de polinización abierta y de polinización de control
(Grant et al. 2004). Para loblolly pine, (Pinus taeda), Tang et al. (2001) y Tang (2003) informaron
sobre la transformación exitosa de Agrobacterium en embriones maduros y para pino chir (Pinus
roxbughii) Parasharami et al. (2006) usaron partículas de bombardeo para transformar embriones
maduros.

La principal desventaja para la transformación de líneas embrionarias cultivadas de embriones

zigóticos inmaduros es que, en general, muy pocos genotipos pueden regenerarse con éxito a
embriones somáticos y posteriormente transformarse por cualquier método. El uso de embriones
maduros a partir de semillas, que están disponibles todo el año, y la capacidad de regenerar
brotes adventicios de la mayoría de los genotipos puede superar el problema de los genotipos
limitados. Gould et al. (2002) transformaron los ápices de los brotes en pino loblolly con la
selección de kanamicina a un nivel “permeable o permisivo” en el medio de selección, lo que dio
como resultado un cierto quimerismo en los brotes recuperados.

En P. radiata, la mayoría de los genotipos son capaces de producir muchos brotes adventicios a
partir de los cotiledones (Aitken-Christie et al. 1988; Horgan y Aitken 1981; Smith 1986). La
propagación clonal comercial de genotipos deseables por esquejes y brotes está bien establecida
en la industria forestal de Nueva Zelanda. Para P. radiata, la micropropagación a través del cultivo
de tejidos también se establece en la operación comercial. Más del 90% de los genotipos de P.
radiata utilizados en la industria forestal son susceptibles de micropropagación (D. Adam, Rayonier
NZ, comunicación personal). Para cruzar árboles con largos tiempos de generación, la prueba de
los genotipos para determinar su conveniencia requiere mucho tiempo y, idealmente, cualquier
modificación genética introducida sería en genotipos probados.

Aquí describimos un método para la modificación genética de Agrobacterium tumefaciens de

brotes micropropagados de P. radiata en cultivo de tejidos. Las ventajas de este método son la
disponibilidad del tejido diana, que no depende de una ventana estrecha para la recolección como
para el desarrollo de líneas celulares embriogénicas. Las líneas que se utilizaron son de diferentes
genotipos y edades y se pueden probar genotipos de campo. Es rápido y la eficiencia es
comparable con otros métodos reportados de transformación de P. radiata. Este método permitirá
a los criadores seleccionar de genotipos conocidos y de desempeño superior. Los cambios
realizados en genotipos seleccionados pueden ser bastante específicos dependiendo de los genes
elegidos.

materiales y métodos

Material vegetal

Los cultivos de brotes se derivaron de semillas (GF 17, GF 19 y GF 26 polinizadas de polinización

abierta), embriones somáticos (regalo de Rayonier NZ Ltd) y setos de 3 años. Los cultivos de brotes
se mantuvieron en cultivo utilizando el medio descrito en detalle en Grant et al. (2007).
A. tumefaciens y vectores binarios.

La cepa KYRT1 de Agrobacterium tumefaciens (Torisky et al. 1997) que contiene uno de los
vectores binarios descritos a continuación se cultivó durante la noche en caldo de Luria (LB)
complementado con MES 5 (2 (N-morfolino) etanosulfónico), 100 mg / l de estreptomicina. 40 mg
/ ml de acetosingona, 10 mg / ml de tetraciclina. A la mañana siguiente, el cultivo de A.
tumefaciens se centrifugó a 4.000 rpm durante 6 min. El sobrenadante se descartó y el sedimento
se resuspendió en LB fresco suplementado con DMSO al 0,5% (dimetilsulfóxido) a la densidad
requerida, DO 550 nm = 0,35 - 0,40.

Plásmidos

Se utilizaron seis plásmidos diferentes en este estudio con un rango de secuencias promotoras que
dirigen los genes marcadores e indicadores seleccionables. Dos de los plásmidos tienen el gen bar,
ya que esto fue de interés para los socios de la industria en este proyecto.

