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STRUTTURA E FUNZIONE DELLA CELLULA

LEZIONE 3
8/11/2017

La MEMBRANA CELLULARE è essenziale, non esiste cellula senza membrana.


È una barriera idrofobica formata da lipidi: racchiude una matrice ibrida (che contiene molti tipi di macromolecole) e
ha la funzione di mantenere nelle condizioni ottimali di struttura e di funzione le proteine di membrana.

La maggioranza dei lipidi che troviamo all’interno delle membrane sono ESTERI DI UN TRIALCOOL (fosfati); trialcool
che prende il nome di GLICEROLO.
Gli esteri sono dei composti nei quali un C è legato con un doppio legame ad un O, con un legame semplice ad un
residuo e con un altro legame semplice ad un –OR; gli esteri sono idrolizzabili.
I lipidi che costituiscono le membrane nel mondo biologico sono dei DIESTERI DEL GLICEROLO: derivano
dall’esterificazione dei due gruppi alcolici del glicerolo con due acidi grassi e dall’esterificazione del terzo gruppo
alcolico con un gruppo fosfato che è legato a sua volta a molecole differenti (come la colina, l’etanolammina, la
serina…).
I diesteri del glicerolo non sono da confondere con i triesteri del glicerolo, ossia i trigliceridi, che sono lipidi di riserva
(composto che non si trova nelle membrane ma ha funzione importante dal punto di vista di riserva degli acidi grassi).

I diesteri del glicerolo sono FOSFOLIPIDI che hanno una parte, la coda, apolare e quindi fortemente idrofobica, e
l’altra, la testa, polare e quindi idrofilica con cariche elettriche di segno +.
Le membrane cellulari sono costituite da un doppio strato di fosoflipidi in cui le teste idrofiliche sono rivolte verso
l’interno della cellula (liquido citoplasmatico) e verso l’esterno, e le code idrofobiche contrapposte e unite insieme da
legami deboli.
La membrana cellulare appare al microscopio elettronico come due strisce scure che delimitano uno spazio chiaro
all’interno. Le due zone scure sono elettrodense mentre la zona interna idrofobica appare chiara perché non vi si lega
nessun marcatore, non è elettrodensa.
Nella parte interna della membrana abbiamo una regione che è profondamente idrofobica nella quale l’acqua non
riesce ad entrare.
La regione interna è una regione che non comunica con l’esterno, l’ambiente interno essendo idrofobico si presta
male ad accogliere tutti i meccanismi molecolari della cellula che normalmente sono costituiti da molecole idrofile.
Nell’ambiente idrofobico si possono accumulare molecole idrofobiche; questo ambiente è elettricamente neutro e
possono entrare quantità variabili di acidi grassi insaturi che hanno un doppio legame e hanno la possibilità di formare
legami ulteriori.

la coda dei fosfolipidi determina le caratteristiche della membrana, è costituita da acidi grassi che possono essere
variabili; possono essere:
 ACIDI GRASSI SATURI che si comportano come bastoncelli
 ACIDI GRASSI INSATURI che hanno curvature

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Sono molecole reattiva che possono reagire con l’Ossigeno (l’O è neutro ed è in grado di permeare le
membrane liberamente in qualunque punto, non solo dove ci sono le proteine di membrana. Pur essendo
neutro è estremamente reattivo perché è sempre inserito in composti perché è un diradicale, ha cioè due
elettroni spaiati. Solo nell’atmosfera si trova allo stato naturale e non inserito all’interno di composti.)
Se si innesca una reazione tra acido grasso insaturo e O, si formano delle specie radicaliche che innescano poi
reazioni a catena che si propagano e si va incontro a STRESS OSSIDATIVO.
Lo stress ossidativo frammenta i lipidi perciò le membrane sono facilmente danneggiabili. La membrana in
caso di stress ossidativo diventa meno spessa.
La conseguenza più grave però dello stress ossidativo è il taglio delle proteine di membrana che sono un
elemento funzionale della membrana cellulare.

Nel caso in cui gli acidi grassi sono insaturi la membrana costruita è molto meno densa rispetto a quella costituita da
acidi grassi saturi perché i lipidi ricurvi occupano più spazio.

Nel caso degli acidi grassi insaturi il doppio legame 𝜋 va a generare la possibilità di avere un’isomeria in base a dove si
trovano le due porzioni più ingombranti della molecola.
L’isomeria è dovuta al fatto che la molecola non può più ruotare intorno al doppio legame 𝜋 formato tra i due carbonii
sono ibridati sp2 .

l’isomeria TRANS (le due parti più ingombranti sono opposte l’una all’altra) va a definire una molecola di acido grasso
insaturo che è in realtà quasi lineare e perciò molto simile alla struttura degli acidi grassi saturi. Gli acidi grassi insaturi
TRANS non sono presenti nelle membrane: costituiscono infatti un pericolo perché essendo molto reattivi e
perossidabili potrebbero dare inizio a delle reazioni radicaliche.
Non sono quindi biologici e nemmeno biodegradabili (se ingeriti l’organismo non è in grado di scinderli), si
accumulano e aumentano lo stress ossidativo.
Per questo motivo i grassi insaturi non vengono utilizzati e ne è vietata la vendita da parte dell’industria alimentare.
A livello industriale si tende a saturizzarli per poterli vendere; quando avviene l’idrogenazione di certi grassi
fortemente insaturi (olii) la reattività porta come risultato l’irrancidirsi degli olii.

Il mondo vivente utilizza soltanto l’isomeria CIS degli acidi grassi (biodegradabile, il corpo è in grado di scinderli, tipo
Omega3).

la struttura della membrana non è fissa nel tempo ma in maniera continua viene modificata in relazione alla
REGOLAZIONE DELLA FLUIDITÀ.
LA MEMBRANA È ASIMMETRICA, la distribuzione dei lipidi non è omogenea, la composizione dei due strati lipidici
(foglietto interno e foglietto esterno) è diversa ed è una diversità intenzionale che deve però essere continuamente
regolata e bilanciata.
I lipidi si possono muovere a livello orizzontale e si possono spostare nella membrana perciò costituiscono il MODELLO
FLUIDO.
Sulle nostre cellule i lipidi, oltre a spostarsi lateralmente, ruotano con un meccanismo noto come FLIP-FLOP, grazie al
quale la membrana si autobilancia.

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La sintesi di lipidi avviene a livello del RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO ma gli enzimi che sintetizzano i lipidi si
trovano nel citosol.
I lipidi vengono quindi sintetizzati ed aggiunti solo nel lato che è a contatto con il citosol e per questo motivo la
membrana si deve bilanciare.
Il meccanismo di FLIP-FLOP con il quale la membrana si autobilancia non è solo spontaneo ma è anche guidato dagli
enzimi FLIPPASI, che materialmente spostano i lipidi da un foglietto all’altro.
Le flippasi sono enzimi di membrana il cui compito è generare asimmetria di membrana con lo scopo di
SEGNALAZIONE (ad esempio la fosfatinilserina si trova solo nei foglietti interni normalmente, se per caso le flippasi la
spostano all’esterno la sua presenza richiama i macrofagi/fagociti che inglobano i corpi apoptotici della cellula
portandola al suicidio/apoptosi; quindi la fosfatinilserina se viene spostata dalle flippasi sta a segnalare la volontà
della cellula di morire).

Nel doppio strato fosfolipidico è presente il colesterolo.


Il colesterolo è un lipide molto importante perché è un costituente delle membrane e gioca un ruolo fondamentale: si
comporta come un bastoncello rigido perché i tre anelli condensati rendono la molecola impossibilitata a piegarsi.

L’ingresso del colesterolo all’interno della membrana (l’unica parte che resta fuori e sporge è il gruppo –OH) tende a
rendere la membrana RIGIDA.
Molto colesterolo all’interno di una membrana biologica renderà la membrana meno mobile (il colesterolo è fisso,
non si piega).

La membrana cellulare è SEMIPERMEABILE: il sistema vita è infatti un sistema aperto che ha bisogno di scambiare
materia ed energia con l’esterno.
La semipermeabilità deriva dalla presenza di proteine.
Nel doppio strato lipidico c’è una quantità considerevole di PROTEINE;
non si tratta di una membrana lipidica in cui c’è qualche proteina bensì LA MEMBRANA È UNA STRUTTURA
IPOPROTEICA con un rapporto di circa 50% in peso di proteine (possono arrivare anche a quote maggiori, per esempio
le membrane batteriche sono formate da più del 70% da proteine. Così come la membrana mitocondriale interna,che
è di derivazione batterica, ha una componente lipidica minoritaria rispetto alla componente proteica).

Struttura e funzione delle proteine di membrana cellulari dipende dalla qualità dei lipidi che costituiscono il doppio
strato fosfolipidico.
Possiamo avere:

1. PROTEINE DI MEMBRANA PERIFERICA, PROTEINE ESTRINSECHE fortemente idrofiliche, non prevedono


contatto con la parte interna idrofobica, (e): la catena polipeptidica è “appoggiata” sulla superficie polare

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della membrana e vi viene trattenuta da interazioni non covalenti (non è un vero e proprio componente della
membrana)
2. PROTEINE ANCORATE ALLA MEMBRANA (f): proteine legate alla membrana mediante un’ancora costituita da
un acido grasso o da un composto isoprenoide tipo gruppo prenile (sono proteine che solitamente si trovano
sulla faccia interna della membrana plasmatica).
(g): proteine legate alla membrana da un’ancora lipidica costituita, ad esempio, da glisoli-fosfatidil-
inositolo(GPI) (sono proteine che si trovano esposte sulla superficie esterna della membrana plasmatica).
3. PROTEINE CON PORZIONI ALL’INTERNO DELLA MEMBRANA.
Le porzioni interne alla membrana possono essere
▪ Tratti alfa-elica lunghi una decina o poco più di amminoacidi. Costituiscono dei canali che
potenzialmente potrebbero far entrare delle molecole di acqua. Questi tratti sono idrofobici all’esterno
ed idrofilici all’interno;
▪ Tratti foglietto-beta (struttura secondaria tenuta insieme da legami ad H/leg peptidici) che conferiscono
rigidità alla proteina, costituiscono pori e mediano cambi. Un esempio sono le porine.
4. PROTEINE DI MEMBRANA INTEGRALI, hanno tre domini-regioni: una parte interna alla membrana, una che
sporge fuori e una che sporge dentro.
Queste proteine hanno ruoli importanti: sono TRASDUTTORI di membrana che servono alla cellula come
sensori delle variazioni dell’ambiente esterno.
Un battere grazie al flagello quando si avvicina a zone in cui la temperatura sta aumentando cambia
direzione, nel caso delle membrane l’aumentare della temperatura è segnalato da queste proteine: la parte
rivolta verso l’esterno cambia geometria e trasduce un segnale.
I recettori attuali sono l’evoluzione di proteine di membrana e che sono i connettori ideali di ciò che dentro e
ciò che è fuori.
Possono essere:
a) PROTEINE INTEGRALI MONOPROTICHE: è immersa nel doppio strato fosfolipidico ed è esposta su
una sola delle due facce della membrana;
b) PROTEINE INTEGRALI MONOPASSO: la catena polipeptidica attraversa una sola volta la membrana
ed espone due domini polari sulle due facce della membrana; la porzione della catena che attraversa
la membrana è di solito costituita da un alfa-elica;
c) PROTEINE INTEGRALI MULTIPASSO: la catena polipeptidica attraversa la membrana più volte, le
porzioni nello spessore della membrana possono essere alfa-elica o foglietto-beta e sono separate
da anse polari esposte alla superficie della membrana;
d) PROTEINE INTEGRALI MULTINUMERICHE: diverse catene polipeptidiche transmembrana possono
associarsi in corrispondenza delle loro porzioni apolari situate nello spessore della membrana

Le proteine di membrana possono essere spesso GLICOSILATE.


La glicosilazione consiste nel legame di alcune catene di zuccheri alle proteine di membrana, avviene solo dalla parte
della membrana rivolta verso l’esterno.
Lo scopo della glicoasilazione è:
➢ quello di immobilizzare l’acqua grazie alle glicoproteine. Un polisaccaride tende a creare uno strato di gel,
chiamato glicocalice, grazie al quale la cellula mantiene dell’acqua immobilizzata all’esterno. Grazie alla
glicosilazione anche una cellula che si trova nel tessuto osseo è sempre idratata.
➢ quello di conferire un potere antigenico, la presenza di glicoproteine diventa un elemento importante nel
riconoscimento del self, cioè del proprio da quello che non lo è. Non è l’antigene costituito dalla parte
proteica-poliamminoacidica ma sono le catene glicidiche l’elemento che va a determinare la caratteristica
antigenica (nei gruppi sanguigni la differenza sta nello zucchero terminale in catene uguali).

Il fatto che le glicoproteine si trovino solo da una parte (quella esterna della membrana) ci potrebbe far pensare che la
glicosilazione sia il risultato di un processo dovuto ad enzimi che stanno fuori dalla cellula (gli ectoenzimi) ,ma in realtà
dipende dal percorso di glicosilazione che inizia all’interno del reticolo endoplasmatico, procede nel Golgi e quando la
vescicola gemmata dal Golgi si fonde con la membrana quello che è dentro apparirà fuori.

La presenza della membrana è indispensabile: isola una parte di contenuto all’interno, regola i meccanismi di scambio
tra esterno-interno e interno-esterno.

Trasporto attraverso la membrana:


1. TRASPORTO PASSIVO  NON RICHIEDE ENERGIA
È il movimento di sostanze secondo il gradiente di concentrazione ( da più concentrato a meno concentrato)

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Possiamo avere DIFFUSIONE SEMPLICE tipo quella dell’ossigeno o dell’anidride carbonica (prodotta e liberata
dalle nostre cellule in qualsiasi punto della membrana, anche a livello dello strato lipidico), tipica di piccole
molecole neutre. Lo ione sodio non può passare perché sebbene piccolo ha una carica positiva e la parte
interna della membrana è una barriera idrofobica, nella quale possono entrare e posizionarsi soltanto
molecole idrofobiche. Questa diffusione funziona secondo un gradiente di concentrazione: va secondo la
statistica da dove ce n’è molto a dove ce n’è poco.

Oppure DIFFUSIONE FACILITATA (a differenza della semplice non avviene attraverso lipidi ma attraverso
proteine) che è il trasporto di ioni e molecole secondo il gradiente di concentrazione mediato da proteine di
membrana. Possiamo avere :

–UNIPORTO (trasporto di una molecola)


–SIMPORTO (trasporto di due molecole contemporaneamente: CO-TRASPORTO nella stessa
direzione o ANTIPORTO in direzioni opposte)

2. TRASPORTO ATTIVO  RICHIEDE ENERGIA


Utilizzato dalla cellula quando porta ad un vantaggio (dal punto di vista della termodinamica è un processo
sfavorito), permette il trasporto di sostanze contro gradiente di concentrazione, la fonte di energia è l’ATP.
L’idrolisi di ATP permette alle proteine di membrana, che fungono da trasportatori, di cambiare la loro
geometria.
Se è coinvolto un trasportatore che il fenomeno inizialmente aumenta la concentrazione poi va a saturazione
perché quando tutti i canali sono occupati raggiunge la velocità limite. Se si vuole aumentare la velocità
bisogna aumentare il numero di canali (la cellula può farlo se stimolata e se ha bisogno di
concentrazioni/quantità maggiori o minori).

Esempio: Se si mangia un panino l’amido sarà scisso in glucosio che dovrà essere catturato dalle cellule dell’intestino;
l’ingresso di glucosio nelle cellule dell’epitelio intestinale va con un meccanismo che richiede energia, un trasporto
attivo. La cellula spreca energia perché tende ad accumularne più che può.
Dentro la cellula dell’epitelio intestinale, nella parte basale rivolta verso il lume c’è un ingresso attivo (la cellula
concentra glucosio) ma la membrana dall’altro lato è permeabile al glucosio che quindi fuoriesce ed entra nel torrente
ematico.
Il sangue refluo dall’intestino passa a livello del fegato, il glucosio con un meccanismo di diffusione passiva attraverso
dei canali entra nelle cellule epatiche. Il glucosio nel momento in un cui entra viene trasformato in glicogeno.

Senza membrana le cellule non potrebbero esistere (la sopravvivenza è improbabile però se manca una membrana
per colpa dell’aspetto osmotico prima di tutto, oppure a causa dell’inesorabile entropia), la membrana delle cellule
eucariotiche e dei batteri normalmente è costituita da esteri del glicerolo (fosfati).
Un caso particolare è costituito dai procarioti, che una volta erano definiti erroneamente archeobatteri: la membrana
dei cosiddetti archea è un doppio strato, contenente acidi grassi, di ETERI di glicerolo.
Il legame etereo è quello in cui c’è un ossigeno a ponte. Mentre l’estere si può idrolizzare mentre l’etere no, per
questo motivo queste membrane sono praticamente indistruttibili.
Gli archea vivono in ambienti particolarmente inospitali grazie a queste membrane particolarmente resistenti.
Le nostre membrane sono di tipo batterico perché noi le abbiamo ereditate dai batteri, viviamo in condizioni nelle
quali non è necessario avere degli eteri.
La membrana ha consentito l’evoluzione dal brodo primordiale, senza la membrana l’evoluzione sarebbe stata
impossibile perché le molecole che sono in grado di esercitare funzioni positive e vantaggiose ma sono senza confine
agiscono in un sistema senza limiti disperdendosi.
Una molecola racchiusa in una membrana andrà a modificare soltanto le molecole contenute all’interno della goccia.

La cellula ha come scopo biologico quello di proliferare, la cellula è un sistema replicante che riesce a duplicarsi grazie
al fatto che possiede un’informazione ed un metabolismo.
Il problema dell’essere vivente è il problema dell’energia, deve contrastare l’aumento di entropia e quindi ha bisogno
di rompere i legami chimici di molecole di cibo per estrarne energia (la cellula è un sistema di trasformazione
dell’energia).
Ci sono organismi viventi miliardari nella crosta terrestre a km di profondità che sono delle forme di vita
strutturalmente semplici.

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Le forme di vita molto complesse che si trovano sulla superficie del pianeta si sono formate perché ci sono state una
serie di condizioni molto particolari che non è detto che si siano verificate da altre parti.
Non esiste vita sulla superficie di pianeti diversi dal nostro, non possiamo però escludere che non ci siano forme di vita
all’interno dei pianeti ma in questo dovrebbero essere forme di vita molto semplici in quanto il costruire glucosio
utilizzando qualcosa che non sia l’ossigeno da luogo ad una resa estremamente bassa.

I viventi che riescono a costruire glucosio (cibo per eccellenza, sicuramente deriviamo da una cellula che utilizzava
glucosio- alimento fondamentale) e tutta la via della glicolisi e respirazione (asse fondamentale del catabolismo) sono
organismi complessi e lenti. L’alternanza delle generazioni è molto lenta.

Ci sono due modi di essere cellula:


-modalità del procariote: struttura con membrana cellulare, ha parete cellulare che impedisce il rigonfiamento
osmotico (l’ambiente esterno tende a variare), acido nucleico libero all’interno della cellula (DNA o RNA o ribosomi),
non ci sono strutture interne
Nel caso del battere l’acido nucleico non è organizzato in cromatina mentre nel caso dell’archea c’è presenza di
cromatina; la cromatina non è quindi modalità di organizzazione di un grande genoma ma è una modalità di
organizzazione che da luogo a delle funzioni diverse.
Il modello del procariote è estremamente evoluto e falsamente semplice. Le scoperte più importanti le hanno fatte i
procarioti.
-modello eucariote: cellula molto più grande, impatto osmotico si risolve meglio perché la superficie di contatto con
l’esterno è piccola rispetto alle dimensioni della cellula, gli organelli sub-cellulari hanno dal punto di vista osmotico
l’effetto di frammentare l’effetto osmotico complessivo.

Il modello eucariote è un modello antico ma incomparabilmente nuovo rispetto al modello del procariote.
Lo svantaggio dell’eucariote è quello di essere grande e di avere una velocità di crescita inevitabilmente lenta.
L’eucariote si nutre di procarioti, ma nutrirsi di procarioti significa fare un’operazione dispendiosa perché l’evoluzione
biologica del procariote, che si basa sul numero di generazioni, è molto maggiore di quella dell’eucariote.
Il procariote cambia in fretta e prima o poi quel procariote di cui l’eucariote si nutre lo ucciderà perché avrà qualche
mutazione che lo eliminerà.
Essere dei predatori di procarioti significa predare qualcosa che biologicamente si evolve molto velocemente;
l’eucariote unicellulare non sarebbe riuscito mai a generare un essere dominante sul pianeta terra dal punto di vista
dimensionale ma avrebbe avuto sempre il problema del procariote più evoluto.
La pluricellularità, resa possibile dalla respirazione e dalla presenza di ossigeno, ha dato luogo ad un vantaggio enorme
agli eucarioti: con la pluricellularità si sono creati una dimensione fisica diversa e hanno abbandonato il mondo dei
batteri (acqua).
La pluricellularità ha dato all’eucariote la possibilità di andare in un'altra dimensione e di eliminare la competizione
diretta con i procarioti.
Sulla terra non ci sono moltissimi batteri, anche se i procarioti sono una parte consistente della biomassa.
La nostra impressione è che il pianeta terra sia popolato da grandi esseri e che se mettessimo sul piatto di una bilancia
gli organismi eucarioti pluricellulari (come balena, esseri umani etc) e sull’altro i procarioti, il piatto della bilancia
caschi a favore degli eucarioti più pesanti.
In realtà sembra che i procarioti siano una quantità di biomassa maggiore rispetto agli eucarioti, sono infatti ovunque
e si possono evolvere molto più rapidamente di noi.
Il nostro rapporto con i procarioti è molto limitato perché una parte dei procarioti ci ignora completamente, i patogeni
che si interessano a noi sono un numero davvero limitato.

Dopo la pluricellularità gli organismi vanno incontro a differenziamento.


Quando avviene il differenziamento delle cellule eucariotiche?
Il differenziamento è dato da un aumento della complessità, una struttura formata da cellule differenziate è una
struttura in cui ci sono cellule con ruolo specializzato.
Per fare un esempio un organismo con le cellule differenziate è come una tribù nella quale, grazie allo sviluppo di
agricoltura e allevamento, il problema del cibo non è più il problema principale e gli individui sono organizzati e
svolgono ciascuno un ruolo diverso.
La stessa cosa a livello cellulare: nel momento in cui è stata disponibile una grande resa energetica dal glucosio, quindi
la cellula si è trovata con una grande quantità di energia, questa è stata un impulso al differenziamento e alla
creazione, organizzazione e sopravvivenza di modelli cellulari più grandi.

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La superficie del pianeta terra inizialmente era un ambiente inospitale perché la radiazione ultravioletta era molto più
intensa, così come i raggi cosmici, e non c’era il cibo.
La vita si è avvicinata alla Terra grazie alla fotosintesi:
❖ Il primo tipo di fotosintesi è stata la fotosintesi ad un fotosistema che utilizzava un composto del quale c’era
grande disponibilità: H2S (acido solfidrico), ossia un gas che a pressione elevata è costretto allo stato liquido
nei fondali marini. In zone irraggiungibili dalla luce si è sviluppato un processo di fotosintesi, cioè costruzione
di glucosio utilizzando onde elettromagnetiche. Questo tipo di fotosintesi andava bene, aveva una resa bassa
e dipendeva dalla presenza di H2S.
I livelli di H2S si sono poi modificati e nel corso del tempo sono quasi scomparsi. Da qualche parte ancora ci
sono e hanno generato delle vittime perché delle bolle sono salite in superficie e hanno avuto un effetto
tossico sulle persone che sono morte.

❖ Il foto-sistema ha consentito d sopravvivere ma c’è stato un salto di qualità sulla superficie del pianeta con lo
sviluppo del processo di fotosintesi in cui il glucosio si fabbricava non scindendo H 2S ma scindendo il suo
omologo H2O, molto più rappresentato sul pianeta terra. Il processo di fotosintesi si basa sull’utilizzo di CO 2
con due foto-sistemi viene scissa l’acqua e si ottiene glucosio e gas (ossigeno).

La fotosintesi con H2S andava a formare zolfo, questo tipo di fotosintesi va ad accumulare ossigeno.

Il processo con due foto-sistemi ha una resa molto maggiore e migliore, non si hanno problemi per
l’approvvigionamento per l’acqua, elemento dominante, molto più rappresentato di H 2S.
La scoperta del processo di fotosintesi con due foto-sistemi comporta la formazione di glucosio e svincola l’essere
vivente dal problema energetico, fabbrica facilmente glucosio utilizzando come sorgente di energia l’energia radiante
del sole.
Da questo punto di vista l’intuizione degli antichi secondo cui il sole è sorgente di vita è vera, con il processo di
fotosintesi si producono grandi quantità di glucosio.
Tutto questo è databile in maniera ragionevolmente certa intorno ai due miliardi di anni fa.
Le motivazioni di questa datazione risiedono in evidenze fossili di rocce grandi dimensionalmente (4-5 m) (anche
adesso che siamo due miliardi di anni dopo), questi fossili sono di procarioti.
Sul pianeta terra sono ritrovabili anche oggi delle grandi strutture (rocce) che in realtà sono fossili di procarioti.
Se si pensa alle dimensioni di un procariote confrontandole con le dimensioni delle grandi rocce trovate alte metri si
ha un’ idea del numero impressionante di procarioti che son presenti nelle rocce.
Queste rocce sono gli stromatoliti ossia rocce fromate da procarioti fossili.
Ci sono stromatoliti anche molto più recenti e sono strutture piccolissime, quasi invisibili.
Gli stromatoliti grandi si sono formati tutti nello stesso momento, o meglio in alcune centinaia di milioni di anni circa
due miliardi di anni fa.
Questo rappresenta e ci da un’indicazione sul fatto che circa due miliardi di anni fa ci deve essere stata sulla superficie
del pianeta un’esplosione di vita.
Un’esplosione di procarioti tale da lasciare imponenti tracce fossili.
Tutto questo non si è più ripetuto infatti stromatoliti di quelle dimensioni non si sono più ritrovati.
In quel periodo ristretto (centinaia di milioni di anni nel quale si sono formati i grossi stromatoliti) c’è stato qualcosa
che ha fatto esplodere la vita: si pensa sia stata la fotosintesi.
Gli oceani erano verdeggianti di batteri di forme fotosintetiche.
Il processo si è fermato e non è proseguito perché questi stromatoliti si sono formati in un lasso importante di tempo
ma geologicamente ridotto; il problema sembra legato all’ossigeno.
L’ossigeno è un diradicale tossico e reattivo.
I carotaggi sul fondale degli oceani dimostrano la presenza di strati di ossidi di ferro e metalli di transizione, questi
grandi strati di ossidi di ferro e metalli di transizione sono come una sorta di fascia la cui datazione è simile a quella
degli stromatoliti ( intorno ai due miliardi di anni fa).
Questi grandi starti di ossidi metallici non si sono più formati.
L’ipotesi è che inizialmente la composizione degli oceani fosse diversa da quella attuale e che ci fossero anche altri ioni
metallici dispersi, ma soprattutto che il processo di fotosintesi ha consentito quell’esplosione di vita perché il gas

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tossico che si formava (l’ossigeno) non si accumulava ma reagiva con gli ioni metallici formando degli ossidi che
diventavano idrossidi in ambiente acquoso e che si sedimentavano sul fondo.
Il fenomeno vita ha avuto centinaia di milioni di anni in cui si è potuto affermare, con la fotosintesi si produceva il
glucosio a basso costo, la radiazione del sole era una radiazione che rispetto ai tempi di vita della cellula era infinita e
per questo la vita ha cominciato a proliferare.
La vita ha proliferato al punto da lasciare le tracce fossili costituite dagli stromatoliti ma l’ossigeno inizialmente non
costituiva problemi.
A poco a poco è successo che gli ioni di metalli di transizione non potevano andare a precipitare cominciano a
diventare rari e l’ossigeno si accumulava.
Accumulare ossigeno significa accumulare gas tossico, un organismo anaerobio esposto all’aria muore ucciso
dall’ossigeno.

Noi riusciamo a sopravvivere in ambiente aerobico perché abbiamo un potente sistema anti-ossidante.
Il perno del sistema anti-ossidante è una piccola molecola formata da tre amminoacidi (il glutatione, molecola
antichissima con proprietà chimiche completamente diverse da quelle dei tre amminoacidi liberi, è una sorta di
molecola ottimale, a basso costo).
Se non c’è glutatione si muore; se si blocca/distrugge il glutatione a livello cellulare la cellula si manterrà viva se
tenuta in atmosfera di azoto, ma se esposta all’ossigeno morirà uccisa dai radicali liberi.
L’accumulo graduale di ossigeno ha comportato un circolo vizioso, si aveva bisogno di fotosintesi per riuscire a vivere
e produrre il glucosio ma più glucosio è stato prodotto e più si è cresciuti come cellula e più si accumulava ossigeno
che più uccideva.
A causa di questo circolo vizioso la vita dopo l’esplosione ha cominciato a tornare indietro: l’ossigeno si accumulava e
le cellule morivano.
Sono riuscite a sopravvivere delle cellule che hanno sviluppato degli antiossidanti, tutti gli organismi viventi hanno
quindi glutatione.
Il glutatione è il perno del meccanismo antiossidante che ha consentito di vivere in presenza di tossine.
Con la respirazione c’è stata un’esplosione di vita perché si è instaurato una sorta di sistema chiuso.
Il sistema chiuso funziona in maniera ottimale perché basta che ci sia luce.
Nel momento in cui il sole si dovesse spegnere, oppure se dovessero morire tutti gli organismi fotosintetici (specie
vegetali), il fenomeno vita scomparirebbe

Di picchi di ossigeno ce ne sono stati diversi: un grosso picco di ossigeno si è accumulato introno ai due miliardi di anni
fa, c’è stato poi un secondo picco di ossigeno iniziato circa un miliardo di anni fa ed è durato fino al cambriano.
I livelli elevati di ossigeno sono testimoniati da stati di ossidazione dei minerali di quel periodo.
Il cambriano era un momento in cui c’era una grande disponibilità di ossigeno nell’atmosfera, c’era una grande
ricchezza di energia.

Gli organismi pluricellulari sono comparsi in corrispondenza del secondo aumento di ossigeno nell’atmosfera e i primi
ominidi ( i nostri antenati lontani) molto più recentemente.
Nel frattempo ci sono miliardi di anni tra organismi pluricellulari e le prime forme di vita: tutto questo tempo è stato
un gioco di estinzioni, ci sono state moltissime estinzioni anche di organismi complessi.

Decine di anni fa si pensava che l’albero della vita (sorta di rappresentazione più o meno simbolica della suddivisione
degli esseri viventi) fosse costituito da due soli rami (eucarioti e procarioti) ; con l’evoluzione della tecnologia si è
scoperto che quelli che erano chiamati come archeobatteri in realtà non sono assolutamente batteri e ciò ha
costituito l’origine di un nuovo terzo ramo.
L’albero della vita ha tre rami: due rami sono formati da procarioti mentre un ramo è quello degli eucarioti.
Non ci sono state tanti origini della vita, o meglio è possibile che si siano formati tanti esseri viventi e quindi tante
cellule/ protocellule diverse tra di loro ma nessuna ha superato gli ostacoli.
Con la tecnologia attuale si è andati a studiare gli organismi e sembrerebbe che tutto derivi da una singola cellula.
L’albero della vita ha un’origine; l’origine di tutti i viventi sembra essere dovuta ad una singola cellula o ad un numero
piccolo di cellule identiche.
Viene fuori e diventa sempre più evidente che quegli organismi non molto considerati, gli archea, in realtà sono una
categoria di viventi e noi siamo i parenti stretti degli archea.
Al punto tale che alcuni sostengono in maniera provocatoria, ma anche con delle basi solide, che in realtà siamo
strettamente imparentati con gli archea.

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Vedremo qual è la ragione per cui questi strani archea indicati una volta come archeobatteri siano dei procarioti che
vivono in ambienti che noi definiamo inospitali, ambienti nei quali questi organismi si sono adattati.
La caratteristica degli archea è quella di riuscire a vivere in ambienti impossibili per temperature, salinità (…) perché si
sono adattati.
Ad esempio i termofili estremi che vivono a temperature molto alte hanno delle proteine e degli enzimi che hanno la
forma corretta a quella temperatura.
Gli archea svolgono la glicolisi come la svolgiamo noi ma i loro enzimi glicolitici, che funzionano in maniera identica
perché hanno lo stesso sito attivo etc., hanno i siti attivi con una specifica struttura giusta per una specifica
temperatura che può essere anche molto elevata, oltre i 100º a pressioni elevate sul fondo degli oceani.
Gli archea svolgono le nostre stesse reazioni con proteine che funzionano a temperature elevate. Ciò da un’idea della
versatilità delle proteine, le stesse identiche reazioni sono svolte dalle proteine a temperature e situazioni diverse.

L’albero della vita sembra essere ricco di rami, è estremamente complesso, con le tecnologie attuali e con l’uso di
metodiche di tipo molecolare sono stati studiati organismi che prima non erano studiati.
La complessità maggiore non è nell’ambito degli eucarioti ma i procarioti sono un’esplosione numerica di tipi diversi
un po’ dappertutto.
Nell’ambito dei viventi ci sono forme di procarioti di tutti i tipi, anche piccolissime (battere con genoma piccolo di 500
mila nucleotidi è il più piccolo conosciuto).
Organismi presenti in quantità notevoli sono i virus.

9
STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE

LEZIONE 4

9/11/2017

IL GENOMA: LA STRATEGIA EVOLUTIVA DEGLI EUBATTERI

Breve introduzione: la sbobina è organizzata a settori: ogni capitolo ha un colore che si riferisce sempre al tema
principale (blu agli archea, rosso agli eubatteri, verde gli eucarioti); di ogni capitolo ci sono brevi paragrafi con un
argomento preciso per poterlo studiare meglio.

Anni fa, non appena si era scoperto che il DNA era la molecola implicata nei processi di carattere ereditario, si era
immaginato che in un qualche modo la dimensione del genoma doveva essere correlata alla complessità
dell’organismo preso in questione (organismo grande  genoma grande ; organismo piccolo  genoma piccolo). In
realtà i dati sperimentali NON confermano questa ipotesi: infatti la dimensione del genoma non mostra correlazione
diretta con la complessità dell’organismo (negli eucarioti solo in piccola parte). Generalmente però, il genoma dei
procarioti è molto inferiore in termini di grandezza rispetto a quello degli eucarioti; la cosa sorprendente è che
comunque, i genomi eucariotici hanno molte differenze tra loro: genomi di piante sono molto più grandi rispetto a
quelli animali, e il genoma dei mammiferi è tra i più piccoli dell’intero mondo animale  c’è quindi una grande
variabilità che a prima vista non è affatto indicativa sulla complessità dell’organismo. La funzione di tutto il DNA è
ancora oggi, in parte, sconosciuta.

Non è nemmeno indicativo il numero dei geni sulla dimensione totale del genoma (sappiamo inoltre che se prendiamo
in esame il proteoma umano per esempio – quindi l’insieme delle proteine – non rispecchia assolutamente il numero
dei geni dai quali esse provengono; abbiamo anche qui una mancanza di correlazione). Questo ci porta alla
conclusione che l’importanza e la correlazione tra genoma e fenotipo dell’organismo, deve essere per forza a livello di
una specifica regolazione dei geni (quindi come funziona tutto il complesso). Oggi sappiamo che dai processi di splicing
derivano poi tutti quegli elementi che sono frutto di diverse associazioni di esoni che portano alla formazione di
diversi tipi di proteine. Non tutte le sequenze esoniche però stanno bene insieme, in quanto si formerebbero
messaggeri ripiegati fortemente instabili che andrebbero a degradarsi  le sequenze di esoni devono essere
specifiche e regolate, in quanto la sequenza che dovrà uscire dal nucleo per essere sottoposta alla sintesi proteica
deve raggiungere il citoplasma integra e funzionale; una sequenza esonica corretta è quindi una sequenza selezionata
che garantisce una corretta traduzione. Questo è importante perché ci dice che il genoma degli eucarioti (a differenza
dei procarioti che non hanno introni) è estremamente regolato e non si basa sulle mutazioni come invece accade nei
procarioti. Una mutazione potrebbe infatti causare la sintesi di una proteina che andrebbe a modificare vie
metaboliche o altre reazioni interne in modo anomalo, ecco perché l’eucariote non si affida alle mutazioni ma cerca di
mantenere una propria stabilità (l’evoluzione verso strutture migliori si ricerca nelle vie di splicing e splicing
alternativo, quindi una strategia diversa).

La strategia di splicing, assente nei batteri, si ritrova anche negli Archea.

ARCHEA

Gli archea, una volta definiti archeobatteri perché grossolanamente assomigliavano a batteri, sono ora una classe
autonoma di organismi.

Caratteristiche principali:
• Unicellulari
• Privi di nucleo
• DNA circolare organizzato in cromatina
• Adattati a vivere in condizioni estreme
• Possiedono qualche introne  riescono a fare splicing

Tutte queste caratteristiche, col tempo, ci hanno portato ad affermare che gli archea sono un gruppo di organismi
molto più simili a noi eucarioti piuttosto che ai batteri.
Batteri  Adattabili (sfruttano mutazioni)
Archea  Adattati (come gli eucarioti, evitano le mutazioni; a che scopo cambiare quando sono già adattato?)
La differenza sostanziale sta nel fatto che i batteri grazie ad un alto grado di mutazioni possono adattarsi più o meno
bene a qualsiasi condizione; l’archea invece si è adattato unicamente a quel tipo di ambiente: possiede quel tipo di
proteine che funzionano in quelle condizioni. Un battere che entra nell’ambiente di un archea non riuscirebbe a
sopravvivere perché non ha il tempo sufficiente per adattarsi; col passare di milioni di anni però, gli ambienti terrestri
sono cambiati ed esistono sempre meno luoghi così estremi, per cui gli archea si troveranno sempre di più relegati a
vivere in zone che non sono quelle a cui loro si sono adattati  questo fenomeno li sta portando ad una estinzione.
Essere adattati ad ambienti che con gli anni si restringono sempre di più è quindi il problema principale degli archea.
A seconda dell’ambiente in cui vivono esistono diverse classi di archea:
➢ ALOFILI: Vivono in ambienti con altissima salinità (le loro proteine non si destabilizzano);
➢ PSICROFILI (o criofili): Vivono a bassissime temperature;
➢ TERMOFILI: Vivono ad altissime temperature;
➢ ACIDOFILI: Vivono in ambienti ad alta acidità;
➢ (METANOGENI): Non sono più considerati una branca a se stante in quanto sono diffusi in tutte e quattro le
branche sopra elencate.
Tutto questo è permesso da geni che codificano per proteine adattate a funzionare in queste determinate condizioni.

ANALOGIE E DIFFERENZE
Vediamo ora alcune analogie e differenze sostanziali tra le 3 classi Archea, Eubatteri ed Eucarioti.
1. Genoma
2. Cromatina
3. Membrane
4. Glicosilazione
5. Riproduzione
1. GENOMA
La presenza del genoma circolare, tipico dei procarioti, da il vantaggio di non avere un singolo inizio di replicazione 
la duplicazione di un DNA circolare è meno problematica rispetto a un DNA lineare: duplicare un DNA lineare
comporta una perdita di informazione ad ogni ciclo; ciò non accade con DNA circolari in quanto non hanno problemi
nei telomeri.
2. CROMATINA
Poiché i genomi degli archea sono piccoli come quelli dei batteri e non sono contenuti in un nucleo, ne emerge che il
ruolo ancestrale della cromatina non era forse tanto quello di compattare il genoma in una struttura di ordine
superiore, quanto piuttosto quello di regolare l'espressione genica. Gli archea hanno però degli istoni: H3 e H4 (gli
istoni più antichi) che sono molto attivi funzionalmente, organizzano la cromatina a tetrameri (la nostra è ad
ottameri).
C’è però un dato curioso: il nostro DNA centromerico è organizzato a tetrameri proprio come la cromatina degli
archea; probabilmente abbiamo ereditato nella zona centromerica la cromatina a tetrameri tipica degli archea.
3. MEMBRANE
Gli archea hanno membrane molto più robuste delle nostre; questa caratteristica è data dal fatto che i loro fosfolipidi
sono costituiti da eteri del glicerolo con catene isoprenoidi. La loro parete cellulare inoltre, a differenza dei batteri, è
priva di peptidoglicano.
Vediamo quindi le differenze:
MEMBRANE

BATTERI ARCHEA EUCARIOTI

• Fosfolipidi esteri del • Fosfolipidi eteri del • Fosfolipidi esteri del


glicerolo con acidi grassi glicerolo con catene glicerolo con acidi
• Parete cellulare con isoprenoidi grassi
peptidoglicano • Parete cellulare priva di • Privi di parete cellulare
peptidoglicano

LEGAME ESTEREO LEGAME ETEREO

Legame difficile da idrolizzare,


Legame facilmente idrolizzabile garantisce maggiore robustezza
(più fragile e meno robusto) alla membrana

Gli eucarioti hanno lo stesso tipo di membrana dei batteri ad eccezione del fatto che non hanno la parete cellulare. La
membrana è quindi l’unica caratteristica che sembriamo aver ereditato dai batteri piuttosto che dagli archea.

4. GLICOSILAZIONE (Per l’approfondimento vedi lezione n°12)


La glicosilazione è una reazione di carattere universale, tutti gli organismi la mettono in atto, ma non tutti allo stesso
modo:

- Eucarioti: Sintesi di una catena ramificata di 14 zuccheri costruita sul lipide dolicolo nel RER, poi trasferita
sull’azoto dell’amminoacido asparagina.
- Eubatteri: Attuano la glicosilazione, ma la catena oltre al fatto di NON essere ramificata, è sintetizzata da un
altro lipide che non è il dolicolo: l’undecaprenol-pirofosfato.
- Archea: La loro glicosilazione sfrutta il dolicolo per sintetizzare catene ramificate diverse però dalle nostre 
questo dato ci porta a supporre che la glicosilazione che noi utilizziamo sembra essere un’evoluzione del
meccanismo archea.

EUCARIOTI EUBATTERI ARCHEA

- Catene ramificate con - Catene lineari - Catene ramificate


14 zuccheri - Undecaprenol- (diverse da quelle
- Dolicolo pirofosfato eucariotiche)
- Dolicolo
5.RIPRODUZIONE

Gli archea, come i batteri, hanno una riproduzione asessuata; più precisamente, 2 archea (aploidi) sono in grado di
fondersi insieme e originare una struttura temporaneamente diploide (etero diploide) che poi si andrà a separare
nuovamente. Un fatto importante è che durante questa fusione temporanea può avvenire il crossing-over. Questo è
un altro elemento in comune con gli eucarioti.

Abbiamo detto che gli archea tendono a evitare mutazioni  cercano di difendere il loro DNA.

Gli archea hanno un ciclo cellulare comparabile al nostro come funzionalità e modalità, cambiano solamente le
tempistiche in quanto le condizioni ambientali influiscono molto sulla velocità del ciclo (ad esempio sulla velocità di
scorrimento della DNA polimerasi: ad alte temperature è molto più veloce).

PROCARIOTI (EUBATTERI)

I procarioti sono i più antichi esseri viventi e presentano la maggiore diversità genetica e metabolica.
Strutturalmente possiedono una parete cellulare esterna costituita da peptidoglicano, una membrana cellulare e un
DNA circolare libero nel citoplasma (non organizzato in cromatina, quindi facilmente accessibile); non possiedono
organelli citoplasmatici eccetto i ribosomi che servono ovviamente per la sintesi proteica. Alcuni batteri possono avere
anche una capsula esterna; il batterio incapsulato è protetto dalle aggressioni del sistema immunitario che lo rileverà
troppo tardi  la capsula conferisce quindi un’alta patogenicità in quanto permette ai batteri di poter evadere per un
tempo sufficiente il sistema immunitario, andando quindi a riprodursi in un numero tale da diventare pericolosi per
l’organismo che li ospita. Alcuni ceppi di streptococco che formano la capsula sono patogeni, mentre quelli senza
capsula sono praticamente innocui.
I batteri possiedono anche i flagelli, estroflessioni che consentono la locomozione: sfruttano dei motori molecolari a
protoni per generare il movimento. La loro alimentazione è permessa da proteine canale che generano un gradiente in
grado di far entrare le sostanze utili al sostentamento del battere.

Morfologicamente si conoscono diversi tipi caratteristici di aggregazione batterica:


➢ Diplococchi: batteri sferici associati 2 a 2
➢ Streptococchi: batteri disposti a formare una catena
➢ Stafilococchi: batteri disposti a formare un grappolo

A seconda del loro stile di vita inoltre, i batteri possono essere:


➢ Aerobi obbligati (tubercolosi)
➢ Anaerobi obbligati (tetano)
➢ Anaerobi facoltativi (escherichia coli)
➢ Saprofiti (decompositori)
➢ Fotoautotrofi (alghe verdi)

Dal punto di vista evolutivo i batteri sono estremamente veloci nel riprodursi; per farsi un’idea un battere può
produrre 350 generazioni di se stesso in una settimana, noi ci mettiamo 5000 anni. La loro evoluzione biologica è
quindi molto più rapida. Questa velocità avrebbe dovuto dare un vantaggio evolutivo sufficiente ai procarioti per non
permettere uno sviluppo significativo agli eucarioti; la pluricellularità eucariote però ha permesso che questo non
accadesse.
Un elemento curioso è che nel nostro organismo ci sono circa 37.200 miliardi di cellule, ma ci sono molti più batteri.
Quell’elemento di 700/800 gr che l’uomo non eredita dai genitori è il microbioma intestinale. Il Progetto Microbioma
Umano è andato a valutare quante specie di batteri sono presenti nell’individuo; si è scoperto che l’uomo è una
società di batteri che hanno innumerevoli abilità tra cui quella di condizionare il nostro funzionamento. Essi poi
competono con altri batteri per impedire loro di colonizzarci, quindi svolgono anche un ruolo immunitario non
indifferente.
Esistono poi batteri estremamente resistenti alle radiazioni  hanno un DNA che riesce a ricostruire molto
rapidamente la propria struttura a seguito di forte esposizione a radioattività.

Esistono poi forme intermedie di procarioti con caratteristiche particolari:


• CLAMIDIE: Piccoli batteri, parassiti obbligati di cellule eucariotiche, in quanto non sono metabolicamente
autonomi. Questi organismi possono esistere in due forme: una extracellulare come spora oppure una
intracellulare (quindi quando entra nella cellula ospite) come battere attivo metabolicamente. Possiede un
DNA circolare con 500 geni.
• MICOPLASMI: Piccolissimi batteri privi di parete cellulare e capsula; hanno un DNA circolare con circa
500'000 paia di basi e 500 geni. Sono molto resistenti agli antibiotici.

Questo significa che il mondo vivente è molto diversificato; con soli 500 geni esistono strutture in grado di vivere e
riprodursi.

SPORULAZIONE
Una capacità fenomenale dei batteri è quella di poter diventare delle spore. Cos’è una spora?
Una spora è una forma di resistenza del battere; quando le condizioni ambientali e/o fisiologiche in cui si trova il
battere non sono sufficienti a garantirgli la sopravvivenza, esso entra in uno stadio di estrema resistenza detto spora.
Il processo di sporulazione è reversibile ed è detto germinazione (spora  battere).
All’interno della spora l’acqua è assente: in questo modo tutto è immobilizzato e le reazioni di idratazione (quelle che
rompono i legami chimici per intenderci) sono rese impossibili  i legami di tutte le strutture batteriche non possono
essere distrutti, ciò garantisce una sopravvivenza anche per migliaia di anni. Nella spora è quindi tutto immobile.
Le spore non sono da confondere con le modalità riproduttive dei funghi.

BIOFILM
Un’altra capacità tipica dei batteri è quella di potersi riunire a formare degli strati biologici detti biofilm. Questi biofilm
non sono altro che una comunità di microrganismi (quindi non costituiti da un’unica categoria di battere) incorporati
in una matrice extracellulare gelatinosa costituita da DNA extracellulare, polisaccaridi e proteine che derivano dagli
stessi batteri.
È un supporto che si può attaccare benissimo a qualsiasi superficie. In questa matrice, che funziona come una vera e
propria casa, i batteri si riproducono e crescono esponenzialmente; se il biofilm in un qualche modo si rompe, i batteri
che ne fuoriescono possono andare a sintetizzare nuovamente un altro biofilm.
Clinicamente, i biofilm sono responsabili di molte infezioni persistenti e croniche a causa della loro intrinseca
resistenza agli agenti antimicrobici e alla selezione di varianti fenotipiche.

DNA PROCARIOTE

Il DNA dei procarioti è tanto ma costituito da pochi geni che non vengono nemmeno utilizzati tutti, quindi non viene
sfruttato interamente; le zone inutilizzate vengono addensate e spiralizzate tramite l’azione di enzimi dette
topoisomerasi. La regolazione batterica di conseguenza è molto semplice, quasi minima; i geni sono organizzati in
operon: unità trascrizionale indipendente, formata da 2-15 geni regolati da un unico promotore (a differenza nostra
che ad ogni gene corrisponde un promotore). E’ molto vantaggioso per il battere perché attiva e trascrive l’operon che
contiene i geni che codificano per la proteina che gli serve. Il primo gene viene sempre trascritto maggiormente
rispetto a quelli seguenti  sarà quindi quello in grado di produrre più proteine; l’ordine è importante perché
definisce il metabolismo in cui le proteine andranno ad agire. L’ultimo gene invece è spesso coinvolto nella sintesi di
proteine regolatrici di altri operon.

Un dato interessante è che il loro DNA è codificante al 98%  ogni danno quindi si trasforma ragionevolmente in una
mutazione. Sono anche aploidi quindi sono molto esposti (la nostra diploidia ci protegge in minima parte da quelle
mutazioni alleliche recessive che altrimenti si esprimerebbero). Il 2% non codificante è l’origine della duplicazione 
zone deputate solamente all’attacco di proteine iniziatrici del processo di replicazione.

Noi, intesi come eucarioti, non abbiamo gli operon ma strutture più o meno equivalenti dette moduli funzionali; sono
set di geni sintetizzati insieme. Il nostro DNA è ordinato in domini funzionali in cui anche se geni sono lontani nel
genoma, nel nucleo sono vicini e possono essere trascritti insieme (come fossero operon)  noi abbiamo quindi geni
co-espressi.

SCAMBI DI DNA TRA BATTERI

Abbiamo detto che i batteri si affidano alle mutazioni: questo è uno svantaggio in quanto esse modificano una
struttura che è il risultato di un’evoluzione di miliardi di anni. I batteri, essendo organismi estremamente adattabili,
riescono a trarre vantaggio da queste mutazioni; come ci riescono? Scambiano DNA con meccanismi orizzontali, ossia
appartenenti alla stessa generazione (gli eucarioti invece fanno scambi di tipo verticale, ossia tramite riproduzione, col
quale un organismo riceve il materiale genetico dei suoi antenati dai suoi genitori). In questo modo il battere aumenta
la sua probabilità di ottenere mutazioni vantaggiose: se un battere X muore, il battere Y può provare a integrare il
genoma X all’interno del suo  aumento della variabilità e convergenza di eventi mutazionali favorevoli.

Esistono 3 tipi principali di scambi orizzontali di DNA:

1. Trasformazione
2. Coniugazione
3. Trasduzione

TRASFORMAZIONE

Questo evento è stato scoperto tramite un importante esperimento condotto da Frederick Griffith nel 1928 che ha
consentito di capire che il fattore principale della trasmissione dei caratteri ereditari fosse il DNA. Il meccanismo da lui
scoperto è anche un tipico esempio dello scambio orizzontale di informazione tra batteri.
 Prendiamo in considerazione 2 ceppi di pneumococco: il tipo R (rugoso, privo di capsula e quindi innocuo) e il
tipo S (liscio con capsula, patogeno); logicamente infettando un topo con un ceppo di tipo S, il topo muore. Al
contrario se lo infettiamo con il tipo R, il topo sopravvive. Questo accade perché, come abbiamo visto
precedentemente, la capsula del tipo S gli permette di eludere il sistema immunitario del topo, che andrà
quindi incontro a morte certa; il tipo R invece, non possedendo la capsula, espone sulla sua membrana
antigeni che vengono immediatamente riconosciuti dal sistema immunitario del topo, che provvede a
eliminarli. Cosa fece allora Griffith? Egli infettò il topo con una miscela di ceppi S uccisi tramite esposizione al
calore e ceppi R vivi: il topo morì, e al suo interno si trovarono ceppi S vivi. Com’è possibile? E’ possibile in
quanto i ceppi R si erano trasformati in ceppi S con un meccanismo allora sconosciuto: la trasformazione. In
pratica i ceppi R avevano integrato nel loro genoma parti di DNA dei ceppi S morti assumendo le loro
caratteristiche patogene. Tramite questo esperimento si capì anche che era avvenuto uno scambio di
materiale tra i due ceppi; inizialmente non si sapeva cosa fosse (si credeva fossero le proteine), oggi
sappiamo che è il DNA.

I batteri quindi possono prendere tratti di DNA dall’esterno in modo aspecifico, e provare ad integrarli nel loro
genoma.

CONIUGAZIONE

La coniugazione è un processo nel quale avviene il trasferimento unidirezionale di infrmazione genetica attraverso
il contatto diretto tra una cellula batterica donatrice e una ricevente. Al contrario della trasformazione, la
coniugazione è un processo specifico. Una condizione necessaria affinchè avvenga questo tipo di scambio, è che
uno dei due batteri possieda un plasmide: DNA circolare extracromosomico. In particolare, il plasmide
responsabile della coniugazione è detto plasmide F o fattore F (di fertilità). La cellula donatrice del fattore è detta
F+, quella ricevente F- ; non può avvenire coniugazione tra due cellule dello “stesso sesso”. Come funziona il
processo? Semplicemente la cellula F+ costruisce un ponte citoplasmatico collegato alla cellula ricevente F-,
duplica il suo fattore e successivamente lo trasferisce alla cellula ricevente tramite il ponte. Alla fine del processo
entrambe le cellule saranno F+. Una nota importante è che il ponte citoplasmatico è molto fragile quindi non
raramente si ha il trasferimento completo dell’intero fattore F.
TRASDUZIONE

La trasduzione è un processo nel quale batteriofagi (virus dei batteri) trasferiscono geni da un batterio donatore a
un altro ricevente; questi batteriofagi sono detti vettori fagici. In poche parole il batteriofago infetta un battere, il
materiale genetico va incontro a ricombinazione (crossing-over) per cui il batteriofago integra nel suo genoma il
DNA batterico; nel momento in cui il fago che contiene il DNA batterico va ad infettare un altro battere, gli
trasferirà quel DNA che potrà subire un’ulteriore crossing-over e integrarsi nel genoma dell’ospite.
STRUTTURA E FUNZIONE DELLA CELLULA
LEZIONE 5
13/11/2017

EVOLUZIONE DELLA CELLULA EUCARIOTE

È difficile dire quando siano comparsi gli eucarioti perché le tracce fossili che hanno lasciato sono estremamente
scarse; sono stati trovati fossili di probabili eucarioti che risalgono a circa 1 miliardo di anni fa.
La loro origine è antica ma è certo che costituiscono un modello cellulare più recente rispetto a quello dei procarioti,
che sono stati i dominatori del pianeta Terra per la stragrande maggioranza del tempo.

I procarioti sono il modello cellulare più antico; nell’ambito dei procarioti ci sono state due linee evolutive
fondamentali:
1. ARCHEA, procariote che si è adattato a livello genomico. (Adattamento genomico= quell’organismo è il più
adatto, ha maggiori possibilità di sopravvivere in un certo sistema. La scommessa evolutiva degli archea è
andata male perché si sono adattati a degli ambienti che a poco a poco stanno scomparendo);
2. BATTERI, modello estremamente adattabile. Questa grandissima adattabilità li ha resi i protagonisti
dell’evoluzione sul pianeta Terra: la maggioranza delle conquiste più importanti sono state fatte dai batteri.
Nell’ambito dei procarioti c’è stato un moderato scambio di geni: l’archea che si era adattato ha cercato di non “dar
via” i propri geni ai batteri (strutturazione in cromatina del DNA dell’archea + la presenza di introni).
Il donatore universale di geni è stato il battere, lo stesso archea ha utilizzato, cercando di personalizzarli, geni
batterici.

Gli eucarioti costituiscono un modello cellulare di dimensioni più grandi e con un tempo di evoluzione estremamente
più lento rispetto a quello dei procarioti perché per duplicare tutto il materiale che hanno all’interno, per poi
dividersi, utilizzano una grossa quantità di energia.
Quale potrebbe essere la funzione di un eucariote in un mondo dominato da procarioti?
Le dimensioni degli eucarioti fanno immaginare che queste cellule si siano sviluppate come modello cellulare che
funge da predatore di procarioti.
La loro comparsa (così come la loro evoluzione) è stata favorita dalla fase aerobia, dalla fotosintesi (scoperta da parte
dei batteri) e dalla respirazione; ciò perché fotosintesi e respirazione hanno portato agli organismi cibo ed energia
necessaria per le divisioni (questa energia ha permesso agli eucarioti di crescere abbastanza rapidamente).
Sicuramente ossigeno e respirazione hanno avuto un ruolo importante anche nella comparsa degli organismi eucarioti
pluricellulari, che è avvenuta nel periodo cambriano.
Gli organismi pluricellulari sono comparsi (ed hanno colonizzato la terra ferma) come svincolo degli eucarioti dal fatto
che non possono competere in termini di evoluzione biologica con i procarioti ( i procarioti si evolvono molto più
rapidamente).

Come sono comparsi gli eucarioti sulla Terra?


Un articolo abbastanza recente (di una ventina di anni fa) afferma che l’origine degli eucarioti sia legata
all’isolamento, nelle profondità degli oceani, di modelli cellulari strani che derivavano da situazioni simbiotiche
nell’ambito dei procarioti (in particolare cellule molto più grandi formate da simbiosi tra archea, componente
dominante, ed eubatteri).
Quest’ipotesi fonda su dati di genomica: non esiste genoma eucariote senza tracce di genomi archea e batterici.
Il genoma degli eucarioti è una chimera, non è costituito da materiale genetico esclusivamente eucariota.

L’origine degli eucarioti è dovuta ad interazioni di tipo metabolico (fagocitosi) tra un archeobatterio anaerobio
(metanogeno, trasfroma H in CH4) ed un eubatterio anaerobio facoltativo.
I batteri entravano interagivano con gli archea perché potevano così sopravvivere grazie al glucosio prodotto dal loro
metabolismo. L’unione tra questi organismi non è perfettamente chiara e diverse ipotesi tentano di esporre le
principali motivazioni.
Un’ipotesi è quella dell’idrogeno: in un ambiente ricco di CO2 e H2 di origine geologica (l’attività vulcanica era
fortemente intensa) con la riduzione delle sorgenti di idrogeno, l’archea diviene dipendente dall’H 2 (gli archea
utilizzano l’H come energia per produrre glucosio) che il batterio produce come scarto del proprio metabolismo in
condizioni anaerobiche.
Quest’ultimo quindi origina un contatto molto stretto con il batterio per ottimizzare l’utilizzo dei suoi prodotti
(l’archea ingloba quasi totalmente il batterio), si instaura così un rapporto di simbiosi.

1
Archea ospite in giallo,
batterio simbionte in blu

Questo contatto è così severo che l’archea, in poco tempo, ingloberà totalmente il battere e scambierà con
quest’ultimo del materiale genetico.
Inizieranno ad essere sintetizzate delle proteine che verranno integrate nella membrana batterica dando inizio ad un
rapporto simbiotico definitivo.
In seguito al trasferimento genico nel genoma dell’archeo-batterio (ospite), il rapporto di simbiosi diviene obbligato e
si afferma il metabolismo energetico tipico degli eucarioti che prevede la fase glicolitica nel citoplasma e la
respirazione cellulare all’interno del simbionte-mitocondrio.
C’è stata un indubbia fusione genica (scambio di geni) tra questi organismi, che si può vedere a livello della membrana
e delle proteine di membrana.
Nella membrana ci sono mescolate insieme zone con esteri (tipo batterico) e zone con eteri (tipo archea) del glicerolo:
la membrana è diventata a composizione mista. A livello della membrana sarà prevalente la componente batterica,
infatti allontanandosi da zone e ambienti particolari è stato più vantaggioso utilizzare la membrana con gli esteri di
tipo batterico.

Questi fenomeni di simbiosi danno quindi origine a


strutture cellulari con dei compartimenti interni;
qualcosa che ricorda molto da vicino i procarioti ma
è diverso: gli eucarioti.
Questi modelli cellulari misti contengono DNA
dell’archea e del battere (i batteri inglobati si
degradano e liberano il loro DNA) mescolati
insieme; per questo motivo è probabile si sia
generata la comparsa della membrana nucleare e
del reticolo endoplasmatico (e di altre strutture
subcellulari) da una serie di fenomeni di endocitosi
che sono serviti a chiudere il materiale genetico
(che in questi nuovi modelli era molto ricco).

Lo sviluppo dei vari meccanismi metabolici ha portato, a meno di un miliardo di anni fa (nel periodo precambriano), ad
un secondo picco di ossigeno che ha generato una grande quantità di energia.

Le evidenze dell’ossidazione dei minerali sul pianeta terra indicano che ci sono stati due momenti di condizioni
fortemente ossidanti:
1. un primo momento intorno a due miliardi di anni fa, quello che si ritiene sia legato alla produzione di
ossigeno da parte di batteri fotosintetici;
2. un secondo picco intorno ad un miliardo di anni, quello che può essere determinante dell’espressione di
un grande sviluppo della vita sul pianeta terra.
2
Il secondo picco di ossigeno ha portato alla comparsa di eucarioti pluricellulari.
Gli organismi eucarioti pluricellulari sono arrivati quindi più tardi nell’evoluzione degli eucarioti: la pluricellularità è
stata la risposta che ha consentito agli eucarioti di restare sul pianeta terra.
C’è stato un cambio di dimensioni per cui la competizione con i batteri non è finita con loro vincitori.
Con la pluricellularità gli eucarioti si sono guadagnati la terra ferma e sono stati in grado di uscire dall’acqua.
Testimonianza che la comparsa di pluricellulari è dovuta al secondo picco di ossigeno è la presenza di fossili di questi
organismi (reperibili anche se molto rari, strani per le dimensioni).
La caratteristica di questi fossili è la dimensione estremamente microscopica: sono fossili piccolissimi formati (ma non
delimitati) da più cellule.
Cos’è che impedisce a questi organismi di diventare più grandi (come avverrà nel cambriano?)
È la mancanza di uno scheletro (oppure di un esoscheletro o endoscheletro): senza i fenomeni di mineralizzazione un
organismo formato da più cellule è condannato a rimanere estremamente piccolo e non competitvo rispetto ai
procarioti; può allargarsi e formare una struttura fatta da poche cellule e ricca d’acqua (es una medusa).
Inoltre senza uno scheletro l’organismo pluricellulare non avrebbe potuto abbandonare il mare e arrivare a
colonizzare la terra ferma (senza scheletro è costretto a rimanere ancorato a certi ambienti).

Che cosa è avvenuto nel CAMBRIANO?


La demarcazione tra il precambriano e il cambriano è data dal fatto che sono comparsi, in maniera abbastanza
repentina in termini geologici (nello spazio di pochi milioni di anni), fossili di eucarioti pluricellulari di grandi
dimensioni.
Sono fossili grandi (gli organismi più grandi superano abbondantemente il metro) che sembrano essersi originati in un
lasso di tempo geologicamente brevissimo (pochi milioni di anni).
La maggior parte degli organismi che si sono formati all’inizio sono scomparsi successivamente: ci sono state un gran
numero di estinzioni che hanno comportato la morte di quasi tutti gli organismi esistenti in quel periodo.
Un gran numero di organismi sono stati ritrovati in Canada alla fine dell’Ottocento come fossili, è stata fatta una
catalogazione e sono stati collegati agli organismi attuali, infine messi nei musei.
Negli anni Settanta (circa un secolo dopo), essendo grande il numero di organismi che c’erano nei musei, alcuni hanno
avuto l’idea di fare delle sezioni.
Con queste sezioni si voleva andare a vedere se i processi di mineralizzazione avessero comportato il mantenimento
delle strutture interne.
In realtà con questi studi hanno trovato una serie di cose strane: nella maggior parte dei casi i piani anatomici interni
erano completamente diversi rispetto a quelli attuali.
I fossili del cambriano dimostravano che quegli organismi avevano un gran numero di piani anatomici.
Si può essere certi che quegli organismi si siano estinti perché gli organismi attuali hanno un limitatissimo numero di
piani anatomici (che risultano essere l’evoluzione dei primitivi).

Si può parlare di esplosione del cambriano perché: fino al precambriano i fossili erano pochi e gli organismi
pluricellulari molto rari, improvvisamente nel cambriano si trova una grandissima quantità di fossili.
È probabile che abbia giocato un ruolo:
• EVOLUZIONE DEL GENOMA  che ha comportato la dotazione dei geni che hanno consentito di utilizzare
fenomeni di mineralizzazione (costruzione di endoscheletro/esoscheletro)
• CONTROLLO DEI PIANI ANATOMICI  cioè dei geni che controllano lo sviluppo dell’organismo in termini di
piani anatomici.
Per esempio i cosiddetti GENI OFFICE (tra i pochi sopravvissuti tra i vari piani anatomici): sono geni
antichissimi che si sono mantenuti semi-invariati fino ai giorni nostri.

Gli organismi, che si sono generati in pochi milioni di anni nel cambriano, hanno dato luogo alla formazione di un
ecosistema molto articolato, infatti sono vissuti in un lasso di tempo di milioni di anni, sufficiente per far si che si
ritrovassero un po’ dappertutto sul pianeta terra.
C’era un ecosistema con predatori e prede (si può affermare che ci fossero dei predatori perché nelle sezioni di alcuni
organismi sono stati trovati pezzi di altri organismi).

Stava avvenendo un grande salto evolutivo descritto da Darwin come accumulo di mutazioni che si sono espresse
lentamente.
TEORIA EVOLUTIVA DI GOULD
Gould, invece, sosteneva che l’evoluzione è avvenuta in modo intermittente (a salti), con improvvise
comparse/scomparse di esseri diversi. Secondo Gould gli organismi non sono collegati da anelli intermedi ma è come
se ri-arrangiamenti genomici siano andati a produrre una struttura genomica diversa e funzionale in maniera diversa.

3
Non tutti gli organismi evoluti sono sopravvissuti, il 90% di essi è estinto e, anche qui, sono tante le ipotesi che
tentano di spiegarne il motivo. L’ipotesi più sostenuta è la teoria dell’impatto, secondo cui un meteorite molto grande
abbia colpito la Terra uccidendo la maggior parte degli organismi viventi; gli unici ad essere sopravvissuti sono i
mammiferi, insieme ai coccodrilli e agli uccelli, entrambi derivanti dall’arcosauro.
Le estinzioni sono spesso opportunità evolutiva: con l’estinzione dei dinosauri (che sembra dovuta essere ad un masso
di 10 km di diametro che ha impattato e ha generato un’improvvisa variazione del cilma), si è dato spazio alla crescita
dei mammiferi e degli esseri umani derivanti.

L’evoluzione degli organismi è stata dei geni e dei genomi: se non ci fosse stato il DNA (come molecola informazionale)
tutta questa evoluzione non ci sarebbe stata.
L’RNA non è in grado di portare l’informazione perché la sua struttura molecolare è instabile e non sarebbe stato in
grado di supportare l’evoluzione.
dobbiamo quindi pensare che
Il DNA è stata una conquista importante che ha consentito l’evoluzione del genoma.

Un altro elemento importante in termini evolutivi è stata la comparsa del nucleo.


Il nucleo ha separato la trascrizione (cioè la sintesi di RNA) dal processo di traduzione (sintesi di proteine); ha quindi
introdotto una possibilità che i procarioti ed i batteri non avevano: quella di potere manipolare l’RNA.

IL GENOMA DI UN EUCARIOTE È UNA CHIMERA, è formato inevitabilmente da


1. geni archea (moltissime delle nostre proteine sono archea leggermente modificate per adattarle a condizioni
di temperatura e pressione diverse)
2. geni batterici (ci sono alcuni organismi eucarioti privi di mitocondri; non hanno mai respirato e non hanno
mitocondri. In questi organismi si trovano organelli strani, chiamati progenosomi, dentro i quali si svolge il
ciclo di Krebs. Questi progenosomi sono in realtà batteri che sono rimasti.)
3. geni nuovi, evolutivamente giovani (geni propri dell’eucariote)

inoltre nel genoma eucariote si trova un elemento in più: GLI INTRONI.


Gli introni sembrano essere delle sequenze introdotte dallo stesso eucariote (non sono quindi qualcosa di estraneo
che invade il genoma o va a frammentare le regioni genomiche).
Nell’evoluzione dei genomi gli introni hanno un certo ruolo perché possono far aumentare di complessità i genomi.

Che cos’è un gene?


Un gene è una regione di DNA (molecola informazionale) reclutata da proteine di regolazione e RNAnc (non
codificante), che inizia sempre con la sequenza ATG (AUG nell’RNA).
Essere gene non è una proprietà assoluta.
Più precisamente un gene è una sequenza di nucleotidi del DNA cellulare, che può essere trascritta per formare
molecole di RNA che direttamente (mRNA) o indirettamente (rRNA; tRNA, ncRNA) portano alla sintesi di una proteina.

4
Nei batteri la maggior parte del DNA porta informazioni per la sintesi di proteine.
Il genoma dei batteri è codificante al 98%: ciò significa che il 98% del DNA del battere contiene sequenze traducibili in
proteine.
Nel 2% hanno delle piccolissime spaziature, tra una sequenza codificante e l’altra, che non sono codificanti.
Il genoma del battere è organizzato in operon ossia entità di trascrizione controllate da un unico promotore, non ci
sono introni e non serve maturazione perché mentre è sintetizzato l’mRNA già inizia la traduzione: la traduzione è co-
trascrizionale, mentre trascrivo inizio a tradurre (sintetizzato l’RNA i ribosomi si attaccano e cominciano a tradurre).
Nel caso del battere il trascritto è subito mRNA e poiché il trascritto è la copia di un operon è una sequenza che può
dar sintesi a più proteine (l’mRNA dei batteri generalmente è poligenico).

Il battere se vuole scoprire qualcosa di nuovo/ha bisogno di un uovo gene deve:


 Affidarsi alle mutazioni, ossia cambiamenti del DNA (danni al DNA che spesso sono deleteri) che potrebbero
dar luogo a funzioni nuove e migliori.
Le mutazioni possono essere favorevoli come sfavorevoli: è più probabile che il battere muoia piuttosto che
questo sopravviva perché le mutazioni sono molto spesso sfavorevoli.
Visto che il DNA batterico è quasi tutto codificante, ogni variazione di DNA/mutazione rischia di esprimersi a
livello di proteina.
I batteri riescono a far convergere sullo stesso battere più mutazioni vantaggiose utilizzando scambi di DNA
(scambi orizzontali, trasformazione, coniugazione e trasduzione), in questo modo riescono a trarre vantaggi e
cambiamenti.

 Possono avvenire scambi di DNA orizzontali per i quali il battere prende del DNA dall’esterno, qualunque sia
la natura di questo DNA;
l’estrema velocità di crescita del battere gli consente un’evoluzione biologica rapidissima; l’alternanza di generazioni
può avvenire in lassi di tempo estremamente brevi.
Batteri che si evolvono con rapidità enorme sono i batteri che definiamo aerobi mentre i batteri anaerobi, che si
trovano nelle profondità della crosta terrestre e usano metabolismi alternativi, sono batteri a crescita lenta.
Anche i batteri a crescita lenta mutano ma tutto è molto più lento, l’alternanza di generazioni è molto più lenta per cui
la loro evoluzione biologica è nettamente più lenta.

Negli eucarioti il gene è una struttura strana.


Il gene eucariote è formato da esoni (regioni codificanti) intervallati da introni (zone non codificanti).
Nell’ambito del genoma umano la somma degli esoni è tra l’1-2% mentre i geni sono ¼ del genoma: ma quando si
parla di geni si intendono esoni+introni.
Gli introni sono la parte dominante dei geni: nell’ambito del genoma sono circa il 98%.
L’informazione che si trova nel gene è frazionata dagli introni che possono essere estremamente lunghi:
l’informazione è quindi diffusa e descritta in una specie di linguaggio segreto, indecifrabile senza il codice genetico
(senza il codice non si riescono infatti ad eliminare gli introni).
Il processo di trascrizione dipende da proteine ed RNAnc, e implica la copiatura di un filamento di DNA per dar luogo
ad una molecola di RNA.
Negli eucarioti il trascritto ad RNA deve andare incontro ad un processo di maturazione perché i geni degli eucarioti
contengono introni (tutti gli eucarioti hanno geni con introni e a complessità dell’organismo si associa una
determinata quantità di introni. Noi abbiamo introno ai 21000 geni, la differenza dei nostri geni da quelli di altri
eucarioti risiede nel numero diverso di introni.)
Il PROCESSO DI MATURAZIONE (=SPLICING) svolge un ruolo essenziale.
Questo processo non è univoco ma può avvenire in vari modi: uno stesso RNA può dar luogo a più mRNA differenti e
quello che si chiama mRNA non è altro che collage di esoni.
Gli esoni del collage possono derivare da una grande molecola di RNA, prodotto di un singolo gene, oppure da diversi
RNA che sono il prodotto di geni diversi.
Lo splicinga non elimina del tutto le regioni non codificanti: negli mRNA ci sono dei pezzi che sono indicati come
sequenze UTR, ossia untraslated (=non tradotto), che son sequenze non codificanti con funzione di regolazione del
porcesso di traduzione.
Le sequenze UTR vengono aggiunte dallo splicing prima dell’AUG di inizio o dopo della sequenza di stop (o
all’estremità 3I o all’estremità 5I).
In tessuti diversi possiamo avere mRNA che derivano dalla stessa regione codificante ma hanno diverse sequenze UTR
(sequenze non tradotte posizionate dallo splicing).

La trascrizione e lo splicing avvengono dentro al nucleo, mentre la traduzione avviene fuori dal nucleo.

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Quello che va incontro al processo di traduzione è molecola di RNA costruita ed assemblata dentro al nucleo e che
chiaramente deve essere difesa dalla degradazione (perché la sua formazione richiede tempo).

l’mRNA che andrà incontro a traduzione avrà un Cap in 5I e un Poly-A in 3I, di protezione.

Per essere tradotto l’mRNa deve uscire dal nucleo nel quale è stato trascritto (non si conoscono le modalità di uscita
dell’mRNA del nucleo).

Finche è nel nucleo l’mRNA può essere modificato.


La prima modificazione a cui va incontro è l’inserzione, tramite lo splicing, di sequenze UTR.
Ulteriori meccanismi di modificazione sono :
 editing : modificazione chimica della zona codificante.
L’editing consiste nell’ntervento di enzimi (portati da RNA) che possono andare a deamminare una citosina
generando una sequenza di stop (in questo caso si avrà un mRNA che darà luogo ad una proteina più corta,
diversa).
Il processo di editing è guidato dagli RNA che possono o posizionare degli enizmi in un certo punto e far
avvenire una certa modifica oppure possono inserire nelle zone codificanti dei nucleotidi (spesso inseriscono
uracile Se l’uracile viene aggiunto nella zona codificante, quella che lega triplette la cornice di lettura scorre e
le triplette al momento della traduzione saranno diverse.)

Da uno stesso gene si possono ricavare proteine diverse, con funzioni diverse a seconda delle modificazioni che ha
subito l’mRNA nel nucleo prima di andare incontro al processo di traduzione.
La presenza di introni, la possibilità di rimuovere gli introni genera una differenza notevole tra un organismo e un
altro: gli introni sono modalità di personalizzazione di una sequenza.
Non si possono usare i geni di un altro organismo perché non è detto che si riesca a fare lo splicing.
Noi sappiamo fare lo splicing di molti geni ma non di tutti.
Le differenze a livello dello splicing sono alla base dell’impossibilità di fecondazione tra specie diverse.

L’evoluzione del genoma degli eucarioti è dovuta a duplicazioni geniche e genomiche.


La dove il battere tenta con le mutazioni di trovare un nuovo tipo di gene, noi esseri umani duplichiamo geni: la
duplicazione genica.
L’eucariote tende a duplicare: molti geni derivano da un gene ancestrale, da accumuli di mutazioni diverse nelle varie
copie. Si possono avere proteine diverse con diverse funzioni che sono collegate in maniera ancestrale, a livello di
sequenze si può anche capire che sono modificazioni di una stessa sequenza.
Ci sono evidenze di trasferimento genico da procarioti ad eucarioti: se guardiamo bene a parte un certo numero,
limitato anche se discretamente grande, di proteine che abbiamo solo noi (geni dell’eucariote, zone di DNA che sono
state reclutate a diventare geni quando c’erano gli eucarioti) e non i batteri (i batteri non possono neanche averli
perché hanno gli introni e quindi i batteri non sarebbero neanche in grado di utilizzarli) tutte le altre sono condivise.

Ci sono delle evidenze che dimostrano che i geni derivano da batteri (anche dagli archea ma soprattutto dai batteri):
c’è stato un trasferimento genico orizzontale; ci sono dei procarioti estremofili che hanno trasferito geni ad alghe
rosse eucarioti e gli hanno permesso di sopravvivere in zone ostili.
Ci sono quindi degli eucarioti adattati a certi ambienti strani, e risalendo alle loro proteine si possono vedere i geni di
provenienza batterica.
Ciò significa che ci sono stati scambi tra procarioti ed eucarioti: sequenze geniche rimaste invariate se non fosse per la
presenza di intorni.
La duplicazione dei geni spesso può dare origine a nuove funzioni.
Avere più copie di geni può voler dire evoluzione indipendente delle copie. Queste copie possono mantenere la
similitudine oppure possono cambiare e cominciare a divergere da un punto di vista funzionale.
Molti dei nostri geni e delle nostre proteine condividono degli elementi chiamati domini o motivi.

6
Se si ha una proteina grande questa potrà essere scissa in strutture tridimensionali (domini) che possono essere
condivisi da proteine diverse; la proteina grande è spesso un assemblaggio di pezzi di genoma con determinate
geometrie.
Lo stesso dominio (regione tridimensionale) può essere ritrovato in enzimi di globuli rossi, in fattori di coagulazione, in
un enzima della tiroide che serve per la fissazione dello iodio.
La duplicazione da origine a nuove funzioni lentamente.
Se ho due copie di un gene queste due copie possono mantenere la funzione ma potrebbe succedere che una delle
due copie possa divergere per qualche mutazione e cominciare a cambiare.
 Il trasferimento orizzontale dei geni da luogo a variazioni rapide.
 la duplicazione o eventuali mutazioni che fanno divergere le varie copie danno luogo ad un’acquisizione lenta
di differenze.

GENI HOX
I geni hox sono geni che controllano i piani anatomici.
I Geni Hox sembrano essersi evoluti all’inizio del periodo Cambriano e sono arrivati a noi con soltanto leggere
modificazioni.
I Geni Hox, che sono responsabili dei pattern di sviluppo anatomico degli organismi pluricellulari, condividono tutti
una particolare sequenza di DNA lunga 180 nucletotidi detta OMEOBOX, ben conservata anche in termini di posizione
degli introni, e codificante per un dominio proteico di 60 amminoacidi (omeodominio) che lega il DNA.
I geni con omeobox sono antichi, la loro presenza è stata dimostrata anche nei lieviti unicellulari.
I geni con omeobox che sono stati trovati nelle piante (geni MADS-box) non sono omologhi a quelli degli animali;
questo fatto indica una loro evoluzione indipendente nel corso della separazione tra animali e vegetali.
I geni Hox sono organizzati in una ordinata sequenza lineare (sono detti co-lineari); il loro ordine è direttamente
correlato alla posizione di una data regione nell’organismo ed alla sequenza temporale di sviluppo.
Variazioni di numero o posizione dei geni Hox influenzano in modo evidente lo sviluppo dell’intero organismo
pluricellulare.

 Gli invertebrati e l’anfiosso hanno un solo set di geni Hox;


 Gli animali senza mascelle ne hanno due set;
 Tutti i vertebrati con mascelle ne hanno quattro set;

la duplicazione dei geni Hox potrebbe essere avvenuta al tempo dell’origine evolutiva dei vertebrati, consentendo una
diversificazione evolutiva di questi geni che potrebbero essere alla base della generazione di organismi più complessi.

CLUSTER DI GENI HOX


I principali geni Hox umani appartengono a quattro cluster Hox:

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STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE
LEZIONE 6
16/11/2017

I virus ed il loro possibile ruolo nell’evoluzione

Proprietà generali dei virus

Un virus è qualcosa a metà tra vivente e non vivente: gli attributi fondamentali dell’essere vivente sono un’efficace
organizzazione che rende l’informazione genica utilizzabile per le funzioni cellulari e la capacità di compiere
metabolismo (trasformazione di energia dalla sua massima distribuzione entropica, che raggiunge spontaneamente, ad
una forma di energia libera utilizzabile per compiere lavoro).

Quello che chiamiamo virus è un acido nucleico senza metabolismo, quindi: è diverso da un oggetto del mondo
inanimato, ma non è nemmeno un essere vivente poiché è un parassita genetico che ha bisogno di un organismo
esterno di cui sfruttare le capacità metaboliche. È un parassita molto evoluto, perché deve essere riconosciuto ed
utilizzato dal contesto cellulare in cui entra; gli enzimi della cellula ospite devono riconoscere ed utilizzare le
informazioni portate dal virus (devono riconoscere l’origine di duplicazione, i promotori, ecc…). Quindi da questo
punto di vista il virus è una struttura apparentemente semplice con una funzionalità estremamente complessa,
risultato di un lungo processo di evoluzione e coevoluzione insieme alle cellule.

Da un punto di vista di forme i virus sono variabili, ad esempio il batteriofago ha una struttura piuttosto diversa dagli
altri. È un virus specifico che infetta i batteri, è sempre un virus a DNA ed è di fatto una sorta di siringa: possiede una
struttura a forma di tubo che si comporta da ago (anche i batteri sono in grado di costruire questa struttura, e la usano
nella la “lotta” con gli altri batteri per iniettare, non DNA ma, eventuali molecole tossiche; probabilmente l’origine di
queste strutture è comune ai due organismi, quindi o un batterio ha integrato nel suo genoma una capacità virale o è
stato un virus a farlo col genoma batterico).

I virus sono un acido nucleico che manca di metabolismo, questo rende un virus un non vivente, ma lo mantiene al di
fuori del mondo inanimato. Il virus in questa sua struttura al di fuori dell’ospite può vivere quasi in eterno, può
addirittura assumere la forma di un cristallo formato da tanti virus legati insieme, ed in quello stato possono esistere
per lunghissimi lassi di tempo, per poi riattivarsi in certe condizioni. Sono parassiti intracellulari obbligati, sono come
una famiglia al di fuori della cellula. Il virus si mantiene allo stato di spora e si manifesta solo quando trova una cellula
che può ospitarlo, di cui può sfruttare il citoplasma.

I virus si possono trovare praticamente ovunque, ad esempio l’ambiente acquatico è pieno di virus che spesso
svolgono attività fondamentali, addirittura influenzando i cicli biochimici.
Negli oceani ci sono enormi quantità di virus altamente differenziati. Sono come riserve di geni che possono essere
inseriti in una cellula, al punto che si dice che questi posso svolgere importanti funzioni negli oceani. Per questo si può
dire che il virus non è solo un parassita, ma un organismo che può svolgere importanti funzioni anche dove altri
organismi non riuscirebbero ad operare (come gli oceani).

È stato difficile isolare i virus poiché sono molto piccoli e passano attraverso i filtri per batteri; i ricercatori cercavano di
filtrare i batteri convinti che fossero gli
unici responsabili delle patologie,
furono scoperti i virus poiché
nonostante i batteri venissero filtrati la
patologia non cessava di nascere.
Furono poi visti anni dopo con la
microscopia elettronica. (Si possono
trovare anche virus più grandi di
batteri, ma sono rari e si incontrano
difficilmente).
CAPSIDE

Il virus in se è un acido nucleico che si trova inscatolato in un contenitore formato da proteine.

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Il rivestimento proteico del virus si chiama capside ed ha forme geometricamente regolari, questo perché: essendo le
proteine che lo costituiscono codificate dal genoma virale ed essendo una sequenza molto breve (codifica per poche
proteine), le poche proteine del capside per cui codifica vengono utilizzate in modo ripetuto.

La funzione del capside è quella di contenere e proteggere l’acido nucleico virale, che di per sé ha una struttura molto
vulnerabile, questo gli fornisce anche stabilità poiché gli acidi nucleici liberi di ripiegarsi su se stessi sono poco stabili,
anche dal punto di vista funzionale e del mantenimento delle informazioni.

Alcuni virus oltre al capside hanno una membrana di rivestimento derivata dall’ultimo ospite infettato, la cui struttura
dipende quindi dalla natura di questo ultimo ospite. Quindi su questa ci saranno proteine di membrana dell’ospite e
del virus. Questi virus sono in grado di dare luogo nella cellula eucariote ad una sintesi di proteina sia nel citosol sia nel
RER (per prodursi le proteine di membrana), questo dimostra quanto sono adattati ed adattabili al contesto cellulare.
Un virus esterno alla cellula circondato dalla membrana avrà delle proteine di membrana che servono al
riconoscimento dell’ospite.

Il virus deve entrare in un ospite: varcando una membrana cellulare, attivando la lisi di una membrana, per iniezione
dell’acido nucleico, oppure tramite meccanismi di endocitosi. Per questo servono meccanismi di riconoscimento tra
proteine di membrana della membrana virale e di quella cellulare; questo rende i virus degli organismi estremamente
specifici per un determinato ospite (quindi è possibile che in un organismo differente il virus non attui nessun
meccanismo) e anche da questo punto di vista è altamente evoluto, si è coevoluto con il suo ospite.

Infezioni virali:

La maggior parte dei virus (come anche dei batteri) non si interessa a noi, quindi non sono dei patogeni; almeno finché
non trovano modo di “adattarsi” al nostro organismo (dovrebbero quindi modificare o ampliare la loro specificità). Se
un virus non ha la capacità di intaccare le nostre cellule o di interagire con i nostri enzimi, per noi, non è altro che un
pezzo di acido nucleico la cui informazione resta latente.

Possiamo contrarre infezioni virali ad esempio per via aerea, in questo caso probabilmente il virus ha sviluppato la
capacità di provocare con la sua infezione dei sintomi nell’uomo che gli permettono la trasmissione per via aerea.
Quindi i virus nella loro interazione sono opportunisticamente capaci di sfruttare a loro favore caratteristiche del
nostro organismo.

A testimonianza della stragrande quantità di virus e delle molteplici vie di trasmissione virale (fin dal passato), oggi
notiamo delle sequenze virali nei genomi cellulari, specialmente degli eucarioti poiché meno soggetti a mutazioni.

(A differenza dei procarioti che si evolvono tramite mutazioni che se cadessero sul tratto virale non subirebbero danni;
gli eucarioti cercano di evitare le mutazioni, perciò un tratto virale che si insidia nel DNA eucariotico difficilmente verrà
mutato e probabilmente ne sarà mantenuta la funzione nelle generazioni).

Un virus che infetta un batterio potrebbe venire perso a causa di mutazioni casuali, queste non recherebbero nessun
danno al batterio poiché la mutazione andrebbe ad intaccare un frammento genomico estraneo a quello essenziale
per il procariota; se ciò non avvenisse il virus dopo aver sfruttato il batterio “a sufficienza” passa al ciclo litico
staccandosi dalla cellula ospite e liberando i prodotti della sua permanenza.

Negli eucarioti invece la situazione è molto diversa, perché: sono molto più lenti, ciò rende i tempi di permanenza
molto più lunghi; ma soprattutto perché tendono a “non buttare” per evitare qualsiasi tipo di mutazione che sia del
proprio genoma o di quello virale (la cellula chiaramente non fa distinzione tra i due, altrimenti non li utilizzerebbe
entrambi ugualmente).

Coevoluzione

La testimonianza è che queste sequenze virali integrate nel corso del tempo, probabilmente non in un essere umano
ma in un antico organismo da cui deriviamo, rappresentano la storia evolutiva che ha portato poi ad una determinata
specie. Tra queste sequenze virali integrate nel nostro genoma ci sono virus veri e propri (sequenze identificabili come

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virus) completamente funzionanti, entrati in una convivenza voluta dal virus, ma chiaramente non dalla cellula (per la
quale la relazione con il virus è sempre conflittuale).

Questo inserimento normalmente non produce danni, ovvero i virus che entrano nel ciclo lisogeno si inseriscono senza
danneggiare la cellula. Ma dipende dall’evoluzione del virus, poiché deve inserirsi in una posizione ben precisa di un
genoma se non vuole danneggiarlo (ne risentirebbe anche il virus essendo che la sua proliferazione dipende dallo stato
di salute dell’ospite); ad esempio in un batterio in cui il 90% del genoma è codificante, per inserirsi senza danneggiare
parte essenziale del genoma il virus deve essere molto specifico ed evoluto. Se lo distruggesse anzitempo finirebbe
distrutto. Perciò i virus si sono selezionati per inserirsi in un certo modo, molto specifico. Nel caso degli eucarioti
spesso si inseriscono in zone non codificanti senza creare danni, ma ciò non significa che la loro presenza sia
indifferente: possono comunque scatenare dei meccanismi, in un certo senso riarrangiano il genoma nella zona in cui
si inseriscono (ad es. ci sono virus oncogeni che possono attuare una trasformazione in senso neoplastico). Quindi
l’interazione con l’ospite è generalmente conflittuale.

Il virus cerca di restare dentro i genomi perché li è al sicuro: quando un virus si trova libero al di fuori di un genoma
ospite è estremamente fragile, tutto lo può danneggiare, qualche organismo potrebbe anche nutrirsene prendendo le
sue proteine e digerendo il suo acido nucleico.

La condizione all’esterno per il virus è quindi pericolosa, mentre all’interno della cellula ospite è protetto e si può
riprodurre, l’unico rischio che il virus incorre all’interno della cellula è una mutazione, che finirebbe per intrappolarlo
tra le miriadi di sequenze genomiche della cellula finché non sarà più un virus ma parte integrante del genoma
cellulare.

I virus si possono in questo contesto anche definire un motore dell’evoluzione, perché le sequenze virali che si
riproducevano dalle cellule utilizzavano l’energia di queste per costruire copie di se stessi. Erano favorite le cellule che
a seguito di qualche variazione o mutazione non riuscivano più a lavorare col DNA virale, così che questo fu il vero e
proprio motore evolutivo: la cellula continuava ad evolversi per mantenere la propria stabilità ed i virus lo facevano
per essere riconosciuti sempre meglio dalle cellule e continuare a sfruttarne il metabolismo. Molti virus sono stati
apportatori di geni alle cellule (non solo organismi “opportunisti”), tanto che noi utilizziamo moltissimi geni di origine
virale, come nella formazione della placenta gioca un ruolo fondamentale una proteina di origine virale. C’è quindi
stato uno scambio tra organismi viventi e virus.