1. pMP2482 (Quaedvlieg et al. 1998) fue amablemente donado por el Dr. Spaink (Países
Bajos). Este plásmido contiene un gen uidA fusionado con un gen sgfpS65T (Chiu et al.
1996) y ambos están bajo el control de un elemento potenciador de AMV y un doble
promotor 35S de CaMV. La columna vertebral de esta construcción es pBINPLUS (van
Engelen et al. 1995). El gen nptII está bajo el control de un promotor nos y un terminador
nos y está ubicado proximal al borde derecho.
2. 2. pTGUS (Liew 1994), con el amable don del Dr. Oi Wah Liew, contiene el gen uidA bajo el
control de una región potenciadora de TMV y el promotor viral CaMV 35S (CaMV 35S) y un
terminador ocs en la columna vertebral de pGA643 (An et al. 1988). El gen uidA está
localizado proximal a la región del borde izquierdo. El marcador marcador seleccionable
nptII está bajo el control de un promotor nos y un terminador nos.
3. 3. p4CL (Hu et al. 1998) amablemente dotado por el Dr. Chung-Jui Tsai (MIT, EE. UU.)
Contiene el promotor 4-Coumarate: CoA ligase 1 de Populus tremuloides que impulsa el
gen GUS y un gen nptII para la selección de kanamicina con un nicho promotor y nos
terminador.
4. 4. pSLJ1111 (Scofield et al. 1992), dotado por Jonathon Jones, es un vector binario que
contiene el gen uidA bajo el control del promotor TR2. Este promotor se expresa de forma
constitutiva y se aisló del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (Velten et al. 1984).
El gen nptII está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. Este vector transporta un
gen Ac transposase también transcrito por un promotor 35S de CaMV.
5. 5. pLN27 (construido por Janet White y dotado por el Dr. Kevin Davies, Plant & Food
Research, Nueva Zelanda), contiene el gen bar (que codifica la fosfinotricina acetil
transferasa) bajo el control del promotor CaMV 35S y un terminador de 5'7 ' en la columna
vertebral de pGA643 (An et al. 1988). El gen de la barra está localizado proximal a la región
del borde izquierdo. El marcador marcador seleccionable nptII está bajo el control de un
promotor nos y un terminador nos.
6. 6. pLUG, construido por el Dr. Richard Weld, Universidad de Lincoln, Nueva Zelanda,
contiene un promotor CaMV 35S que maneja la barra, un segundo promotor CaMV 35S
que maneja el gen uidA y un promotor de ubiquitina que maneja el gen nptII en pCAMBIA
3301 + pRN2 (4Kb HindIII) frag) T-ADN = 9025 pb.
 Transformar brotes

Los explantes adventicios de brotes para experimentos de transformación procedían de cultivos en

crecimiento activo que se habían subcultivado en medio LP ½ (medio Le Poivre modificado por
Aitken-Christie et al. (1988)) sin reguladores de crecimiento 3-4 semanas antes. El vástago apical
se cortó a aproximadamente 1 cm de la parte superior, las agujas se cortaron y el vástago se cortó
longitudinalmente con un protector que se había sumergido en el cultivo de Agrobacterium para
dar 2 explantes. Luego, cada explante se sumergió en el cultivo de Agrobacterium y se colocó en
medio LP que contenía 5 mg / L de 2,4-D y 20 mg / L de acetosringona. Después de 3 días, los
explantes se transfirieron a medio LP que contenía 5 mg / l de BA y 200 mg / l de timentina.
Después de 7 días, los explantes se transfirieron al mismo medio y luego de 7 días adicionales se
transfirieron al medio de selección - ½ LP con 200 mg / L de Timentina y 10 mg / L de kanamicina o
6 mg / L de geneticina. Las transferencias se realizaron quincenalmente al medio de selección
durante un mínimo de 12 semanas. Los brotes se hicieron crecer como se describe en Grant et al.
(2007).

Los explantes fueron sumergidos en el cultivo de Agrobacterium, posteriormente se transfirieron a

un medio de selección, las transferencias se realizaron quincenalmente al medio de selección
durante un mínimo de 12 semanas

Transferencia al suelo

El trasplante de brotes a invernadero se realizó como en Grant et al. (2007).