TRASPOSONI

Nella storia di convivenza con i virus ci sono sequenze di derivazione virale che continuano ad esistere, non attive
come virus ma ancora attive per meccanismi come lo spostamento, e si dicono appunto elementi mobili. Sono parti di
virus domesticate, entrate a far parte del genoma da cui non possono uscire, non possono più formare particelle virali.
Queste sequenze sono risultato di un rapporto di convivenza, e questo ha permesso di sviluppare una grossa quantità
di meccanismi specifici di resistenza a questi organismi (per tenerli dentro senza che si attivino). Nonostante questo, a
volte si possono attivare spostandosi, e finendo in zone fondamentali del genoma dove possono creare danni (come
gravi patologie che derivano dall’interruzione di un gene da parte di uno di questi elementi mobili).

Elementi trasponibili (EVE = endogenous viral elements = elementi virali endogeni): sono sequenze di natura virale
diventate endogene, quindi non sono più virus completi, ma sono strutture funzionanti che possono duplicarsi ed
inserirsi ma non possono più dare luogo ad un virus vero e proprio. Questi sono i cosiddetti elementi trasponibili, sono

3
rimasti nei genomi come virus intrappolati che non potranno più essere attivati per raggiungere lo stato litico. Questi
elementi si possono muovere: i trasposoni sono sequenze che possono spostarsi lungo il DNA, si staccano e si
inseriscono da un’altra parte (ci sarà un’integrasi coinvolta nel processo).

Negli eucarioti i trasposoni sono meno importanti che nei procarioti, poiché un trasposone implica nuove sintesi e
riarrangiamenti genomici. Nelle cellule eucariotiche le sintesi di DNA avvengono raramente, mente avvengono molto
frequentemente le sintesi di RNA.

Infatti troviamo anche dei retrotrasposoni (ERV, sono particolari EVE), formati dall’infezione da parte di retrovirus.
Sono molto più importanti nelle cellule eucariotiche, perché possono agire sul fenomeno della trascrizione che avviene
continuamente nella cellula, e possono essere retrotrascritti in DNA dalla trascrittasi inversa (molto presente nella
cellule eucariotiche, probabilmente anche questa frutto di lunghe convivenze con genomi virali). Alcuni tipi di ERV
potrebbero oltretutto codificare per la sintesi dell’enzima trascrittasi inversa.
Questo RNA virale può essere quindi convertito in un filamento di DNA, che può a sua volta essere aggregato ad un
complementare per formare un doppio filamento di acido nucleico, ed infine può essere inserito nel genoma. Cioè
letteralmente questi ERV sono elementi in movimento che possono spostarsi in posizioni casuali del genoma.
Queste sequenze mobili sembra che si muovano casualmente, ma si pensa che in realtà ci sia un criterio alla base del
loro movimento: durante l’organizzazione nello sviluppo cerebrale c’è un grande movimento di elementi ERV, che
causa un costante riarrangiamento genomico, il che produce la diversità dei neuroni, la loro speciazione. Quindi se in
questo caso il processo di movimento fosse casuale porterebbe alla morte cellulare, invece i trasposoni producono un
effetto che ha un’utilità per l’organismo.

Un altro esempio è quello dello sviluppo della placenta:


Sincitina: proteina acquisita da virus, svolge un ruolo importante nella formazione della placenta. Serve al virus perché
si fonda con la cellula ospite (ruolo molto importante nell’infezione virale), quindi media una fusione di membrana. La
sincitina si è conservata molto, infatti media la formazione dello strato esterno della placenta in quanto dirige le cellule
della placenta a fondersi con le cellule dell’utero. È una proteina basilare, che se bloccata comporta la sterilità.
Sembra che la sincitina svolga ruoli importanti anche nella formazione del muscolo.
Tutti i mammiferi usano sincitina (in modo diverso perché porta alla formazione di placente diverse), ma per tutti è
una proteina assolutamente fondamentale.

L’uomo nell’evoluzione è riuscito apparentemente a bloccare la trasposizione di certe sequenze (es. gli elementi LINE1:
long interdispersed element, che sono ancora trasponibili nelle scimmie) e di altre no, come la sequenza Alu: queste
sono sequenze di un complesso molto importante.

Sequenze Alu: la sigla deriva da un enzima di restrizione batterico. Si intendono corte sequenze che vengono tagliate
dall’enzima di restrizione batterico Alu. Gli enzimi Alu sono delle DNAsi (enzimi di restrizione) che tagliano il genoma in
posizione specifica, in una certa sequenza.
(Il batterio che produce l’enzima non può tagliare il proprio DNA ma potrà tagliare un DNA estraneo).
Da quando sono stati scoperti questi enzimi di restrizione sono state fatte molte prove ed esperimenti nel tagliare
genomi; tagliando il genoma umano si è notata una reazione sorprendente: il genoma veniva completamente
spappolato, frammentato in pezzi piccolissimi; questo ha dimostrato che la sequenza bersaglio è presente una miriade
di volte (le sequenze Alu rappresentano circa il 10% del genoma). Queste sequenze derivano da un RNA cellulare 7S
che si trova nelle particelle SRP (strutture che portano il ribosoma ad agganciarsi al RE); c’è una sorta di trascrittasi
inversa nelle cellule che continua a retrotrascrivere quella sequenza in DNA, che le integrasi inseriscono nel genoma.
Le sequenze Alu sono sequenze brevi interdisperse (SINE: short interdispersed element), e sono entità che si
comportano come elementi mobili, sono perciò duplicabili ed inseribili. Si conserva ancora intatta la derivazione di

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queste sequenze, ovvero un RNA cellulare 7S che si conserva tra proteine che formano la particella SRP, particella di
riconoscimento del segnale: riconosce nella proteina in sintesi una certa sequenza di amminoacidi, blocca la sintesi, e
favorisce l’aggancio del ribosoma al RER dove poi inizierà la trascrizione conseguentemente al distacco della SRP.

Essendo che troviamo queste sequenze solo nell’uomo e nelle scimmie antropomorfe (sono sequenze raramente
esonizzabili: sono brevi e con molte sequenze di stop, è quindi molto raro che vadano a far parte di esoni), ed è ancora
attivo in queste specie, significa che la speciazione tra noi e la scimmia è probabilmente connessa a crisi geniche di
origine virale (essendo che tra l’altro queste sequenze sono sicuramente causa di elevata variabilità genica).

Esistono però sistemi che servono ad evitare l’espressione dei trasposoni:


Ci sono certi tipi di proteine come la KRAB-ZNF (proteina DNA legante con domini KRAB e zinc finger) che fungono da
difesa del genoma contro l’invasione da ERV, queste riconoscono l’acido nucleico e legano il DNA entrando nella
doppia elica (riconoscono specificamente un certo numero di basi).
Questa proteina ha un sistema di zinco che lega il DNA ed uno KRAB che è in grado di legare proteine; di queste se ne
sono sviluppate molte, ognuna capace di legare diverse sequenze di retrotrasposoni, e di bloccarne l’espressione.
Queste proteine sono i grado di legarne altre e così facendo modificano la conformazione della cromatina; un esempio
di proteina che vi si lega è la KAP-1: nelle cellule di mammifero, le KAP-1 partecipano al silenziamento genico, alla
crescita, al differenziamento cellulare, alla pluripotenza, alla trasformazione tumorale, all’apoptosi ed alla riparazione
del DNA.
La proteina KAP-1che è evolutivamente molto conservata, svolge un ruolo importante nell'organizzazione dinamica
della struttura della cromatina tramite la sua capacità di influenzare i pattern epigenetici e la compattazione della
cromatina.

BATTERIOFAGO (aka fago)

Una reazione virale tipica può essere quella di un batteriofago che inietta il suo acido
nucleico in un batterio le cui risorse iniziano a lavorare sul genoma virale, ma col tempo
inizierà la distruzione dell’acido nucleico batterico. Quindi come esito dell’infezione ci sarà
un’attivazione dei meccanismi litici della cellula che iniziano a distruggere il DNA batterico,
cosi il virus sarà a tutti gli effetti padrone della cellula, in quando questa agirà solamente
per quanto “scritto” sul genoma virale.
Le nuove particelle virali si assemblano tra loro senza necessità di ATP (proteine
monomeriche per formare strutture quaternarie), ma sfruttando l’energia dell’entropia
dell’acqua. Questo avviene perché la proteina si muove in acqua portandosi dietro
molecole di H2O che sono immobilizzate nella struttura proteica; nel momento in cui due
subunità si urtano liberano l’H2O immobilizzata e quindi aumentano l’entropia del sistema.
Due subunità si legano spontaneamente quando la superficie di contatto è grande a
sufficienza da creare un aumento di entropia dell’H2O notevole, cosi non c’è bisogno di sfruttare energia libera, ma
basta sfruttare un gioco di interazione tra superfici.
Questo fatto (proteine che agiscono a seconda della loro struttura e superficie) è proprio quello che permette di
distinguere una proteina utile e funzionante da una non funzionante e guasta, quest’ultima infatti deve essere
riconosciuta per poi venire distrutta, poiché una proteina con una struttura errata libera per la cellula è come una
“mina vagante” dato che potrebbe interagire con un substrato errato.

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Solo quando il batterio è pieno di virus avviene la lisi del batterio, perché il virus contiene geni la cui espressione nel
tempo è molto variabile, in questo caso c’è un gene che viene trascritto solo quando il batterio è pieno. Oltre a
messaggi di natura funzionale il virus quindi porta anche messaggi di natura temporale, cioè il processo di trascrizione
non avviene tutto insieme, ma c’è un gene che viene prodotto solo alla fine.
La cosa interessante dei batteriofagi è che il loro genoma è sfruttato al massimo: nel momento in cui il fago entra nel
batterio fa avvenire la sintesi delle sue molecole tenendo conto anche del fattore tempo, l’ultimo tipo di proteina verrà
sintetizzata solo quando il batterio si sarà riempito di fagi assemblati.
Ecco un’altra prova del fatto che il virus è un acido nucleico estremamente piccolo ma che contiene un’informazione
notevole, da questo punto di vista c’è un’informazione utilizzata al massimo livello, infatti il virus è un acido nucleico
che si è selezionato nel tempo evolvendosi e diventando sempre più efficiente.

Quindi, per quanto riguarda l’infezione da parte di un fago, ci sono due possibilità:
1- l’acido nucleico entra nel batterio, se è lineare viene ciclizzato (perché così può essere duplicato continuamente e
non se ne perdono pezzi, come avviene con i telomeri), viene trascritto e tradotto per poi distruggere il batterio e
liberare nuovi fagi.
2- l’acido nucleico può entrare ad integrarsi nel cromosoma batterico.
Sostanzialmente questo dipende dallo stato metabolico del batterio (salute del batterio). Quindi, se il batterio è in
buona salute il virus si integrerà nel genoma batterico non attivando il ciclo litico, continuando solamente a sfruttare le
funzioni vitali del batterio (il genoma virale oltretutto porterà alla sintesi di molecole che eviteranno l’infezione dello
stesso batterio da parte di altri virus).
Nel momento in cui le cose dovessero “andare male” nel batterio l’integrazione del virus cesserà, il virus abbandonerà
il cromosoma batterico ed attiverà i meccanismi di lisi che porteranno appunto all’attuazione del ciclo litico virale. Cioè
in maniera opportunistica il virus “abbandona alla nave che sta affondando” dando il colpo di grazia al batterio.
Quindi, l’attivazione dello stato lisogeno ed un conseguente passaggio allo stato litico saranno determinati dalle
condizioni in cui si trova la cellula ospite.

Il batteriofago entra iniettato nella cellula ospite, ma altri virus (che possono essere quelli che infettano gli eucarioti)
possono avere varie modalità di accesso all’interno della cellula da infettare:
-endocitosi: il virus possiede una membrana di derivazione cellulare con complessi proteici di membrana che vengono
riconosciuti da quelli della membrana dell’ospite; questo attiva un processo di fusione cellulare per cui le membrane si
fondono ed il capside con il suo contenuto si trova libero all’interno del citoplasma eucariotico, in cui il capside sarà
demolito (da un fagolisosoma) e l’acido nucleico di libererà.
-fagocitosi: il virus interagisce con la membrana, entra sotto forma di corpo estraneo nella cellula, viene chiamato in
causa il lisosoma che andrà a digerire il complesso proteico del capside.
-internalizzazione tramite vescicole: se il virus è senza capside viene internalizzato all’interno di una vescicola fornata
dalla membrana cellulare che all’interno della cellula lascerà uscire il genoma virale.
Quindi l’internalizzazione di un virus nel genoma di un eucariota è un processo altamente specifico, guidato e

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controllato; si basa sempre su meccanismi di riconoscimento e controllo nell’interazione tra virus e cellula tramite le
proteine.

Se il virus all’interno della cellula riesce a mutare per andare ad interagire completamente col genoma eucariotico può
verificarsi un salto di specie virale, perciò può accadere che non produca danni al genoma eucariotico, e che quindi
non si noti la sua presenza, finché non si attiverà il suo ciclo litico. Pertanto questo tipo di infezioni possono essere
molto gravi.

Virus a DNA e ad RNA

Un virus porta un acido nucleico che può essere DNA o RNA, quindi a singola o doppia elica. In entrambi i casi
abbastanza piccoli (>2000ntd), ma ci sono virus con quantità piuttosto elevate di acido nucleico e genomi molto più
complessi, ma sono comunque virus perché non hanno un proprio metabolismo.

RETROVIRUS

Ci sono virus a RNA, che sono una componente minoritaria, ma sono molto importanti poiché sono molto attivi
specialmente nei sistemi pluricellulari: riescono con più facilità ad infettarli. Le cellule di un organismo pluricellulare in
grande parte non si dividono, e non avvenendo la duplicazione attiva, un virus a DNA farebbe fatica ad intaccare il
genoma. Un virus ad RNA trova molta facilità essendo che, in una cellula ferma dal punto di vista duplicativo (e quindi
attiva dal punto di vista della sintesi proteica) verrà continuamente sintetizzato RNA.
Questo virus, portandosi la trascrittasi inversa già posizionata sull’acido nucleico virale, non appena entrerà nell’ospite,
potrà stabilizzare il proprio genoma in DNA e ciò gli consente di inserirsi in tutte le possibilità all’interno del genoma.
Avere la trascrittasi inversa già posizionata porta anche dei rischi: la molecola di RNA in questo modo entrando nella
cellula ha una possibilità altissima di essere distrutta o danneggiata (questo rende l’infezione una “gara”).
I retrovirus sono molto importanti dal punto di vista di patogenicità nel nostro caso: l’infezione dell’ospite è un gioco di
proteine, dipende quindi da meccanismi di aggancio e riconoscimento di forme e complessi tra le proteine virali e
quelle dell’ospite. Se il virus, a seguito di una mutazione, non può più riconoscere le proteine dell’ospite o non può più
essere riconosciuto, comincerà a perdere il suo potere infettivo (il livello di patogenicità del virus si attenua); questo
porta ad avere tra le generazioni virali una sempre minor efficacia patogena e quindi le successive infezioni saranno
sempre meno gravi per l’ospite.
È questo meccanismo che porta la popolazione infettata a mantenere forme virali inattive o attenuate, da qui inizia ad
instaurarsi un rapporto di convivenza.

(Più un virus è letale più tenderà a scomparire


piuttosto che attenuarsi, poiché tende ad uccidere
l’ospite prima di poter creare un rapporto di
convivenza dato dalla sua attenuazione)
(Schema retrovirus slide, immagine vecchia e non
molto corretta ma fa capire bene come sono
disposte le componenti retrovirali)

Un retrovirus è un virus a RNA che, come ad


esempio il virus HIV, può avere una membrana di
rivestimento esterno umana che deriva dall’ultimo
ospite che gli permette di infettare una cellula
umana senza essere riconosciuto come elemento estraneo. Cosi la membrana virale si andrà a fondere con la
membrana umana (interazione proteica).
Nel caso specifico dell’HIV gli organismi virali non avranno la capacità di interagire con ogni cellula umana, ma
specificamente con alcune che hanno certi recettori sulla superficie, come i linfociti T helper (svolgono il
coordinamento del sistema immunitario).

In generale la cellula eucariotica di un organismo pluricellulare reagisce all’infezione virale attivando meccanismi di
autodistruzione (apoptosi = morte cellulare programmata e regolata) che si sono evoluti specificamente anche per
debellare infezioni virali. Il processo apoptotico comporta la distruzione del DNA della cellula, quindi il virus
inevitabilmente verrà distrutto.

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Tornando all’esempio dell’HIV:
I linfociti T helper colpiti da HIV quindi avvieranno il processo di
apoptosi cosi che il virus verrà distrutto; ma la morte dei linfociti
provoca la patologia di immunodeficienza, infatti tra i tentativi
farmacologici di debellare le conseguenze dell’infezione da HIV c’è
quello di bloccare l’avvio dell’apoptosi nei linfociti T helper poiché, se
non portasse alla perdita dei linfociti, il virus HIV non produrrebbe
grossi danni; in un certo senso perché siamo “abituati” a convivere con
dei retrovirus. Il problema è che l’elevata specificità del virus HIV nei
confronti dei linfociti T helper fa sì che tutte le particelle virali si
concentrino su di essi (che tra l’altro non sono una grande
popolazione).

Una volta all’interno questo acido nucleico virale deve essere ricopiato
in DNA: entrerà nel nucleo, la trascrittasi inversa che lo copierà in DNA
(se questa non funziona bene verrà semplicemente distrutto). L’RNA
virale però per essere ricopiato in DNA deve prima entrare nel nucleo e
per farlo deve superare sofisticati sistemi di riconoscimento; li supera venendo riconosciuto come particella “familiare”
che deve entrare nel nucleo.
(anche questo è il risultato di un complesso processo evolutivo. Molti di questi processi si sono scoperti studiando
virus, perciò non è chiaro se i virus nell’evoluzione si siano impadroniti di meccanismi cellulari o se, viceversa, questi
meccanismi siano di origine virale).

Il DNA (o RNA per un retrovirus) virale è portato


dentro il nucleo, dove verrà trascritto in RNA; questo
DNA virale si potrà inserire nel genoma (come spesso
avviene) e così l’infezione risulterà
momentaneamente sospesa, oppure può restare
libero ed attivo continuando a trascrivere RNA virale.
Le molecole di RNA virale trascritte devono poi uscire
dal nucleo, ed anche questo è un processo altamente
guidato e non scontato per una molecola estranea alla
cellula (considerato che spesso ci sono RNA
appartenenti alla cellula che non vengono riconosciuti
e quindi non escono dal nucleo); perciò l’RNA virale
riesce ad interagire con i meccanismi di trasporto
dell’RNA che lo riconoscono come una sequenza da
portare fuori. Dopodiché l’RNA fuori dal nucleo deve
essere oltretutto riconosciuto da proteine contenenti
sequenze segnale capaci di legare il ribosoma al RE;
ciò porterà alla produzione di proteine virali che
tramite l’interazione di vescicole si vanno a fondere
con la membrana, così che nel momento in cui verrà
esocitato il virus ci saranno tratti di membrana con
proteine virali che saranno responsabili dell’infezione
di un altro ospite.
(il virus ha geni che producono proteine di membrana
dai ribosomi del RER, così che queste restino sulla
membrana del virus man mano che le particelle virali
gemmano dalla cellula)

Quindi l’infezione virale è un meccanismo di estrema compatibilità e di estrema evoluzione, perché ci sono meccanismi
complessissimi che devono funzionare con estrema efficienza.

Integrasi: enzimi per integrare il DNA virale nel genoma cellulare. Si è cercato di studiare come integrare del DNA in un
genoma, ma l’unico modo trovato è stato quello di impiegare dei virus, il problema è che si inseriscono dove vogliono
loro.

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Non è facile capire come funzionano le integrasi, probabilmente dipende dallo stato della cromatina. Poiché le
integrasi sono proteine queste riconoscono sequenze. Il loro utilizzo pertanto può essere pericoloso.

Ci sono dei virus che non possono dare luogo allo stato lisogeno, ma solo al ciclo litico. Come il virus dell’influenza, che
non può depositarsi in noi (a volte può farlo in una particolare forma, che però non è il vero virus); questo contiene
piccoli RNA separati e quando infetta una cellula non può entrare in stato lisogeno perché l’inserimento di piccole
molecole nel genoma sarebbe un inserimento randomizzato visto che si andrebbero a posizionare sparse in più luoghi,
ciò renderebbe impossibile riformare la particella virale dopo l’inserimento.
L’influenza dà luogo ad una manifestazione litica importante; finché si manifesta infezione l’individuo è portatore di
virus, quando questa cessa il virus non c’è più.

Nell’interazione tra un virus ed un ospite ci può essere una trasformazione in senso oncogeno (es papilloma virus), si
attiveranno quindi meccanismi che spingono la cellula a proliferare. I virus oncogeni sono virus che vanno in cellule
ancora in grado di proliferare; possono provocare una reazione in senso neoplastico, quindi di fatto sono stimolatori
del processo di duplicazione (come virus che sono in grado di riattivare i processi dei telomeri).
Ma ci sono meccanismi di difesa dall’impazzimento di questi meccanismi cellulari, come appunto quello dei telomeri
che si accorciano rendendo la cellula destinata a morire, infatti alcuni organismi virali allungano i telomeri (proprio per
questo i virus più evoluti vanno a colpire questo meccanismo).

I virus che non possono entrare in ciclo lisogeno daranno quindi luogo ad un’infezione molto acuta ma di breve durata.
Oppure ci sono altri virus che danno luogo ad infezione lenta e molto duratura, questo vuol dire che l’interazione del
virus con l’ospite non è a favore del virus; così l’ospite diventerà un produttore lento di virus che si spargeranno
nell’organismo.
Oppure si può verificare un’infezione latente nel caso di un virus integrato nel genoma, per cui non c’è nessuna
manifestazione dell’infezione, ma il virus si può riattivare (es herpes) in qualunque momento, in risposta a stimoli o
stress dando manifestazioni improvvise, per poi tornare inattivo e manifestarsi nuovamente all’arrivo di un nuovo
stimolo.

STRACAZZATA INUTILE

È stato fatto un esperimento con un computer inserendo nel pc una sequenza che si potesse duplicare cosi che questa
funzionasse, il computer era isolato (no internet), questa sequenza si è duplicata autonomamente e la memoria si è
riempita, ma la sequenza iniziale non c’era più ma c’erano lunghe sequenze molto più complesse. Questo per dire che
un sistema autoduplicante, nel mondo informatico continua ad aumentare di complessità, un po’ come accade nel

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mondo biologico. Nel sistema però non c’erano solo le lunghe sequenze duplicate, ma anche delle sequenze più brevi
“parassiti” che facevano parte del meccanismo evolutivo. Lo schema emerso da questo è stato come un albero
evolutivo, con sequenze lunghe che continuavano a duplicarsi ed altre brevi parassita che intralciavano la duplicazione,
ogni tanto emergevano nuovi rami ed alcuni altri si fermavano (come estinzione), perché le sequenze accumulavano
errori, oppure una sequenza breve che veniva duplicata troppo finiva per interrompere la lunga, farla scomparire, e poi
finiva anch’essa (la corta) per scomparire. Tutto questo di fatto ricorda ciò che potrebbe essere avvenuto con gli acidi
nucleici nella storia. Questo ci fa pensare che i virus potrebbero essere organismi attivi nell’evoluzione. L’ospite del
virus viene selezionato in base alla sua capacità di difendersi.

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STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE

LEZIONE 7

20/11/2017

- Il filamento intermedio è formato da proteine lunghe, le lamine sono un tipo di proteine, la polimerizzazione
avviene mediante deboli interazioni tre le superfici di queste proteine che vanno a formare delle strutture
sempre più grandi, che prendono il nome di filamenti intermedi.
- La disgregazione avviene mediante fosforilazione, una lamina interna aggancia la cromatina, nel momento in
cui la cellula si dividerà le proteine della lamina andranno incontro a un processo massiccio di fosforilazione;
questo disorganizzerà la lamina nucleare perché le proteine si respingeranno anche tra di loro, molte di esse
sono associate alla membrana o legate strettamente a proteine di membrana.

- Tutta la membrana nucleare si disorganizza, si frammenta in microvescicole che poi si riformeranno alla fine
della mitosi. Quando i cromatidi saranno arrivati ai poli opposti della cellula, ma già mentre viaggiano,
cominciano ad essere ricoperti da quelle piccole vescicole che contengono delle parti di nucleo perché nella
Anafase quando i cromatidi migrano la fosforilazione verrà rimossa e si riformerà un’altra volta la membrana
nucleare; la cromatina verrà poi depolimerizzata, si riformeranno i ??? [colpo di tosse di Riccardo Bacchini]. In
realtà è un processo molto complicato che deve avvenire con precisione assoluta, anche perché i cromosomi
all’interno occupano una serie di posizioni ben definite.

All’interno del nucleo togliendo gli acidi nucleici e dissolvendo la membrana si otterrà una sorta di scheletro
filamentoso. Il DNA all’interno del nucleo è quindi appoggiato a una sorta di nucleoscheletro.

• NPC (complessi dei pori nucleari)

Il poro è un grande complesso di proteine. Le proteine principali che lo costituiscono sono chiamate NuP (proteine del
nucleo). I pori sono strutture geometriche abbastanza interessanti. Non sono tutti uguali tra di loro. Anche nel numero
delle proteine, che non intervengono di solito contemporaneamente. I pori hanno una struttura di base simile con
molte diversità, ovvero non sono tutti uguali tra loro. La loro disposizione nella membrana nucleare dipende
dall’organizzazione del DNA, quindi sono strutture assemblabili.

Le Nup sono molto conservate: servono a fare delle strutture molto comuni tra gli eucarioti. Ci sono delle famiglie di
Nup, e si diversificano anche per dimensioni. Sono proteine in grado di polimerizzare e formano la struttura del poro,
ovvero un doppio anello che sporge da un lato e dall’altro e formato da alcune Nup. Oltre alle Nup ci sono anche altri
tipi di proteine.

• La funzione del poro è quella di isolare quasi completamente il nucleo rispetto al citoplasma, ovvero i pori della
membrana si possono chiudere. Quando i pori sono chiusi il nucleo è quasi isolato, solo piccolissime molecole
possono attraversare liberamente.
• Il poro è mantenuto anche in termini evolutivi: nell’ambito degli eucarioti i pori della membrana nucleare hanno
delle strutture assolutamente comparabili; un po’ diversa è la composizione delle proteine.
• Come si formano i pori: Zone del reticolo endoplasmatico diventano parti della membrana nucleare che quindi è
una specializzazione, una parte del reticolo. Si fondono insieme le membrane dei due foglietti del reticolo, che è
una struttura cava con un lume interno. Questa fusione di membrane è un gioco di proteine, in particolare la Nup
53 sembra svolgere un ruolo chiave legandosi in certe regioni e fa cambiare forma alla membrana, spingendola
verso la parte inferiore in corrispondenza della quale ci saranno altre Nup 53 coadiuvate da altre proteine per cui
le due membrane di questa struttura cava che è il reticolo endoplasmatico verranno avvicinate insieme e fatte
fondere, formando delle zone in cui si assemblerà il complesso delle Nup e altri tipi di proteine che andranno poi
a costruire il poro.
• Il poro è una struttura dimensionalmente enorme, formata da tanti tipi di proteine. Non è una struttura standard,
sono differenti a seconda della molecola che deve passare, per esempio una molecola di mRNA in uscita, o alcune
proteine in ingresso o subunità ribosomiali. Mutazioni a livello di elementi costitutivi del poro hanno un impatto
notevole sulla funzione della cellula.
• I pori regolano il traffico nucleo-citoplasma, che in ingresso verso il nucleo riguarda essenzialmente le proteine,
che sono sintetizzate fuori dal nucleo e poi entrano attraverso i pori. Gli RNA invece escono dal nucleo. Nella zona
specializzata della membrana abbiamo nella parte del lato esterno (??? Nuclear ??) ci sono vari tipi di proteine,
essa è reticolo endoplasmatico a tutti gli effetti infatti si possono legare i ribosomi sul lato esterno. Le proteine
sintetizzate posso finire nello spazio perinucleare. Dal lato interno è molto più ricca la concentrazione di proteine,
dove c’è tutto il rivestimento di lamìne e altri tipi di proteine di membrana associate alle lamine.

Quando avverranno le fosforilazioni il complesso, il nucleo tenderà a disassemblarsi.

• La funzione della lamina è ancorare la cromatina formando associazioni LAD (lamina associated domain= domini
di cromatina associati alla lamina). Una parte importante di cromatina è associata alla lamina nucleare. Sono
proteine conservate, svolgono un ruolo a tantissimi livelli inclusa regolazione di attività dei geni. Se dispongo male
la cromatina verso il nucleo, non compio la corretta associazione, il processo di funzionamento dei geni ne verrà
alterato, anche perché è organizzato in maniera ordinata.
• I componenti svolgono un ruolo anche nel processo di trascrizione, cioè l’organizzazione della cromatina regola la
trascrizione. Quando la cellula compie la mitosi e si riassembla la membrana nucleare si compie un processo che
prevede il riposizionamento dei pori della membrana nucleare e la riorganizzazione della cromatina in maniera
ordinata. Entrando da un poro si raggiungeranno certe zone di cromatina in maniera preferenziale rispetto ad
altre, come se a livello del nucleo ci fosse un sistema viario, non è la stessa cosa entrare da una parte o dall’altra.
• La disposizione della cromatina dentro il nucleo è variabile, può essere modificata cambiando grado di
specializzazione della cellula e espressione genica ecc. Cambiamenti drammatici avvengono quando avviene la
mitosi, come quando la membrana nucleare viene disassemblata ovvero avviene la disgregazione di un gran
numero di complessi. Le proteine dei pori si trasferiscono nei cinetocori, quindi svolgono ruoli supplementari in
relazione all’ancoraggio dei cromatidi e al distacco dei cromatidi durante la mitosi. Alla fine, verranno rimontati.
La membrana separata in tante vescicole mantenute separate per il fatto che il fosfato è legato, quando inizia
l’anafase [altro colpo di tosse] molecolari.
L’anafase inizia con una fase di defosforilazione. La fosforilazione viene bloccata, i complessi di chinasi che vanno
a fosforilare sono inattivati e quindi andrà avanti solo la defosforilazione. Il cromosoma si spezzerà in cromatidi, i
cromatidi cominceranno a migrare portati dalle fibre del fuso e mentre ciò avviene questo insieme di piccole
vescicole tenute separate dall’alto grado di fosforilazione staccando il fosfato si cominceranno ad assemblare sia
tra di loro sia con la cromatina dei cromatidi che migrerà verso i vari pori. Quando si raggiungono i pori opposti si
riforma la membrana nucleare, ma tutti gli elementi erano già lì presenti.
• Inizialmente si pensava che i pori fossero tutti uguali strutturalmente, e che per trovare pori diversi fosse
necessario considerare un diverso nucleo o cellula o organismo. In realtà anche nella stessa cellula possono
esserci pori diversi tra di loro. L’assemblaggio e le proteine del poro sono legati alla funzione; hanno un ruolo
importante nell’organizzazione tridimensionale del genoma. I pori e la cromatina sono associati non a caso, la
formazione dei pori è legata al tipo di cromatina che si trova in quella regione. La cromatina non è come si
immaginava, un materiale libero all’interno del nucleo disposto a caso: nel nucleo è disposta in maniera ordinata.
• Attraverso i pori le sostanze possono entrare e uscire mediante la loro apertura, dovuta all’interazione tra
proteine e il trasporto avviene mediante intervento di complessi di proteine, le esportine (trasporto
generalmente di RNA) e le importine (trasporto generalmente di proteine dal citosol all’interno del nucleo). Il
trasporto richiede consumo di energia, ovvero è necessario un legame di importina o esportina con una proteina
che possiede un composto ad alta energia, la GTP. Il complesso legherà la struttura molecola da portare (cargo).
Le proteine sono GTPasi della famiglia Ran. Molte funzioni complesse della cellula sono legate allo stesso tipo di
informazione con un po’ di modificazioni. Funzioni complicate come ad esempio assemblaggio del citoscheletro
ecc. in realtà dipendono in materia stretta da una grande famiglia di proteine e enzimi con attività di GTPasi
ovvero in grado di idrolizzare il GTP. Queste GTPasi hanno un comportamento diverso dagli altri enzimi, i quali
legano il substrato modificandolo e liberando il prodotto. Questo comportamento deriva da enzima ancestrale
che è all’origine di questa grande superfamiglia. Questa GTPasi ha il GDP legato che è una parte del prodotto che
non viene liberato finchè la proteina della famiglia Ran interagisce con un GEF (GTP Exchange Factor) , che può
essere una proteina o tRNA (nel caso di sintesi proteica. Il complesso cambia forma e cambia nucleotide (da
difosfato a trifosfato), espelle il GDP e si legherà il GTP. Il complesso lega quindi un’esportina che cambierà
geometria e legherà il cargo (possono essere proteine o molecole RNA o tRNA), forma un complesso
multiproteico che interagisce in modo specifico con il poro che ne determina l’apertura. Dopo l’ingresso del
complesso c’è idrolisi di GTP (lo stimolo per l’idrolisi avverrà nell’attraversamento dei pori), cioè il cargo è liberato
e i trasportatori devono uscire. Una parte di fosfato viene liberato e il GTP resta, l’enzima cambia forma, la stessa
cosa avviene per l’importina, il cargo si trova libero e resterà a svolgere le funzioni all’interno del nucleo.
Il processo di trasporto è altamente organizzato e richiede complessi di proteine che si assemblano tra di loro in
base a complementarietà di forma. Una forma errata può mettere a serio rischio le funzioni della cellula.
• La presenza del nucleo e dei pori costituisce una barriera: il nucleo può entrare in contatto con elementi esterni
ma ciò è regolato; c’è quindi una separazione della cromatina dall’ambiente esterno. All’interno del nucleo
trascrizione, sintesi di RNA che imprigionati dalla struttura del nucleo possono andare incontro a processi di
maturazione. Ciò non avviene nel procariote dove il processo avviene velocemente. All’interno non c’è la
possibilità di sintesi di proteine: anche se ci sono le subunità ribosomali e gli mRNA non posso iniziare costruzione
di proteine perché le subunità non funzionali
• Ogni evento di attivazione genica non interessa un solo gene: i complessi di proteine di regolazione del processo
di trascrizione, i fattori di trascrizione, sono in numero minore di quello dei geni. Quindi un gene è attivato da una
combinazione di fattori di trascrizione. Una certa combinazione può attivare più geni, un evento di trascrizione
interessa diverse decine di centinaia di geni. Si formeranno più molecole di RNA che matureranno nel nucleo ma
potrebbero non fuoriuscire, senza avere il prodotto proteine.
La presenza del nucleo consente quindi una grande regolazione.
• Il DNA nel nucleo è organizzato sotto forma di cromatina. Il DNA è un acido desossiribonucleico, acido per la
presenza di fosfato. È salificato in quanto è legato con proteine basiche, gli istoni. Una funzione è neutralizzare le
cariche negative del DNA. Un DNA denudato, privo di proteine, tende a diventare instabile. A seconda del livello di
composizione tenderà ad aprirsi all’aumentare della temperatura.

• La cromatina è organizzata in
eterocromatina ed eucromatina. L’eterocromatina è
molto addensata, inattiva dal punto di vista di
trascrizione (al contrario dell’eucromatina):
impedisce l’ingresso degli enzimi che operano la
trascrizione. Nel nucleo la cromatina è in condizione
dinamica e ciò ha una funzione importante anche
nei processi di trascrizione.

• I cromosomi occupano dei territori ben definiti, all’interno del nucleo ci sono Domini topologici, ovvero sono una
modalità di aggregazione della cromatina secondo un’organizzazione tridimensionale. Essi sono mantenuti nel
corso dell’evoluzione, ovvero l’assemblaggio è sostanzialmente simile indipendentemente dal tipo di organismo.
Diverso da un organismo all’altro possono essere invece le anse dei geni di un certo dominio.
I moduli funzionali sono l’equivalente dell’operon dei batteri.
• Il DNA nel nucleo è
solitamente presente nella forma
B, con le basi appaiate disposte in
maniera ortogonale rispetto asse
dell’elica. Non è unica struttura del
DNA, esiste anche la forma A in cui
c’è un filamento con spessore
costante e le basi sono inclinate
rispetto l’elica. Queste due forme
dipendono da motori molecolari
(proteine). La struttura è a doppia
elica ma la geometria è diversa.
La transizione dalla forma B ad A
comporta delle variazioni
significative in termini di
trascrizione, perché il DNA non è
più attivabile. In entrambi i casi
l’avvolgimento è destrorso.
Un’altra struttura (forma Z) ha
invece l’avvolgimento sinistrorso.
Complessi di proteine modificano il
verso di avvolgimento, motori
molecolari ATP-dipendenti, che
utilizzano energia liberata da
idrolisi di ATP come energia
conformazionale, cambiano forma
e compiono movimenti. Essi sono
guidati da grandi RNA che vanno a posizionarli in certe regioni. La variazione dell’avvolgimento dell’elica implica
che alcune basi vengano spostate all’esterno, che sono quindi esposte e più facilmente danneggiabili. Quindi
modificando la struttura tridimensionale si possono togliere dalla funzione delle parti di genoma. Ciò potrebbe
avere un ruolo importante nella regolazione del DNA. Ciò avviene anche nei batteri il cui DNA può essere
compattato per togliere dalla funzione certi operon.
• Il nucleosoma è un complesso tra DNA e proteine basiche dette istoni. Essi sono proteine piccole. L’Istone H1 (la
H identifica la parola istone In inglese) è il più grande, 17000 di peso molecolare, circa 200 amminoacidi. Esso non
fa parte del nucleosoma. Svolge diverse funzioni, tra cui avvia processi di polimerizzazione a livello della
cromatina. Gli altri istoni (H2A, H2B, H3, H4) sono invece più piccoli, poco più di 100 amminoacidi.
La cromatina degli archea è formata da solo due tipi di istoni organizzati in tetrameri, H3 e H4, i quali sono i più
antichi. H2A e H2B sono invece più recenti e presenti solo negli eucarioti.
• L’istone è una proteina altamente conservata, c’è una minima variazione tra un organismo e un altro. L’istone H4
è il più piccolo (102 amminoacidi), la sua sequenza nell’essere umano e nel fagiolo differisce per solo 2
amminoacidi. Sono proteine conservate perché avendo un ruolo importante nell’organizzazione della cromatina
sono poche le mutazioni che si possono tollerare. Cambiando la proteina l’ottamero non si assembla più non ha la
struttura giusta e il sistema intero non funziona.
La formazione del nucleosoma avverrà intorno ad H3 e H4 che si assemblano poi H2A e H2B si uniscono
successivamente.
• La struttura della cromatina è DNA avvolto per due giri intorno a un ottamero di istoni, l’istone H2A e H2B, due
istoni H3 e due istoni H4. Gli istoni hanno tratti ad alfa elica (core) e una coda (possono essere anche due), ovvero
una struttura lineare di fino a 50 amminoacidi, che sporgono dalla struttura. Tutti gli istoni hanno carica si segno +
perché sono basiche per via dei gruppi amminici. L’assunzione di questo tipo di struttura è guidato, non si
assembla spontaneamente. Si immaginava che la spaziatura tra nucleosomi fosse di un certo numero di
nucleotidi, in realtà questo numero è variabile, cosi come la disposizione, il numero di nucleosomi, il tipo di
posizione ecc. Quindi la struttura della cromatina non è regolare come si pensava. Essa è anche modificabile:
durante il processo di trascrizione si assembla sul promotore un complesso di proteine, fattori di trascrizione e
RNA polimerasi. Perciò è necessario spazio sul DNA, quindi vengono rimossi dei nucleosomi. Ovvero se non
vengono rimossi non può avvenire la trascrizione.
• I nucleosomi possono anche variare nella composizione in istoni. La composizione media è di 4 classi ma ci sono
delle varianti istoniche: ad esempio nel centromero dei cromosomi c’è una variante di H3 indicata con CENH3 che
dà luogo a una strutturazione della cromatina con nucleosomi legati a tetrameri di istoni.
• Il ‘filo’ può essere più o meno condensato, in base alla polimerizzazione della cromatina. L’aggregazione dei
nucleosomi in strutture sempre più compatte è legata alla formazione del cromosoma perché si dovrà poi
suddividere l’informazione in due parti uguali.
Il cromosoma di 30 nm sembra essere un artefatto, la struttura potrebbe essere differente, di natura frattale,
tenuta insieme da proteine dette condensine. La struttura è difficile da studiare a causa delle sue dimensioni e si
pensa sia una struttura più complicata di come appare.
• La cromatina fortemente addensata è definita eterocromatina, la cromatina meno addensata (eucromatina) è
invece attiva dal punto di vista trascrizionale perché raggiungibile dalle proteine. La modalità di organizzazione
della cromatina nel nucleo riflette la possibilità di attivare geni, ovvero legata a specializzazione del tessuto. Sotto
forma di eterocromatina ci sono tutte quelle zone di genoma momentaneamente non necessarie. E’ quindi una
modalità di regolazione.
Quando avviene la separazione tra le cellule della linea germinale e somatica ciò che avviene è l’inattivazione dei
geni che consente l’esecuzione della meiosi nelle cellule somatiche. Questa inattivazione può avvenire sotto
forma di eterocromatina oppure modificando la geometria.
Una eterocromatina particolare è il corpo di Barr, uno dei cromosomi X che viene disattivato nel sesso femminile.
Ciò avviene perché c’è una differenza di quantità di geni tra X e Y, quindi la quantità in più nell’X viene inattivata.
Il processo di inattivazione è randomizzato, quindi due gemelle monovulari possono avere differenze a livello
dell’eterocromatina.
• La struttura tridimensionale dei cromosomi deve essere organizzata in un certo modo. Ci potrebbero essere degli
stati di patologia legati ad alterata distribuzione della cromatina in un nucleo. L’attivazione genica e anche la
trascrizione dipendono in maniera stretta da com’è organizzata la cromatina.
• I cromosomi occupano dei territori ben definiti. È possibile riuscire a renderli colorati andando a costruire sonde
fluorescenti che riconoscano certe regioni che si trovano solo su quel cromosoma e non su altri. La disposizione
dei cromosomi è ordinata all’interno dei nuclei e non casuale, ci sono dei territori ben definiti. C’è un certo
dinamismo all’interno del nucleo perché i cromosomi hanno un margine di movimento. La posizione dei
cromosomi del nucleo cambia e ciò è legato ad altri tipi di funzioni come la riparazione del DNA. Se c’è un
avvolgimento alterato ci potrebbero essere delle patologie a causa di geni indesiderati.
• La cromatina è ancorata alla membrana e anse di cromosomi si dirigono verso l’interno. Il DNA è manipolato da
grandi complessi di proteine La cromatina è legata grazie alla coesina, in grado di abbracciare i doppi filamenti di
DNA e in grado di organizzare i domini. Sono una sorta di ‘memoria’ perché riposizionano i fattori di trascrizione
in certe regioni.
• I domini topologici (zone accessibili di eucromatina circondate da eterocromatina), le anse di DNA di cromosomi
diversi si trovano vicini grazie ad esse che andranno incontro a un processo di trascrizione insieme. Esistono geni
di co-trascrizione, che prendono il nome di Moduli funzionali. Sono l’equivalente tridimensionale dell’operon
(un’entità di geni che sono trascritti insieme e tradotti insieme) dei procarioti, che è lineare. Un esempio di
modulo funzionale è il ribosoma, costituito da rRNA e un’80ina di proteine. Mentre si sintetizzano gli rRNA nel
nucleolo si attivano quei geni sparsi nel genoma e si formano gli mRNA che andranno nel citosol, poi si
assemblerà il ribosoma che avviene quindi co-attivando insieme alcuni geni.
• La struttura della cromatina è detta a collana di perle, ogni nucleosoma è come se fosse una perla. Occupa un
volume abbastanza grande. La rimozione delle perle, degli ottameri di istoni, come si verifica nella formazione
dello spermatozoo, consente di ridurre le dimensioni di quel gruppo in maniera drastica. In certi casi quel nucleo
può arrivare ad essere anche un quarantesimo del nucleo originale della cellula di partenza.
• L’organizzazione in cromatina è legata strettamente al differenziamento della cellula. Negli studi l’interesse verso
le cellule staminali embrionali si è in parte modificato e in parte diminuito perché si riesce a riportare a staminali
delle cellule differenziate. Se vado a comparare una cellula staminale con una cellula differenziata, la cellula
staminale ha un nucleo con dell’eterocromatina (ma è meno di quella che c’è in quella più matura). Nelle cellule
differenziate (somatiche) il nucleo dà luogo a un’organizzazione molto stabile: i pori sono ben posizionati, la
struttura del nucleo è abbastanza regolare e la cromatina è organizzata in LAD. Quindi in un nucleo di una cellula
differenziata c‘è una situazione stabile perché i geni sono posizionati in maniera tale da essere attivabili. Più la
cellula è differenziata più la struttura diventa invariabile. Al livello di cellule staminali (zigote) il nucleo è molto
grande perché l’eterocromatina è quasi assente (è depolimerizzata). Nella cellula differenziata c’è molta
eterocromatina.
È diversa anche la lamina: la lamina nucleare c’è ma non è strutturata in maniera adeguata, manca la lamìna A. Lo
stesso spazio perinucleare e la forma nucleare sono molto incerti: i pori non sono ben collegati con la cromatina
che è disancorata (i punti di contatto sono pochi).
Una cellula staminale, lo zigote, è totipotente: costruire un intenitivo?!?!?!? inclusi gli annessi embrionali. Mano a
mano che questa cellula, dividendosi con la mitosi, inizia a differenziarsi, il processo di differenziamento è
associato con un aumento dell’eterocromatina, quindi comincia la chiusura della cromatina. Quindi nella cellula
differenziata la cromatina è organizzata in gran parte di eterocromatina. Aprendo la cromatina di una cellula
differenziata e la si potrebbe trasformare in cellula staminale. Questo tipo di situazione rende inutile la staminale
embrionale: in teoria io potrei arrivare a costruire una staminale differenziando una cellula differenziata.
• Chi è che rimodella la cromatina? Sono dei complessi macromolecolari, degli enzimi ATP-dipendenti (motori
molecolari che cambiano forma e compiono un lavoro utilizzando ATP). L’energia liberata dall’idrolisi nell’ATP si
traduce in variazione di forma per cui questi sono in grado di operare ad esempio un nucleosoma. A questo punto
la cromatina è molto simile in tutte le regioni (istoni standard).
• Come fa il motore molecolare a sapere che deve spostare questo nucleosoma? I responsabili sembrano essere dei
lunghi RNA non codificati, l’anello che manca nell’interazione fra la proteina e gli RNA. Ci sono quindi grandi
complessi che modellano la cromatina che sono in parte anche responsabili dell’organizzazione dei nucleosomi.
Oltre a questi ci sono le code degli istoni. Il nucleosoma non è una sorta di sfera: vi sporgono almeno 8 code degli
istoni. La modificazione delle code degli istoni sono in grado di modificare lo stato di aggregazione della
cromatina. Metilando un certo amminoacido nella coda di un certo istone io posso avere come risposta a questo
l’addensamento della cromatina in quella regione. Si addensa perché su quell’amminoacido modificato si legherà
una proteina che riconosce quella codificazione e porterà con sé gli altri enzimi il cui risultato sarà una cromatina
fortemente condensata. Gli stati di aggregazione della cromatina possono essere influenzati oltre che da motori
molecolari, anche da modificazioni delle code degli istoni (modificazioni reversibili).
• L’acetilazione o la metilazione sono in grado di influenzare lo stato della cromatina. Se io voglio togliere un certo
numero di geni posso metilare quella regione e si condensa. Se voglio aumentare la cromatina io posso acetilare.
L’acetilazione ha l’effetto opposto. La metilazione tende quindi a chiudere l’acetilazione ad aprire.
• Le code degli istoni hanno alcune decine di amminoacidi e quello che è invariabile è la posizione degli
amminoacidi nelle code degli istoni. Se si toglie un amminoacido il sistema non funziona più perché un diverso
tipo di metilazione avrà un effetto diverso.
• I motori molecolari che modificano la cromatina, che pertanto è una sorta di ‘cantiere di lavoro’, sono di quattro
famiglie molto grandi. Di quelle umane si conosce poco. Sono comunque grossi aggregati di proteine con strutture
quaternarie. Possono cambiare la posizione di una certa sequenza esponendola, in modo da attivarla poiché se è
avvolta intorno all’ottamero degli istoni non può interagire. L’organizzazione della cromatina non dipende quindi
direttamente dal DNA ma da vari enzimi che vengono posizionati da varie molecole di RNA.

Queste codificazioni possono essere trasmesse per via ereditaria andando a costituire l’epigenetica. Le modificazioni
delle code degli istoni sono reversibile ma possono essere ereditate. Ovvero possono essere ereditate oltre al DNA le
modificazioni epigenetiche. L’eredità epigenetica può scomparire dopo alcune generazioni. Ci sono molti fenomeni
che vanno al di là del DNA. L’epigenomica è una forma di ereditarietà reversibile Un’impronta epigenetica può
dipendere dal genoma del padre o della madre. Prevalentemente è femminile perché dopo la fecondazione il primo
DNA che si assembla è quello femminile.

Ci sono anche piccoli RNA ereditabili, ovvero c’è un a parte di ereditarietà non legata al DNA.

A livello degli enzimi nei cromatidi si possono acetilare o metilare attivandoli o inattivandoli, ma non si possono
prevedere gli effetti e i meccanismi. Il codice di modificazioni epigenetiche è comunque molto complesso, non solo le
semplici acetilazione e metilazione, ma anche altri meccanismi come la trimetilazione, fosforilazione e la
protomilazione (legata un gruppo metilico)

Anche il DNA può essere modificato tramite metilazione.


• La modificazione delle code degli istoni riguardano i gruppi R. LE sequenze di AA sono regioni invariabili e un
enzima può ottenere effetti macroscopici diversi aggiungendo ad esempio un CH3 su un amminoacido. Questi
sono dovuti alla presenza di complessi proteici che si legano sugli amminoacidi modificati, che ne richiamano altre
ed enzimi che agiranno a livello della cromatina. L’effetto è altamente specifico e sequenza dipendente.

(Cromodominio= proteine che in maniera specifica riconoscono una lisina metilata)

• Le variazioni epigenetiche non dipendono dalla sequenza di DNA quindi sono imprevedibili. La modificazione
epigenetica viene mantenuta in un fenotipo stabile ed ereditario. Verrà cancellata nella formazione dei gameti e
poi ripristinata. Deve avvenire in varie zone specifiche quindi la proteina deve riconoscere zone in cui legarsi, è
difficile indirizzare l’enzima (ruolo degli RNA non codificanti) perché i nucleosomi sono in larga parte uguali.
• L’epigenetica ha un ruolo chiave nel differenziamento, attivando e disattivando alcune zone. L’organo che
principalmente si avvale dell’epigenetica è il cervello: le stimoli sensoriali danno luogo a modificazioni
epigenetiche a livello del DNA dei neuroni, quando si impara o dimentica qualcosa. Ci sono degli studi per fare
queste modificazioni ad esempio sui ricordi di un individuo. Il cervello sembra quindi agire in maniera
Lamarckiana, anche nel consolidamento della memoria. Quando si impara qualsiasi cosa questo si traduce in
modificazioni epigenetiche a livello del DNA. Ciò si è scoperto facendo degli esperimenti sul cervello di ratto, il cui
DNA risultava frammentato dopo aver imparato qualcosa. Gli stessi fringuelli di Darwin sembrano avere
differenze a livello epigenetico e non del genoma, quindi uno dei capisaldi della teoria darwiniana sembra
vacillare.
STRUTTURA E FUNZIONE DELLA CELLULA
LEZIONE 8
La Trascrizione

la trascrizione è il processo nel quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte in una molecola
complementare di RNA. Concettualmente, si tratta del trasferimento dell'informazione genetica dal DNA
all'RNA. Nel caso in cui il DNA codifichi una proteina, la trascrizione è l'inizio del processo che porta,
attraverso la produzione intermedia di un mRNA, alla sintesi di peptidi o proteine funzionali. Di definisce
gene una qualsiasi sequenza che va incontro a trascrizione, anche se il prodotto finale è semplicemente un
RNA che non va in contro alla traduzione.

Nel caso della trascrizione in organismi procarioti, a causa dell’organizzazione dei geni in operon, la
regolazione della trascrizione è molto più semplice. Infatti i batteri hanno un solo tipo di RNA polimerasi, il
loro DNA è circolare ed è contenuto nel citoplasma, che è molto più accessibile del nucleo delle cellule
eucariote. Inoltre la traduzione è un processo cotrascrizionale, mano a mano che sintetizzo la molecola di
RNA ci saranno ribosomi che me la traducono, mentre negli eucarioti l’RNA deve passare per vari passaggi
di maturazione prima di passare nel citoplasma dove verrà tradotto.

Il processo di trascrizione prende in causa un solo filamento di DNA per farne la copia in RNA, il filamento a
singola elica che ne deriva è sempre in direzione 5’  3’ per cui il DNA è stato letto in direzione 3’  5’.
Avendo due filamenti di DNA, chiamerò filamento di senso, il filamento con la sequenza che voglio copiare,
e filamento di antisenso quello complementare che andrò a usare come stampo per il nuovo filamento di
RNA. La trascrizione infatti, riguarda solo un filamento e questo deve essere l’antisenso del tratto che
vogliamo trascrivere come RNA. Le sequenze di senso e di antisenso sono arbitrarie, infatti io potrei avere
due geni sovrapposti nei due filamenti complementari, e a seconda di quale dei due devo trascrivere userò
come stampo l’uno o l’altro.

Il filamento che ottengo dopo la trascrizione è a singola elica, il fatto che non sia doppia non dipende dal
fatto che abbiamo l’Uracile al posto della Timina, ma solo dal fatto che utilizziamo un solo filamento di DNA
come stampo e quindi avremo un solo filamento di RNA come risultato.
Il destino dell’RNA non è solo quello di essere tradotto dai ribosomi, infatti soprattutto negli eucarioti
esistono una miriade di RNA che rimangono tali (Tabella), gli unici RNA che vengono tradotti sono i mRNA.

Nel caso dei procarioti l’operon semplifica la trascrizione, uno dietro l’altro sono contenuti i geni che
codificano per la stessa funzione. Questo rende gli operon dei batteri una struttura con lunghezza poco
variabile, ecco perché i procarioti hanno pochi tipi di RNA polimerasi, perché essendo il tratto da trascrivere
di lunghezza quasi standard mi basta solo un enzima.

Negli eucarioti invece, abbiamo geni completamente diversi, con lunghezze che possono variare da poche
centinaia di basi a milioni di basi, questo vuol dire che RNA polimerasi devono essere specifiche per una
certa lunghezza, e nel caso di segmenti molto lunghi devono anche essere velocissime, perché se fossero
lente il rischio che l’RNA appena formato si rompa o si degradi sarebbe molto alto. Ne abbiamo un’altra con
velocità molto simile a quella dei batteri e poi ne abbiamo un’altra che è molto più lenta del solito, e che
trascrive pezzi di RNA veramente piccoli. Questo perché abbiamo una varianza di lunghezza di basi molto
grande. Noi eucarioti abbiamo diversi RNA polimerasi che sintetizzano sempre in modo uguale ma con
diverse velocità, questo comporta anche una diversa complessità di struttura di questi enzimi, e dei loro
complessi di trascrizione. Abbiamo 3 tipi principali di RNA Polimerasi:

RNA Polimerasi I

La Polimerasi I è un enzima dedicato alla trascrizione del gene che codifica per i vari rRNA. Naturalmente
questa polimerasi riconosce esclusivamente i promotori di questo gene, il che semplifica molto la
regolazione, infatti bastano pochi fattori di trascrizione sul promotore, e la polimerasi si aggancia e inizia a
trascrivere. Questo significa che, come ogni volta, la trascrizione di un singolo gene implica indirettamente
la trascrizione dei vari geni che codificano per i fattori di trascrizione che si devono legare al promotore.

Sappiamo che le subunità dei ribosomi sono formati, oltre che da molte proteine, da 4 componenti a RNA
28S 18S 5.8S e 5S. La 5S non fa parte del gene che viene trascritto dalla polimerasi I ma viene trascritto
simultaneamente dalla polimerasi III, mentre 28S 18S e 5.8S fanno parte dello stesso gene. Sono contenuti
tutti nello stesso gene in modo tale che le quantità delle varie componenti del ribosoma sia circa la stessa,
infatti durante la maturazione questo lungo trascritto viene spezzato nelle tre componenti, che si
troveranno sempre nello stesso numero.
I ribosomi sono una delle strutture più importanti per la cellula, infatti gli permette di attuare la sintesi
proteica. Essendo così importante una cellula non può permettersi di accumulare mutazioni su questo
gene. Così sia i procarioti che gli eucarioti hanno copie multiple di questo gene, i procarioti hanno dalle 2
alla decina di copie, mentre gli eucarioti hanno anche qualche migliaio di copie. Nella struttura
tridimensionale della cromatina infatti, le varie anse che contengono i geni multipli si trovano vicino tra loro
in modo da essere regolate insieme. Finita la trascrizione le varie componenti sono mandate in una speciale
zona chiamata nucleolo per la maturazione, qui vengono maturati ma vengono lasciate inattive,
diventeranno funzionali solo quando verranno espulse tramite i pori nucleali all’esterno del nucleo.

RNA Polimerasi II

La polimerasi II è un enzima molto grande utilizzato per sintetizzare lunghi tratti di DNA, che normalmente
vengono maturati diventando mRNA, ma non solo perché insieme a queste lunghe sequenze può anche
trascrivere piccoli RNA-non-codificanti che andranno a gestire il processo di splicing della molecola,
formando lo spliceosoma. Avendo a che fare con lunghe zone questo enzima di trascrizione deve
inevitabilmente imbattersi nella struttura della cromatina, con la presenza quindi di nucleosomi e di
cromatina più o meno condensata. Per far fronte a questo l’enzima deve avere un’enorme massa d’urto
sufficiente ad aprire la struttura del nucleosoma avanzando senza troppe difficoltà, infatti delle tre
polimerasi è l’enzima più veloce.

RNA Polimerasi III

La polimerasi III delle tre è l’enzima più lento, infatti deve trascrivere piccoli tratti di DNA normalmente non
codificanti. Tra questi ci sono i geni per i tRNA, per gli RNA ribosomiali 5S, alcuni piccoli RNA nucleari (ad
esempio snRNA) e piccoli RNA citoplasmatici (scRNA).

Avendo tre differenti tipi di polimerasi, avrò 3 diversi tipi di promotori


per questi enzimi. Normalmente il promotore di un gene eucariotico
è una zona più o meno estesa del genoma, che si trova prima
dell’inizio di un certo gene ad una distanza da esso non ben definita.
A questo promotore come abbiamo detto ci leghiamo vari fattori di
trascrizione, naturalmente maggiore è la complessità del complesso
di trascrizione maggiore sarà anche il lavoro compiuto dalla
polimerasi, il complesso della polimerasi II non è a caso quello più
voluminoso e complicato. Normalmente i geni che trascrivono per
RNA codificanti, hanno all’interno del loro promotore una certa
ripetizione di coppie di TATA, non a caso questa parte di promotore è
detto TATA Box. A queste sequenze si legano normalmente le
proteine TATA Binding Protein TBP, fattore di trascrizione
indispensabile per assemblare la macchina di trascrizione eucariotica.
La cromatina però ha il ruolo fondamentale perché per far partire la
trascrizione bisogna spostare i nucleosomi per fare spazio al
complesso di trascrizione che deve legare la polimerasi II che è un
enzima molto ingombrante che si lega ad un complesso enorme di
proteine.
Uno dei problemi relativi all’età e che nel corso dell’invecchiamento si tende ad avere una perdita
di nucleosomi. Questo porta il DNA ad assumere un certo grado di libertà che può portare
all’attivazione dei promotori di geni che non si sarebbero mai attivati. Ovviamente lo spostamento
dei nucleosomi è sempre un processo attivo. L’organizzazione in cromatidi è molto controllata.

Processo di Trascrizione

Il processo di trascrizione avviene mediante il passaggio di due fasi:

• Lo Stadio Lento: durante questa fase c’è l’attacco dei fattori di trascrizione al promotore, che
quando si conclude permette alla RNA Polimerasi di agganciarsi in modo corretto. Con idrolisi di
ATP apro la doppia elica, e l’enzima può iniziare ad usare come stampo il singolo filamento di DNA.
Questa fase è chiamata lenta perché l’RNA polimerasi è un enzima capace di legare in maniera
efficiente e veloce le basi solo se si appoggia su un doppio filamento, nel caso in cui il DNA è
appena stato aperto, l’RNA polimerasi fa fatica ad appaiare e a far star ferme le basi che sono
legate tra di loro con pochi legami deboli. Quindi l’enzima in questa fase compie molti errori e
ricomincia a inserire nucleotidi finché non trova l’appaiamento giusto creando un doppio filamento
abbastanza lungo per far partire lo stadio veloce della trascrizione.
• Lo Stadio Veloce: a questo punto l’enzima cambia forma, cioè lega delle proteine chiamate
Proteine di Elongazione che cambiano la struttura della polimerasi stabilizzandola. La polimerasi è
ora in grado di aggiungere in maniera efficace basi ad un tratto che è già a doppia elica.

La polimerasi va avanti finché non trova il codone di stop e ferma la sua trascrizione. Quando l’enzima trova
la forma corretta, lascia la maggior parte dei fattori di trascrizione attaccati al promotore in modo che
molte RNA polimerasi riescano a legarsi allo stesso promotore e iniziare la trascrizione. Quanti di questi
fattori si leghino insieme e a che velocità vadano dipende da molti fattori tra cui i principali sono:

• La stabilità del complesso di fattori di trascrizione, infatti il movimento della polimerasi sulla
cromatina crea vibrazioni e movimento, che possono mano a mano destabilizzare il complesso di
trascrizione, che dopo aver legato molte polimerasi può dissociarsi bloccando per un istante la
trascrizione di quel gene.
• La compattazione della cromatina

L’RNA Polimerasi è l’unica polimerasi che riesce ad iniziare la sintesi da un singolo filamento. Infatti durante
la duplicazione del DNA, la DNA polimerasi ha bisogno di un primer per iniziare a trascrivere, questo primer
è fornito da speciali enzimi chiamati Primasi, che sono una sotto classe delle RNA polimerasi.

La trascrizione può essere velocizzata mediante l’attacco della DNA polimerasi ad una sequenza chiamata
enancher, a cui si legano varie proteine co trascrizionali che possono aumentare la velocità di trascrizione
fino a 1000 volte. Il loro funzionamento però non è ancora del tutto chiaro.
Il concetto di gene è molto relativo, infatti sono geni tutte le sequenze genomiche che hanno un promotore
a cui possono legarsi dei fattori di trascrizione. Il promotore eucariotico è molto grande, migliaia e migliaia
di basi, e facciamo fatica a capire dove finisce il promotore e inizia il gene. Ad ogni promotore per far
partire la trascrizione bisogna che ci siano legati vari fattori di trascrizione, quindi in ogni promotore si
legano diversi fattori di trascrizione, quindi la creazione di un RNA da un singolo gene non chiama in causa
solo quel gene ma decine, centinaia di altri geni che trascrivono per i fattori di trascrizione che si legano al
promotore. Considerando che abbiamo 2 metri di DNA completamente ripiegato su sé stesso, non si riesce
a capire come tanti fattori di trascrizione riescano a legare un tratto così lungo di DNA senza che la
geometria della cromatina influisca sul loro legame. Probabilmente è proprio la sua geometria e la sua
struttura tridimensionale che causa l’interazione giusta tra proteine che poi formeranno il complesso di
trascrizione. Nei procarioti come per gli eucarioti, la RNA polimerasi non si lega direttamente al promotore
ma ad un fattore di trascrizione chiamato Fattore Sigma. Essendo l’intero genoma batterico organizzato in
operon, in totale i fattori sigma che agiscono nello stesso momento all’interno di una cellula procariotica
sono meno di una decina.

La maturazione dell’RNA

La maturazione del segmento di RNA che è stato appena trascritto avviene mediante due processi: lo
Splicing, e l’Editing.

Lo splicing

Prima che un RNA possa essere tradotto in proteine, c’è bisogno che passi per il processo di splicing. Il
risultato di questo processo può essere sempre lo stesso tipo di mRNA, oppure molti diversi mRNA che
derivano tutti dallo stesso RNA processato in modi diversi (splicing alternativo).

Lo splicing inizia con l’assemblaggio di un composto chiamato spliceosoma. Le sue dimensioni sono simili a
quelle di un ribosoma ed è composto da circa 150 proteine e 5 RNA, i quali sono i responsabili del
riconoscimento delle sequenze ai confini introne-esone ed almeno uno a partecipare alla catalisi della
reazione di taglio.

Gli RNA di cui è composto sono snRNA, Small Nuclear RNA, non abbandonano mai il nucleo e sono codificati
e trascritti principalmente dalla polimerasi III, ma anche dalla polimerasi II, se questi piccoli RNA sono
integrati nel gene che si sta trascrivendo.

Nell’ambito dei siti di splicing si identificano siti forti e siti deboli. Lo splicing alternativo infatti non va a caso
ma dipende molto dall’informazione che c’è nell’esone e nell’introne che stò leggendo.

Il sito di splicing forte consente l’assemblaggio veloce dello spliceosoma, quindi se ho due siti forti uno
dopo l’altro, gli esoni verranno attaccati velocemente. I siti deboli invece sono siti in cui l’assemblaggio
dello spliceosoma è lento, e non avviene proprio se compare un sito forte. L’enzima andando veloce non fa
in tempo a montare lo spliceosoma tra due siti deboli, che arriva un sito forte che assembla lo spliceosoma
saltando un esone, exon skypping. Se il processo va avanti abbastanza lentamente, il sito forte compare in
un tempo abbastanza lungo per dare modo allo spliceosoma di assemblarsi tra due siti deboli. La velocità di
avanzamento di questo enzima dipende dal grado di condensazione della cromatina, l’organizzazione della
cromatina ha un effetto notevole sullo splicing, perché normalmente lo splicing è cotrascrizionale. In realtà
lo stesso introne viene avvolto come se fosse un rocchetto attorno ad una proteina, quindi le due estremità
di splicing le posso trovare vicine, ma questo modo posso modificare anche i siti di splicing nascondendone
uno.
Lo spliceosoma non sceglie casualmente dove tagliare, infatti ogni esone inizia con una coppia GT e finisce
con una coppia AG. Sembrerebbe allora che questo meccanismo non sia così difficile, basta che lo
spliceosoma riconosca queste due coppie di nucleotidi. Il problema è che se si va a guardare un normale
RNA ne contiene tantissime di queste coppie, ma solo alcune sono usate come margini di splicing.

L’introne viene eliminato mediante una struttura a cappio, si è visto che lo spliceosoma crea un sito attivo
con un’Adenina scoperta per eliminare gli introni, ma con l’ingegneria genetica si è visto che se si toglie
quell’Adenina il sistema si abitua utilizzandone un’altra. Quindi c’è informazione anche negli introni, quelle
informazioni che vengono lette dal meccanismo di splicing. Lo splicing alternativo può influire sul trascritto
in vari modi:

In generale il processo di splicing non è ancora molto chiaro ma si sa che funziona con buona
approssimazione bene, anche se qualche volta lo splicing alternativo è collegato a molte patologie. Infatti lo
splicing mi da certe percentuali di diverse proteine che derivano dallo stesso RNA di partenza. Se il
meccanismo di splicing non funziona bene per qualsiasi motivo (mutazioni puntiformi di certe parti
importanti degli introni o degli esoni, o mutazioni della struttura dello spliceosoma) le percentuali di
proteina potrebbero essere sbagliate e questo può causare, e causa spesso, patologie e problemi anche
gravi. Anche se non si sa esattamente come funziona il processo di splicing si sa che sia negli introni che
negli esoni è contenuto l’informazione per lo splicing, gli introni ce l’hanno a livello dell’ordine di basi,
mentre gli esoni hanno l’informazione di splicing a livello della terza base delle triplette.

La complessità dell’eucariote si associa molto bene con la varietà dello splicing, i nostri geni non sono tanti,
ma abbiamo tantissime proteine. Fra noi e gli scimpanzé il DNA è diverso all’1% ma le differenze vere
stanno nel numero di proteine che possiamo creare partendo dallo stesso gene.

Editing
Finito il processo di splicing, mRNA può andare incontro ad altre modificazioni che prendono il nome di
editing. Questo processo è di recente scoperta infatti fino a pochi anni fa si dava origine diversa a proteine
che in realtà sono frutto dello stesso gene ma processato con due tipi diversi di editing. Un esempio di
editing è la modificazione tessuto-specifica del gene di mammifero per l'apolipoproteina-B.
Questa è sintetizzata regolarmente nel fegato, ma nelle cellule dell'intestino avviene una deaminazione sito
specifica della citosina nell'mRNA che la codifica. Questa deaminazione, catalizzata dall'enzima citidina
deamminasi provoca una mutazione non-senso che causa l'inserimento di un codone di stop al posto del
codone che codifica per la glutammina (CAA-->UAA). Questo comporta l'arresto prematuro della sintesi
della proteina e quindi nell'intestino viene prodotta una forma tronca. Un altro esempio di editing
dell'mRNA è la deaminazione della Citosina, che non è un processocasuale ma è guidato da speciali RNA
guida, che riconoscono sequenze anche lunghe di mRNA legandosi e portando gli enzimi nella posizione
specifica.

Un altro tipo di editing è l’inserzione di basi in posizioni specifiche. Generalmente se inserisco basi inserisco
l’Uracile, anche se normalmente questo è un meccanismo abbastanza raro e pericoloso perché se
l’inserzione mi capita all’interno di una zona codificante mi creerebbe un frame shift, uno spostamento
della finestra di lettura, che mi porterebbe ad una proteina completamente diversa da come era prima.

Struttura dell’mRNA Maturo

Finiti i processi di Splicing e di Editing, il nostro mRNA è finalmente maturo, e pronto per essere espulso dal
nucleo all’interno del citoplasma.

La struttura di questo mRNA è molto caratteristico, infatti abbiamo nell’estremità 5’ un cap, questo cap è
un nucleotide 8-metil-guanosina, legata al contrario. Tra questa molecola e la zona codificante
normalmente ci sono strutture chiamate UTR 5’ (Un-Traslated Region 5’), che possono essere state
aggiunte durante lo splicing. Tra queste strutture ci sono anche le sequenze IRES, Internal Ribosome Entry
Site, che furono osservate per la prima volta a livello di mRNA virali in cui si era notato come alcuni mRNA
erano privi del Cap al 5'. Le IRES favoriscono quindi la traduzione di mRNA privi del Cap al 5', cosa molto
utile per la cellula soprattutto quando si ha un blocco globale della traduzione,
causato da un stress cellulare. Nella regione del 3’ UTR invece ho una sequenza
AAUAAA, una speciale sequenza inserita spesso dallo splicing, a cui si può legare uno
speciale enzima chiamato enzima poliadenilante, che aggiunge a questa sequenza
varie Adenine. Questa struttura chiamata coda poli-A è utile perché tende ad attirare
varie proteine che circolarizzano l’mRNA rendendolo più stabile, e più facile da legare
da vari ribosomi che possono iniziare la sintesi.
La Maturazione dei Ribosomi

Un tempo si credeva che per attivare due geni contemporaneamente, la cellula gli andasse a cercare nei
propri cromosomi e gli attivasse, si è scoperto che non è così, infatti geni che devono essere cotrascritti,
cioè trascritti nello stesso momento, sono organizzati in moduli funzionali. Questi sono i corrispettivi degli
operon negli eucarioti, infatti questi geni si trovano vicini nello spazio tridimensionale legati insieme da
molecole chiamate coesine. Più moduli funzionali possono creare un dominio cellulare, come quello che
gestisce la produzione e la maturazione dei ribosomi.

Quando la cellula ha bisogno di produrre dei ribosomi si attivano tutti insieme una serie di fattori:

• I fattori di trascrizione per il gene che deve legare la polimerasi I, che genera tutti i vari segmenti di
RNA.
• Tutte le proteine che trovo nel ribosoma, che sono circa 55 vengono prodotte nello stesso
momento e nello stesso numero dei segmenti di RNA che compongono le due subunità, vengono
trascritte nel nucleo tradotte nel citosol e poi vengono riportate all’interno dai pori nella zona del
nucleolo.
• Gli enzimi che intervengono nella maturazione e nel trasporto delle due subunità del ribosoma.

Il trascritto del gene della polimerasi I è un lungo gene che darà origine alle varie parti del ribosoma, che
sono 25S 18S 5.8S, mentre la 5S viene prodotta dalla polimerasi III. Nei procarioti al posto della 18S si ha la
16S che comprende al suo interno anche la 5.8S. Queste unità vengono trascritte in un unico RNA perché
nel caso fossero in geni separati sarebbe impossibile averne un numero circa uguale. Il risultato finale della
trascrizione della polimerasi I è un lunghissimo trascritto di RNA che viene tagliato nelle varie subunità e
viene maturale all’interno del nucleolo.

Il nucleolo è una struttura subnucleare non suddivisa da membrane di alcun genere. Di queste strutture
possono essercene anche più di una all’interno del nucleo ed è direttamente collegata alla produzione di
ribosomi, quindi alla sintesi proteica. Al suo interno si dividono due regioni: regione globulare, e regione
fibrillare densa.

La regione fibrillare densa è composta dal DNA che dà origine agli rRNA, e ai filamenti neoformati di RNA
che iniziano una fase di maturazione. La fase globulare invece è formata da quelle strutture che poi
diventeranno le due subunità del ribosoma, in via di maturazione.

Affinché avvenga questa maturazione c’è bisogno che questi RNA non vengano degradati. Questo non
avviene perché l’rRNA contiene molte sequenze palindrome che si chiudono su se stesse, gli exosomi non
riescono a distruggere molecole di RNA a doppio filamento, mentre tratti a singola elica possono essere
aggrediti dalle RNAasi, quindi vengono modificati cambiando le basi azotate, in modo da non essere
riconosciute dal macchinario di degradazione degli RNA, l’exosoma.

Nel nucleolo si incrociano gli RNA e le proteine ribosomiali, che vengono da fuori, con le RNA 5s che non
vengono trascritte dalla polimerasi I ma dalla polimerasi III. essendo le due subunità del ribosoma due
strutture tridimensionali che non corrispondono al minimo di energia la loro maturazione è molto
controllata e gestita da vari enzimi. Finita la maturazione nel nucleolo queste strutture vengono trasportate
fino al poro dove vengono espulsi, dopodiché le molecole utilizzate per il loro assemblaggio/trasporto e
maturazione torneranno nel nucleo. Queste subunità che nel nucleo non potevano funzionare, completano
la propria maturazione nel citosol dove iniziano la propria attività.
RNA Transfer

Uno dei compiti della polimerasi III, è quella di produrre gli RNA Trasfer, quelle molecole di RNA che fanno
da tramite per tradurre il codice genetico da triplette di basi azotate ad amminoacidi.

Anche la molecola di tRNA va in contro a maturazione, infatti questa molecola va in contro ad una serie di
cambiamenti di struttura che gli permettono di raggiungere la sua forma finale, che non è a trifoglio
trilobato come è nelle stilizzazioni dei libri, ma è a forma di bastoncello ripiegato. (figura)

Quando viene sintetizzato un pre-tRNA assumerà la sua struttura finale


come prodotto di maturazione, le due estremità verranno tagliate, e la
molecola si rischiude su sé stessa, formando tratti a doppia elica, dovuti
alla presenza di sequenze palindrome, e tratti a singola elica.

Nelle zone del tRNA a singola elica le basi vengono modificate per
essere inattaccabili dalle RNAasi, e rendendo questa molecole di lunga
vita. All’estremità 3’ nei procarioti come negli eucarioti si trova la
sequenza CCA. Questa sequenza non si sa perché ma accomuna tutti gli
esseri viventi, perché l’enzima amminoacil-tRNA sintetasi riesce a legare
gli amminoacidi all’estremità 3’solo se trova la sequenza CCA. Negli
eucarioti l’unica differenza è che questa sequenza viene aggiunta
enzimaticamente durante la maturazione mentre nei procarioti che devono crescere molto in fretta è
direttamente integrata nella sequenza del gene.

Naturalmente l’unica parte del tRNA che non va in contro a modifiche è la parte terminale del bastoncello
che contiene l’anticodone. Infatti se questa parte venisse medicata si andrebbe a distruggere il codice
genetico. Questo fa capire anche che se l’enzima amminoacil-tRNA sintetasi, non attacca l’amminoacido
giusto al tRNA con quel anticodone viene meno l’intero codice genetico.
STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE
LEZIONE 9
23/11/2017

Regolazione degli Operon Batterici

Il modello di organizzazione dei batteri è molto funzionale, geni con la stessa funzione vengono
trascritti insieme e sono contenuti in una struttura chiamata Operon. Questa struttura è formata da un
promotore che varia da qualche centinaio a qualche migliaio di basi, e da un serie di molti geni con la
stessa funzione conclusi da un terminatore. Il promotore a sua volta ha delle piccole sequenze ripetute
a cui si lega il Fattore Sigma e successivamente la RNA polimerasi, infatti queste proteine riescono a
riconoscere piccole sequenze perché sarebbe svantaggioso per il battere sintetizzare lunghe proteine
che riconoscono lunghe sequenze dei promotori. Il problema di riconoscere sequenze piccole però è
quello che queste si possono trovare anche in altri Operon, e quindi il rischio è che un Fattore Sigma
attivi più di un Operon indesiderato. All’interno del promotore c’è anche una piccola sequenza
chiamata operatore, che ha una funzione regolativa se legato con speciali proteine.

Durante la trascrizione ho un fattore sigma, che si lega al promotore di un certo Operon. A questo
complesso fattore sigma/promotore si lega l’RNA polimerasi che fa partire la trascrizione dei geni
contenuti all’interno dell’unità trascrizionale che è l’Operon.
Apparentemente sembrerebbe che questo tipo di processo non abbia alcun tipo di controllo, inoltre se
il fattore sigma è libero di muoversi per il citoplasma del batterio è facile anche che si leghi ai
promotori di geni che in verità non dovevano essere attivati. Queste attivazioni sbagliate sono evitate
mediante due tipi di regolazione: la Regolazione Negativa e la Regolazione Positiva.

➢ La Regolazione Negativa (Operon TRP)

La regolazione negativa agisce a livello del promotore, in particolare in una piccola sequenza
molto specifica, l’operatore, riconosciuta da una certa proteina. Il legame specifico proteina
operatore occupa quello spazio sul promotore che avrebbe occupato il fattore sigma legato alla
RNA polimerasi che quindi non è in grado più di legarsi. Questo è il caso dell’Operon
Triptofano, questo amminoacido è tra i più complessi da produrre, i batteri riuscivano a
sopravvivere solo se lo trovavano nell’ambiente circostante, ma durante l’evoluzione si vede
che alcuni batteri sono stati in grado di sintetizzarlo per conto loro. L’Operon di questo
amminoacido è composto da 5 geni che codificano per 5 enzimi che sono necessari alla sua
produzione. I 5 enzimi continuano a produrre l’amminoacido finché non accumulano troppe
mutazioni e vengono distrutti, nel caso che la concentrazione di triptofano sia ancora bassa la
trascrizione dell’Operon rimane inalterata, nel caso che il triptofano sia troppo concentrato
all’interno del battere l’operon deve essere spento. In questo caso entra in gioco una speciale
proteina che riesce a legare specificatamente una certa sequenza del promotore, chiamata
operatore, questa famiglia di proteine ha la caratteristica di avere due forme, una attiva e una
non. Nel caso del triptofano quando la concentrazione dell’amminoacido è bassa allora la
proteina si trova nella forma inattiva, mentre se la concentrazione è alta a questa proteina lega
continuamente un triptofano, questo causa un cambio di forma che permette al complesso di
legarsi all’operatore. Questa sequenza se ricoperta da questa proteina occupa lo spazio che
occuperebbe il fattore sigma con la RNA polimerasi che quindi non riesce a legarsi. Le affinità
dell’interazione tra il ligando e la proteina repressore sono estremamente importanti, perché
deve essere a bassa affinità, altrimenti il repressore sequestra il triptofano e continua a
bloccare la trascrizione, e anche il distacco di questo amminoacido diventa complicato. Quindi
la proteina lega l’amminoacido con un’affinità abbastanza bassa in modo tale che solo dopo una
certa soglia di concentrazione ci sia un legame stabile tra i due che permette un cambio di
forma. Mano a mano che un triptofano si attacca e si stacca ce n’è sempre uno che si riattacca
subito dopo.
Nell’Operon LAC (lattosio) c’è una doppia regolazione sia positiva che negativa. Infatti se il
lattosio non è presente all’esterno del batterio allora la regolazione è negativa e il promotore è
completamente bloccato, ma se c’è una certa concentrazione di LAC all’esterno, l’Operon è in
pre-allerta e lega l’RNA polimerasi che però è inattivo.

➢ La Regolazione Positiva (Operon LAC)

Il lattosio è un disaccaride formato da glucosio e galattosio


legati da un legame 1,4-glicosidico. L’Operon destinato a
digerirlo è formato da 3 geni, il primo trascritto è la β-
Galattosidasi che è in grado di rompere il legame glicosidico e di
ottenere glucosio e galattosio. Il secondo gene trascritto in
ordine è una proteina di membrana che facilita l’ingresso delle
molecole di lattosio, e il terzo è la β-galattoside transacetilasi
che trasforma il galattosio in glucosio. Nei batteri la forma
principale di energia è il glucosio ma avere anche fonti alternative aumenta la possibilità di
sopravvivenza, quindi più Operon di questo tipo ha un batterio maggiore è la probabilità di
sopravvivenza. Il lattosio non ha speciali canali sulla membrana dei procarioti che gli
permettono di entrare liberamente all’interno, ma entra utilizzando canali di altre molecole
clandestinamente. Quindi la concentrazione di questo zucchero all’interno della membrana
sarà veramente bassa. Se il lattosio non è proprio presente all’esterno il suo Operon è
completamente bloccato, perché una speciale proteina simile a quella del triptofano ma con
effetto contrario è legato all’operatore. Ma se anche pochi disaccaridi penetrano all’interno, la
proteina si lega subito cambia forma e rilascia il sito di legame
per il fattore sigma e la RNA polimerasi. Quindi il primo tipo di
regolazione di questo tipo di operon è di tipo negativo. Se la
proteina legando il lattosio si distacca l’RNA polimerasi si
aggancia al fattore sigma che ha riconosciuto la sequenza del
promotore ma la trascrizione non parte. Questo avviene perché
nell’operon si dice che il promotore è debole, cioè è in grado di
legare l’RNA polimerasi ma non di far partire la trascrizione.
Questo ha un significato in termini di evoluzione, infatti se il
batterio dispone ancora di glucosio è inutile attivare un
meccanismo che mi dà accesso a fonti alternative di energia
(che poi il lattosio viene comunque trasformato tutto il glucosio) è uno spreco enorme di
risorse. Il batterio semplicemente mette in pre-allerta l’operon LAC, e solo ed esclusivamente
quando finisco il glucosio parte la trascrizione. Il batterio per capire quando finisce il glucosio
utilizza una speciale molecola chiamata cAMP, adenosin mono fosfato ciclica, una molecola che
deriva dall’ATP privata di 2 fosfati in cui l’ultimo rimasto si ripiega e forma un legame con lo
zucchero. La presenza di questa molecola stabilizza il promotore che da debole diventa forte
facendo progredire la trascrizione.
L’affinità della proteina che lega l’operatore con il lattosio deve essere molto alta, infatti al
contrario del triptofano che è un amminoacido molto presente all’interno della membrana, il
lattosio deve entrare per vie indirette utilizzando canali non specifici per la sua forma, quindi la
sua concentrazione all’interno della cellula sarà molto bassa. Una affinità per questa molecola
molto alta assicura che anche in caso di poche molecole di lattosio, l’operon sia già in pre-
allerta con l’RAN polimerasi pronto a trascrivere.

Negli eucarioti, i fattori di trascrizione sono molti, non si limitano alla decina di fattori Sigma che
hanno i procarioti. Questo numero impressionante di fattori di trascrizione che abbiamo in più dei
procarioti significa che la nostra regolazione è molto più raffinata. I geni che abbiamo in più rispetto ai
procarioti probabilmente sono per la maggior parte fattori di trascrizione. Ecco perché abbiamo molta
sensibilità ad un aumento di cromosomi. Mentre nei batteri possiamo avere anche 2-3 copie del DNA
senza avere problemi.

Gli RNA-non-codificanti

Fino a pochi anni fa non si conosceva il preciso compito di questi ncRNA (non Coding RNA) quindi si
riteneva che tutto cioè che non era gene era semplicemente DNA spazzatura. Ad oggi invece sappiamo
che a dispetto del 1,2% di DNA che diventa codificante l’80% dimostra avere funzioni biochimiche più
complesse. Non solo i piccoli RNA non codificanti, ma anche i lncRNA (long non Coding RNA) negli
ultimi anni hanno rivelato il loro ruolo, soprattutto nella regolazione epigenetica delle cellule.
Gli RNA codificanti si pensava fossero una esclusiva delle cellule eucariotiche, ma in verità sono stati
scoperti anche nelle cellule procariotiche.

I geni che codificano per questi RNA possono trovarsi veramente ovunque. Possono essere tutti
insieme in una certa regione cromosomica, come in un operon batterico in cui la molecola di RNA dopo
la trascrizione viene spezzettata e dà origine a molti ncRNA. Possono trovarsi separati e lontani fra
loro come normalissimi geni, oppure questi ncRNA possono anche essere ricavati dal riciclo degli
introni di geni processati dallo splicing.

Un po’ tutti gli ncRNA ma soprattutto le varianti molto lunghe, hanno un problema di stabilità. Infatti
gli RNA sono tuti a singoli filamento e non sono molecole con il minimo di energia quindi tendono a
deteriorarsi e a spaccarsi. Per funzionare queste molecole devono essere attaccate ad una serie di
proteine che ne mantengono la struttura tridimensionale semirigida, o che ripiegano la struttura di
una molecola tridimensionale nel modo corretto. Questi lncRNA sono stati scoperti pochi anni fa, ma in
verità si conoscevano da molto, venivano semplicemente scambianti per subunità ribosomiali, perché
a dimensione e composizione sono molto simili.

Tutti gli RNA vengono trascritti all’interno del nucleo, dove vengono anche processati dal macchinario
dello splicing, se destinati a questa via. Si credeva che solo gli RNA che subissero splicing e che quindi
possedessero sia il Cap che la coda poli-A potessero oltrepassare il poro nucleare per andare nel
citoplasma. Ma si è scoperto che non è così infatti ci sono almeno 7 diverse vie per trasportare RNA di
diverse misure e con diverse caratteristiche, e non tutte queste vie prevedono l’uscita mediante il
poro nucleare, infatti per gli RNA molto grandi si crea un’invaginazione della membrana nucleare che
avvolge completamente la molecola. Si crea a tutti gli effetti una vescicola che gemma dalla membrana
nucleare, questa vescicola nel citoplasma viene smontata e il suo contenuto viene attaccato da una
serie di proteine che maturano questo lncRNA.
I microRNA

I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA non codificante a singolo filamento, si tratta di
polimeri lunghi circa 20-22 nucleotidi e principalmente attivi nella regolazione dell'espressione
genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale. I miRNA vengono inglobati nel complesso di
silenziamento indotto da RNA (RISC) e inducono il silenziamento genico tramite sovrapposizione con
sequenze complementari presenti su molecole di mRNA. Tale legame comporta una repressione
della traduzione o la degradazione della molecola bersaglio. Il silenziamento può avvenire in vari
modi:

1. Taglio della molecola di mRNA


2. Destabilizzazione della molecola di mRNA tramite accorciamento della coda di poli-A
3. Diminuzione dell'efficienza di traduzione del messaggero;
I miRNA ricordano gli siRNA (small interfering RNAs), ma differiscono da questi in quanto derivano da
regioni di RNA che si ripiegano autonomamente a formare delle corte forcine (sequenze palindrome),
mentre i siRNA derivano da sequenze di RNA a doppio filamento più lunghe, anche se la loro
amturazione è del tutto simile a quella dei microRNA. La loro maturazione parte da un piccolo
trascritto detto pri-miRNA, questo primo trascritto si ripiega su se stesso perché a varie sequenze
palindrome, in questo modo forma una struttura chiamata hairpin, a forcella. Questa struttura viene
subito processata da una speciale RNAasi chiamata Drosha, che ne taglia i due estremi liberi. A questo
punto la molecola che è parzialmente a doppio filamento, chiamata pre-miRNA, esce dal nucleo e
arriva nel citoplasma grazie al passaggio di un enzima predisposto specificatamente al trasporto di
pre-miRNA, l’esportina 5. Nel citoplasma questa molecola viene aperta e se ne taglia un filamento,
ottenendo un miRNA quasi maturo, perché a questo si aggiungeranno tante altre proteine per formare
il complesso di silenziamento indotto da RNA, chiamato anche complesso RISC. Il miRNA a singolo
filamento farà da guida al complesso che poi potrà bloccare l’mRNA bersaglio.
RNA circolari

Gli RNA non codificanti possono anche chiudersi ad anello, naturalmente devono avere lunghezze
maggiori di quelle dei miRNA o dei siRNA, infatti sono lunghi dalle 50-70 basi. I geni che codificano per
questi circRNA sono molto conservati tra specie, e la loro funzione è oggetto di molti studi. Si pensa
però che questi circRNA riescano a staccare i miRNA dal loro bersaglio mRNA, e che li conservino.

Triplex RNA o tiRNA

I tiRNA derivano dai tRNA modificati, non svolgono la loro funzione ma mantengono la loro capacità di
interagire con i ribosomi. Sono prodotti in caso di stress cellulare, perché interagiscono con il
ribosoma e bloccano la sintesi di proteine, perché in caso di stress la cellula deve indirizzare le sue
risorse energetiche in qualcosa che può aiutarla ad uscire da questo stato, e sicuramente il processo di
traduzione è uno dei processi più dispendiosi. Questi tiRNA agiscono a livello dell’interazione tra il cap
e la subunità minore dell’rRNA bloccando la traduzione. Si è notato però che la sintesi di alcuni mRNA
continuava comunque nonostante la presenza di questi tiRNA, infatti non tutte le traduzioni sono
mediate dal cap, c’è un’altra struttura chiamata sequenza IRES. Le sequenze IRES sono state scoperte
per la prima volta nei virus, ma si sono ritrovate all’interno di alcuni geni eucariotici, e non si riesce
più a capire da chi siano derivate. Quindi in una cellula tutto il processo di traduzione è bloccato
tranne quello dei geni con la sequenza IRES forte ( le sequenze si dividono in forti e deboli a seconda
dell’affinità tra loro e le subunità ribosomiali), che dovrebbe sollevare la cellula dal suo stato di stress.