Contaminación por Agrobacterium.

Para determinar si los resultados positivos de la PCR se debieron a una infección residual por
Agrobacterium en las plántulas, se cultivaron agujas y tallos en el caldo de Luria en las mismas
condiciones que en Grant et al. (2004).

Análisis Moleculares

Extracción de ADN

Para pequeñas cantidades de ADN genómico, se molieron 100 mg (peso fresco) de tejido de P.
radiata en nitrógeno líquido utilizando una mano de plástico desechable en tubos Eppendorf y el
método de extracción del kit DNeasy Plant Mini (Qiagen), siguiendo las instrucciones del
fabricante.

Para cantidades mayores de ADN genómico, se trituraron 0,8-1,2 g (peso fresco) de tejido de P.
radiata en nitrógeno líquido utilizando una mano y un mortero. Se utilizaron dos métodos de
extracción:

1. El kit DNeasy Plant Maxi (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante,

2. Un método CTAB modificado (Doyle y Doyle 1990; Grant et al. 2004).

Hibridación del sur

La hibridación Southern se llevó a cabo según lo descrito por Grant et al. (2004) y Dale (2004). El
ADN genómico se digirió con EcoR1 para pLN27 y pLUG, HindIII para pSLJ1111, pPMP 2482 y p4CL,
que se cortaron una vez en el T-ADN. Además, las líneas genómicas transformadas con pPMP2482
se cortaron con EcoR1 que corta dos veces dentro del T-DNA y Pst1 que corta tres veces.

Hibridacion de Southern

La hibridación Southern se llevó a cabo según lo descrito por Grant et al. (2004) y Dale (2004). El
ADN genómico se digirió con EcoR1 para pLN27 y pLUG, HindIII para pSLJ1111, pPMP 2482 y p4CL,
que se cortaron una vez en el T-ADN. Además, las líneas genómicas transformadas con pPMP2482
se cortaron con EcoR1 que corta dos veces dentro del T-DNA y Pst1 que corta tres veces.

Del Sur

Análisis de PCR

Cada PCR se realizó varias veces para asegurar la reproducibilidad. Los PCR para confirmar la
presencia del transgén incluyeron el gen marcador seleccionable - nptII, y el (los) gen (es) de
interés - uidA, gfp y bar. Para una confirmación adicional de la PCR que abarca, donde se utilizaron
cebadores en varias combinaciones para amplificar los productos de la PCR que abarcan el
promotor, el terminador, el marcador seleccionable y el gen o los genes de interés. Para garantizar
que el resultado no se debiera a la contaminación por Agrobacterium, se llevó a cabo la PCR del
gen de virulencia VirG en todos los transformantes putativos del brote.

El análisis de PCR se llevó a cabo en varias extracciones de ADN diferentes de brotes

transformados de manera putativa para verificar que las plantas de un brote original no fueran
quiméricas. Para los estudios de expresión, el ADN de al menos 5 brotes se extrajo por separado y
los 5 se analizaron por PCR para el gen marcador seleccionable, el gen o genes de interés y los
genes de virulencia de Agrobacterium.

Primers utilizados

Los siguientes cebadores se utilizaron en las ilustraciones de este documento.

La expresión génica

Brotes crecientes en Buster® / Basta®

Para probar la expresión del gen bar, los brotes putativos transgénicos se cultivaron en medio ½ LP
que contenía 5 mg / L de fosfinotricina (PPT) si eran brotes jóvenes, o 8 mg / L de PPT para brotes
más viejos y para una selección más rigurosa. Los niveles de PPT adecuados para la selección de
brotes transgénicos se determinaron previamente por T Dale (datos no publicados).

GFP

Para los estudios de expresión, la detección de GFP en agujas se realizó mediante microscopía de
fluorescencia con un aumento de 400x. Jóvenes, agujas de crecimiento activo de la punta de los
brotes de P. radiata, se montaron en agua y se observaron para detectar fluorescencia.