Piwi interfering-RNA, o piRNA

Questi tipi di RNA interagiscono con speciali proteine chiamate Piwi. Queste proteine vengono
espresse in un particolare momento, specialmente nell’uomo. Durante la spermatogenesi durante la
transizione tra spermatide e spermatozoo, c’è un’ondata di metilazione di tutto il genoma, questo
potrebbe portare all’attivazione accidentale dei retrotrasposoni, le unità mobili del nostro genoma che
potrebbero generare seri problemi spostandosi all’interno di un gene codificante. Questi piccoli piRNA
legano le proteine Piwi inducendo il silenziamento di questi retrotrasposoni, ma oltre a questo
sembrano avere un ruolo epigenetico abbastanza importante

I long-non-coding-RNA, o lncRNA

Studi degli ultimi 10 anni hanno evidenziato la presenza di un tipo di RNA non codificante di cui si è
scoperta l’enorme importanza. Oltre ai piccoli RNA non codificanti di massimo un centinaio di basi
esistono un gran numero di long non-coding-RNA, lncRNA, con le funzioni più svariate. Questi RNA
sono lunghi dalle 200 basi in poi, data la loro grandezza si pensava fossero pezzi di introni non ancora
distrutti o addirittura subunità ribosomiali.
Derivano dalla trascrizione di lunghi geni sia dalla polimerasi II che dalla polimerasi III, solo nel caso
siano lunghi 200-300 basi, oppure possono essere riciclati da introni o pezzi di introni, nei batteri
avendo il DNA codificante al 98% si possono trovare
nell’elica antisenso di molti geni. Molti di questi lncRNA
subiscono il processo di splicing e per la presenza di molte
zone palindrome si ripiegano su se stessi formando una
struttura secondaria che ne caratterizza le funzioni. Abbiamo
a disposizione software informatici che ci permettono, data
la sequenza di un gene, di trovare la struttura geometrica a
minimo di energia potenziale. I test che si sono fatti con i geni
che codificano per questi lncRNA non sono stati
soddisfacenti, infatti la struttura che il software prevedeva
non veniva rispecchiata nella realtà, questo dimostra che
questi lncRNA vengono aiutati nel processo di maturazione
per ottenere forme geometriche non casuali ma
completamente imprevedibili.
Le sequenza dei piccoli RNA non codificanti è molto conservata mentre quella dei lncRNA lo è di meno.
Questo perché più che la sequenza è conservata la geometria spaziale di questi RNA, infatti nonostante
la sequenza sia anche molto diversa i principali gruppi funzionali si trovano in posizioni spaziali ben
definiti. Le funzioni di questi lncRNA sono moltissime e coprono moltissimi campi. Per prima cosa si è
notata che la presenza di alcuni lncRNA in molti casi di tumori, abbassava notevolmente la speranza di
vita del paziente, come nel caso di HOTAIR un lncRNA che se trovato in quantità alte all’interno di
molti tumori mammari, del colon o epatici, la speranza di vita dei pazienti si accorciava di molto.
Questi lncRNA possono appaiarsi al DNA, ed essendo molto lunghi possono identificare unicamente
una certa sequenza portando con loro vari enzimi. Anche le proteine svolgono questo compito, ma per
identificare una sola base c’è bisogno di almeno 30 amminoacidi, e quindi non riconoscono mai una
sequenza di più di 6-7 basi. Fungendo da guida per vari fattori i lncRNA possono:
• Bloccare i promotori di alcuni geni, appaiandosi con il promotore o parti di esso impendendo
alla polimerasi di attaccarsi e iniziare la trascrizione, oppure chiudendo la stessa polimerasi
all’interno della sua struttura non facendola avanzare.
• Portare fattori di trascrizione al loro promotore, è infatti vero che questi riescono a
riconoscere specificatamente una certa sequenza di 6-7 basi, che però potrebbe trovarsi in
molti punti all’interno del genoma.
• Hanno una funzione regolatrice in senso epigenetico. Infatti possono portare con loro vari
enzimi che possono acetilare o metilare le code degli istoni in molti promotori di alcuni geni
specifici. Oppure possono portare enzimi che spostano i nucleosomi con conseguente
formazione di eterocromatina o eucromatina.
• Possono regolare lo splicing, specialmente se derivano dall’elica antisenso di un certo gene,
appaiandosi con un certo esone e mascherandolo dalla macchina dello splicing che lo salta.
• Fungono da impalcature per organizzare vari complessi macromolecolari, come possono
essere le strutture quaternarie delle proteine, oppure incastro preciso tra l’rRNA e le proteine
che poi andranno a formare le subunità mature.
• Possono fungere da cargo per gli esosomi, insieme a molti altri tipi di RNA, mediano il
trasferimento di materiale tra cellule e agiscono in caso come molecole di signalling cellula-
cellula.
• Possono appaiarsi con dei miRNA sequestrandoli dal legame con gli mRNA bersaglio
(ricordando che i siRNA si appaiano perfettamente all’mRNA e ne inducono la degradazione
mentre i miRNA si appaiano con vari mismatch e bloccano la traduzione momentaneamente)

Exosoma e la degradazione degli RNA

Questo mare di molecole deve essere anche degradato, oltre che gestito nella maturazione. Se sono
abbastanza stabili queste molecole riescono ad avere una struttura adatta per funzionare ma diventa
un problema degradarle. La macchina che degrada queste molecole è l’Exosoma (ha lo stesso nome
degli esosomi tradotti in inglese, ma in italiano si distinguono grazie alla X al posto della S). Questa
struttura è una specie di cilindro a sei membri con pareti formate da proteine. Ha due possibili
strutture, uno a modello esagonale, l’altro a triangolo. La versione eucariotica umana è simile a quella
archea ed è triangolare, la differenza è che quella umana è composta da 9 proteine diverse mentre
quella archea da solo 4 proteine differenti. Anche i batteri hanno una struttura simile che però è
chiamata degradosoma.

Nel caso del proteasoma al suo interno si trovavano principalmente proteasi, nell’exosoma invece
troviamo principalmente RNAasi. Oltre alle RNAasi posso trovare anche la polinucleotide fosforilasi,
che spezzetta l’RNA un nucleotide alla volta. Dovendo spezzare anche molecole di RNA con una
struttura secondaria si rende necessario l’enzima RNA elicasi, che utilizza l’energia fornita dall’ATP per
spezzare i doppi filamenti di RNA e inserire all’interno dell’exosoma una catena singola di nucleotidi
che vengono letteralmente trascinati dentro da una macchina ad ATP. Nel caso di un RNA che esce dal
nucleo accidentalmente, esiste un meccanismo che aggiunge una coda poli-U che stimola la
degradazione di questo RNA.
STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE
LEZIONE 10
27/11/2017

Quello che chiamiamo CODICE GENETICO è un concetto, non è materiale.


È sbagliato affermare che il DNA è il codice genetico perché il DNA è una molecola, mentre il codice genetico è una
modalità che consente di associare a certe triplette di nucleotidi del DNA un amminoacido.
La sequenza delle basi, con la sua imprevedibilità, contiene informazioni ed il codice genetico è la modalità che ci
consente di decifrare il messaggio contenuto in quelle regioni di DNA, alle quali proteine e RNA attribuiscono il
significato di geni.
Il GENE è una regione della molecola di DNA, trascritto per decisione di RNA che vanno a posizionare certi tipi di
proteine a quel livello.
Il gene che codifica per una proteina viene letto e tradotto utilizzando il vocabolario ideale del CODICE GENETICO.

Tutte le specie utilizzano lo stesso codice genetico.


Il codice genetico non è un’entità materiale ma è una sorta di vocabolario che consente di utilizzare un’informazione
contenuta nell’acido nucleico per costruire una sequenza di amminoacidi, cioè una proteina.
Il codice genetico funziona SOLO a triplette di basi azotate (noi abbiamo 4 basi azotate che devono portare
l’informazione per 20 aa diversi).
Un codice genetico a coppie o a singola base non sarebbe stato adeguato a consentire la sintesi di una proteina
perché:
 se ogni base indicasse un amminoacido ne potremmo sintetizzare solo 4 e sarebbe insufficiente;
 non funziona nemmeno a coppie di basi perché in quel caso le combinazioni sarebbero 16 (=42) e
perderemmo quattro amminoacidi. Non funziona a coppie perché la forza del legame tra due basi
(soprattutto quelle che danno luogo a due legami ad H AU) non avrebbe reso quel legame
sufficientemente stabile.

A triplette le ricombinazioni sono 64 (43) le combinazioni sono superiori agli amminoacidi (20).

Delle 64 combinazioni:
-61 SONO UTILIZZATE
-3 SONO SEQUENZE DI STOP

Le sequenze UAG (codone Ambra), UAA (codone Ocra), e UGA (codone Opale) sono CODONI DI STOP.
Nel momento in cui nella sequenza di un mRNA compare uno dei codoni di stop non c’è nessun RNA-tranfert che porti
un amminoacido ed il risultato sarà l’interruzione della sintesi: la catena polipeptidica fino ad ora formata sarà ceduta
all’acqua e il ribosoma si disgregherà.
Se una mutazione, alterazione della sequenza del DNA, generasse una sequenza di stop (come nel caso dell’editing) si
otterrebbe una proteina più corta perché il ribosoma arrivato a quella sequenza non sarebbe più in grado di
aggiungere amminoacidi.

Il codice genetico NON È AMBIGUO: ogni tripletta di nucleotidi rappresenta un solo amminoacido; l’amminoacido
successivo a quello già sintetizzato è rappresentato e specificato dalla tripletta successiva.

Il codice genetico NON È SOVRAPPOSTO: viene letto a triplette.

1
Non contiene virgole: un gene, che codifica per una specifica funzione, è costituito da una serie più o meno lunga di
“triplette” di basi azotate che codificano ognuna per un amminoacido che andrà a costituire la proteina per cui il gene
faceva da stampo. A monte ed a valle di tali triplette esistono sequenze specifiche con funzioni regolatorie e di
inizio/fine trascrizione. Se per “segno di interpunzione” intendiamo una virgola tra una tripletta e l’altra, possiamo
smentirne l’esistenza.
Prendiamo in considerazione le mutazioni puntiformi in cui si ha ad esempio l’aggiunta o la perdita di una base
azotata: in tali casi si ha uno scivolamento della lettura delle triplette dovuto proprio all’aggiunta o alla perdita di una
base, ciò può portare alla formazione di una proteina differente da quella di partenza. La presenza di un segno di
interpunzione farebbe invece in modo di sincronizzare la lettura del codone partendo sempre dopo un’ipotetica
“virgola”, ma ciò in realtà non avviene.
Permette al DNA di mantenere stabile l’informazione.

Gli amminoacidi possono essere specificati da una sola combinazione: ad esempio il TRIPTOFANO e la METIONINA.
La metionina AUG costituisce un caso particolare: il processo di sintesi proteica è in grado di iniziare solo in sua
presenza e per questo motivo è il primo amminoacido di tutte le catene polipeptidiche.
Tutti gli organismi viventi sul pianeta Terra hanno geni nel DNA che iniziano con una sequenza ATG, che diventa AUG
nell’RNA (la traduzione si verifica a livello di RNA, nel codice genetico non è inserita la timina ma si trova l’uracile).
Se volessimo cercare all’interno del DNA delle regioni potenzialmente codificanti dovremmo guardare i tratti
contenenti sequenze AUG.
I ribosomi funzionano in tutti gli organismi viventi, procarioti o eucarioti, a partire da una metionina che, come primo
amminoacido della catena polipeptidica, definisce la cornice di lettura.
Il messaggio contenuto nella sequenza di un acido nucleico potrebbe essere letto in vari modi ma il ribosoma, che
oltre ad unire gli amminoacidi identifica la cornice di lettura, consente di decifrare il messaggio che nell’acido nucleico
è criptato.

Il codice genetico È DEGENERE e uno stesso amminoacido può quindi essere specificato da più di una tripletta di
nucleotidi.
Un esempio è costituito dall’amminoacido LEUCINA che è specificato da sei diverse combinazioni.
La leucina nella sua forma reattiva è utilizzata nella pratica per determinare la velocità di sintesi delle proteine; questo
amminoacido da la massima sensibilità essendo codificato da sei diverse combinazioni di nucleotidi.
La leucina è un amminoacido che si trova in quantità maggiore di altri nella struttura delle proteine.
infatti
I geni sono derivati dal reclutamento casuale di una certa regione del DNA (sono sequenze randomizzate di DNA)
quindi un amminoacido specificato da più combinazioni ha maggiori probabilità di essere inserito e rappresentato a
livello della proteina.
Questo concetto non è sempre vero, un esempio è costituito dall’amminoacido ARGININA che, pur essendo
specificato da sei combinazioni, si trova poco nelle catene polipeptidiche.
L’arginina è un amminoacido poco rappresentato perché è estremamente basico e genera cariche elettriche sulla
superficie delle proteine che lo contengono, andando a modificarne le caratteristiche.
Gli amminoacidi (non neutrali) basici o acidi, che possono influenzare notevolmente le caratteristiche della proteina,
sono rappresentati all’interno delle catene polipeptidiche un numero di volte minore rispetto a tutti gli altri.
Non è una regola assoluta, la quantità di amminoacidi non neutrali all’interno della catena polipeptidica dipende
anche dal tipo di proteina: gli istoni ad esempio hanno una certa quantità di amminoacidi basici mentre proteine acide
presentano pochissima arginina o amminoacidi basici in generale.

Nel caso particolare di ARGININA e LISINA (l’arginina è rappresentata da sei combinazioni mentre la lisina è specificata
da due combinazioni) ci aspetteremmo logicamente che, a parte i vincoli legati alle cariche elettriche, in una proteina
basica dovremmo avere più arginina che lisina.
È infatti più probabile che un pezzo di DNA reclutato a diventare gene abbia più volte le sei combinazioni che le due.
Nel caso specifico non è così ma è strano perché normalmente negli altri casi si verifica questa situazione.
Sembrerebbe che l’arginina sia arrivata molto dopo rispetto alla lisina, è infatti un prodotto dell’evoluzione degli
amminoacidi formati con le sintesi abiotiche (reazioni simulate con le apparecchiature di Miller).
Nelle cellule non ci sono amminoacidi strani, si trovano quelli più rappresentati tra i prodotti delle sintesi abiotiche ma
ci sono delle eccezioni: l’amminoacido ORNITINA non è presente nelle proteine attuali pur essendo tra quelli più
rappresentati.
L’arginina, invece, si trova nelle proteine attuali pur essendo un amminoacido sicuramente derivato dal metabolismo
e quindi non molto rappresentato.
In realtà all’interno delle cellule l’ornitina c’è ma viene utilizzata per la sintesi dell’arginina.

2
L’ornitina è molto simile alla lisina: differiscono soltanto per un –CH2 nel gruppo –R.

(TUTTI GLI AMMINOACIDI DIFFERISCONO TRA DI LORO SOLO PER IL GRUPPO –R)

La basicità di ornitina e lisina è uguale, l’arginina invece ha due azoti ed è quindi molto più basica.
L’arginina essendo molto più basica modifica in maniera più consistente le cariche elettriche superficiali a livello della
proteina.

Nella maggioranza delle proteine vecchie troviamo una situazione anomala: la lisina è dominante rispetto all’arginina.
Nelle proteine vecchie si trovava l’ornitina e nel momento in cui col metabolismo si è creata l’arginina ed è avvenuta la
sostituzione graduale di ornitina con l’arginina, le caratteristiche tridimensionali delle proteine sono state modificate:
con cariche elettriche di segno + in quantità maggiore la geometria finale della proteina è diversa e porta al non
funzionamento (infatti un catalizzatore enzimatico che cambia la sua geometria non funziona più).
La conseguenza del non funzionamento di queste proteine è stata la morte di molti organismi nei quali il metabolismo
è andato in tilt.
Sono sopravvissuti solo gli organismi che, a seguito di mutazioni, al posto dell’arginina hanno inserito la lisina (anche
se la lisina è specificata da due sole combinazioni) nelle proteine vecchie. Queste mutazioni consentivano alla proteina
di mantenere la propria conformazione e quindi la sua attività.
Nelle proteine nuove/ più giovani (una proteina presente solo negli eucarioti è palesemente una proteina nuova e
quindi giovane. il criterio di più nuovo deriva dal fatto che le possiedono soltanto alcuni organismi e non tutti)
troviamo il contrario: c’è più arginina che lisina come ci si aspetterebbe logicamente.

Il tRNA deve portare il giusto amminoacido che corrisponde al suo anticodone: la corretta sintesi della proteina
dipende dal fatto che ogni tRNA leghi l’amminoacido corrispondente alla tripletta che lo codifica.

3
Gli enzimi che legano l’aa al tRNA sono altamente specifici, precisi e selettivi (non si troverà mai un tRNA legato ad un
aa diverso da quello acui era destinato).
L’enzima che lega l’amminoacido non deve sbagliare: se l’enzima sbagliasse la situazione sarebbe ingestibile perché le
sequenze codificanti potrebbero codificare per più catalizzatori perché la struttura delle proteine enzimatiche sarebbe
variabile.

Questi enzimi fanno parte della famiglia degli AMMINOACIL-tRNA-SINTETASI: enzimi che sintetizzano l’amminoacil-
tRNA, ossia un RNA-transfert con un amminoacido legato.
Questi enzimi sono ognuno specifico per un certo amminoacido tuttavia, nel momento in cui hanno provato ad
utilizzare l’enzima che lega l’arginina in presenza di sola ornitina, hanno scoperto che l’enzima funziona con tutti e due
gli amminoacidi seppur abbiamo –R diversi (è l’unico enzima in grado di legare due amminoacidi, oltre all’arginina
funziona soltanto con l’ornitina; non con lisina o altri amminoacidi perché è comunque un enzima altamente specifico.
Se si mettono insieme ornitina ed arginina l’enzima “preferisce” l’arginina, ossia l’aa a cui è destinato principalmente).
L’ipotesi è che probabilmente quell’enzima, che mantiene anche oggi la possibilità di legare bene l’ornitina oltre
all’arginina, fosse un enzima nato con lo scopo di legare l’ornitina e che poi, nel momento in cui col metabolismo si è
cominciato a produrre l’arginina, abbia cominciato ad inserire l’arginina modificando le caratteristiche geometriche
della sua proteina.
La proteina modificata non funzionava più e quindi sopravvivevano, tra gli organismi, soltanto quei mutanti che, a
seguito di mutazioni, specificavano amminoacidi con basicità uguale a quella dell’ornitina.

Gli amminoacidi hanno una parte della molecola comune (-NH2 e -COOH) a tutti (tranne alla prolina che è un gruppo
imminico, anziché amminico. Nella prolina il gruppo -NH2 non è libero ma una posizione del gruppo è occupata da un
legame con un atomo di C e per questo la molecola ha la forma di un anello.
La prolina è un imminoacido, la sua presenza nella struttura di una proteina ha effetti notevoli in termini di
conformazione perché non può fare legami ad H e di conseguenza strutture secondarie ad 𝛼-𝑒𝑙𝑖𝑐𝑎.
Se per una mutazione la prolina prende il posto di un altro amminoacido all’interno della catena polipeptidica la
proteina non sarà più in grado di svolgere le proprie funzioni perché cambierà la sua geometria, un tratto 𝛼-𝑒𝑙𝑖𝑐𝑎
diventa un tratto disordinato.)
Gli amminoacidi differiscono tra di loro per il solo gruppo –R.

4
Se tutti gli amminoacidi hanno una consistente parte della struttura in comune

come fa l’enzima amminoacil-t-RNA-sintetasi a non sbagliare e a legare l’amminoacido giusto?

Dal punto di vista della termodinamica non esiste un modo per impedire ad un amminoacido di entrare nel sito attivo
di un enzima che ne lega un altro, ma allora come fa l’enzima ad essere così specifico? Come può discriminare un
amminoacido da un altro se questi sono molto simili tra di loro?

L’amminoacido deve essere legato al tRNA: il legame avviene a livello del nucleotide contenente adenina che si trova
all’estremità in 3I del tRNA, dopo due citosine.
Tutti i tRNA finiscono con la sequenza CCA:
 nel caso dei procarioti è contenuta nei geni
 nella maggior parte degli organismi è aggiunta dopo. La ragione di questa aggiunta a posteriori è che gli
enzimi amminoacil-tRNA-sintetasi, che derivano da un unico enzima ancestrale, sanno legare un
amminoacido a tRNA solo se c’è la sequenza CGA.

Gli enizmi amminoacil-t-RNA-sintetasi sono una sorta di fossili molecolari, ossia enzimi antichi miliardi di anni derivati
da un precursore unico, condivisi, che si sono differenziati e hanno acquisito specificità per legare i diversi
amminoacidi.
Il loro meccanismo di riconoscimento è rimasto inalterato.
In qualsiasi organismo, batteri inclusi, ci sono più di 20 amminoacil-t-RNA-sintetasi (in numero sempre superiore a
quello degli amminoacidi).

Gli enzimi amminoacil-t-RNA-sintetasi hanno tre substrati: AMMINOACIDO, ATP, t-RNA.


Catalizzano il legame ad alta energia tra il giusto aa e il tRNA con l’anticodone giusto, usando l’energia della molecola
di ATP: senza ATP il legame tra amminoacido e tRNA non potrebbe avvenire, la reazione che porta alla formazione del
legame è infatti una reazione che avviene a patto che sia fornita energia al sistema (reazione endoergonica).

La reazione AMMINOACIDO + ATP + tRNA AMMINAOCIL~tRNA + AMP + P~P


è suddivisibile in due step:
1. AMMINOACIDO + ATP  AMMINOACIL~AMP + P~P
È lo stadio veloce della reazione.
L’amminoacido entra nel sito attivo dell’enzima, l’enzima idrolizza l’ATP liberando pirofosfato (due P legati
insieme; nella cellula non si trova pirofosfato perché appena liberato intervengono le pirofosfatasi, enzimi
ubiquitari, che rompono il legame tra i due P) e l’amminoacido viene legato al fosfato che è rimasto solo.
L’idrolisi dell’ATP consiste nella rottura di due legami ad alta energia con conseguente liberazione di energia
che viene utilizzata per formare un altro legame ad alta energia tra aa e fosfato.
Amminoacido e fosfato sono tenuti insieme da un legame ad alta energia, indicato convenzionalmente con
un segno circonflesso, e formano l’amminoacil-AMP.
Questo tipo di reazione non potrà mai raggiungere l’equilibrio perché si toglie continuamente un prodotto (il
pirofosfato) dall’equilibrio: ogni volta che ci sono un enzima e un tRNA liberi avviene la reazione perché il
sistema è completamente fuori dall’equilibrio.
Questo step non è completamente selettivo: se l’amminoacido, anche sbagliato, entra nel sito attivo
dell’enzima la reazione di irdolisi di ATP avviene.

5
2. AMMINOACIL~AMP + tRNA  AMMINAOCIL~tRNA + AMP (oppure AMMINAOCIDO + tRNA + AMP)
È lo stadio lento della reazione, è altamente selettivo.
Il tRNA interagisce con l’enzima, se lo riconosce ed è quello giusto lo lega a sé. L’enzima non riconosce il tRNA
dall’anticodone perché l’anticodone “sta giù”; lo riconosce direttamente da altre parti della struttura
tridimensionale.
Se si legano l’enzima andrà a trasferire l’amminoacido legato al fosfato dell’AMP al nucleotide contenente
adenina che si trova sul terminale del tRNA si forma un amminoacil-tRNA- ossia un tRNA caricato co un
amminoacido e un AMP.

La reazione diventa selettiva a livello dello stato di transizione (momento in cui il sistema è reversibile nel quale si
stanno formando i nuovi legami e contemporaneamente rompendo i vecchi): se nell’ambito del sito attivo c’è la
massima complementarietà con l’amminoacido allora si formerà il complesso attivato e la reazione andrà verso destra
con la formazione dei prodotti.

Se nel sito attivo dell’enzima entra un amminoacido diverso da quello destinato a quel catalizzatore, magari un po’ più
piccolo ma complessivamente con caratteristiche simili, lo stato di transizione è quasi uguale perché il sito attivo non
è stato completamente occupato dal gruppo R.
Nello stato di transizione la reazione è reversibile per cui, non essendo l’aa giusto per quel sito attivo, la reazione
inverte il suo senso e torna indietro verso sinistra: si liberano in ordine l’amminoacido, il tRNA e AMP.
Questo tipo di situazione è valida per tutti gli enzimi che sono catalizzatori: non si sono evoluti per legare bene il
substrato ma si sono evoluti per riconoscere lo stato di transizione.
Il riconoscimento dello stato di transizione è il momento di funzionamento dell’enzima, il momento nel quale può
discriminare gli aa che gli si legano.

Grazie al riconoscimento degli aa sbagliati nello stato di transizione, gli enzimi amminoacil-tRNA-sintetasi non
sbagliano mai.
In ogni caso però, sia che l’aa sia giusto sia che sia sbagliato, non si può impedire che l’aa sbagliato entri nel sito attivo
e si ha consumo di ATP.
Se si mette l’enzima che dovrebbe legare l’alanina al tRNA in vitro con solo glicina non si troverà mai una glicina legata
ma si vedrà tutto l’ATP idrolizzato.
Lo stadio veloce della reazione avviene sempre, lo stadio lento no: in questo modo l’aa legato al tRNA è sempre giusto.

Esistono due famiglie geniche di amminoacil-tRNA_sintetasi, gli enzimi si differenziano in due classi in base al modo
con il quale interagiscono e legano gli amminoacidi ai loro tRNA(il tipo di legame che si forma è sempre lo stesso):

6
o ENZIMI DI CLASSE I: legano l’amminoacido all’ossidrile in posizione 2I, sono generalmente monomerici

o ENZIMI DI CLASSE II: legano l’amminoacido all’ossidrile in posizione 3I, sono generalmente dimerici

Nelle immagini tridimensionali, che sono abbastanza reali, possiamo distinguere gli enzimi di classi diverse.
Le immagini derivano da elaborazioni di immagini a raggi X.

Una molecola di DNA ha 6 possibili schemi di lettura, la trascrizione riduce a tre i possibili schemi di lettura del DNA.

7
I RIBOSOMI sono i ribozimi più conosciuti (un ribozima è una molecola di RNA in grado di catalizzare una reazione. Il
termine ribozima deriva da acido ribonuceico e enzima.)
Il RIBOSOMA è una struttura composta da RNA e proteine (composizione mista).
RNA e proteine interagiscono formando due subunità (MINORE E MAGGIORE) che si assemblano formando il
ribosoma funzionale.
Subunità minore e maggiore sono diverse tra loro:
 Nelle subunità minori le proteine sono dentro e l’RNA è fuori (sorta di cestino di RNA con le proteine dentro);
 Nelle subunità maggiori le proteine sono all’esterno intorno all’RNA;
Le subunità ribosomiali sono bitorzolute, sono molecole molto grosse che interagiscono e man mano che si avvicinano
si orientano; la modalità di assemblamento non è ancora stata chiarita perché è un’interazione molecolare molto
complessa che chiama in causa un gran numero di proteine e di fattori. L’assemblamento avviene nel citosol: quando
la subunità minore lega l’mRNA, arriva poi la subunità maggiore che si lega a sua volta a quella minore con attaccato
l’mRNA.

I ribosomi dei procarioti e degli eucarioti sono diversi da un punto di vista di dimensioni (quelli degli eucarioti sono più
grandi di quelli dei procarioti) ma dal punto di vista della funzione sono identici.
Quelli dei batteri sono più piccoli di quelli degli eucarioti, hanno un minor numero di proteine e gli rRNA sono diversi
per quanto riguarda le sequenze che li compongono ma sono uguali tra di loro per quanto riguarda la struttura
tridimensionale (funzionano allo stesso modo anche se hanno dimensioni diverse).

Negli eucarioti:

o La subunità maggiore pesa 3/3,5 milioni di daltons ed è formata da un RNA 28S, un RNA 5,8S, un piccolo RNA
5S e 45 proteine.
(la subunità maggiore degli eucarioti è dimensionalmente più grande rispetto a quella dei procarioti)
o L’assemblaggio del ribosoma (subunità maggiore + subunità minore) inizia nel nucleo (nel nucleolo
confluiscono proteine e subunità ribosomiali) ma qui il ribosoma non è funzionale; lo sarà una volta
completato l’assemblaggio nel citosol.
Nel nucleo le particelle che daranno luogo alle due subunità si assemblano mentre si muovono; sono
trasportate a livello di pori di membrana, una volta nel citoplasma ci sono degli enzimi che intervengono e
completano l’assemblaggio.
La maturazione finale avviene quindi nel citoplasma.
Quando arrivano nel citoplasma ci sono certi tipi di proteine (molte sono enzimi) che devono essere riportate
dentro il nucleo.
Il meccanismo di formazione e il trasporto dei ribosomi non è del tutto chiaro (c’è piccolo consumo di ATP ma
che non da energia per spostare le strutture quindi non è chiaro come siano veicolate e trasportate nella
cellula.)
o L’ mRNA porta un solo gene
o Il ribosoma si lega in zone specifiche dell’mRNA: al Cap o alle sequenze IRES (internal ribosome entry site).
Una volta legato il ribosoma scorre fino alla prima sequenza AUG che trova.
Sulla sequenza AUG si assemblano le subunità del ribosoma e comincia il processo di traduzione.

8
La traduzione della proteina si blocca quando il ribosoma incontra una delle sequenze di stop e si stacca
dall’mRNA.

Nei procarioti:

o la subunità maggiore pesa 1,8 milioni di daltons ed è formata da RNA 23S, da un piccolo RNA 5S (di 120
nucleotidi) e da 34 proteine.
o I ribosomi si assemblano e vengono subito utilizzati
o Tutte le regioni del DNA sono codificanti: i geni del battere sono organizzati in operon, ossia entità di
trascrizione con un unico promotore che sintetizzano mRNA poligenici.
Questi mRNA contengono più sequenze geniche spaziate da un pezzo di RNA.
Essendo poligenico l’mRNA ha più sequenze AUG di inizio.
(l’AUG presente all’interno dell’mRNA non è necessariamente una tripletta d’inizio, può essere anche un
amminoacido della catena).
Nel caso dei procarioti il ribosoma non può staccarsi dall’mRNA quando incontra una sequenza di stop perché
l’mRNA batterico è poligenico.
Se nei procarioti la traduzione avvenisse allo stesso modo di quella degli eucarioti: i procarioti riuscirebbero a
tradurre soltanto il primo gene al quale il ribosoma si lega.
o Nei procarioti il ribosoma non ha specifiche regioni di legame ma la subunità minore può interagire con
l’mRNA legandosi in qualunque sua regione.
Il ribosoma nei procarioti è in grado di distinguere le triplette AUG di inizio da AUG che si trovano nella zona
codificante e sono amminoacidi della catena polipeptidica.
Nei batteri le triplette AUG di inizio traduzione sono precedute da piccole sequenze che interagiscono con
l’rRNA della subunità minore: sequenze di Shine-Dalgarno.
Il ribosoma interagisce e si lega a queste sequenze, cambia la sua geometria e si blocca sul primo AUG che
incontra.
o Ci sono due tipi di tRNA che portano la metionina, questi due hanno lo stesso anticodone ma uno porta una
metionina normale e l’altro una metionina formilata (tRNA dedicato all’inizio della catena).
La metionina formilata presenta il gruppo amminico formilato (= legato ad un acido formico), l’amminoacido
in questa forma può trovarsi soltanto all’inizio della catena polipeptidica (come primo amminoacido di una
serie) perché non ha il gruppo amminico e non è in grado di legare altri amminoacidi.

Ci sono dei ribosomi anche in strutture subcellulari come mitocondri e cloroplasti: sono un po’ più piccoli di quelli
procariotici.
I ribosomi degli archea sono ribosomi piccoli come quelli dei batteri, ma sono molto più simili a quelli degli eucarioti
tantoché se si prova ad assemblare subunità minori e maggiori creando un ribosoma misto quello archea-battere non
funzionerà, mentre paradossalemente quello archea-eucariote funzionerà.
Questo significa che il ribosoma archea, pur essendo di dimensioni identiche a quello batterico, ha delle differenze
sostanziali per cui l’assemblaggio non funzione.
I nostri ribosomi, anche se più grandi, sono di tipo archea.

9
Una delle funzioni dei ribosomi è quella di definire la cornice di lettura: la subunità minore del ribosoma riconosce la
sequenza AUG (unico meccanismo di riconoscimento, valido per procarioti ed eucarioti), il ribosoma si assembla ed
automaticamente specifica come leggere tutto il resto dell’mRNA fino alla sequenza di STOP.

Quando il ribosoma è assemblato si delimitano 3 SITI /CAVITÀ:


1. SITO A (amminoacidico) ACCETTORE  a livello del quale entra il tRNA con l’amminoacido
2. SITO P PEPTIDIDICO  nella subunità maggiore, grazie alla peptidil-transferasi, avviene lo spostamento
dell’aa dal tRNA alla catena polipeptidica; è in questo sito che avviene la creazione del legame peptidico tra
gli amminoacidi.
La peptidil transferasi non è un enzima ma un ribozima: la catalisi è quindi affidata ad un RNA, la funzione
delle proteine nei ribosomi è solo strutturale e non funzionale.
3. SITO E (exit) si trova il tRNA dopo che ha ceduto l’aa, è il sito di eliminazione ed espulsione del tRNA perché
non è più in contatto con nulla

Il sito A e il sito P si formano con il concorso


delle due subunità e sono a contatto con
l’mRNA, il sito E si forma solo nella subunità
maggiore e non è in comunicazione con
l’mRNA:

La catena polipeptidica (filo di amminoacidi)


nascente esce attraverso un tunnel /tubo
posizionato tra le subunità maggiore e
minore e formato da rRNA e proteine
ribosomiali.
La proteina attraversa questo canale senza
interagire fortemente: ciò significa che è
composta da specifici amminoacidi (non
tutto è quindi traducibile come si pensava !
un ribosoma può tradurre soltanto
specifiche sequenze di amminoacidi).
In una singola cellula, grazie ai ribosomi, si
sintetizzano circa 13.000 proteine al
secondo.

10
La SINTESI PROTEICA O TRADUZIONE è uno dei processi che consuma più energia perché va avanti sempre: si
interrompe solo quando la cellula entra in divisione ma anche durante la duplicazione del DNA c’è un attivissima
sintesi di proteine (formazione di proteine istoniche e geniche).

Meccanismo della sintesi:

1) La prima fase comincia quando la subunità minore del ribosoma si attacca al filamento di mRNA presso
l’estremità 5I , ponendo in evidenza il primo codone AUG. (nei procarioti il ribosoma si attacca all’estremità
iniziale dell’mRNA anche se il resto della molecola è ancora in fase di trascrizione: nei procarioti, a differenza degli
eucarioti, trascrizione e traduzione possono avvenire contemporaneamente)
Il primo tRNA si colloca in modo da appaiarsi al codone d’inizio dell’mRNA (5I-AUG-3I), complementare
all’anticodone del tRNA (3I-UAC-5I).
La metionina AUG sarà quindi il primo amminoacido della catena polipeptidica in via di formazione.
La combinazione tra subunità minore, mRNA e tRNA d’inizio è detta complesso di inizio; una volta che questo si è
formato. La subunità maggiore si attacca a quella minore ed il tRNA d’inizio va ad occupare il sito P della subunità
maggiore.
L’energia necessaria per questa tappa, che completa la fase iniziale, viene fornita dall’idrolisi del nucleotide
guanosina trifosfato ( GTP= composto ad alta energia responsabile di attività enzimatiche).
L’idrolisi di GTP permette anche al ribosoma di traslocare di tripletta in tripletta.
(l’ATP interviene soltanto nella formazione del legame tra amminoacido e tRNA)

2) All’inizio della seconda fase, quella di allungamento, il secondo codone dell’mRNA si trova in corrispondenza del
sito A della subunità maggiore. Un tRNA con l’anticodone complementare si inserisce sulla molecola di mRNA e,
con il suo amminoacido, viene ad occupare il sito A del ribosoma. A questo punto entrambi i siti, A e P, sono
occupati e si forma un legame peptidico tra i due amminoacidi.
L’mRNA, dopo la formazione del legame tra i due amminoacidi, score in avanti di un codone nel ribosoma, di
conseguenza:
 Il primo tRNA si sposta nel sito E e viene liberato;
 Il secondo tRNA, al quale sono attaccati il primo e il secondo amminoacido, passa dal sito A al sito P;
 Un terzo complesso amminoacido-tRNA si inserisce nel sito A, adesso libero, di fronte al terzo codone
dell’mRNA;
Quindi l’operazione si ripete. Di volta in volta il sito E riceve il tRNA che deve allontanarsi, il sito P accetta il tRNA
recante la catena polipeptidica in formazione e il sito A accoglie il tRNA con il nuovo amminoacido che dovrà
aggiungersi alla catena.

11
3) All’estremità finale della catena è presente uno dei tre codoni di stop che portano il segnale di arresto. Non
esistono tRNA con anticodoni corrispondenti a queste triplette di stop e, di conseguenza, durante la fase di
terminazione nel sito A non entrerà alcun tRNA, ma si inserirà una piccola proteina detta fattore di rilascio.
Il fattore di rilascio ha la funzione di mantenere attiva la geometria del ribosoma: come risultato il ribosoma
cercherà di cedere la catena polipeptidica; non essendoci alcun aa ad attenderla verrà ceduta all’acqua.
Quando si giunge ad un codone di terminazione, la traduzione cessa, la catena polipeptidica esce dal ribosoma e
le due subunità ribosomiali si separano.

La molecola di mRNA è lineare e molto instabile, nel


corso della sintesi proteica le molecole di mRNA
assumono una forma a spirale o possono addirittura
essere circolarizzate tramite la formazione di un
legame chimico tra le estremità 3I e 5I.

Questa geometria:
a. consente alla cellula di svolgere più facilmente il
processo della sintesi proteica perché l’mRNA
non può ripiegarsi come vuole
b. difende le estremità dell’mRNA dalle RNAasi

Oltre alla geometria circolare, un altro elemento che


impedisce all’mRNA di ripiegarsi è la presenza di più
ribosomi (che lo stabilizzano).

L’analisi di singoli ribosomi mentre traducono un mRNA rivela che la traduzione avviene con:
• cicli di traslocazione. La traslocazione di un codone si verifica in meno di 0,1 sec, ciò significa che in 1 s un
ribosoma si sposta di 10 triplette ed inserisce quindi 10 aa alla catena polipeptidica.
• successive pause. Le pause generano un rallentamento del tempo di sintesi complessivo. Le pause sono
dovute a diversi fattori, tra questi: il codice genetico è degenere e più triplette possono specificare lo stesso
aa ma non tutti i tRNA sono presenti nella stessa quantità. Ogni tripletta ha un tRNA specifico e non funziona
allo stesso modo di triplette che codificano lo stesso aa.
Le pause sono dovute al fatto che il ribosoma “aspetta” il giusto tRNA per una tripletta.
con una durata media di 2,8 sec.

Il prodotto finale della sintesi proteica è la PROTEINA, ossia un polipeptide.


La proteina è una catena di amminoacidi tenuti insieme uno all’altro da un legame peptidico, ovvero un legame che si
forma tra il gruppo amminico di un amminoacido e il gruppo carbossilico dell’altro, creato attraverso una reazione di
condensazione con perdita di una molecola di acqua.
Il legame peptidico ha un parziale carattere di doppio legame e in termini di geometria della proteina le conferisce una
struttura abbastanza rigida.
Una proteina è una molecola nella quale vengono convenzionalmente distinti vari livelli di organizzazione (possono
essere tre o quattro a seconda della proteina):
➢ STRUTTURA PRIMARIA: sequenza di amminoacidi tenuti insieme da legami peptidici. È direttamente
codificata dalla sequenza di nucleotidi del gene;
➢ STRUTTURA SECONDARIA: ripiegamento dovuto alla formazione di legami ad idrogeno tra gruppi −C≡O e
gruppi –NH di diversi legami peptidici. I ripiegamenti possono essere di due tipi:
 alfa-elica  la proteina ricca di questo tipo di legami è morbida e occupa molto spazio.
 beta-pieghettata  la proteina ricca di queste strutture è molto compatta e rigida.
I legami di tipo beta si formano tra –CO e –NH che possono appartenere alla stessa proteina
ma si trovano in regioni diverse e lontane tra di loro, oppure possono appartenere a due
proteine filamentose diverse.

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Il prione è una proteina chiamata in causa nella sindrome della mucca pazza. Queste proteine possono passare
dall’avere una struttura tutta alfa-elica ad avere una struttura totalmente beta, quindi passa dall’essere una
proteina molto morbida ad essere rigida e compatta.
Quando diventa una struttura principalmente beta comincia a precipitare come fosse un mattone; si
costituiscono dei muri all’interno della cellula che schiacciano gli altri tipi di proteine e impediscono il
funzionamento della cellula.

la presenza dell’imminoacido prolina determina l’interruzione della struttura secondaria, ciò perché quando forma il
legame peptidico la prolina non ha NH.
Il tratto ordinato in presenza di prolina diventa disordinato e assume il nome di random coil.

➢ STRUTTURA TERZIARIA: ripiegamento finale della proteina ad opera di vari tipi di legame (ionico, idrofobico,
covalenti come ponti –S–S–) tra i gruppi R dei vari amminoacidi. È la reale immagine (geometria finale) della
proteina.
La struttura terziaria, responsabile della funzione della proteina, non è specificata dal gene ma dipende dalle
interazioni con l’ambiente in cui si forma;
➢ STRUTTURA QUATERNARIA: struttura di proteine con grandi dimensioni, è l’unione di subunità, ossia
proteine indipendenti con struttura terziaria, unite da legami deboli tra i gruppi R.
I legami deboli hanno un ruolo importante nella formazione di strutture quaternarie.
Le strutture quaternarie si formano perché si uniscono spontaneamente delle macromolecole. Le
macromolecole si sono unite perché l’aumento di entropia dell’acqua ha fornito l’energia necessaria; le due
macromolecole avranno una condizione più ordinata mentre l’acqua i trova in una situazione di massimo
disordine molecolare (la maggior parte delle interazioni tra macromolecole biologiche non è guidata dal
consumo di energia libera di Gibbs ma dall’aumento di entropia);

Es. emoglobina,
formata da 4
gruppi eme

proteine diverse possono condividere uguali domini o motivi:

Un insieme di elementi di strutture secondarie che svolgono la stessa funzione, con la stessa modalità, in proteine
diverse formano un MOTIVO. (es. proteine che legano il Ca, lo legano tutte con la stessa modalità)
In proteine diverse, un motivo ha diversa sequenza di amminoacidi ma resta invariata la forma complessiva e la
posizione nello spazio di alcuni amminoacidi.

Proteine di grandi dimensioni sono costituite da un insieme di strutture terziarie dette DOMINI.

Un dominio è parte di una grande proteina responsabile di una specifica funzione ed ha una specifica struttura
tridimensionale corretta.

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Gli esoni codificano per un dominio (o parte di un dominio) di una catena polipeptidica, i primi domini che si formano
in una proteina andranno ad influenzare i successivi ( la proteina si forma come una somma di esoni).
Una proteina piccola può essere fatta da un singolo dominio mentre proteine più grandi sono costituite da più domini.
Proteine grosse sono costituite da più domini e quindi da più esoni e non da uno unico perché servirebbe un mRNA
lunghissimo ( e più è lungo e più è instabile), e perché nel corso della sintesi è meno probabile che qualche raro errore
possa avvenire.

Le proteine sono formate da un


insieme di domini. Proteine diverse
possono contenere domini uguali.
Ad esempio nei fattori di
coagulazione si possono ritrovare
regioni tridimensionali identiche a
quelle del sistema nervoso etc.

Varie condizioni patologiche, molto diverse fra di loro, hanno come elemento
centrale della loro insorgenza e della sintomatologia che le caratterizza il fatto che
una specifica proteina o gruppo di proteine simili assumono una conformazione
scorretta.
Un esempio è rappresentato dall’anemia falciforme (dovuta a sostituzione di un
nucleotide nelle catene beta dell’emoglobina. Cambia la polarità delle proteine e
quindi la loro geometria.), malattia ereditaria nella quale i globuli rossi dei pazienti
hanno una forma normale quando la pressione parziale dell’ossigeno è alta (a
livello dei polmoni), ma quando essa si abbassa (a livello dei capillari nei tessuti), si
deformano assumendo una forma a falce ed irrigidendosi.

Le proteine possono essere modificate prima della sintesi, queste modificazioni avvengono a carico degli esoni,
consistono in una sorta di splicing a livello della proteina; c’è possibilità di editing.
Le modificazioni post-traduzionali modificano forma della proteina e le interazioni con le altre molecole.

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1

STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE


LEZIONE 11
29/11/2017

Ruolo della superfamiglia delle GTPasi


Il nuovo t-RNA, dopo che l’amminoacil-t-RNA-sintetasi gli ha legato l’amminoacido, non si dirige da solo nel sito di
attacco della subunità maggiore del ribosoma, ma viene accompagnato da una proteina che appartiene alla famiglia
delle GTPasi (es.: la proteina EF-Tu). Le GTPasi legano il tRNA, cambiano forma e si attivano, scambiano il GDP con il
GTP e restando incollate al t-RNA lo accompagnano ad entrare nel ribosoma.
Se il t-RNA è giusto (corretto riconoscimento codone-anticodone) si posiziona sull’anticodone e l’enzima va ad
interagire con il ribosoma in una certa regione. In seguito l’enzima idrolizza GTP e l’energia liberata dal legame ad alta
energia con il fosfato, è utilizzata come energia conformazionale, quel particolare tipo di energia che permette alla
proteina di cambiare forma, staccarsi dal t-RNA e consegnarlo al ribosoma.
Se, come è possibile che sia, entra un t-RNA non corretto, questo non riesce a legarsi con l’anticodone, EF-Tu non
interagisce con il ribosoma e non molla il t-RNA, portandolo via con sé.
Il t-RNA è quindi liberato nel ribosoma e gli aa. sono legati grazie all’attività di peptidil-transferasi affidata all’r-RNA.
Successivamente la proteina EF-G interagisce con il ribosoma, per idrolisi di GTP avviene lo scorrimento della subunità
maggiore e il t-RNA, privato dell’aa., si viene a trovare nel sito E (uscita).
(N.B. non è il t-RNA che si sposta, è la subunità maggiore che scorre e il t-RNA si viene a trovare nel sito E).

Per ogni amminoacido che va a costituire la catena peptidica consumo 4 legami ad alta energia:
• 2 nel LEGAME AA. + t-RNA (idrolisi di ATP)
• 1 nel LEGAME t-RNA + ribosoma (idrolisi di GTP)
• 1 per SCORRIMENTO RIBOSOMA (idrolisi di GTP)
La proteina svolge funzioni fondamentali per la cellula ma ha un costo energetico molto elevato nel processo di
sintesi.

Le GTPasi sono una grande famiglia di proteine che seppur apparentemente diverse come molecola complessiva
hanno mantenuto identico funzionamento: interagiscono con qualcosa, cambiano forma, scambiano GDP con GTP,
compiono reazioni di idrolisi solo quando interagiscono con un certo bersaglio. Idrolizzato il GTP, il fosfato è liberato
ma il GDP resta. Sono proteine che hanno quindi 2 conformazioni, una conformazione quando hanno legato il GDP ed
una, quando hanno legato GTP. A seconda della conformazione legano molecole diverse.
Molte funzioni complesse sono legate a proteine di una stessa famiglia, varianti dello stesso gene, che utilizzano la
stessa informazione, non si è creato quindi un meccanismo diverso, ma si è mantenuto quello modificando il
bersaglio. Derivano tutte da un enzima ancestrale.
Le varie proteine sono codificate da geni diversi che però sono derivate da mutazioni dello stesso gene. Le GTPasi
indicano che molte funzioni complesse ed evolute sono riarrangiamenti di funzioni e di attività antecedenti. Dello
spazio informazionale del DNA ne usiamo poco. Queste proteine sono imparentate tra loro, funzioni complesse sono
legate a membri enzimatici imparentati tra di loro, non è costruzione di una cosa completamente nuova.

Famiglie di piccole GTPasi e loro ruoli:


• IF-2, EF-Tu, EF-G, RF-3: Initiation Factors, Elongation Factors, Releasing Factors.
• Ras: signalling dei fattori di crescita. Molte di queste sono oncogeni, perché una Ras mutata spinge la cellula
a proliferare.
• Proteine G (eterotrimeri ά, β, γ): signalling. Mediano una serie di trasduzione di segnali, solo la proteina G ά è
una GTPasi.
• Rab: indirizzamento e corretta fusione di vescicole.
• ARF: gemmazione di vescicole rivestite da proteine.
• Ran: trasporto di proteine dentro e fuori dal nucleo.
• Rho: Regolazione assemblaggio del citoscheletro.

Funzionamento delle GTPasi:


• idrolizzano il substrato GTP solo quando interagiscono con un opportuno bersaglio, diverso per i vari membri
di ogni sottofamiglia. Per le EF-Tu è la superficie del ribosoma.
• solo il fosfato prodotto dalla reazione di idrolisi viene liberato, il GDP viene invece mantenuto nel sito attivo.
La molecola a seguito della reazione cambia forma e questo fa mantenere attaccato il GDP.
2

• solo a seguito di una interazione molecolare con un bersaglio diverso per i vari membri della famiglia,
l’enzima è in grado di liberare il prodotto GDP ed assumere la forma giusta per legare una nuova molecola del
substrato GTP. Il bersaglio per la EF-Tu è un t-RNA legato ad un aa., a seguito del legame, l’enzima modifica la
sua forma e il GDP si viene a trovare fuori, si forma un sito ad elevatissima affinità per il GTP.

La mutazione di quel gene ha lasciato inalterato il sito attivo, che verrà attivato e cambierà in seguito all’interazione
con bersagli diversi.
Due conformazioni, due diverse interazioni: in ogni forma danno luogo ad effetti diversi meccanismi ON/OFF.

GAF: fattore di
attivazione della GEF: GTP exchange
GTPasi. factor. Gli enzimi delle
varie famiglie
interagiscono con
diversi bersagli GEF.

“Un meccanismo anomalo”. Gli enzimi della famiglia delle GTPasi sono enzimi strani poiché un enzima normale,
solitamente, lega il substrato, catalizza la reazione e libera i prodotti. Questi legano il substrato, quando ad esempio
interagiscono con t-RNA, e lo legano in maniera anomala poiché loro hanno già GDP che è parte del prodotto. Dopo
che è avvenuto il corretto riconoscimento codone-anticodone le GTPasi formano il prodotto ma non lo liberano
completamente, rilasciano il fosfato ma tengono legato il GDP nel sito attivo che rimane così bloccato. Il GDP sarà
scambiato poi con GTP solo a seguito dell’interazione con t-RNA.

Due diverse conformazioni = due diverse interazioni


1. una con GDP legato
2. una con GTP legato
Le due conformazioni danno luogo ad effetti diversi, e possono convertirsi l’una nell’altra a seguito di interazioni.
Si comportano come un interruttore di tipo ON/OFF

Il citosol cellulare
Il citosol è la matrice liquida colloidale (è ricco di molecole, ad esempio le proteine) che lambisce gli organuli
subcellulari e in cui si trova dispersa qualunque molecola presente all’interno della cellula. Nel citosol si verificano:
1. Regolazione del ciclo cellulare.
2. Assemblaggio dell’apoptosoma (complesso che media l’apoptosi, la morte cellulare programmata).
3. Organizzazione del citoscheletro.
4. Glicolisi.
5. Ciclo pentosi-fosfati (porta alla formazione del ribosio).
6. Sintesi dei desossiribonucleotidi (sintetizzati nel citosol e portati nel nucleo durante la duplicazione del DNA).
7. Formazione amminoacil-tRNA (gli RNA escono dal nucleo senza nulla, solo nel citosol legano l’aa.).
8. Trasduzione del segnale nel corso della comunicazione tra cellule.
Nel citosol trovo molte molecole che interagiscono con molteplici reazioni chimiche. Ad esempio:
• alcune proteine (enzimi, proteine del citoscheletro che possono assemblarsi o disassemblarsi).
Grande quantità di proteine che la cellula contiene sono chiuse in compartimenti  EFFETTO OSMOTICO TRA
CITOSOL E AMBIENTE ESTERNO È RIDOTTO. Un battere ha un effetto osmotico maggiore poiché è piccolo e
pieno di molecole.
• mRNA che fuoriescono dal nucleo.
• tRNA con l’aa. legato.
• subunità di ribosomi pronte per assemblarsi e realizzare la sintesi proteica.
3

Sintesi di proteine nel citosol e loro destinazione


La funzione di una proteina dipende da una corretta struttura tridimensionale, e tale geometria, essendo l’espressione
dell’informazione (la sequenza degli amminoacidi), è scritta nel DNA.
I prodotti dei geni (proteine) non sono, quindi, sequenze a caso ma assumono struttura tridimensionale solo dopo un
processo di selezione. Può verificarsi, infatti, anche il caso in cui esse non la raggiungano. Se io inventassi una
sequenza di amminoacidi a caso, questa potrebbe non raggiungere una struttura compatta. Si fermerebbe in uno
stato chiamato “molten globule”.
Se una mutazione, ad esempio, fa cambiare qualcosa, la proteina non funziona più.
La struttura tridimensionale può essere raggiunta prima o poi a seconda della regione in cui la proteina deve svolgere
le sue funzioni e in base alla posizione del suo bersaglio.
Se una proteina è destinata ad agire nel citosol, raggiungerà immediatamente la struttura 3D nel citosol. Un enzima
destinato al nucleo può raggiungerla nel citosol o nel momento in cui incontra l’organulo bersaglio. Un enzima
destinato al perossisoma raggiungerà la sua conformazione solo nell’organulo.
La sintesi di proteine spesso inizia e termina nel citosol, altre volte finisce solo nel reticolo endoplasmatico ruvido
(RER).
Non tutte le proteine sintetizzate nel citosol restano nel citosol, alcune andranno nel nucleo, nei mitocondri o nei
perossisomi. Quelle che vanno negli organelli sono mantenute inattive. Le proteine che svolgono le loro funzioni nel
citosol e quelle destinate al nucleo assumono nel citosol una corretta struttura tridimensionale. Quelle destinate al
nucleo però raggiungono sì la strutt. 3D, ma hanno sequenze segnale. Nell’insieme dei loro amminoacidi, alcuni hanno
la funzione di segnale, determinano interazioni con importine, GTPasi Ran e attivano meccanismi di ingresso nel
nucleo. Tali meccanismi possono avvenire immediatamente, come nel caso degli istoni, che dopo essere stati
sintetizzati ed acetilati formano l’ottamero e quest’ultimo è portato nel nucleo con struttura già definitiva. L’RNA
polimerasi è assemblata e portata dentro il nucleo, fuori non potrebbe agire. Alcune proteine come i fattori di
trascrizione sono sintetizzati nel citosol ma bloccati da un complesso quaternario, vanno nel nucleo solo in risposta a
certo stimolo. Solo con la disgregazione del complex quaternario (con fosforilazione) il fattore è liberato e può entrare
nel nucleo interagendo con le importine. L’ingresso dentro il nucleo può avvenire prima o poi.

• Molecole trasportate dal Nucleo verso il Citosol: subunità maggiore e subunità minore del ribosoma, tRNA,
mRNA, RNA 7S delle SRP.
• Molecole trasportate dal Citosol verso il Nucleo: un gran numero di proteine ed enzimi, ad esempio le DNA
polimerasi, le RNA polimerasi, i fattori di trascrizione, le proteine dei ribosomi, gli istoni, ecc.

“Molten globule”. Un filamento di amminoacidi, interagendo con l’acqua, tenderà ad organizzarsi nello spazio
formando elementi di struttura secondaria, potrà sviluppare tratti ad α-elica ed iniziare ad assumere struttura
tridimensionale spontaneamente mediante interazione con l’ambiente esterno. La struttura mano a mano che si
forma tende a ripiegarsi, i gruppi R idrofobici verranno spinti all’interno e i gruppi idrofilici all’esterno. Il percorso
verso la compattazione, attraversa stadi conformazionali chiamati molten globule, globulo fuso. La proteina ha già una
sua struttura ma è lassa, non chiusa. Non ci sono ad esempio i ponti disolfuro, la cui formazione è affidata al
glutatione. La proteina sta assumendo la geometria ma non riesce a chiudersi, resta allo stato di molten globule, che è
uno stato aperto con gruppi idrofobici esterni, i quali, se la proteina rimane in questo stato, sono riconosciuti dal
complesso di degradazione e la proteina sarà eliminata. Se la proteina ha la sequenza giusta si chiuderà, e avrà la
struttura definitiva. Alcune proteine sintetizzate nel citosol restano allo stato di molten globule, a causa di una
specifica sequenza di amminoacidi: hanno un peptide in più che impedisce la chiusura della molecola con tutto
l’idrofobico interno e l’idrofilico esterno.

Caratteristiche generali delle proteine sintetizzate nel citosol: ruolo del Glutatione
La formazione di ponti a disolfuro è regolata da un tripeptide che prende il nome di Glutatione, formato da 3
amminoacidi legati insieme: acido glutammico, cisteina e glicina. La sintesi del Glutatione non avviene mediante
ribosomi, i tre amminoacidi sono uniti insieme grazie a due reazioni enzimatiche: una unisce il carbossile legato al
carbonio γ dell’acido glutammico al gruppo α-amminico della cisteina, l’altra che unisce il gruppo carbossilico legato al
carbonio α della cisteina al gruppo α-amminico della glicina. Nella molecola del glutatione, anch’essa antica e
condivisa, la cisteina contenente -SH è stabile e può restare con l’-SH un tempo indefinito. La cisteina da sola, invece è
piuttosto instabile, se messa in acqua forma ponti a disolfuro (S-S) in poco tempo.
Il glutatione è il perno del sistema antiossidante della cellula e per questo è presente in grandi quantità, nell’ordine
del millimolare come l’ATP. Se distruggessimo il glutatione cellulare, come risultato della sua demolizione,
otterremmo la morte cellulare dovuta ad esposizione all’ossigeno. Posso anche avere vitamina C o E ma è il glutatione
a generare il sistema antiossidante. E’ una molecola che costa poco, è stabile ma sufficientemente reattivo nei
4

confronti dei radicali liberi. Mantiene i gruppi -SH sulla superficie delle proteine del citosol allo stato di -SH così che le
proteine del citosol non abbiano ponti disolfuro (ogni volta che si forma un disolfuro il glutatione me lo apre).
Ad esempio le tubuline che costituiscono i microtubuli devono avere 8 -SH liberi sulla superficie, se le isolassimo tali
gruppi si danneggerebbero in assenza di glutatione e la tubulina non polimerizzerebbe più. Proteine provenienti dal
citosol: gruppi -SH. Proteine provenienti dal RE: ponti a disolfuro, che determinano strutture piuttosto rigide (proteine
di membrana). Il glutatione non fa formare i ponti a disolfuro, quindi la proteina rimane aperta così che quelle
destinate agli organuli non siano attive nel citosol. È ora facilmente internalizzabile (?).
Proteine diverse possono avere lo stesso peptide segnale (generalmente N-terminale) che le guida per raggiungere il
loro target finale che possiede i recettori per quel segnale. Questo peptide segnale può non essere visto se analizzo i
geni perché può essere stato portato successivamente ad un meccanismo di splicing. Se leggo gli mRNA posso
prevedere, sulla base delle sequenze segnale quali possano essere le varie destinazioni.

Trasporto di proteine nel nucleo, nei mitocondri e nei perossisomi


La sintesi di proteine inizia nel citosol. Il completamento può avvenire anch’esso nel citosol o nel reticolo
endoplasmatico. Se si completa nel Citosol, le proteine sintetizzate potranno:
• restare nel citosol;
• entrare nel nucleo;
• traslocare in mitocondri, perossisomi, cloroplasti;

La regolazione nel destinare le proteine è affidata a sequenze segnale formate da amminoacidi, si tratta di un peptide-
segnale. Una proteina che deve stare nel citosol non ha sequenze segnale, e là resta. Se destinata al nucleo ha zone
che consentono l’interazione con le importine o le Ran che le possono portare nel nucleo ma la presenza delle
sequenze segnale non impedisce il raggiungimento della struttura tridimensionale. La proteina che deve andare nel
nucleo è bloccata tramite un complesso quaternario che maschera la sequenza segnale (es. fattori di trascrizione, nel
citosol ho molti fattori di trascrizione che non entrano nel nucleo perché bloccati dai complessi quaternari, hanno
comunque la struttura definitiva). Questa particolare struttura non disturba perché fuori dal nucleo non possono
svolgere la loro funzione. Nel caso di traslocazioni di proteine in mitocondri, cloroplasti e perossisomi il meccanismo è
più complesso.
I perossisomi contengono enzimi in grado di perossidare e portare alla formazione di elementi estremamente reattivi.
Queste reazioni sono a rischio, perciò le faccio avvenire in un ambiente chiuso per evitare di danneggiare l’ambiente
esterno. Il problema è che il perossisoma gli enzimi non li sa sintetizzare così provengono dal citosol, ma in questo
percorso devono rimanere inattivi, altrimenti sarebbe inutile avere il perossisoma. Gli enzimi indirizzati al perossisoma
devono avere una sequenza segnale che farà diverse cose:
1. È riconosciuta de recettori sulla superficie del perossisoma.
2. È agganciata dai recettori del perossisoma che la legano con alta affinità dopo l’urto.
3. È attivato un meccanismo che fa sì che il filo di amminoacidi venga internalizzato. Si attiva un processo di
trasferimento della proteina che richiede energia.

Lo stesso processo riguarda il mitocondrio. In questo caso c’è minore consumo di energia perché il gradiente
protonico aiuta l’internalizzazione.
Con l’ingresso nella struttura bersaglio il peptide-bersaglio viene tagliato e il filo di aa. ripercorrerà le tappe per il
raggiungimento della struttura 3D (anche quello di molten globule) ma questa volta, poiché privo del peptide segnale
che gli impediva di ripiegarsi, può raggiungere la sua struttura definitiva. Nel caso in cui sfortunatamente non si
verifichi mai l’urto con il perossisoma l’enzima verrà distrutto. La cellula rischia di eliminare proteine utili ma allo
stesso tempo previene il pericolo di avere proteine con gruppi idrofobici esposti.

Traslocazione nel mitocondrio


Entrare nel mitocondrio è complesso perché il mitocondrio ha una doppia membrana e non ci sono pori. Inoltre la
membrana interna è di tipo batterico, i lipidi sono una minoranza così da presentarsi come una membrana proteica.
L’estremo livello di compattazione della membrana mitocondriale interna è dimostrato dal fatto che si generi un
gradiente di protoni, proprio perché nemmeno queste particelle così piccole riescono a passare e si accumulano.
Come fa a passare la proteina se non passano neanche i protoni? Tramite canali che si assemblano nei punti di
contatto tra membrana esterna ed interna. A questi livelli si assemblano delle strutture a formare pori molto
compatti. I recettori posti in corrispondenza dei pori riconoscono la sequenza segnale.
La proteina che viaggia con gruppi idrofobici esposti è normalmente accompagnata. Esiste una famiglia di proteine, i
chaperons, che sono ATPasi che si legano a quelle proteine che presentano gruppi idrofobici esposti. Queste
idrolizzano ATP e lo usano per spingere dentro la struttura della proteina i gruppi idrofobici. Non sempre riescono a
5

mandarli dentro ma la proteina è comunque sempre circondata da chaperons, che le impediscono di poter
liberamente interagire con altro. La proteina accompagnata da chaperons urta i recettori, che sono sempre proteine
in grado di dare luogo a interazioni specifiche.
Nel momento in cui viene l’urto, il recettore cambia forma, abbraccia la sequenza segnale e viene a svilupparsi una
sorta di poro che permette l’internalizzazione della proteina, guidata in parte dal gradiente di protone, in parte dagli
stessi chaperons che spingono la proteina dentro idrolizzando ATP. All’interno ci sono dei chaperons mitocondriali, di
tipo batterico che si legano alla proteina e la tirano. La proteina entra del tutto nella matrice mitocondriale, la
sequenza segnale è tagliata ed assumerà la struttura definitiva. La proteina destinata allo spazio intermembrana vi
giunge a partire dalla matrice. Tolta la prima sequenza segnale, ce ne è un’altra che attiva un meccanismo di
traslocazione che porterà la proteina nello spazio intermembrana attraverso pori, non appena vi giunge la sequenza
segnale è tagliata e la proteina assume la struttura definitiva e funzionante. Ricorda! Le proteine destinate ai
mitocondri possono avere 2 sequenze segnale.
Nel perossisoma c’è un meccanismo che permette di risucchiare direttamente la proteina.

Molten globule e chaperon (hsp)


Le proteine chaperons sono chiamate con acronimo Hsp (calore, schock, proteina)  proteine da schock termico. Se
espongo la cellula ad alte temperature aumenta la quantità di queste proteine. Dopo alcuni anni si scopre che queste
proteine sono chaperons e a causa dell’aumento della temperatura c’è aumento dei movimenti e delle proteine che si
denaturano, così si aumenta anche la produzione di queste proteine che tentano di riportare tutto nella forma giusta.
Legano le proteine mal funzionanti grazie ai gruppi idrofobici esterni, si tenta di rimaneggiarla se non si riesce a
correggerla, prima o poi verrà distrutta.
La proteina che entra nel mitocondrio è portata dalle Hsp70 del citosol ed è tirata dall’interno dalle Hsp70
mitocondriali che legano la zona idrofobica, idrolizzano ATP e sfruttano l’energia liberata come energia
conformazionale. Cambiano forma e risucchiano la proteina con meccanismi oscillatori. L’ingresso della proteina
comporta consumo di energia.
La struttura della proteina passa stadi tridimensionali sempre più complessi, passa un certo tempo come molten
globule per poi assumere quella finale. Le proteine funzionanti che sintetizziamo sono il risultato di un processo di
selezione. Le sequenze che a causa di mutazioni hanno comportato mal avvolgimenti della proteina sono state
selezionate negativamente. Alcune sono state intenzionalmente lasciate, come le sequenze segnale.
Costruire proteina significa che i primi amminoacidi che sporgono dal ribosoma cominciano ad assumere strutture ad
α-elica, poi si interrompono: si delineano i primi elementi di struttura secondaria che poi iniziano a compattarsi. Il
problema è che una proteina piccola, fatta di pochi aa. che forma solo struttura terziaria può raggiungere rapidamente
la sua strutt. finale, nel caso si tratti di una proteina grande, la situazione è complessa. Se i primi amminoacidi
assumono struttura tridimensionale, la struttura degli amminoacidi a venire è influenzata e deformata.
Più è grande la proteina e più complesso è far assumere la struttura giusta (GIUSTO= senza gruppi idrofobici esterni).
Fare assumere giusta struttura costa energia. Se il tutto non riesce o se le Hsp non fanno in tempo, la grande proteina
avvolta male si lega con altre proteine formando ammassi di proteine denaturate. Conseguenze ammassi proteici:
Alzheimer, sindrome della mucca pazza. Tali ammassi vanno eliminati e ci pensano le Hsp  RUOLO Hsp: aiutano la
proteina sintetizzata a chiudersi e ad assumere la conformazione di molten globule, che poi si chiude e la proteina è
funzionante. Se non si riesce si ritorna indietro, altre Hsp intervengono MA ad un certo punto può succedere che la
proteina assuma struttura con zone idrofobiche esposte e forma aggregati che possono legare vari tipi di proteine e
danneggiare la cellula.  RUOLO Hsp: intervengono nella rimozione di aggregati. Si legano ai gruppi idrofobici e
staccano le proteine una ad una dall’aggregato cercando di fare assumere la giusta conformazione. La produzione di
proteine non è solo questione di mRNA e ribosoma, ma è necessario farle assumere una precisa geometria.
Le Hsp sono famiglie di proteine che svolgono ruoli diversi: le Hsp60 circondano le proteine e idrolizzano ATP
spingendo da tutte le parti, si staccano solo se la proteina non ha gruppi idrofobici esposti.
Costruire una proteina è dispendioso. Costa in termini di ATP.
L’accumulo di proteine danneggiate è connesso con molte patologie.
Il reticolo endoplasmatico non sa distruggere le proteine mal avvolte e allora le esporta nel citosol e le cede ai
proteasomi (meccanismo che trita le proteine). Il problema si verifica nel caso in cui i proteasomi sono occupati e il
reticolo endoplasmatico si riempie di proteine mal avvolte ed entra in stress che porta a varie patologie. Trattare le
proteine non è scontato. È complesso: GENE PROTEINA PROTEINA FUNZIONANTE.
Le proteine mal avvolte vengono riconosciute da zone idrofobiche esposte, le proteine che si trovano nel citosol non
hanno zone idrofobiche esposte. Le sub-unità hanno zone con gruppi idrofilici e idrofobici esposti che quando si forma
la struttura quaternaria sarà tenuta insieme da legami elettrostatici ma anche idrofobici. Se per caso ho sintetizzato
una subunità in più, questa sarà distrutta.
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Cenni su struttura e funzione del proteasoma

Che cos’è l’ubiquitina?


Il processo di distruzione di proteine mal avvolte è complesso.
La prima tappa consiste nel dirigere le proteine verso la sede in cui è attivato il processo di distruzione, ma nel fare
questo le proteine mal funzionanti devono essere prima bloccate per evitare che interagiscano con altre molecole. Le
proteine che presentano gruppi idrofobici esposti sono legate da una piccola proteina molto solubile, l’ubiquitina.
Dopo che un’ubiquitina si è legata è possibile che se ne attacchino altre, la proteina è così letteralmente circondata da
ubiquitine che mascherano i gruppi idrofobici impendendo interazioni dannose per la cellula. La presenza di ubiquitine
attiva il proteasoma che lascia quest’ultime libere per risucchiare all’interno la proteina con un meccanismo che
consuma energia. Il proteasoma è un complesso al cui interno sono presenti delle proteasi, enzimi che tagliano le
proteine a piccoli frammenti o a singoli amminoacidi.
I proteasomi funzionano bene nel sistema immunitario, spezzano gli antigeni in pezzi.
L’ubiquitina è molto importante non solo nell’interazione con proteine da distruggere ma quasi tutti gli aa.
dell’ubiquitina danno luogo ad interazioni, e legare ubiquitina in un modo o in un altro ha significati differenti, attiva
meccanismi diversi.

Una proteina può:


• assumere immediatamente la corretta struttura tridimensionale e funzionare.
• assumere la corretta struttura tridimensionale solo dopo un meccanismo di correzione operato dalle Hsp.
• essere distrutta qualora, anche a seguito dell’azione delle Hsp, la proteina non abbia assunto la corretta
struttura.

Chi distrugge le proteine?


Il proteasoma è un macchinario proteolitico considerato (“se volete”) come l’equivalente dell’exosoma per la
demolizione di RNA. I proteasomi hanno la forma di un cilindro le cui pareti sono costituite da proteasi. Essi si trovano:
• nel citosol.
• nel nucleo: i meccanismi di riarrangiamento della cromatina comportano la demolizione di proteine, le RNA
polimerasi o le DNA polimerasi che non funzionano più vengono distrutte in loco, così come enzimi entrati in
stallo.
I proteasomi hanno le dimensioni di una subunità ribosomiale quindi sono stati scoperti tardivamente perché al
microscopio elettronico apparivano come puntini ed erano confusi.
Essi svolgono la proteina, i ponti disolfuro vengono tagliati ed escono gli amminoacidi.

Come si entra nel proteasoma:


1. Via preferenziale: riconoscimento del substrato legato a varie ubiquitine.
2. Via non preferenziale: l’ingresso è affidato all’amminoacido N-terminale. Tutti i geni hanno ATG d’inizio nella
zona codificante, che diventa AUG nell’m-RNA. Tutte le proteine hanno una metionina come primo aa. Se
prendo una qualunque proteina cellulare in molto casi non ha metionina all’inizio perché è stata modificata
dopo la traduzione. La presenza dell’aa. N-terminale condiziona la vita della proteina, poiché essa ha vita
breve nella cellula, quando urta un proteasoma viene distrutta. Certi tipi di proteine vivono per alcuni minuti,
altre per lassi di tempo più lunghi, quando non sono più funzionanti sono distrutte.

Come funziona un proteasoma


Il proteasoma lega la catena di ubiquitine, le taglia via e le libera (vanno a svolgere altre funzioni), la proteina viene
risucchiata all’interno con un meccanismo che consuma ATP e poi è distrutta.
Anche se il meccanismo di passaggio è ancora misterioso, il proteasoma può viaggiare tra nucleo e citosol. In
particolare è sottratto in quantità notevoli dal citosol qualora avvengano specifiche reazioni nel nucleo, come
rimodellamento della cromatina. Poiché i proteasomi sono fatti di proteine e sono sintetizzati nel citosol, il fatto che
se ne siano trovati nel nucleo testimonia che qualcuno necessariamente li abbia portati.
All’interno della cellula c’è un sistema di controllo qualità delle proteine (la non qualità per le proteine solubili è data
da gruppi idrofobici esposti).
Le proteine di membrana hanno diversa composizione. Hanno tratti ad α-elica nella membrana, gruppi R idrofobici
all’esterno e gruppi R idrofilici all’interno che formano dei canali. La proteina di membrana ha sempre un pezzo che
sporge fuori e un pezzo che sporge dentro, se questo non è avvolto bene bisogna distruggerlo con un meccanismo
particolare che lega i gruppi idrofobici, sebbene sia proteina di membrana, vengono legate ubiquitine mentre sta
uscendo dalla membrana ed è portata ai perossisomi.
7

Modificazioni di questo tipo, come la presenza o meno dell’aa. N-terminale indicano che il prodotto proteina nelle
cellule è già fortemente modificato.
Se il raggiungimento della struttura tridimensionale della proteina avvenisse solo a seguito di interazione con il
solvente, fosse quindi spontaneo, basterebbe cambiare la temperatura per denaturarsi o rinaturarsi  alcune
proteine manifestano questo comportamento ma la maggioranza no perché sono state modificate dopo la sintesi. La
proteina funziona solo se modificata, e tutte le modificazioni generano un proteoma enorme. Anche se le proteine
sono codificate da geni, essi hanno poca rilevanza ai fini della loro funzione poiché interagiscono in base a come sono
modificate.

Complessità del trascrittoma umano e ruolo delle modificazioni post-traduzionali


Il genoma umano contiene:
• 21 mila geni che codificano per proteine.
Il trascrittoma umano contiene:
• oltre 100mila trascritti.
Il proteoma umano contiene:
• oltre 1 milione di proteine.
Il grande numero di proteine deriva oltre che dallo splicing alternativo dalle modificazioni post-traduzionali.

Modificazione post-traduzionali (PTM)


Le modificazioni post-traduzionali (PTM = glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione, ecc.) delle proteine
sono usate dalle cellule eucarioti per diversificare le funzioni delle proteine e coordinare dinamicamente le loro reti di
interazioni.
Difettosa PTM è associata a numerosi disturbi dello sviluppo ed a patologie umane. Questo mette in evidenza
l'importanza delle PTM nel mantenere in buona salute la cellula.
Tipi di PTM:
• PROTEOLISI (IRREVERSIBILE): se taglio un pezzo, non è più
possibile ottenere la struttura di partenza. È utilizzata per
bloccare la proteina in una certa geometria che non sarebbe
stato mai possibile raggiungere. L’insulina, costituita da due
catene è il prodotto di una proteina unica che si è avvolta e a
cui sono stati tagliati dei pezzi. Gli enzimi che tagliano sono le
proteasi. Ne esistono di vari tipi. Alcune proteasi digestive
staccano un aa. alla volta, altre che tagliano in modo
sequenza-specifica, cioè solo in certe condizioni. Esempi di
proteolisi sono l’eliminazione della metionina, della sequenza
segnale, di peptidi interni che vanno a definire una struttura
che non corrisponde al minimo di energia potenziale.
Lego dei gruppi, posso fosforilare o defosforilare.
• METILAZIONE (REVERSIBILE)
• FOSFORILAZIONE (REVERSIBILE) Nella profase mitotica scompare la membrana
• ACETILAZIONE (REVERSIBILE) nucleare a seguito della fosforilazione delle
lamine nucleari, si distaccano dalla cromatina e si
respingono con il DNA. Quando inizia l’anafase le
lamine sono defosforilare e si ricostituisce la

membrana mentre i cromatidi si muovono.
UBIQUITINAZIONE (REVERSIBILE): se uso la lisina, il 48° aa dell’ubiquitina attivo il proteasoma ma se la lego
con un altro aa. attivo meccanismi diversi.
• SUMOILAZIONE (REVERSIBILE): legare le proteine SUMO, “Ubiquityn like”, simili all’ubiquitina. Lego una
proteina su un’altra e a seconda di come le lego creo geometrie che consentono interazioni.
• GLICOSILAZIONE (REVERSIBILE): lego catene di zucchero fortemente idrofilici.
• ISOPRENILAZIONE (REVERSIBILE): lego gruppi idrofobici che potrebbero ancorare la proteina alla membrana.

Esistono anche meccanismi di splicing di proteine. Posso tagliare proteine o assemblare pezzi di proteine che
provengono da geni diversi. Il rimaneggiamento delle proteine è importante perché arricchisce il proteoma e dimostra
quanto tutto sia indeducibile dal DNA. La conoscenza del genoma non ha condotto ai risultati sperati, perché anche
conoscendo tutti i geni non sapremmo quali proteine possano formarsi.
8

Formazione ponti disolfuro: modificazione importante. È un legame covalente che avvicina e blocca parti lontane di
una proteina. Il problema è che i ponti S-S si possono anche formare sbagliati e verranno esposti sti maledettissimi
(!!!!!) gruppi idrofobici all’esterno. Le nostre proteine sono state selezionate affinché nella formazione dei ponti
disolfuro i gruppi idrofobici fossero interni.

Molteplici funzioni dell’ubiquitina e delle proteine SUMO


L’ubiquitina è una piccola proteina di 76 amminoacidi che viene legata covalentemente, spesso con un residuo di
lisina, ma anche ad altri aa., ad una proteina substrato.
L’ ubiquitina ha sette residui di lisina (proteina basica) con cui ha la possibilità di formare tanti tipi di collegamenti, K6,
K11, K27, K29, K33, K48 e K63; altra possibilità è il legame con il gruppo –NH2 della metionina N‐terminale, M1, o
con il gruppo –COOH della glicina, G76.
Le proteine SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) sono piccole proteine simili all’ubiquitina utilizzate come
modificatori. Nelle cellule di mammifero ci sono almeno quattro: SUMO1, SUMO2, SUMO3 e SUMO4 (recentemente
scoperta nell’uomo). Svolgono importanti funzioni in processi quali il ciclo cellulare, la funzione mitocondriale, il
mantenimento dell’integrità genomica, la localizzazione subcellulare delle proteine, la spermioistogenesi, interferenza
con la degradazione di proteine target attraverso il blocco dei siti di attacco dell’ubiquitina, …

L’ubiquitinazione è una sequenza di tre eventi (attivazione, coniugazione e legatura) che coinvolge tre diversi enzimi:
• E1 lega la glicina C-terminale dell’ubiquitina (o di una proteina SUMO) ad una cisteina del sito attivo
dell’enzima con idrolisi di ATP e formazione di un tioestere con legame ad alta energia libera di idrolisi.
(Principato parla di metionina nel sito attivo, ma non credo sia giusto perché non ha il gruppo -SH).
• E2 catalizza il trasferimento dell’ubiquitina da E1 alla cisteina presente nel suo sito attivo (trans tio
esterificazione). Ci sono diversi E2.
• E3 lega la glicina C-terminale dell’ubiquitina ad un residuo di lisina di una proteina bersaglio, che può essere
anche una ubiquitina.
Il genoma umano codifica per 2 E1 (attivazione) almeno 38 E2 e più di 600 E3 (trasferimento al bersaglio). Il processo
di ubiquitinazione è molto specifico.

A seconda di come lego l’ubiquitina, cioè a seconda di quale aa. è interessato nel legame con il substrato ottengo
geometrie e quindi interazioni diverse che mi permettono di svolgere molteplici funzioni. Se lego:
• K48 attivo il proteasoma.
• K63 attivo eventi di segnalazione cellulare nella risposta al danno al DNA e segnalazione di citochine.
• G76 lego un substrato (è la glicina terminale, vedi enzima E1).
• M1 attivo processi di regolazione e risposta al danno del DNA.
STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE
LEZIONE 12
30/11/2017

Il RETICOLO ENDOPLASMATICO è il più grande organello subcellulare delle cellule eucariotiche; consiste in un sistema
di canali membranosi uniti tra loro grazie a strutture tubulari, questi canali assumono varie forme, tra cui quelle
di cisterne (sacchi appiattiti),sacculi e tubuli.
Il RE si trova in continuità con la membrana nucleare; reticolo e membrana hanno una struttura molto simile (la
differenza principale tra i due è qualitativa e dovuta al fatto che la membrana nucleare è specializzata perché possiede
i pori) e ciò che li accumuna principalmente è la presenza di ribosomi che adempiono al compito della sintesi proteica.

I ribosomi della membrana nucleare sono adesi nella parte che sporge nel citoplasma mentre quelli del RE sono
attaccati ad una specifica regione specializzata, denominata reticolo endoplasmatico ruvido.
I ribosomi sono tutti uguali ed è la sequenza segnale del tradotto che determina l’aggancio o meno al reticolo
endoplasmatico/membrana nucleare.
Non esistono quindi, come si credeva in passato, due classi di ribosomi (ribosomi liberi e ribosomi legati) e l’essere
legato non dipende direttamente dal ribosoma.

Il RETICOLO ENDOPLASMATICO comprende due regioni specializzate: reticolo endoplasmatico liscio REL e reticolo
endoplasmatico ruvido RER.
Le due regioni del RE non sono separate fisicamente ma sono adiacenti, in comunicazione tra loro e costituiscono un
unico complesso; la divisione avviene sulla base della differente composizione chimica.
Il RER si distingue dal REL per:
La presenza di ribosomi adesi alla superfice;
La presenza del lipide dolicolo (sul quale avviene la N-glicosilazione, ossia l’aggancio della catena di 14
zuccheri) visibile al microscopio elettronico;
Attività enzimatica della proteina disolfuro-isomerasi, responsabile dell’apertura e della formazione di ponti
disolfuro;
La presenza di proteine BiP;

Il REL si distingue invece per:


La presenza di pompe del Calcio che sequestrano tutto il Ca 2+ presente nel citosol: per questo motivo non si
trova mai lo ione calcio libero nella cellula.
La fuoriuscita dello ione dal reticolo comporta un segnale; un aumento di ioni Ca2+ nel citosol può scatenare
reazioni come la morte cellulare oppure mediare la risposta degli ormoni (lo ione funge da secondo
messaggero).
Per questo motivo i livelli di ioni Ca2+ sono molto importanti.
Nel corso dell’evoluzione si sono selezionate proteine diverse che legano Ca2+ usando un motivo comune 
Le proteine calcio-leganti derivano da un’unica proteina ancestrale.

I ribosomi aderiscono al RER grazie al complesso SRP, ossia particelle di riconoscimento del peptide segnale.

1
Il complesso SRP (= signal recognition particle) strutturalmente comprende:
• un RNA lobato, che ricorda un t-RNA, chiamato RNA-7S (strettamente imparentato agli RNA che hanno dato
origine alle sequenze ALU nel DNA).
La molecola di RNA-7S ha una struttura tridimensionale.
A parte l’m-RNA che ha la zona codificante che deve essere lineare, quando parliamo di RNA in tutti gli altri
casi questi assumono strutture tridimensionali con tratti a doppia elica intramolecolari.
Questi tratti a doppia elica sono formati da un solo filamento ripiegato su se stesso e poi ci sono delle zone
aperte (circonferenze a struttura singola): nelle zone aperte, dove cessa la doppia elica, spesso ci sono
accoppiamenti anomali (per esempio accoppiamenti tra purine).
Guardando la sequenza di un RNA non si può immaginare esattamente quale sarà la struttura
tridimensionale e ciò è un problema nel caso di lunghi RNA non codificanti.

• proteine che legano il peptide segnale.


Tra le proteine dell’SRP c’è anche una GTPasi che idrolizza GTP (substrato legato ad una proteina dell’SRP)
quando il ribosoma, bloccato dalla particella SRP, è immobilizzato e si muoverà nella cellula spinto da
molecole più piccole con moti browniani (moto disordinato e casuale delle particelle nei fluidi).

Nell’immagine,
rappresentante
una particella
SRP, è possibile
notare i tratti a
doppia elica e le
“zone aperte” a
filamento
singolo dell’RNA

Il complesso SRP è un RNA citoplasmatico presente in grandi quantità, devono esserci infatti molte particelle SRP in
modo tale che ogni volta che compare una sequenza segnale da un ribosoma, subito un SRP sia in grado di
riconoscerla.

La funzione principale delle particelle SRP è quella di:


a. riconoscere la sequenza segnale delle proteine, con la quale il ribosoma si lega in corso di sintesi;
b. mediare il legame del ribosoma sul reticolo ruvido.
quindi
Il complesso SRP riconosce, lega e accompagna il ribosoma permettendo la sua interazione con il recettore del reticolo
endoplasmatico (o, nei batteri, sulla membrana plasmatica).

Le proteine che entrano nel reticolo endoplasmatico ruvido sono proteine che iniziano la sintesi nel citosol ma non la
concludono a causa della presenza di una sequenza segnale, che molto spesso si trova nella zona N-terminale.
La sequenza segnale è costituita dai primi amminoacidi (situati nella zona terminale) sintetizzati in polipeptide che
sporgono dal ribosoma.
Questi primi amminoacidi vengono riconosciuti in maniera specifica dal complesso SRP, che media il legame del
ribosoma al RER, permettendo alla proteina di concludere la propria sintesi all’interno del RER.
Tutte le proteine che devono essere sintetizzate a livello del reticolo endoplasmatico ruvido devono avere all’inizio
della loro regione codificante queste sequenze segnale, se non le avessero non potrebbero essere riconosciute dalle
SRP e di conseguenza non potrebbero legarsi allo stesso RER.
Queste sequenze sono elemento comune di tutte le proteine, tuttavia le proteine mature non le presentano
(generalmente vengono tagliate durante la maturazione) e quindi tempo fa, non sapendo del fatto che queste

2
sequenze possono essere rimosse grazie a degli enzimi, non si capiva il motivo per il quale alcuni ribosomi si legassero
al reticolo ed altri no. Si pensava dipendesse dal ribosoma stesso.

La sequenza segnale ha funzione di :


a. far riconoscere al complesso SRP la proteina;
b. indirizzare la proteina al reticolo endoplasmatico;
c. impedire alla proteina di funzionare qualora fosse sintetizzata erroneamente al di fuori del RER.
Se il complesso SRP non dovesse incontrare e riconoscere la sequenza segnale, mentre la sintesi si verifica nel
citosol, la proteina finirebbe di essere completamente sintetizzata nel citosol ma non sarebbe corretta perché
la sua struttura sarebbe completamente diversa dalla proteina che sarebbe dovuta essere sintetizzata nel
RER. La proteina non riuscirebbe a chiudersi dal punto di vista strutturale (e “di forma”) e quindi sarebbe poi
inevitabilmente distrutta.
La sintesi sbagliata della proteina fuori dal RER non è un grosso problema anche grazie alla presenza della
catena di zuccheri sulle proteine sintetizzate nel RER, che vanno incontro a glicosilazione durante la sintesi.
Il contributo della glicosilazione è importante perché la pesante catena di zuccheri ha un grande effetto sulla
struttura tridimensionale della proteina.
La proteina sintetizzata al di fuori del RER avrebbe la stessa sequenza di amminoacidi ma non ci sarebbe il
contributo della glicosilazione alla struttura tridimensionale.

Grazie alla sequenza segnale e alla glicosilazione non c’è un vero pericolo che la proteina possa funzionare se
sintetizzata erroneamente: solo nel RER la proteina avrà la struttura finale.

Generalmente la proteina sintetizzata nel RER, anche se ha la sua struttura finale, non è funzionante.
Nel reticolo ruvido, dopo la rimozione enzimatica della sequenza segnale, la proteina assume la sua struttura
tridimensionale senza gruppi idrofobici esposti (se restano gruppi idrofobici esposti verrà esportata e distrutta dopo
vari tentativi di farle assumere la struttura giusta) ma, perché sia funzionante, sono decisivi i passaggi nel Golgi.

Nel Golgi verranno fatte modificazioni importanti che porteranno la proteina ad essere attiva in certi casi specifici.
Questa modalità co-traduzionale garantisce che le proteine destinate all’esportazione non raggiungano la loro
conformazione definitiva al di fuori del RER.

Ad esempio gli enzimi destinati ai lisosomi (come fosoflipasi e proteasi), ossia strutture digestive, sono sintetizzati nel RER
ma non sono attivi anche se hanno la loro struttura tridimensionale finale.
Generalmente gli enzimi in grado di digerire tutta la cellula transitano nel RER, passano nel Golgi e arrivano al lisosoma senza
attivarsi.
Questi enzimi sono idrolasi acide e si attivano solo quando il pH è acido (nel lisosoma stesso), nel RER il pH è basico e sono
quindi inattivati.
La maggior parte degli enzimi lisosomiali agiranno attivati da meccanismi proteolitici e, prima di attivarsi, troveranno certi
tipi di proteasi che all’abbassarsi del pH cominceranno a tagliare altri enzimi consentendo la formazione del sito attivo (che
c’è fin dall’inizio ma non è mai stato evidente).
Gli enzimi lisosomiali hanno questo destino che è diverso rispetto a quello degli enzimi che vanno nel perossisoma.

Nel momento in cui la SRP riconosce la sequenza segnale si lega al ribosoma:


il complesso formato dalla proteina e dalla particella SRP entra nel ribosoma e ne occupa il sito A (in realtà di tutto il
complesso dell’SRP soltanto la parte degli RNA-7S entra nel sito A del ribosoma) in questo modo si blocca la sintesi
proteica e si entra in una fase che è possibile definire “di stallo”.

Dopo aver bloccato il sito A, il complesso SRP accompagna il ribosoma, che è in fase di stallo, sulla superficie del
reticolo endoplasmatico ruvido per far si che leghi con un recettore.
Il sistema, dalla fase di stallo, si potrà riattivare solo dopo la rimozione della particella SRP dal sito A.
La rimozione della particella SRP avverrà solo nel momento in cui il complesso incontrerà e si legherà ad un recettore
sulla membrana del RER, quindi la sintesi della proteina si ri-attiva solo se c’è un’interazione con il RER.

3
Il recettore intero sulla membrana del reticolo endoplasmatico ruvido si trova solo quando arriva il ribosoma legato ad
un SRP altrimenti si trovano i vari pezzi separati e l’atterraggio del ribosoma sul reticolo endoplasmatico ruvido non
può avvenire.
Per questo motivo un ribosoma da solo (che non sia legato a SRP) in corso di sintesi può urtare il RE quanto vuole ma
non c’è alcun recettore pronto a legarlo, solo se il ribosoma è legato all’SRP viene agganciato al RE e la sequenza
segnale viene presa dal canale della proteina di membrana.

Quando il ribosoma in stallo urta la membrana del RER c’è un’interazione tra due GTPasi, ossia quella della SRP e
quella sulla membrana.
Nel momento in cui avviene l’incontro queste due GTPasi interagiscono e fungono, ognuna nei confronti dell’altra, da
meccanismo di attivazione dell’idrolisi.
Quindi le due si urtano e avviene contemporaneamente in entrambe l’idrolisi di GTP.
➢ La GTPasi legata all’SRP utilizza l’energia che si è liberata come energia conformazionale e fa si che il
complesso SRP subisca una variazione di forma e lasci la sequenza segnale.
La sequenza segnale viene lasciata e ceduta ad una proteina di membrana, che è un canale. Il risultato è che
la SRP se ne va via e la sua GTPasi rimane con GDP nel sito attivo (altro membro della famiglia di enzimi
GTPasi).
Il complesso SRP scambierà GDP con GTP (e il ciclo ricomincerà) quando incontrerà e legherà un’altra
sequenza segnale che sporge da un ribosoma in corso di sintesi.
Nel frattempo il complesso è inattivato.
➢ La proteina GTPasi di membrana (alla quale si era ancorata la SRP nell’interazione) si sposta, ruota e va a
trasferire e posizionare il ribosoma legandolo al complesso di proteine (che a quel punto originerà un poro
nella membrana che prima non c'era).
Il legame ribosoma/recettore è permesso dall’idrolisi di ATP.