La fluorescencia de GFP se cuantificó para 7 líneas transformadas independientemente y 3

controles no transformados mediante análisis de imagen. Se retiraron tres agujas de la punta de
disparo de cada disparo de las 7 líneas transformadas y 3 líneas de control. Se usó microscopía de
epi-fluorescencia a 10 aumentos y se utilizaron procedimientos idénticos para capturar los canales
Rojo-Azul-Verde, y se obtuvieron tres imágenes por aguja. Dentro de cada imagen, se midieron 5
áreas estandarizadas para el brillo de píxeles individuales de la señal del canal verde. El brillo
medio de píxeles para cada área se usó para análisis de datos adicionales mediante ANOVA. La
recopilación de datos se realizó en diferentes días con diferentes agujas para asegurar la
reproducibilidad (para más detalles, ver Dale 2004).

Resultados

Todas las construcciones contenían nptII, por lo que los explantes se podían seleccionar con
kanamicina o geneticina que habían demostrado ser exitosas para seleccionar brotes de P. radiata
transgénicos de explantes de embriones maduros (Grant et al. 2004). Tanto la kanamicina como la
geneticina tuvieron éxito en la selección de brotes transformados con PCR positiva (Tabla 2)
independientemente de la secuencia promotora utilizada para conducir el gen nptII. La posición
del gen nptII en el plásmido no fue considerada. La Tabla 2 también muestra que este método fue
exitoso con el rango de diferentes plásmidos utilizados y fue independiente del genotipo del
explante.

Tabla 2

El agente de selección, número de explantes, genotipos y la gama de plásmidos utilizados. Todos

los experimentos produjeron brotes positivos para PCR.

* PCR positiva para al menos 2 genes en el T-ADN y PCR negativa para la contaminación por
Agrobacterium.

** Eficiencia: los disparos del mismo explante pueden o no ser idénticos. Para el propósito de esta
estimación de eficiencia, solo se cuenta un disparo de cada explante.

*** Clones embriogénicos dotados por Rayonier NZ

La Fig. 1 muestra un resumen de los pasos para obtener brotes transgénicos del co-cultivo de
explantes de punta de brote de pino con la cepa KYRT1 de Agrobacterium tumefaciens. La Fig. 1a
muestra los brotes en crecimiento activo listos para procesar para la transformación. Después de
la cocultivación durante 3 días, se observó que las manchas de expresión de GUS estaban
generalmente bien distribuidas a lo largo de la superficie de corte de los explantes de brotes (Fig.
1b). El tejido no transformado moriría y los brotes verdes se desarrollaron y crecieron hasta que
quedaron bien establecidos en el medio de selección (Fig. 1c y d). Este patrón fue consistente para
kanamicina y geneticina como agente de selección. La figura 1e muestra plantas transgénicas en el
invernadero. La Figura 1f muestra una aguja de control sin fluorescencia de GFP, solo la
autofluorescencia roja atribuida a la corofila. La Fig. 1g muestra la fluorescencia de GFP en una
aguja joven en crecimiento activo de una plántula transgénica a un aumento de 400X. Esta
muestra muestra células mesófilas verdes que indican una fuerte expresión de GFP junto con la
autofluorescencia roja de la corofila. En agujas de algunas plántulas transgénicas donde el gen GFP
estaba presente y las líneas eran expresores bajos, la expresión de GFP tendió a enmascararse por
la fuerte auto-fluorescencia roja de la clorofila, aunque aplastar las agujas liberó las células
mesófilas fluorescentes.
Fig. 1 Un resumen de la producción de una línea de P. radiata transgénica después de la infección
por Agrobacterium de explantes de brotes. un P.radiata Micro-propagado dispara listo para la
transformación. b Expresión transitoria del marcador visual GUS (β-glucuronidasa) en un explante
de brote de P.radiata, tres días después del cocultivo con Agrobacterium que contiene el
constructo plasmídico pLUG. c Explantes de brotes cocultivados que se regeneran en un medio
selectivo que contiene 10 mg / L de kanamicina.
Hola Columba hasta lo amarillo traduje o traduci..como se dice??