La proteina entra nel lume del RER e la sintesi riprede perché il complesso SRP è stato rimosso, dopo il ri-
arrangiamento strutturale, e ha lasciato libero il sito A del ribosoma.
Quando la sintesi è completata arrivano le sequenze di stop, a cui non corrisponde alcun t-RNA, e il ribosoma si
disassembla.

4
Dopo che i ribosomi sono stati legati nel RER si verifica un’importante modificazione di post-sintesi all’interno del RER
ossia la
GLICOSILAZIONE :

la glicosilazione è un processo al quale vanno incontro solo le proteine sintetizzate nel RER; consiste nell’aggiunta, alla
proteina, di un polisaccaride ramificato costituito da 14 zuccheri (struttura imponente in termini dimensionali);
avviene mentre la proteina viene sintetizzata e sta entrando nel lume del reticolo endoplasmatico  la proteina
assume una struttura tridimensionale che sarà fortemente influenzata dalla sequenza di zuccheri (che costituisce un
gruppo fortemente idrofilo).

La glicosilazione è un elemento importante, non “discrimina” le proteine una dall’altra infatti avviene in maniera
omogenea: tutte le proteine sono glicosilate allo stesso modo.
La glicosilazione a livello del RER non è l’unica, infatti nel passaggio attraverso il Golgi ne avverranno un’ulteriore
come modificazione della glicosilazione iniziale e un’altra nota come “glicosilazione de novo” che è diversa per quanto
riguarda l’amminoacido glicosilato su cui si forma la sequenza di zuccheri.

Il meccanismo d sintesi della catena di 14 zuccheri chiama in causa diversi enzimi.


C’è cooperazione tra proteine nel citosol e proteine nel reticolo endoplasmatico ruvido: è per questo un meccanismo
molecolare complicato che prevede sincronia operativa tra esterno e interno.
Il processo di glicosilazione inizia nella faccia del reticolo rivolta verso il citosol dove sul lipide dolicolo, che attraversa
tutta la membrana, avverrà una fosforilazione e la formazione di un legame ad alta energia a tre fosfati.
Il processo di aggiunta degli zuccheri non è casuale; prevede l’aggiunta (in ordine) di uno zucchero alla volta:
1) N-acetil-glicosammina
2) Glucosio amminato e Glucosio N-acetilato
3) Mannosio (molecola con struttura esagonale, imparentato con glucosio)
Una volta costruita una catena di 7 zuccheri il grande lipide dolicolo viene fatto ruotare.
Nella rotazione sporgeranno i 7 zuccheri all’interno sui quali verranno aggiunti altri zuccheri dall’esterno.
Gli zuccheri dall’esterno verranno portati dentro da tante molecole di dolicolo.
Nel momento in cui la catena a sette zuccheri iniziale è ruotata all’interno del lume il primo zucchero che lega è
mannosio.

Quando la struttura ramificata di zuccheri è completa, verrà rotto il legame ad alta energia, formato coi P, che la tiene
unita al dolicolo e l’energia liberata sarà sufficiente a trasferire il fosfato sull’azoto del gruppo amminico
dell’asparagina del polipeptide nascente.
La proteina viene glicosilata mentre sta entrando nel lume del RER quindi la glicosilazione è definita co-traduzionale.

Il DOLICOLO è un di trans-membrana (attraversa tutta la membrana ed è grande come i due foglietti) molto grande.
Si trova nelle cellule umane (per quello che si sa è presente anche negli archea mentre non si trova nei batteri).

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La catena di zuccheri verrà ceduta in toto dal dolicolo all’azoto di un acido basico della proteina, chiamato asparagina.
Si parla di N-glicosilazione perché l’aggiunta della catena avviene a livello dell’azoto.
Nel corso di sintesi la comparsa dell’ingombrante catena idrofilica modifica l’avvolgimento della proteina.

GLUTATIONE
Nell’ambito del reticolo endoplasmatico rugoso è molto importante il ruolo del GLUTATIONE o GSH (maniera
informale con cui è indicato per mettere in evidenza la sua funzione sulfidrilica, che è la principale della molecola),
molecola con proprietà antiossidanti.
Il glutatione è una molecola antica, trovata invariata in quasi tutti gli organismi, infatti in qualche raro organismo, tipo
nel tripanosoma, c’è un analogo modificato del glutatione chiamato tripanotione.
È presente soprattutto negli organismi aerobi, quelli anaerobi possono averlo ma anche no; questa molecola ha avuto
un impulso e un grande sviluppo con l’aumento della fase aerobica.

Il glutatione è un tripeptide ed è quindi formato da tre amminoacidi:

- Acido glutammico
- Cisteina che fornisce –SH
- Glicina

Viene sintetizzato a partire da acido glutammico ( amminoacido con C al centro, -COOH in 𝛼, gruppo amminico –NH2,
H e gruppo -R con CH2CH2COOH) e cisteina, uniti da un legame peptidico atipico, cioè il legame 𝛾.
Dopo la formazione di questo legame si lega una glicina al precedente composto formando così il glutatione che è
anche chiamato
𝛾-glutammil-cisteinilgilcina

la struttura
del
glutatione
è una Y.

Per ragioni poco conosciute la funzione sulfidrilica (gruppo –SH) ha una reattività diversa nel glutatione rispetto a
quando si trova in altre proteine (nelle quali il gruppo è poco affidabile e tende a legarsi/ossidarsi molto facilmente).
Nel glutatione l gruppo –SH si ossida con difficoltà, rendendolo una molecola stabile.

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Il glutatione può esistere in due forme: ossidato o ridotto.

Dentro la cellula si trova quasi tutto allo stato ossidato; quando è ridotto ci sono enzimi glutatione-reduttasi che lo
riportano allo stato ossidato.
All’interno della cellula deve essere presente una percentuale di glutatione allo stato ridotto infatti se venisse ossidato
tutto la cellula non potrebbe più stare nella fase aerobica perché non sarebbe in grado di stare esposta all’ossigeno.

Il glutatione è importante perchè:


• mantiene riducente l’ambiente del citosol  riduce la vitamina C. Quando reagisce la vitamina C si ossida e,
se non ci fosse il glutatione che la riduce, si esaurirebbe molto in fretta.
La stessa cosa vale per la vitamina E che quando reagisce sposta la funzione radicalica nel citosol, ma viene
rigenerata dal glutatione.
Il glutatione modifica quindi la formazione degli –SH e li sposta nelle strutture determinandone le caratteristiche.

Nelle proteine sintetizzate nel reticolo tutti i gruppi –SH sono occupati in legami  LE PROTEINE PRESENTI NEL
RETICOLO ENDOPLSMATICO NON HANNO GRUPPI –SH SUPERFICIALI MA SOLO PONTI DISOLFURO PERCHÉ
L’AMBIENTE INTRARETICOLO È OSSIDANTE PER LA BASSA CONCENTRAZIONE DI RIDUCENTI COME IL GLUTATIONE
(=riducente universale).

Dal punto di vista strutturale le proteine sintetizzate nel reticolo sono più compatte e rigide rispetto alle proteine del
citosol cellulare.

Le proteine del citosol cellulare hanno –SH superficiali e pochi e rari ponti disolfuro interni, ciò perché l’ambiente del
citosol è riducente per la grande presenza di antiossidanti come il glutatione. È difficile mantenere la proteina
citosolica nello stato coi gruppi -SH ridotti perché la sua tendenza ad ossidarsi è notevole.

esempio di proteina sintetizzata nel RER:


La matrice extracellulare è un substrato formato da glicoproteine: la parte degli zuccheri (glico) è molto grossa perché
nel Golgi le proteine hanno subìto glicosilazioni importanti, oltre a quella che avevano subito nel RER, che le hanno
rese molto rigide. Sono proteine che devono essere rigide perché su di esse si appoggia la cellula.

7
Proteina sintetizzata nel RER:
Quando la proteina entra nel RER come sequenza primaria di amminoacidi, sporgono i gruppi –R idrofobici e i vari
gruppi -SH delle cisteine.
L’ambiente interno del RER è un ambiente tendenzialmente ossidato perché non c’è il glutatione.
I gruppi -SH reattivi cercano di reagire col primo -SH che trovano, per questo la proteina si ripiega su se stessa per
formare ponti disolfuro.
La formazione di disolfuri, che sono legami covalenti, porta all’immobilizzazione del filo di amminoacidi.
Questa rigidità impedisce ai chaperon di svolgere la propria funzione

I chaperon possono spingere la parte idrofobica all’interno ma non riescono a farla entrare perché il legame covalente
dei ponti disolfuro blocca la proteina in quella struttura.

Se i ponti disolfuro formati a caso non sono corretti e la proteina non riuscirà ad avvolgersi in maniera giusta, avrà i
gruppi idrofobici esposti e sarà chiamato in causa un meccanismo enzimatico con funzione specifica.
L’enzima è in grado di sapere se la proteina ha disolfuri sbagliati grazie alla presenza di gruppi idrofobici: lega le
proteine che hanno gruppi idrofobici esposti.
Il gruppo idrofobico è infatti una sorta di segnale universale di mal avvolgimento, quindi la cellula interviene per
risolvere la situazione.
Le proteine funzionanti non hanno mai gruppi idrofobici all’esterno.
L’enzima che svolge questa funzione è la proteina di membrana del RER denominata disolfuro-proteina-isomerasi PDI.
Questo enzima riarrangia i ponti a disolfuro delle proteine che presentano regioni irdofobiche esposte all’esterno.

È un enzima specializzato, ha una sorta di sito attivo/cavità in cui c’è un ponte disolfuro che lega proteine con gruppi
idrofobici esposti.
Le funzioni di questo enzima possono essere:
1) assistere le proteine in corso di sintesi. Se gli -SH delle proteine, legati nel modo sbagliato, reagiscono con
l’enzima questo forma ponti disolfuro misto e facilita la formazione del disolfuro corretto.
Catalizza la formazione dei disolfuro : blocca e fa reagire i gruppi –SH.
2) Se c’è un –SH con amminoacidi idrofobici l’enzima può legare l’–SH in modo tale che i chaperon possano
intervenire  l’enzima quindi sposta e va a formare ponti a disolfuro in maniera tale che non ci siano gruppi
idrofobici esposti.
3) Se c’è proteina con disolfuri sbagliati che immobilizzano la struttura e gruppi idrofobici esposti, l’enzima li
può legare e andare a rompere i disolfuri sbagliati della proteina. In questo caso catalizza una modificazione
dei ponti disolfuro: libera –SH e reagisce con altri disolfuri aprendoli. Nel momento in cui non ci sono più

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zone idrofobiche esposte la proteina viene rilasciata e l’enzima cerca di far assumere dei ponti disolfuro
giusti.

I ribosomi sono vicini tra di loro sulla superficie del RER (non sono sparsi ma tendono a legarsi abbastanza vicini tra di
loro andando a formare delle strutture a spirale) e quindi le proteine entrano vicine le une alle altre per questo
motivo esiste la possibilità che si formino aggregati tra coppie diverse dello steso tipo di proteina, dovuti ad
interazione delle zone idrofobiche sporgenti .
Questi aggregati occupano spazio e bloccano il reticolo endoplasmatico ruvido impedendo il proseguire della sintesi
proteica.
Le sequenze idrofobiche che sporgono chiamano in causa le proteine BiP (Binding Immunoglobulin Protein)
che sono proteine di legame.
Le proteine BiP sono specifiche e costituiscono l’equivalente dei chaperons, sono diversi dai chaperons del citosol
perché sono calcio-dipendenti (funzionano soltanto in presenza di ioni Ca + ) attivi nel RE (nel citosol non avrebbero
funzione).
Il reticolo endoplasmatico costituisce un’unica entità nella quale gli ioni sono liberi di circolare; per questo motivo gli
ioni calcio sequestrati dal reticolo liscio sono accessibili al reticolo ruvido e in questo modo alle proteine BiP.
La proteina entra come filamento lineare e gli amminoacidi idrofobici sono inevitabilmente esposti, le sequenze delle
proteine sono tutte una vicino all’altra e i ribosomi sono organizzati in poli-ribosoma che permette loro di entrare
insieme: il pericolo sta nella possibilità di legame, tra di loro, delle zone idrofobiche.

Le proteine BiP impediscono proprio questo e come chaperons cercano di far assumere alla proteina la struttura
giusta.

Le BiP
1) idrolizzano ATP
2) mascherano le zone idrofobiche
3) svolgono ruolo nella struttura tridimensionale della proteina  assistono la proteina e impediscono la
formazione di aggregati in corso di sintesi

Nonostante tutti questi interventi c’è un consistente problema di proteine mal avvolte; per la costruzione della
proteina non è sufficiente avere l’m-RNA, i ribosomi, il t-RNA perché questa sia funzionante.
Non è facile che la proteina assuma la struttura giusta.
C’è un serio problema di proteine mal avvolte che diventa complicato perché non esiste un sistema di degradazione
nel reticolo endoplasmatico.
Le proteine mal avvolte devono essere esportate e, appena fuoriescono, marcate con l’ubiquitina in modo che
vengano demolite nei proteosomi.

Esiste tutto un meccanismo per la degradazione delle proteine mal avvolte ma se qualcosa non funziona bene si entra
in condizioni di stress da reticolo endoplasmatico; per esempio potrebbe succedere che i portatori sono tutti
occupati, la quota di proteine mal avvolte è molto alta o il RE è in difficolta per motivi legati ad altre cose ( il RE è sede
di sintesi di lipidi ed è possibile che possa essere ingorgato di lipidi creando problemi alle proteine).

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Lo stress da reticolo endoplasmatico è presente in molti tipi di patologie; in qualche caso è elemento alla base della
patologia mentre in altri casi è una conseguenza della disfunzione.

Tutto quello che è sintetizzato dal reticolo endoplasmatico (proteine sintetizzate nel RER + lipidi sintetizzati nel REL)
raggiungerà zone di reticolo indicate come “elementi di transizione”.
Gli elementi di transizione sono nella zona del reticolo ruvido ma non hanno ribosomi legati: sono le zone da cui
avviene la gemmazione di vescicole.
Non è strano che il RE gemmi vescicole perché è ripieno di lipidi e proteine: la gemmazione è dovuta a proteine che
formano vescicole (le vescicole da sole non si formano).
Tutto il traffico e la stessa gemmazione d vescicole non è un processo casuale ma è guidato.
Il movimento di vescicole è importante nell’ambito della funzione cellulare perché le strutture subcellulari si
scambiano solo vescicole (le vescicole son dirette da un compartimento all’altro) per comunicare tra di loro.
Dagli elementi di transizione i prodotti del RE passano all’interno di vescicole e grazie al loro traffico arrivano nella
zona cis del Golgi dove, una volta entrati, subiranno importanti modificazioni.
Il Golgi è una sorta di “reparto di rifinitura” del prodotto proteina e “inscatolamento ai fini della spedizione”.
Il Sistema del Golgi è un sistema di membrane separate dal reticolo endoplasmatico (non sono in continuità).

La gemmazione di vescicole è un traffico complesso di membrane la cui specificità è assicurata da una famiglia di
GTPasi la famiglia RAB.
La famiglia RAB, coadiuvata spesso da un’altra famiglia denominata ARF, media il traffico di vescicole.
La famiglia Rab fa parte delle GTPasi, costituisce infatti una variante dell’enzima ancestrale che ha assunto un ruolo
talmente importante da dare origine a prodotti ( che derivano da mutazioni geniche) che sono stati selezionati e si
sono specializzati per assumere nuove funzioni.
Le GTPasi Rab funzionano come le altre da un punto di vista del meccanismo di catalisi ma si differenziano per quanto
riguarda gli interattori.
la famiglia Rab comprende tanti elementi, è infatti una famiglia multi-genica.
Gli elementi sono riconoscibili tra di loro pur avendo lo stesso meccanismo e pur essendo proteine che in maniera
evidente sono imparentate tra di loro e con altre GTPasi.
Condividono tutte lo stesso sito attivo che viene però stimolato in maniera diversa.
La specificità è data dalle numerose mutazioni delle Rab, che comportano un’alterazione del meccanismo della
normale omeostasi cellulare.

Le proteine Rab, che possono legare GDP o idrolizzare GTP a seconda del substrato con il quale interagiscono,
possono:
a. intervenire nelle vie endocitiche;
b. controllare il processo di gemmazione delle vescicole dall’internalizzazione delle proteine al trasporto stesso.
Intervengono infatti nei meccanismi di gemmazione per endocitosi delle vescicole; guidando, grazie alla
presenza di opportune Rab (Rab5, Rab4, Rab13), il percorso delle vescicole.
c. Degradare le proteine; oltre che nel riciclare della membrana plasmatica.

Le proteine della famiglia che mediano il traffico sono le COPI, COPII, e CLATRINA: sono proteine molto grandi che
ancorandosi alla membrana (legando proteine di membrana) sono in grado di polimerizzare andando a formare una
struttura sferica; quando la polimerizzazione è completata cominceranno a distaccarsi.
Queste proteine mediano quindi il distacco di una grande vescicola rivestita.

Le COPII sono sintetizzate nel citosol e sono dei grandi complessi proteici a quattro braccia; possono ancorarsi alle
membrane del reticolo e creare per polimerizzazione polimeri di COPII, cioè grandi gabbie con struttura sferica.
La proteina COPII forma delle grosse vescicole con ripieno non selettivo.

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La funzione delle proteine COPII è di fare gemmare vescicole che partono dal reticolo endoplasmatico e viaggiano
verso la zona cis del Golgi.
Il viaggio può avvenire direttamente nei vegetali, mentre nel caso di cellule animali c’è un compartimento intermedio
chiamato ERGIC: la vescicola si stacca va a livello del compartimento ERGIC, e poi da ERGIC si staccano vescicole che
vanno nella zona cis. (Il processo è mediato.)

Le COPI intervengono invece nel traffico dentro al Golgi. (Sia dal Golgi a tornare indietro, sia da una zona all’altra del
Golgi).
Hanno una struttura trigonale, così come la CLATRINA (proteina imparentata con la COPI, legata al trasporto di enzimi
lisosomiali verso il lisosoma).
La COPI e la CLATRINA hanno strutture molto simili, sono molecole trilobate e la vescicola che gemmano è più piccola
rispetto a quella gemmata dalle COPII.

Le vescicole che si staccano sono inizialmente rivestite dalle proteine di rivestimento che poi si staccano.
Le vescicole si trovano quindi senza rivestimento.

Ci sono particolari proteine di membrana che sono complessi, formati da strutture con 4 braccia, in grado di ancorare
le proteine sulla membrana del reticolo.
Sono T-SNARE, V-SNARE e sono proteine di fusione specifiche posizionate sulla membrana.

La vescicola, contenente proteine v-SNER, può interagire con un bersaglio che può contenere alcuni tipi di proteine
SNER indicate come t-SNER ( dve “t” sta per target).

Le proteine SNER sono quattro; mediano la fusione che può avvenire in maniera:

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❖ OMOLITICA: vescicole che vengono dalla stessa membrana si fondono tra loro, è un meccanismo che
chiamerà in causa vescicole ciascuna aventi 4 proteine SNER
❖ ETEROLOTICA : fusione di vescicole di diversa provenienza, provengono da due strutture subcellulari
diverse. Il bersaglio ha tre t-SNER e la vescicola che arriva per la fusione contiene la quarta vescicola, che
è una v-SNER. Le quattro SNER formano un complesso con struttura quaternaria compatta che media
l’avvicinamento delle vescicole e la loro inevitabile fusione.
Le 4 SNER si trovano sulla stessa membrana come un complesso, legate tra loro.
Alla fine del processo vanno staccate perché altrimenti resterebbero bloccate in quella situazione.
L’interazione che porterà la SNERa contatto con le altre, dipende da interazioni tra proteine Rab. (come il legame del
ribosoma al recettore del RER dipende dall’interazione tra GTPasi della SRP con GTPasi della membrana in un processo
specifico.)

FUSIONE ETEROLITICA TRA VESCICOLE DEL RER E DEL GOLGI  processo altamente guidato
Per passare dal RER al Golgi c’è un traffico di vescicole.

Il meccanismo di fusione delle vescicole è completamente guidato e mediato dalle proteine SNERP.
La fusione tra le vescicole non deriva dal loro urto (quando urtano due sfere possono solo rimbalzare) ma avviene
grazie ad assemblaggio di proteine in complessi quaternari.
Ci sono dei meccanismi di riapertura di questi complessi: il complesso quaternario delle proteine SNERP, che ha
mediato la fusione e fa si che le vescicole restino attorcigliate tra di loro, viene riportato nella situazione iniziale da
una serie di proteine ATPasi che circondano il complesso, idrolizzano ATP, ruotano dopo aver agganciato i vari
elementi e separano quindi le proteine.

È una fusione tra vescicole che provengono da due compartimenti diversi: una vescicola proviene dal reticolo
endoplasmatico e l’altra dal Golgi.
La vescicola che viene dal RER contiene una proteina v-SNER, mentre sul Golgi ci sono tre t-SNER disoccupate che
aspettano di essere legate (proteine di membrana con importante parte che sporge).
La v-SNER entrerà in contatto con le t-SNER soltanto a seguito di un’interazione tra Rab.

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Il processo è guidato dalle Rab (che intervengono sia sulla vescicola che si sposta sia sulla membrana che costituisce il
bersaglio): la vescicola è portata nel sito specifico dove si riesce ad ancorare.
Nel momento in cui avviene l’ancoraggio, il legame delle Rab va a posizionare la v-SNER vicino alle t-SNER.
A questo punto si assembla un complesso di SNER che è trans per cui tre SNER sono sulla membrana del bersaglio
mentre la quarta SNER si trova sulla vescicola.
Il complesso trans media la fusione.

Le proteine si attorcigliano in struttura quaternaria e la vescicola proveniente dal RER si fonderà con la membrana del
Golgi perché le fasi lipidiche interagiscono.

Nel momento in cui si ha la fusione il complesso si trasforma in cis perché una parte di membrana diventa parte
dell’altra.
Quando avviene l’interazione, nel caso della fusione tra vescicole che provengono da membrane di organelli diversi, si
hanno t-SNER in attesa della v-SNER.

Il complesso deve essere poi disassmeblato.


Le SNER si ritrovano tutte sulla stessa membrana, la vescicola si è fusa e il suo contenuto è entrato dentro al bersaglio;
il complesso formato dalle quattro SNER è rimasto intatto.

Per disassemblare le SNER bisogna aprire il legame  il processo di apertura di proteine attorcigliate chiama in causa
un complesso ATPasico chiamato NSF che interagisce con proteina SNAP.

Il complesso attorcigliato, formato dalle SNERP, verrà aperto da questo motore molecolare che:

❖ si assembla
❖ idrolizza ATP
❖ ruota aprendo il complesso

Si può avere il riciclo di SNER che, nel caso di fusione eterolitica viene riportata nel luogo di origine mentre nel caso di
fusione omolitica resta con tutte e quattro su un’altra membrana dello stesso identico tipo.

I meccanismi di avvicinamento chiamano in causa principalmente proteine Rab ma possono esserci anche altri tipi di
proteine che mediano il processo.

Esempi presi da articoli:

DSL1 è complesso di proteine dimensionalmente grandi, fotografabile al microscopio elettronico.

Si parla di complessi molecolari grandi, pluriproteici e che possono esistere in diverse forse. Il complesso DSL1 si
assembla e si lega sull’estremità dell’esterno. Può esistere in due forme: forma lassa e aperta oppure forma chiusa. In
forma lassa il complesso può portare e favorire l’assemblaggio delle SNER. Questo stesso tipo di complesso proteico
interviene anche nel traffico dal RER al Golgi o dal RER all’ERGIC.

Le interazioni tra proteine sono spesso guidate da altri tipi di proteine che possono:

- garantire le interazioni
- bloccare le interazioni quando è in forma chiusa (la fusione tra due vescicole non può avvenire)

Chi è che separa le proteine complesso di proteine con attività ATPasica che lega il complesso e l’estremità delle cis-
SNER , idrolizza ATP e ruota allontanando le catene che sono attorcigliate ( le storciglia).

Questo sistema NSF coadiuvato dalle proteina SNAP, dimostra la versatilità delle proteine che possono agire in molti
modi. Alcune proteine sono dei veri e propri motori ad ATP(es dineine e chinesi che possono muoversi su microtubuli
utilizzando ATP e trasportare vescicole. Oppure come pompe di portoni che formano ATP nei mitocondri, o pompe di

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portoni che acidificano l’ambiente intralisosomiale per attivare enzimi lisosomatici. ), altre sono dei veri e propri
combustibili (GTP, ATP, UTP) che procurano una quota di energia sufficiente a guidare processi.

Le proteine sono molecole estremamente versatili, la loro potenzialità è enorme; sarebbe impensabile immaginare il
sistema vita senza proteine.

Le proteine che erroneamente sono state portate sono riconoscibili perché hanno sequenza chiamata K/HDEL, tutte le
proteine che devono svolgere la loro funzione nel RER hanno questi aminoacidi esposti sulla superfice.
Nel Golgi ci sono dei recettori che legano questa struttura: questi recettori legano la struttura ed introno a loro
verranno fatte gemmare vescicole che riporteranno indietro le proteine in questione.
Una proteina che doveva funzionare nel RER e che va a finire erroneamente nel Golgi viene portata indietro con un
traffico retrogrado che è un traffico di recupero.
Questo traffico di recupero è reso necessario perché è molto facile che una proteina finisca erroneamente dalla zona
finale del RE al Golgi; ciò perché le proteine COPII fanno gemmare vescicole con contenuto casuale (non c’è nessun
tipo di selezione).
Le proteine che arrivano alla fine del RE, come passeggeri salgono senza biglietto sugli autobus; qualunque proteina si
trovi in quella zona si trova impacchettato nella vescicola e trasportato alla zona cis del Golgi.
Chi non doveva andare può essere riportato indietro perché viene riconosciuto.

Questa vescicola è indirizzata verso un determinato bersaglio; se non raggiuge il suo bersaglio per qualche motivo,
vagherà nella cellula finché i lisosomi (o altro) non la distruggono. Tra le funzioni dei lisosomi c’è anche la clinofagia
ossia la distruzione di vescicole di secrezione che non sono mai state usate. Un esempio di vescicole di secrezione mi
utilizzate è quello delle vescicole piene di ormoni; se non avviene la secrezione dopo un certo lasso di tempo verrà
distrutta dai lisosomi.

È possibile che una proteina che debba funzionare nel RER, la cui funzione è quindi quella di stare nel RER,
disgraziatamente si possa trovare chiusa in una vescicola ed andare a finire nel Golgi; questo comporterà una perdita
di proteine dal reticolo ruvido e conseguentemente un danno energetico.
Si può parlare di danno energetico perché le proteine in questione andrebbero a sostituire secreti.
Esiste un meccanismo di recupero ossia il TRAFFICO RETROGRADO:
le vescicole, oltre a percorre la direzione RER  Golgi, possono essere gemmate “al contrario” e in questo caso sono
vescicole che contengono solo proteine che devono restare nel reticolo.
Ci sono dei recettori nell’apparato del Golgi che riconoscono e legano le proteine che hanno una specifica sequenza
segnale; questi recettori, dopo aver legato le sequenze segnale, vengono assemblati da proteine dall’esterno e avverrà
la gemmazione di una vescicola.
Questa vescicola, che contiene recettori e proteine con la sequenza segnale legata, seguirà un traffico retrogrado che
ha come destinazione il RER, sulla membrana del quale avverrà la fusione.

Le vescicole che fuoriescono dal Golgi non sono libere di “nuotare” nel citosol ma verranno portate da motori
molecolari (ci sono delle ATPasi come chinesine/kinesine e dineine, appartenenti ad una famiglia proteica conosciuta
con il nome di “motori proteici”) che camminano sui microtubuli al punto giusto, dove avverrà la fusione.

Il DESTINO FINALE della proteina sintetizzata nel RER (proteine che avevano la sequenza segnale) può essere:
1. SECREZIONE COSTITUTIVA ossia processo lento e non selettivo che serve sia a rifornire la membrana
cellulare di nuove proteine e recettori, sia a formare le proteine della matrice extracellulare.
Ha lo scopo di mandare fuori dalla cellula proteine fortemente glicosilate. La forte glicosilazione delle
proteine in questione ha una funzione importante, ossia serve a mantenere idratato l’ambiente esterno.
2. SECREZIONE REGOLATA di ormoni di natura peptidica, ossia processo che avviene in maniera condizionata a
qualcosa; costituisce per esempio la risposta ad un ormone o ad un processo recettoriale (esempio sono le
vescicole piene di insulina che sono ferme nelle cellule beta del pancreas. La secrezione dell’insulina avverrà
quando dei recettori, che legano glucosio con bassa affinità e che sono presenti sulla membrana delle cellula
beta , essendo la glicemia alta legano glucosio. Questi recettori legano male il glucosio perché hanno bassa
affinità ma se il glucosio è tanto, anche se si staccasse dal recettore ci sarebbe subito un altro glucosio pronto
a legarsi. Nel momento in cui i recettori legano il glucosio subiscono una transizione geometrica (cambiano la
geometri interna e quindi anche le interazioni che fanno. Essendo un recettore una proteina che attraversa
tutta la membrana, se lega qualcosa fuori, questo grande filo di amminoacidi cambia leggermente la sua
geometria e cambia qualcosa anche all’interno.), si assemblano semplici proteine e si attivano attività

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enzimatiche che vanno a fosforilare attivando così la cascata di traduzione del segnale, il cosiddetto
“singalling”. L’esito è la fusione delle vescicole con la membrana e la conseguente liberazione di insulina.
3. Un’altra possibilità per le proteine è quella biosintesi di lisosomi: gli enzimi lisosomatici hanno un percorso
particolare infatti sono sintetizzati nel RER e da questo non vanno in secrezione ma vanno a formare le
strutture dei lisosomi.
4. Proteine destinate a restare all’interno del RER;
5. Proteine di membrana (tutti i recettori di membrana sono sintetizzati a livello del RER)
Nel caso del virus HIV, la proteina GP120, che si trova sulla membrana cellulare che ricopre i virus e che
media l’interazione con i recettori sui linfociti T-Helper, verrà sintetizzata da ribosomi adesi al RER.
Anche nell’ambito delle proteine sintetizzabili dal genoma virale ci sono proteine di membrana, i ribosomi e
le SRP riconosceranno quelle sequenze.

Il messaggio che indica la destinazione della proteina risiede già nell’m-RNA, non necessariamente lo si ritrova in
maniera semplice nei geni ma sicuramente si trova nell’assemblato dell’m-RNA, ossia l’insieme di esoni, sequenze UTR
(etc).
Il destino della proteina dipende dalle SEQUENZE SEGNALE: ossia da sequenze di amminoacidi.
Le proteine di membrana hanno un segnale che spesso è determinato ma la sequenza segnale può essere anche
dentro la struttura della proteina o verso la fine della proteina ed espresso in corso di sintesi (solo per le proteine di
membrana).
Esistono dei programmi che permettono, a partire dalla sequenza, di prevedere il destino delle proteine: per esempio
quelle di membrana possono essere riconosciute per la sequenza di amminoacidi idrofobici vicini tra di loro.

Rappresentazione del meccanismo di sintesi proteica a livello del ribosoma:


c’è m-RNA, il ribosoma, la sequenza segnale ancorata alla membrana; la sintesi ha ripreso (il complesso SRP si è
staccato) e la proteina di nuova sintesi sta entrando all’interno del RER.
La sequenza segnale è bloccata e la sintesi riprende per cui la proteina va a crescere all’interno.
La sequenza segnale (in arancione) non si trova perché c’è proteasi specifica nella membrana del RER che è chiamata
segnalasi (asi=taglia) che va a tagliare la sequenza segnale.
Nel momento in cui la sequenza segnale viene tagliata, la proteina crescerà, verrà tutta internalizzata e assumerà una
sua struttura tridimensionale.

Questa è una possibilità e molti tipi di proteine solubili sono sintetizzate in questo modo (=non si trova la sequenza
segnale).

In realtà le proteine di membrana possono ritrovarsi legate alla membrana in tutti i modi possibili e questo dipenderà
dalla posizione all’interno della catena della sequenza segnale, che determina il sito di ancoraggio della proteina
conferendogli un ruolo specialistico.

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Altre modalità:

1. Avviene l’ancoraggio, la sequenza segnale è bloccata, la proteina viene sintetizzata ma la usa traslocazione è
impedita. La traslocazione è impedita per la presenza (in giallo) di una serie di amminoacidi idrofobici che
costituiscono tipo una sequenza segnale idrofobica. La sequenza interagisce con i lipidi che stanno a
circondare il canale proteico. Il risultato è che la sintesi di proteine continua ma il filo di amminoacidi dopo la
sequenza non riesce ad entrare e la proteina verrà sintetizzata con una parte dentro ed una fuori. La proteina
sarà ancorata alla membrana: l’-NH2 inziale dentro e il -COOH finale fuori; è proteina con un tratto 𝛼-elica
dentro alla membrana.

2. La sequenza segnale si trova all’inizio, poi interviene una sequenza di blocco idrofobica nella traslocazione
che interagisce con la parte idrofoba della membrana e quindi impedisce la traslocazione della proteina. La
sequenza segnale non è all’inizio; c’è una sequenza simile a quella segnale (è un meccanismo differente che
permette al ribosoma di restare incastrato nella membrana) ed è nel mezzo della proteina. Quando compare
questa sequenza un grosso pezzo di proteina è già stato sintetizzato.
Avviene un meccanismo diverso dal solito: non sono le SRP che legano il ribosoma al reticolo ma c’è un
meccanismo che porta la sequenza segnale a legarsi a livello del canale di membrana. La proteina in questo
modo ancorerà il ribosoma (avviene tutto normalmente).
L’SRP si staccherà, il ribosoma riprenderà la sintesi ma la sequenza in questione resterà bloccata dentro alla
membrana. Si avrà proteina orientata al contrario di quella del caso 1.) : la parte N-terminale sporge fuori
mentre la -COOH all’interno.
La sequenza segnale si trovava in corso di sintesi, quando una parte della proteina era già stata sintetizzata.
La sequenza che si trova è idrofobica altrimenti non potrebbe restare nella membrana.

3. Parte della proteina è stata sintetizzata e viene ancorata mediante una sequenza segnale. La proteina sta
entrando, compare la sequenza (gialla) di stop. La proteina che si forma ha –NH2 iniziale e -COOH terminale
dalla stessa parte e una grande ansa che sta dall’altra parte.

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4. proteine di membrana multipasso attraversano la membrana più volte.
Le proteine multipasso hanno sequenze segnale senza interruzione, sono grandi complessi che attraversano
più volte la membrana.
Sono come recettori che funzionano con le proteine G; sono una classe di recettori con centinaia di membri
che regolano funzioni importantissime sono cioè recettori di molecole segnale. Sono una famiglia molecolare,
perché tutti i recettori passano la membrana 7 volte; hanno 7 tratti ad 𝛼-elica e hanno una parte che sporge
all’interno della cellula sempre uguale (per tutta la famiglia molecolare). Il punto di diversità consiste nelle
zone che stanno fuori dalla cellula e che possono legare molecole segnale diverse. (Possono legare da piccole
molecole tipo l’adrenalina a grandi molecole come proteine.) Sono una grande famiglia, variazione dello
stesso tema: sono recettori apparentemente diversi ma che nelle strutture sono varianti di uno stesso tema
(trasportano la stessa informazione con differenze).

Nell’ambito delle proteine gli orientamenti possono essere molti, si può costruire una proteina orientata in tutti i modi
immaginabili.
Si può costruire un meccanismo opposto in cui la sequenza segnale c’è dall’inizio (fin da quando la proteina sta
entrando) la sequenza di STOP della traslocazione fa si che la proteina sporga fuori; alla fine ricompare un’altra
sequenza segnale e la proteina viene riinserita e completamente sintetizzata.
Le diverse possibilità di orientamento delle proteine di membrana costituiscono un gioco di sequenze segnale e
sequenze di stop (blocco) della traslocazione.

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LEZIONE 12: parte finale
30/11/2017

ERAD: controllo qualità delle proteine


Nel reticolo endoplasmatico ruvido avviene la sintesi della proteina, se la struttura è corretta verrà inviata con
vescicole all’apparato di Golgi, se invece non assume la struttura corretta (i sistemi di aiuto alla proteina non
funzionano) interviene un meccanismo di controllo qualità chiamato ERAD (degradazione associata al reticolo
endoplasmatico).

È necessario esportare la proteina ed anche in questo caso interviene l’ubiquitina, che ha il solito scopo di mascherare
le zone idrofobiche e impedire la formazione di aggregati.
La proteina mal avvolta è legata a chaperons calcio-dipendente (es. la proteina BiP) che la trasportano a meccanismi
proteici di membrana del RER in cui si vengono a creare canali (si tratta di una sorta di traslocone). Con un
meccanismo attivo la proteina è risucchiata nel canale, ubiquitinata e portata verso il citosol. Nel citosol incontra il
proteasoma e viene smaltita.
Il problema del mal avvolgimento e quindi ERAD, riguarda ogni tipo di proteina, sia citosolica che di membrana.
• Le proteine solubili, non di membrana, che a causa di una sbagliata conformazione tenderebbero a formare
aggregati, sono rese abbastanza solubili dai chaperons che mascherano le zone idrofobiche. Impediscono
l’aggregazione, le staccano e le portano fuori.
• Le proteine di membrana:
1. La proteina di membrana può essere staccata dalla membrana grazie ai chaperons, e trasportata al
complesso di traslocazione, la proteina esce ubiquitinata e viene distrutta dai proteasomi. (2)
2. Se la proteina di membrana è avvolta male nella parte che è rivolta verso il lume, ci sono due
possibilità: o questa parte è tagliata e prelevata da chaperons, o addirittura, se vicino c’è il
traslocone, questa parte è risucchiata dal traslocone che alla fine andrà a staccarla dalla membrana
e a trasportarla fuori. Anche la proteina integrale di membrana può essere spostata, tolta dalla
membrana e ritrovarsi nel citosol ubiquitinata. (3) e (4)

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3. Se la proteina di membrana è avvolta male nella parte rivolta verso il citosol il processo di
ubiquitinazione inizia nel citosol e la proteina è staccata. Alla fine andrà nel proteasoma a
degradare. (5)

Il processo funziona bene se i proteasomi sono disponibili, in caso contrario il reticolo endoplasmatico entra in una
condizione di stress. Si riempie di proteine danneggiate e questo interferisce con il normale funzionamento del
reticolo comportando anche la morte cellulare. Si attivano meccanismi strani come fattori di trascrizione particolari
che intervengono in condizione di stress. Se ERAD non funziona, il RE non funziona, la cellula non produce più proteine
utili e si entra in condizioni di patologia. In molti casi danni cellulari prima o poi vanno a comportare stress del reticolo
endoplasmatico, in certi casi lo stress può essere causa in altri conseguenza del danno cellulare.

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1

STRUTTURA E FUNZIONE DELLA CELLULA


LEZIONE 13
04/12/2017

Funzioni del RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO


Il REL è la parte del reticolo endoplasmatico, nel suo complesso, con composizione fisica e chimica diversa: non
dispone dei recettori che legano i ribosomi e dispone di meccanismi molecolari differenti. Se analizzassimo porzioni di
RER e REL, anche in assenza di ribosomi legati riusciremmo a distinguerli.
Funzioni REL:
• Accumulo ioni calcio. Non si possono trovare nel citosol, c’è meccanismo di regolazione estremamente
accurato perché ci sono proteine in grado di legare calcio e cambiare forma, nella forma con il calcio legato
danno luogo a interazioni diverse. Nel corso dell’evoluzione si sono selezionate proteine calcio-leganti diverse
strutturalmente ma che legano calcio allo stesso modo. Hanno tutte stesso motivo calcio-legante.
• Sintesi di lipidi. Tutti i lipidi della cellula, compresi gli ormoni di origine steroidea sono sintetizzati nel REL.
• Intervenire nella fase 1 del processo di detossificazione.

Ruolo del reticolo liscio nella regolazione dei livelli di ioni calcio nel citosol
Gli ioni calcio sono legati a particolari proteine e intervengono a tanti livelli. La presenza di ioni calcio nel citosol
interviene nel “signalling cellulare” in risposta a molecole segnale (ioni calcio=secondo messaggero).
Gioca molti ed importanti ruoli perché il motivo calcio-legante è ripetuto in molte proteine che a seguito di questo
cambiano la loro geometria e attivano processi. In questo caso l’interazione avviene per contatto tra superfici
compatibili, quindi con eliminazione di acqua e successivo aumento di entropia dell’acqua e formazione di un
complesso quaternario.
I livelli plasmatici degli ioni calcio sono strettamente regolati (±5%) (esempio: un aumento è legato alla secrezione di
insulina)
• Se sono troppo bassi = iper-eccitabilità neuronale;
• Se sono troppo alti = ipo-eccitabilità neuronale.
Punti di controllo dei livelli di ioni calcio:
• assorbimento → attraverso l’intestino
• escrezione → attraverso l’urina
• accumulo temporaneo → nel tessuto osseo

Pompe e canali del calcio


La concentrazione di ioni Ca++ nel citosol è minore di 1μM. Entra
nella cellula attraverso canali del calcio, meccanismi non attivi
sulla base di una differenza di concentrazione e viene rimandato
fuori dalla cellula con meccanismi attivi che impediscono al calcio di
restare nel citosol. Il calcio può essere sequestrato anche dalle
strutture subcellulari, ad esempio REL. Il calcio che entra nella
cellula è quindi in parte rimandato fuori, in parte finirà o nel REL o
nei mitocondri o nei lisosomi.
Il calcio libero nella cellula non esiste perché attiva particolari
meccanismi importanti. Viene accumulato perché solo in risposta a
certi stimoli sarà liberato nel citosol. I meccanismi rimarranno
attivi fino a quando le pompe molecolari non risequestreranno il
calcio nel RE o non lo rimanderanno fuori.

Proteine calcio leganti e loro ruolo nella cellula


Nel REL ci sono pompe e canali che con meccanismo attivo spostano gli ioni calcio, ad esempio in risposta a certi
ormoni.
Alcuni ormoni attivano un processo di trasduzione del segnale che comporta il taglio di un lipide di membrana, il
fosfatidil-inositolo che genera 3 gruppi fosfato e un inositolo che può legarsi ai canali del calcio del REL, aprirli e fare
aumentare i livelli di questo ione nel citosol. Le pompe che mandano il calcio fuori dalla cellula sono sempre attive ma
se c’è un aumento di ioni le pompe non riescono ad eliminarlo subito, e così si lega a proteine che sono disponibili
nella cellula e mediano processi. All’interno della cellula calcio libero non si presenta, per quanto riguarda gli ioni
bivalenti c’è una ridotta quantità di Mg2+.

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All’interno del RE il calcio non è libero come ione vagante ma è affidato a proteine. Ciascuna di queste proteine ha 20-
50 siti che legano Ca++ con bassa affinità, contenenti amminoacidi acidi.
• Calsequestrina nel lume del reticolo sarcoplasmatico, che è una specializzazione del reticolo liscio.
Aumento livello ioni calcio nel tessuto muscolare: la troponina che è legata alla tropomiosina maschera i siti
dell’actina che potrebbero interagire con la miosina. All’aumento di ioni calcio la troponina cambia forma,
sposta la tropomiosina e si espongono i siti di binding dell’actina per la miosina (siti calcio leganti). Si ha
contrazione muscolare.
Aumento di ioni calcio  modifica della geometria di una proteina calcio-legante  effetto macroscopico
(es: contrazione muscolare).
• Calreticulina che si trova nel lume del reticolo liscio di cellule non muscolari. Ha anche un ruolo nel protein
folding.
L’evoluzione di una proteina specifica di accumulo di ioni calcio indica che gli ioni calcio sono importanti (“devono
essere trattati con rispetto”) e che bisogna impedire la loro libera fuoriuscita all’esterno. Il calcio è accumulato,
legandolo a proteine particolari come il ferro (transferrina che porta a spasso gli ioni ferro all’interno della cellula, la
ferritina che accumula ioni ferro). Sono tutti ioni con funzioni importanti perché hanno bersagli ben definiti, con i quali
interagendo scatenano specifiche reazioni nella cellula, modificano il funzionamento della cellula.

Calmoduline ed altri esempi di proteine che legano ioni calcio

Nell’ambito del citosol cellulare ci sono proteine che legano calcio


come la CALMODULINA. È in grado di legare 4 ioni calcio e
presentarsi nelle due diverse conformazioni geometriche, una con
calcio legato e una priva di calcio. Ci sono 4 motivi elica-loop-elica,
due per ogni estremità della calmodulina, che ha quasi la forma di un
manubrio. La calmodulina senza calcio è una molecola estremamente
inerte, solubile che non interagisce con niente, non appena lega
calcio modifica la sua forma e interagisce con un bersaglio.
Alcuni enzimi attivati dalla calmodulina:
• Alcune Protein kinasi (CaM kinasi) che trasferiscono un
fosfato dall’ATP ad un idrossile di un altro enzima la cui attività viene modificata.
• La Ca++-ATPasi della membrana cellulare che pompa Ca++ fuori dalla cellula. Solitamente il calcio non c’è
nella cellula, solo quando stimolate da calmodulina si attivano.
Mutazioni ai geni che regolano le funzioni del calcio hanno effetti estremamente negativi, fino alla morte cellulare.
Altro esempio di proteine calcio-leganti è la COLLAGENASI. Può legare 2 ioni calcio e modificare la sua geometria.

Ruolo biologico delle variazioni conformazionali delle proteine calcio leganti


Tante proteine legano calcio perché questo si lega tramite un motivo.
MOTIVO: alcuni elementi di struttura secondaria che possono apparire diversi ma con particolari requisiti. Ad esempio
la localizzazione di certi gruppi R di aa. che devono riuscire a legare quelle molecole in grado di comportare una
variazione di geometria (parole di principato “in questo caso si tratta di amminoacidi acidi, acido aspartico e acido
glutammico, che legano il calcio. La proteina si avvolge attorno allo ione calcio” credo si riferisca ai gruppi R della
calmodulina che legano lo ione calcio).
• Motivo elica-loop-elica (a) lega il DNA. Le proteine che legano DNA hanno questo tipo di motivo, due tratti ad
α-elica uniti da un tratto disordinato. Le poche proteine che legano in maniera specifica il DNA condividono il
motivo.
• Motivo elica-loop-elica (b) lega calcio. Il calcio è legato nel loop. Proteine calcio-leganti possono apparire
diverse nella struttura e come sequenza amminoacidica ma quello che è importante è che certi aa. che
legano calcio (un paio) devono sempre essere presenti e sempre secondo una geometria definita. Tutte le
proteine che legano calcio condividono tale dominio.

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MECCANISMO VITA è basato su PROTEINE CHE CAMBIANO FORMA, e danno luogo ad INTERAZIONI DIVERSE (le
proteine sono insostituibili, non esistono molecole in grado di comportarsi allo stesso modo).

Sintesi di lipidi
Tutti i lipidi che si trovano nella cellula sono stati sintetizzati nel REL. Dal RE nel suo complesso si staccheranno poi
vescicole che porteranno i lipidi nelle varie strutture subcellulari. I mitocondri e la membrana cellulare rinnovano il
loro contenuto di lipidi ricevendo vescicole. Il RE nel suo complesso è una struttura in continua crescita, nella parte
liscia c’è continuamente produzione di membrana nuova, e la zona rugosa è in continuità con la zona liscia. Nel
complesso il RE aumenta di dimensioni.
La membrana ha un contenuto di lipidi ASIMMETRICO.

La presenza di certi lipidi in un foglietto di membrana o in un altro è indicativa di determinate condizioni. Se sposto nel
foglietto esterno un lipide che normalmente è nel foglietto interno, attiva meccanismi come quello di codice per la
cellula morta. I macrofagi si avvicinano a tutte le cellule che presentano la fosfatidil-serina. Questo lipide non è mai
esterno, se è presente significa che quello è un pezzo di cellula morta. L’asimmetria della membrana è dovuta a
MECCANISMI FLIP-FLOP. Possono essere spontanei o guidati. La membrana è un cantiere di lavoro, ed è modificata in
risposta a stimoli (programma la morte  sposta la fosfatidil-serina fuori).
La costruzione di lipidi non avviene nel lume del REL ma nel citosol cellulare. Gli enzimi sono contenuti nel REL ma un
nuovo lipide è sintetizzato solo nella membrana rivolta verso il citosol.

Sintesi di lipidi nel Reticolo endoplasmatico liscio

Meccanismo di flip-flop

Ruolo della generazione della asimmetria delle membrane nella cellula


La sintesi di fosfolipidi di membrana avviene ad opera di un concorso di enzimi del citosol e della membrana del REL. Il
nuovo lipide si trova sintetizzato nel foglietto esposto verso il citosol e la membrana si arricchisce solo da una parte, in
cui sono inseriti tutti i nuovi lipidi. Il foglietto interno ha, quindi, meno lipidi. Questo meccanismo determina il
processo spontaneo di flip-flop. I lipidi che si trovano verso il citosol verranno rigirati spontaneamente e la membrana
si riequilibrerà. In parte il processo è guidato da enzimi di membrana una volta chiamati flippasi, ora indicati come
scramblasi.
Nelle membrane il contenuto di lipidi non è randomizzato, c’è forte asimmetria nella membrana. la distribuzione dei
lipidi non è casuale, certi tipi io li trovo solo nella parte interna o solo nella parte esterna. I lipidi vengono spostati e
fatti ruotare, e gli acidi grassi cambiati da saturo a insaturo. Lo scopo è mettere le proteine di membrana nelle
condizioni ottimali di funzionamento.
Gli enzimi che spostano i lipidi di membrana gemmano in vescicole dal RE, in particolare da quelle zone chiamate
“elementi di transizione”, né lisce né rugose, e andranno a determinare nei vari bersagli, come la membrana cellulare,
la particolare asimmetria e dove, in risposta a certi stimoli, i lipidi sono spostati.

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Anche i lipidi non di membrana sono sintetizzati nel REL, ad esempio gli ormoni steroidei o anche il tessuto
ghiandolare che produce molecole segnale di natura lipidica ha un esteso sviluppo di reticolo liscio.

Processo di detossificazione cellulare

Quando e perché una molecola può essere pericolosa


Come mai dobbiamo detossificare? Dobbiamo detossificare (mi piaceva riprendere la domanda e sentirmi alle
elementari 😉 ) perché la cellula è un sistema aperto, scambia materiali con l’esterno, si alimenta ed elimina i rifiuti. La
cellula entra in contatto con un grande numero di molecole. Con l’alimentazione si introducono mix molecolari
complessi. La singola cellula si ciba di glucosio, ma l’organismo ha bisogno di miscele molto più complesse. Quando
tocco qualcosa entro in contatto con molecole, quando respiro non entro in contatto solo con ossigeno o azoto ma
con tantissime altre specie. L’organismo è esposto ad una sorta di contatto con molecole provenienti dall’ambiente
esterno. Può entrare in contatto con molecole che derivano dal processo di trasformazione esercitato all’interno
dell’organismo di molecole che provengono dall’esterno. Se le molecole sono inerti non c’è problema ma se sono
reattive, con qualche zona della struttura reattiva, è pericolosa perché può reagire.
Noi siamo in grado di detossificare e inattivare molecole reattive di provenienza:
• esogena (xenobiotici come erbicidi e pesticidi, inquinanti nell’aria come prodotti di combustione e fumo di
sigaretta, prodotti farmaceutici). Se ho come in questo caso una molecola reattiva che non ho mai incontrato
la cellula cercherà di avviare il processo di detossificazione ma non so se ho l’enzima adatto o meno. Se non
ce l’ho non riesco a disattivare la molecola e posso anche morire. Poco a poco nel corso dell’evoluzione
l’essere umano è stato selezionato. Noi abbiamo un insieme di enzimi di detossificazione che ci garantiscono
protezione dalle molecole reattive con cui i nostri antenati sono entrati in contatto. Un prodotto nuovo
qualcuno è in grado di inattivarlo altri no. Si avvia un processo di selezione.
• endogena (tossine intestinali prodotte da batteri, parassiti e lieviti, ormoni, acidi biliari, intermedi
metabolici).

Fase acquosa: grande meccanismo di difesa. L’essere vivente è un sistema acquoso, l’acqua è l’elemento
fondamentale, per questo la fase acquosa è molto difesa. I nostri meccanismi di difesa si trovano soprattutto nella
fase acquosa in modo tale che una molecola tossica idrosolubile possa essere smaltita con una certa facilità. La
molecola tossica idrosolubile ha grosse difficoltà ad entrare nella cellula, può entrarci con escamotage e poi ci sono
meccanismi che la inattivano. Dentro la cellula ci sono poi le pompe molecolari che eliminano le molecole inattivate. Il
complesso di detossificazione in fase acquosa funziona benissimo.
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Membrana: parte più fragile della cellula. L’interno della membrana è idrofobico così una molecola idrofobica
tenderà ad entrare dentro la membrana e ad accumularsi. Noi eliminiamo con facilità una molecola idrofila, mentre
non riusciamo ad eliminare molecole idrofobiche poiché entrano dentro la membrana, in cui non ci sono meccanismi
di detossificazione. Le molecole dentro la membrana costituiscono un potenziale pericolo perché la membrana è
attraversata da piccole molecole come l’ossigeno, che la attraversa liberamente anche nella fase lipidica. La presenza
di molecole tossiche può innescare reazioni radicaliche che sono reazioni a catena, determinano l’effetto di
propagazione, un radicale reagisce con una specie chimica, si costituisce un altro radicale e così via.
La reazione radicalica terminerà solo quando i radicali saranno presenti in quantità così elevate che reagiranno tra
loro, con reazione di annichilazione. Se ciò avviene la membrana è però distrutta. Nel citosol per la difesa ci sono
glutatione, vitamica C e vitamina E. Nella membrana la difesa è data soprattutto dalla vitamina E, che però è presente
in quantità ridotte e anche quando questa reagisce diventa un radicale e deve essere rigenerata dal glutatione nel
citosol.
Nella membrana ci sono poi gli acidi grassi insaturi che hanno doppi legami e reagiscono con radicali liberi come
l’ossigeno (irrancidimento oli ricchi di acidi grassi insaturi). A seguito di tali legami gli acidi grassi si spezzano e questo
determina riduzione nello spessore della membrana. L’assottigliamento della membrana ha effetti drammatici per le
proteine di membrana che non funzionano più, la cellula non regola i suoi scambi ed è destinata a morire.

Caratteristiche peculiari degli enzimi di detossificazione e loro distribuzione


Il sistema di detossificazione del REL si trova in tutti gli organi che, direttamente o indirettamente, comunicano con
l’esterno.
(Non si trova nei muscoli né nei globuli rossi. Negli altri organi può trovarsi in maggiore o minore quantità)
• Fegato è l’organo più ricco del meccanismo di detossificazione. Esso non comunica con l’esterno ma tutto
quello che noi ingeriamo mangiando o bevendo passerà per il fegato. È la principale barriera (un composto
tossico, un veleno distruggerà il fegato).
• Polmone (benzopirene e vari catrami).
• Intestino
• Rene
• Epidermide
• Gonadi
• Placenta, le sue cellule hanno molto REL. Si impedisce che molecole tossiche raggiungano il feto.

Il REL dispone di un meccanismo di detossificazione perché si pensa che tra tutti i traffici di membrane prima o poi le
molecole tossiche liposolubili arrivino al REL e lì si accumulino. I bersagli sono le molecole liposolubili e il meccanismo
consiste nel renderle abbastanza idrosolubili da poter essere risucchiate via dalla membrana e trattate come
molecole tossiche idrosolubili. Gli enzimi più importanti nel meccanismo di detossificazione sono quelli in grado di
generare -OH: gli enzimi eme-dipendenti, che possiedono il gruppo eme, un gruppo specializzato nel legare ossigeno e
trasportarlo, come l’emoglobina.
Il gruppo eme consiste in un anello tetrapirrolico. I sostituenti differenziano un eme da un altro, nei mitocondri
citocromo C, citocromo B e C1.
Gli eme sono di vario tipo: gruppi eme molto rappresentati nel REL sono: l’eme P450 che è simile all’eme
dell’emoglobina ma diverso per alcune catene laterali, e l’eme P5.
Nell’uomo, le famiglie di enzimi dipendenti dal citocromo P450 sono indicate come CYP1, CYP2, … sono grandi famiglie
geniche.

Famiglie geniche ed evoluzione del sito attivo degli enzimi di detossificazione


Noi disponiamo di enzimi che possono agire contro qualunque molecola reattiva liposolubile che entra dentro le
membrane, anche quelle non esistenti in natura, inventate dall’uomo o di produzione industriale. Questo fa pensare
che tali enzimi debbano appartenere a grandi famiglie geniche. Io devo avere in teoria un enzima per ogni cosa, ma
non è possibile. Nell’evoluzione di questi enzimi c’è un alto grado di polimorfismi. Questi enzimi accumulano
mutazioni e possono cambiare la geometria del sito attivo e funzionare lo stesso, in maniera peggiore o migliore,
verso substrati piuttosto che altri. Il sistema di detossificazione si è ampliato nel corso dell’evoluzione, mutazioni
dannose sono state selezionate negativamente e si sono generate famiglie geniche, divise in sottofamiglie. Ogni
individuo può avere due tipi di sottofamiglie e questo genera un’estrema eterogeneità della capacità di detossificare
tra un individuo ed un altro.

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Nell’uomo ci sono almeno 18 famiglie geniche, 43 sottofamiglie di enzimi contenenti il citocromo P450.

CYP1 non è un singolo enzima ma indica la famiglia 1 che può avere sottofamiglie, ognuna con diversi e numerosi
membri. Di ciascuna famiglia, ogni individuo può avere due geni (uguali o diversi se omozigote o eterozigote) e può
quindi esprimere fino a due diversi isoenzimi.
Questo genera notevole eterogeneità tra un individuo ed un altro. Gli enzimi sono continuamente in evoluzione e il
pattern di detossificazione da un individuo ad un altro tende ad essere differente  effetti collaterali farmaci: la
presenza di una diversa forma di enzimi di detossificazione può essere inadatta per eliminare quel farmaco o essere
troppo veloce, troppo adatta. C’è un problema di dosaggi. Gli effetti collaterali dipendono dal set genico di un
individuo. Un obiettivo è quello di riuscire a determinare la costituzione di enzimi in un individuo e conoscere la loro
variabilità per saper come possano reagire.

Come è stato possibile che si siano generate così tante famiglie e sottofamiglie? Come può l’enzima avere una serie,
che teoricamente, sarebbe infinita di substrati?
Generalmente un enzima è una molecola che ha una regione, spesso una cavità sulla superficie che prende il nome di
sito attivo. Se io avessi una mutazione che altera la struttura del sito attivo avrei un enzima non funzionante, con il
pericolo che se è questo è importante a livello di metabolismo cellulare tutto il sistema ne risulta compromesso. Gli
enzimi generalmente si conservano nella geometria del sito attivo, basti pensare agli enzimi della glicolisi. Una
mutazione che altera la struttura del sito attivo è selezionata negativamente. Questi enzimi invece funzionano
diversamente: è importante conservare solo una parte del sito attivo. Non agiscono riconoscendo tutta la molecola,
ma solo un particolare, quello specifico gruppo funzionale può quindi trovarsi in molecole diverse. Questi enzimi sono
tolleranti verso mutazioni che cadono nel sito attivo purché si conservi quel particolare. Avrò quindi due enzimi che
agiranno entrambi verso quel gruppo ma possono legare substrati anche un po’ diversi.
Questi enzimi sono specifici verso certi gruppi funzionali ma sono stati tolleranti verso mutazioni che riguardassero la
geometria complessiva del sito attivo.
Il fatto che questi enzimi siano tolleranti nei confronti di modificazioni del sito attivo ha come vantaggio l’estrema
versatilità e variabilità nelle molecole bersaglio. Se entro in contatto con qualcosa di estraneo questo per una serie di
mutazioni può essere riconosciuto e smaltito, se non ho l’enzima adatto sarà invece tossico.
Enzimi comuni  tolleranza verso mutazioni in periferia.
Enzimi di detossificazione tolleranza verso mutazioni nel sito attivo.
Gli enzimi si sono evoluti sotto forma di varianti, che hanno siti attivi molto diversi tra loro che però legano tutti lo
stesso gruppo funzionale.
Il corredo enzimatico volto alla detossificazione è frutto del processo evolutivo e dipende da quali molecole dannose
hanno incontrato i nostri antenati. Se un individuo presentava una variante strana di un certo enzima, e proprio
quell’enzima era l’unico adatto contro una particolare molecola dannosa, solo quell’individuo sarà sopravvissuto e
l’enzima si sarà diffuso tra i membri delle generazioni successive. Spostamenti e variazioni a questo livello genera una
serie di problematiche, io so detossificare solo le molecole che i miei antenati hanno saputo degradare, e poche altre
varianti.
Esempio: la soia. La soia contiene molecole con azione di fitoestrogeni. Un cinese mangia soia senza alcun
danno mentre in un’isola del Giappone, circa un secolo fa, ci sono stati problemi nell’introduzione della soia.
Si è riscontrato un calo nella fertilità maschile, donne che andavano in menopausa oltre i 50 anni quasi 60.
Con il passare del tempo questi effetti non si sono più verificati perché si sono sviluppati enzimi per la
detossificazione.
Esempio 2: il grano. Anch’esso produce estrogeni “ma a noi non ce ne frega niente” perché abbiamo
sviluppato tutto il pattern enzimatico.
Esempio 3: la natura ci ha dato variabilità. Se le industrie producono una nuova molecola tossica, alcuni la
riusciranno a eliminare altri no. È stato condotto un esperimento nel quale veniva dato ad una serie di
individui qualcosa da bere o da mangiare in cui poteva esserci, senza che lo sapessero, una molecola strana.
Eccetto casi di reazioni isteriche, individui che la trovavano ovunque, c’erano altri che la sapevano
riconoscere in maniera accurata. Solo un campione ristretto era in grado di identificare un sapore o un odore
strano, il resto della popolazione ha assunto la molecola con effetti dannosi per l’organismo (ma non letali).
Così è successo per l’evoluzione.
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Spostamento di popolazione dall’Asia in Canada ha comportato una frequenza alta di tumore al colon dovuta alla
diversa alimentazione. Così quando andiamo al supermercato e compriamo cose strane dobbiamo stare attenti perché
non sappiamo come possa reagire il nostro organismo.

ENZIMI DI DETOSSIFICAZIONE = ENZIMI INDUCIBILI


Noi disponiamo di meccanismi in grado di estrarre molecole lipidiche dalla membrana, immaginate il colesterolo,
l’ormone steroideo, testosterone, estradione ecc. Ci sono recettori citoplasmatici che estraggono quel lipide con l’-OH,
cambiano forma e diventano fattori di trascrizione che vanno ad agire a livello nucleare. Attivano o spegnendo geni di
detossificazione in risposta, ad esempio, al testosterone. Questi recettori hanno originato famiglie proteiche non più
in grado di legare l’ormone steroideo ma che possono interagire con molecole liposolubili che con gli -OH sporgono
dalle membrane.
La presenza dello xenobiotico può indurre la sintesi di enzimi che lo sappiano “attivare” (Princi dice così ma per me
voleva intendere detossificare).
Il sistema è modulabile. Alcuni enzimi posso averli ma non esprimerli mai. È la presenza della molecola che stimola la
presenza dell’enzima.
Esempio: se non ho mai bevuto caffè ma ho l’enzima giusto, lo attivo e da quel momento in poi lo esprimerò.
Esempio 2: se ho un farmaco che è stato coniugato ed eliminato, esso diventerà sempre meno efficace.
Meccanismo di assuefazione, so già come comportarmi con un farmaco, posso aumentare le pompe che lo
eliminano e così dovrò usare dosaggi più elevati o altri escamotage.
È accaduto in passato con farmaci antitumorali.
L’aumento di espressione di un isoenzima può comportare grandi variazioni, come la diminuita espressione di un altro,
l’inibizione dell’espressione di un altro isoenzima, l’improvvisa attivazione di un isoenzima non espresso. Il problema
sorge perché se assumo una sostanza tossica e ho l’enzima che riesce a detossificarla, aumenterà l’espressione di
questo ma posso ridurre quello di un altro. Questa considerazione è alla base del danno che potrebbe provocare
l’interferenza tra farmaci oppure, dopo aver assunto un farmaco, posso non essere più in grado di detossificare una
molecola che prima non mi dava alcun problema.

Tra un individuo ed un altro ci possono essere notevoli differenze qualitative e/o quantitative nella capacità di
detossificare, in termini di tipi di molecole, velocità del processo, eventuale tossicità dei prodotti che si formano.
Proprio la differenza tra enzimi di detossicazione deve essere considerata attentamente quando si svolgono gli
esperimenti, poiché un topo non possiede gli stessi enzimi dell’uomo.
Tali differenze non sono solo il risultato di differenze genetiche, dipendono anche dell’eventuale effetto di altre
sostanze con cui si entra in contatto a scopo voluttuario o terapeutico.
A causa dei suoi composti cumarinici e bioflavonoidi inibitori del CYP3A4 a livello intestinale, il succo di pompelmo,
assunto insieme a farmaci substrati del CYP3A4, mantiene alta la loro concentrazione nel plasma con rischio di
tossicità. Il succo di pompelmo manda in tilt l’enzima che non detossifica più.
Il processo di detossificazione non sempre porta alla inattivazione di una molecola, talvolta può alterarne la reattività
o portare alla formazione di composti tossici:
• la codeina può diventare morfina-simile, un analgesico più potente;
• il cortisone può essere trasformato nel più attivo idrocortisone;
• il paracetamolo a basse dosi è ben tollerato perché in parte viene eliminato come tale, oltre la metà è
eliminato coniugato con acido glucuronico, ed il resto come coniugato con solfato e glutatione. Se però la sua
dose supera la disponibilità dei coniuganti, il suo intermedio reattivo formato nella Fase I (N-acetil-parafenil-
chinopirina) resta nella cellula ed agisce come composto tossico, soprattutto se non si somministra cisteina.
Sono i cosiddetti effetti collaterali che differiscono in ognuno di noi

Gli enzimi della fase 1:


• aumentano nei fumatori;
• aumentano o diminuiscono quando si usano farmaci;
• aumentano mangiando carne alla griglia, consumando bevande molto alcooliche, conservanti antiossidanti
come BHT o alcuni oli vegetali;
• sono variamente influenzati da flavonoidi;
• diminuiscono nei vegani;
• sono indotti da cavoli e broccoli (indolo-3-carbinolo), arance/mandarini e semi di cumino o finocchio
(limonene);

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• sono inibiti da pompelmo e uva (naringenina), peperoncino (capsaicina), zafferano (curcumino), chiodi di
garofano (eugenolo), cipolle (quercetina)

FASE 1
Estrazione di molecole liposolubili dalle membrane. Gli enzimi della fase 1,
sfruttando ossigeno, aggiungono -OH nelle zone reattive, la molecola è
parzialmente idrosolubile e come risultato si avrà sia che la proteina inizierà a sporgere dalla membrana sia che si
troverà disattivata. Enzimi coinvolti nella fase 1:
• Ossidasi a funzione mista;
• Carbossil-esterasi;
• Esterasi A;
• Epossido idrolasi;
• Reduttasi:

È necessario quindi che una parte di ossigeno che respiriamo vada REL dove ci sono enzimi eme-dipendenti. che
possiedono il gruppo eme, un gruppo specializzato a legare l’ossigeno.
Le ossidasi a funzione mista (dipendenti dal citocromo P450) sono localizzate nel reticolo endoplasmatico liscio e sono
le più efficienti nel rendere idrosolubili le molecole reattive.

EME P450
Gruppo eme è formato da 4 molecole di pirrolo legati tra loro. Formo un tetrapirrolo, a cui sono legate catene laterali
diverse. È specificato nel legare ossigeno. Al centro c’è un atomo di ferro che può passare dallo stato di ossidazione +2
a +3. Il ferro lega gli atomi di azoto con legami complessi ma è accessibile da parte dell’ossigeno. Il ferro allo stato di
ox +2 lega l’ossigeno che cerca un elettrone. Il ferro passa a stato di ox +3. Se prendiamo il caso dell’emoglobina, essa
lega l’ossigeno e non è più in grado di liberarlo, si trasforma in metaemoglobina. Nel globulo rosso ci sono enzimi
metaemoglobina reduttasi che riportano l’emoglobina da +3 a +2. Il sistema è glutatione dipendente.
Le ossidasi miste sono un complesso proteico in cui il gruppo eme costituisce la parte finale.
La reazione complessiva è complicata. Gli enzimi possono intervenire in diverse reazioni:
• epossidazione
• N-, O-, S-dealchilazione
• dealogenazione ossidativa
• idrossilazione di composti alifatici
• ossidazione dello zolfo
• idrossilazione di composti aromatici
• deamminazione ossidativa
• N-idrossilazione
Il problema dell’utilizzo dell’ossigeno con gruppi eme è dato dal fatto che questo si può prendere un elettrone
generando radicali liberi. Questo può avvenire anche nella membrana.

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Se le molecole tossiche da rendere idrosolubili sono di grandi dimensioni o soprattutto con anelli condensati il
processo può non riuscire, io modifico una parte ma si genera un gruppo reattivo dall’altra.
Il benzopirene ad esempio è tossico di per sé e responsabile della formazione di tumori, ma studi su biopsie su morti
per tumore al polmone hanno rivelato correlazione tra la presenza di alcune forme di detossificazione e il tumore,
alcuni enzimi trasformavano il benzopirene in una forma ancora più reattiva.
Tale meccanismo funziona bene se voglio togliere le molecole dalle membrane, ma non sempre le inattivano. Si
possono generare gruppi ancora più reattivi (vedi sopra esempi)

FASE 2
La molecola reattiva idrosolubile è bersaglio di enzimi coniuganti, che agiscono in fase acquosa. Nel citosol cellulare
disattivano la molecola reattiva legando altre molecole, di diverso tipo, ma sempre fortemente idrosolubile. Questi
composti sono usati come coniuganti:
• solfato
• amminoacidi come glicina, taurina, glutammina, ornitina, arginina
• glutatione
• metilazione
• acido glucuronico
La fase 2 è inibita da carenze nutrizionali, esposizione a tossine che esauriscono le riserve di substrati o cofattori (es.
acetaminofene, alcool e diete ipoproteiche inducono deplezione di glutatione, necessario per detossificare
l’acetaminofene)
La fase 2 è stimolata da cavoli, broccoli, cavolfiori, verza (glucosinolati), aglio, olio di rosmarino, soia, buccia d’arancia
(limonene), estratto di cardo mariano (silimarina), S-adenosil metionina (SAM).

FASE 3
Eliminazione molecole tossiche. Esistono pompe molecolari, chiamate MDR (MultiDrug Resistance) sulla membrana
cellulare che mandano fuori tutte le molecole coniugate, qualunque sia l’identità della molecola legata. Infatti è stato
coniugato solo chi era reattivo.
Ci possono essere una serie di problematiche come molecole che entrano utilizzando altre vie e che eludono il
meccanismo. Le pompe sono inoltre bloccabili, se c’è qualcosa che si blocca all’interno il processo non funzionerà
bene. Meccanismo di assuefazione: se una cosa la si prende molte volte, la cellula impara ad eliminarla ed in
particolare esprimerà quegli enzimi utili alla detossicazione.
Le cellule tumorali che inizialmente sono sensibili ad un certo farmaco, spesso sviluppano resistenza contro di esso e
composti simili, inattivano velocemente il farmaco o ne impediscono l’ingresso.

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STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE

LEZIONE 14

6/12/2017

GOLGI, SECREZIONE E BIOGENESI DEI LISOSOMI

Durante questa lezione vedremo in dettaglio diversi argomenti inerenti alla struttura e alla funzione dell’apparato del
Golgi, della secrezione e della biogenesi dei lisosomi con rispettive funzioni.
1. STRUTTURA E FUNZIONE GOLGI
2. SECREZIONE COSTITUTIVA E REGOLATA
3. BIOGENESI LISOSOMI

STRUTTURA E FUNZIONE DEL GOLGI

L’apparato del Golgi è una struttura cellulare costituita da un complesso di vescicole appiattite (sacculi) separate
fisicamente dal RE (reticolo endoplasmatico). Prima di procedere con la trattazione dei singoli processi che avvengono
in questa struttura, è necessario descriverne in breve la sua struttura e compartimentazione. Strutturalmente e
funzionalmente è suddiviso in 3 zone:
• CIS: Le vescicole neo sintetizzate provenienti dal RER arrivano alla faccia cis del Golgi, dove si fondono con la
sua membrana rilasciando il loro contenuto all’interno del lume. Una volta nel lume, le molecole passano
attraverso la zona mediale dove subiscono modificazioni fino ad arrivare alla faccia trans dove vengono
impacchettate e secrete; la prima porzione di questa zona è detta Cis-Golgi-Network (CGN) che riceve
direttamente le vescicole provenienti dal RER.
• MEDIALE: Zona di transizione tra la CIS e la TRANS costituita da diversi compartimenti; in questa porzione, il
contenuto delle vescicole arrivate alla faccia cis viene rielaborato tramite l’intervento di numerosi enzimi
diversi per ogni compartimento;
• TRANS: La faccia trans guarda verso la membrana plasmatica della cellula; da qui infatti, gemmano vescicole
che potranno fondersi alle altre membrane cellulari, oppure riversare il loro contenuto al di fuori della cellula
(Secrezione). Più precisamente, il TGN (trans-Golgi-network) provvede allo smistamento delle vescicole
uscenti.

Queste 3 zone, oltre ad avere strutture e funzioni diverse, hanno anche composizioni chimiche diverse. La differenza
cis-mediale-trans è semplicemente su base funzionale: le vescicole cis hanno contenuto enzimatico diverso di quelle
mediale e trans. Al microscopio elettronico, i sacculi del Golgi risultano molto vicini ma staccati gli uni dagli altri; in
realtà essi sono a diretto contatto tramite proteine che li mantengono in connessione ma staccati fisicamente.

1
Esperimento: Per verificare che i sacculi sono in diretto contatto tra di loro ma fisicamente separati da proteine, si usa
una sostanza, la Brefeldina, in grado di disorganizzare le strutture del Golgi. Somministrando a cellule in coltura un
amminoacido radioattivo, in assenza di brefeldina, in pochi minuti il collagene sintetizzato dal RER diffonde piano
piano nei compartimenti del Golgi; in presenza di brefeldina invece, il collagene resta bloccato in una struttura fusa e
disorganizzata.
 E’ la prova che i compartimenti sono connessi tra loro.

Il Golgi si occupa quindi di:


• Ricezione e smistamento delle vescicole
• Modificazione delle proteine (N-glicosilazione ed O-glicosilazione) all’interno dei suoi compartimenti.
Vediamo questi processi più nel dettaglio.

RICEZIONE E SMISTAMENTO VESCICOLE

Il dialogo tra il RE e il Golgi e tra il Golgi e le destinazioni finali delle vescicole (lisosomi, membrane), avviene attraverso
specifiche proteine guida:

• COP II (RER  Golgi): Queste proteine si occupano del trasporto specifico da RER  Golgi, quindi gemmano
esclusivamente dal RER. Hanno struttura quaternaria con 4 braccia, tanto grande da essere visibile al
microscopio elettronico. Per formare la vescicola, esse individuano le proteine presenti sulla membrana del
RER e, direttamente o con l’ausilio di altre proteine, vi si legano; ogni COPII poi, polimerizza con le altre
adiacenti grazie ai movimenti fluidi della membrana, andando a formare una struttura ad eterotetramero
(dovuta al fatto che ogni COPII ha 4 braccia appunto). Una volta essersi formata questa struttura, la
membrana si deforma andando a costituire una vescicola di forma sferica che si andrà a staccare; nel
momento in cui la vescicola si stacca, le proteine cominciano a depolimerizzarsi lasciandola priva di
rivestimento. Il destino della vescicola dipende dai segnali di riconoscimento presenti sulla sua superficie e da
quelli sulla membrana del bersaglio (processi di riconoscimento con proteine T e V-SNARE, recettori specifici
e proteine RAB associate). E’ importante sapere che il contenuto delle vescicole è randomizzato, ossia non è
selezionato. C’è inoltre una differenza tra cellule vegetali e animali: nelle prime, le vescicole che si staccano
dal RER arrivano direttamente alla faccia cis dove si fondono con la membrana; nelle cellule animali invece,
sembrerebbe che ci sia un compartimento intermedio (ERGIC) che non fa parte propriamente del Golgi,a cui
arrivano le vescicole provenienti dal RER, e successivamente vengono secrete verso il Golgi con rivestimenti
di COPI.

• COPI (Golgi  RER): Queste proteine rivestono quelle vescicole che dal Golgi sono dirette verso il RER o
verso il Golgi stesso, come abbiamo appena visto nel caso del compartimento ERGIC. Pur avendo una
struttura a 3 braccia simile a quella della clatrina, le due proteine hanno funzioni diverse. La COPI è coinvolta
principalmente nei processi di trasporto retrogrado, ossia quel tipo di trasporto Golgi  RER che consente un
riutilizzo di quegli enzimi sfruttati dal Golgi che non sono stati scartati; più in dettaglio, questo trasporto è
regolato da recettori legati ad una specifica sequenza amminoacidica detta K/HDEL che si trova in tutte le
proteine destinate a restare nel RE. La vescicola che si stacca non è libera di muoversi, ma è veicolata da
motori molecolari, che utilizzando dei microtubuli come fossero una strada, riportano la vescicola a fondersi
con il RER.

• CLATRINA: Proteina coinvolta nei processi di endocitosi specifica, in quanto si ha il trasporto di


determinate molecole di varia natura dall'esterno all'interno della cellula attraverso il riconoscimento di
appositi recettori di membrana. Come nelle COPII, la clatrina forma strutture geometriche specifiche
(icosaedriche in questo caso) che inglobano il materiale da endocitare; una volta formata la vescicola, la
clatrina si distacca e torna sulla membrana per ripetere lo stesso procedimento con una nuova molecola.

2
Tutto quello che passa dal Golgi è destinato all’esportazione oppure a una funzione specifica che è quella di riempire
delle vescicole vuote o strutture multi-vescicolari. Il contenuto di queste vescicole è variabile: si possono inserire
recettori che devono tornare sulla membrana plasmatica, enzimi lisosomali che andranno (insieme alla vescicola) a
costituire un lisosoma vero e proprio, oppure ancora altri tipi di enzimi che andranno a costituire endovescicole dette
endosomi. La secrezione comprende anche quei processi di riassemblamento della membrana attraverso vescicole
contenenti pompe, canali, pezzi di membrana ecc…

MODIFICAZIONE DELLE PROTEINE

Cosa ci fanno le proteine nel Golgi? Ricapitolando: esse sono state appena sintetizzate dal RER, con il giusto
ripiegamento e senza gruppi idrofobici esposti, sono quindi funzionali e pronte a svolgere la loro azione. A questo
punto si sono invescicolate e sono arrivate nella faccia cis del Golgi senza ulteriori controlli. Se la vescicola non
entrasse in contatto con la faccia cis sarebbe libera di diffondere nella cellula all’infinito senza potersi fondere con
nient’altro, fino a che un lisosoma non la degraderebbe; questo significa che il processo di riconoscimento e fusione
tra vescicola e faccia cis del Golgi è altamente specifico: è un meccanismo attivato e guidato dalle GTPasi della famiglia
Rab.

Una volta che la proteina raggiunge la zona cis:


• Se è solubile  sarà in grado di muoversi libera nel lume
• Se è una proteina di membrana  si ancorerà alla membrana plasmatica

Nella zona cis c’è un unico tipo di enzima che ha la funzione di fosforilare il mannosio della catena di 14 zuccheri delle
proteine, solo per quelle che sono destinate ai lisosomi. Tutte le proteine però, arrivano con la stessa catena di 14
zuccheri  l’enzima riconosce unicamente quelle che dovranno andare ai lisosomi. Come riesce a discriminarle?
Riesce a riconoscere una struttura tridimensionale precisa. C’è la certezza che sia un unico enzima perché esiste una
malattia detta a cellule i, dovuta al fatto che il nucleo delle cellule ha una forma schiacciata a forma di i (tipo un
bastoncello). Le cellule si riempiono di vacuoli vuoti (insieme di vescicole vuote) che spingono e schiacciano il nucleo

3
verso un’estremità della cellula. Questa malattia è caratterizzata dal fatto che i lisosomi sono vuoti gli enzimi sono
prodotti ma si trovano all’esterno e non raggiungeranno mai il lisosoma. E’ la conseguenza della mutazione di un
singolo gene che blocca la diffusione degli enzimi all’interno dei lisosomi. Gli enzimi lisosomali che rimangono
all’esterno sono inattivi perché non sono stati fosforilati sul mannosio e hanno quindi una composizione anomala che
li disattiva.In sintesi, sono arrivati al Golgi ma non hanno subito la modificazione che consentiva loro di raggiungere i
lisosomi.

Gli enzimi che sono stati modificati correttamente invece, vengono invescicolati da COPI e spediti verso i
compartimenti mediale e trans del Golgi; coloro che hanno legato il mannosio-6-fosfato (M6P) attraverseranno più o
meno indenni queste zone senza essere modificati, e raggiungeranno la parte finale della zona trans in cui sono
presenti recettori per il M6P (ricordiamo che il M6P è presente solo nelle proteine destinate ai lisosomi) 
riconoscimento proteina-recettore il recettore cambia geometria e si lega all’adaptina su cui si legano le clatrine
vengono quindi gemmate vescicole rivestite di clatrina contenenti dei recettori su cui sono legate le proteine con M6P
destinate ai lisosomi.

Tutte le altre proteine subiscono, a differenza degli enzimi lisosomali, ulteriori glicosilazioni nelle zone mediale e
trans:
➢ N-Glicosilazione: Modifica la sequenza dei 14 zuccheri legati dal RER;
➢ O-Glicosilazione: Ulteriore glicosilazione sul gruppo –OH di serine, treonine o tirosine, che aggiunge alla
catena uno zucchero alla volta (ex novo); è una glicosilazione unica del Golgi.
Il processo di glicosilazione avviene quindi sia nel RER che nel Golgi (nella zona mediale), ma a differenza del RER in
cui le proteine vengono glicosilate attraverso trasferimento di 14 zuccheri da dolicolo al gruppo amminico
dell’amminoacido asparagina, la glicosilazione nel Golgi avviene con l’aggiunta di singoli zuccheri sul gruppo -OH delle
serine, treonine e tirosine.
Ogni compartimento del Golgi, consta di un’attività enzimatica diversa  ci sono enzimi marker che caratterizzano i
singoli compartimenti svolgendo ognuno una funzione specifica e diversa dagli altri. Ci sono comunque enzimi che
sono condivisi e sono presenti in tutti i compartimenti.
Le proteine che subiscono tutti i processi di glicosilazione, spesso hanno più componente glucidica rispetto a quella
proteica, e sono per queste mandate nella matrice extracellulare: giaciglio esterno alla cellula ricco di proteine
glicosilate e rigide che rendono l’acqua simile ad un gel; la cellula sfrutta la matrice come sistema d’ancoraggio e di
supporto.

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Ricapitolando:

➢ Nella zona cis vengono accolte le vescicole provenienti


dal RER e ne gemmano di nuove per il trasporto
retrogrado o per i compartimenti mediale e trans; qui
vengono inoltre fosforilate UNICAMENTE le proteine
destinate ai lisosomi.
➢ Nelle zone mediale e trans avvengono invece ulteriori
glicosilazioni quali la N-glicosilazione che modifica la
catena dei 14 zuccheri aggiunta nel RER e la O-
glicosilazione che consta dell’aggiunta di uno zucchero
alla volta alla catena dei 14 zuccheri.
➢ Raggiunta la parte finale della zona trans, nel TGN viene
completato lo smistamento delle glicoproteine per la
secrezione regolata o costitutiva, per la formazione della
membrana o per la sintesi di nuovi lisosomi (VEDI
CAPITOLI SUCCESSIVI).

La glicosilazione delle proteine è quindi una modificazione post-traduzionale onnipresente in tutti i viventi.
Le complesse strutture degli zuccheri svolgono ruoli biologici e fisiologici cruciali:
➢ Contribuiscono al ripiegamento delle proteine ed al controllo della qualità
➢ Riconoscimento biologico
➢ Conferiscono un ulteriore livello di contenuto informativo alle strutture polipeptidiche sottostanti.
➢ Potere antigenico
➢ Garantisce idratazione dell’esterno della cellula
Le strutture di oligosaccaridi sulla superficie cellulare influenzano le interazioni delle cellule con l'ambiente
extracellulare, fornendo ligandi per l'adesione cellulare, per le interazioni con varie macromolecole e per l’invasione
dei patogeni.

Quindi abbiamo visto che il Golgi è una struttura che rifinisce e completa quelle modificazioni alle proteine che erano
cominciate nel RER, per poi impacchettarle e spedirle in diversi distretti specifici. Il destino finale della proteina è o la
secrezione o la biogenesi dei lisosomi.

SECREZIONE

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SECREZIONE

COSTITUTIVA REGOLATA

Comune a tutte le cellule Interessa particolari distretti cellulari in


cui vengono spedite solo un certo tipo di
Processo lento ma continuo proteine in risposta ad un preciso stimolo

 Riversa all’esterno proteine che


costituiranno matrice extracellulare
oppure riforniranno la membrana
La secrezione costitutiva genera vescicole dirette verso la membrana plasmatica, che contengono nuove
proteine altamente glicosilate che andranno a costituire la matrice extracellulare. E’ un processo non selettivo nella
vescicola si possono ritrovare elementi che normalmente non dovrebbero esserci (come ad esempio enzimi
lisosomali).

La secrezione regolata invece è un processo specializzato molto più preciso e selettivo che consiste
nell’impacchettamento di specifiche proteine in vescicole che sono dirette al bersaglio solo se guidate da un preciso
stimolo.

Una nota importante va data all’orientamento delle glicosilazioni: le proteine della membrana cellulare possiedono il
dominio glicosilato verso l’esterno della cellula  questo perché la glicosilazione nel RE e nel Golgi è avvenuta nel
lume dell’organello (quindi nella porzione interna) e così è proseguita fino all’impacchettamento in vescicole; durante
la fusione con la membrana, il dominio glicosidico si viene trovare automaticamente all’esterno della cellula.

Durante la fusione con la


membrana, la porzione
La vescicola contiene al suo
glicosilata si viene a trovare nella
interno la porzione glicosilata
porzione esterna della cellula
(derivante dal RER e Golgi)

N.B: Se la vescicola si fondesse invece con un lisosoma, la glicosilazione sarebbe rivolta verso l’interno della struttura.

BIOGENESI DEI LISOSOMI

I lisosomi sono strutture subcellulari che svolgono una funzione digestiva e una funzione come centro di riciclaggio di
materiali che provengono sia dall’esterno che dall’interno della cellula; si formano a partire da un concorso tra RER e
Golgi. Gli enzimi lisosomali sono strutture digestive dette idrolasi acide in grado di scindere acqua e aggiungere H+ o
OH- a un legame chimico per distruggerlo. La maggior parte dei legami della cellula si formano per condensazione di
una molecola d’acqua  le idrolasi agiscono nel modo opposto per distruggerli. Questi enzimi derivano dalla
glicosilazione nel RER e fosforilazione del mannosio nel Golgi; raggiunta la zona trans del Golgi, vescicole circondate di
clatrina e contenenti recettori legati al M6P enzimatico, si staccano e vanno a fondersi con un endolisosoma
(=compartimento intermedio). Da questo endolisosoma le possibilità sono due:

1. Gemmano vescicole contenenti enzimi lisosomali legati ai recettori per il M6P, dirette verso dei lisosomi già
sintetizzati;
2. Lo stesso endolisosoma verrà riempito e diventerà lisosoma.

In ogni caso, una volta che l’enzima legato al recettore si fonde con l’endolisosoma, lo stesso enzima si staccherà dal
recettore. Come mai allora si lega e poi si stacca nel momento della fusione? Per via del pH. Nell’ambiente cellulare, il

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pH neutro-basico favorisce il legame tra il M6P dell’enzima e il recettore; quando avviene la fusione con
l’endolisosoma dove il pH tende ad essere acido (pH~5), le cariche superficiali della proteina si modificano facendone
variare la conformazione e il recettore cambia geometria si stacca e torna indietro al TGN (Trans-Golgi-Network).
Una volta entrato l’enzima con M6P, un altro enzima marker detto fosfatasi acida rimuove il fosfato dal mannosio
esclusivamente quando il pH è acido (defosforilazione a pH acidi). Una volta staccato il fosfato, l’enzima diventa
un’idrolasi.
L’ambiente poi non rimane sempre acido, in quanto il pH è il fattore che regola di fatto l’attivazione o meno delle
idrolasi. Come riesce ad acidificare il proprio ambiente interno? Sono presenti pompe di protoni ATP-dipendenti che
permettono di acidificare o alcalinizzare l’ambiente a seconda del bisogno.

Il lisosoma non è una struttura isolata dal resto dalla cellula ma fa parte di un sistema che collabora collettivamente
per la sopravvivenza e per mantenere un equilibrio interno. Svolge una funzione digestiva di riciclaggio  smantella
biomolecole (digestione) nelle loro componenti più semplici che vengono poi fatte uscire dal lisosoma per poter
essere riutilizzate (riciclaggio)
Nel lisosoma ci sono centinaia di enzimi dette idrolasi acide: enzimi in grado di compiere idrolisi. Hanno tutti la stessa
funzione ma hanno diversi substrati d’azione; agiscono unicamente a pH acidi (<7).  delle pompe protoniche
(strettamente imparentate con ATPsintetasi) che acidificano l’ambiente interno.

Ci sono diversi tipi di idrolasi all’interno del lisosoma:


▪ Nucleasi
▪ Proteasi
▪ Glicosilasi
▪ Lipasi
▪ Solfatasi
▪ Fosfolipasi
▪ Fosfatasi

Come abbiamo visto in precedenza, le porzioni glicosilate delle proteine nel lisosoma, sono rivolte verso l’interno;
questa endoglicosilazione è molto funzionale al lisosoma in quanto gli permette di riparare la membrana plasmatica
della cellula in casi di emergenza  se c’è un danno alla membrana, il lisosoma ci si può fondere e tamponare la
rottura (funziona proprio come una vescicola che si fonde sulla membrana per riversare all’esterno il suo contenuto).
Nel lisosoma ci sono anche numerose proteine che svolgono tantissime funzioni: la proteina più presente è la LAMP1,
una proteina strutturale situata nella membrana del lisosoma. Ce ne sono anche altre con funzione di sensore, di
canale ionico, di trasporto ecc…

I lisosomi quindi intervengono per:


➢ Riparare la membrana plasmatica
➢ Secrezione
➢ Signalling
➢ Autofagia (quando la cellula non ha energia, digerisce parti di se stessa)
➢ Metabolismo energetico
➢ Nel sistema immunitario

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➢ Digestione

La digestione attuata dal lisosoma:

DIGESTIONE

EXTRACELLULARE INTRACELLULARE

➢ Fecondazione ➢ Materiale endogeno


➢ Impianto ➢ Materiale esogeno
➢ Invasione

La digestione extracellulare avviene quando il lisosoma riversa il suo contenuto all’esterno e può essere attuata solo
da lisosomi altamente specializzati; ad esempio nell’acrosoma (apice della testa dello spermatozoo) ci sono lisosomi
che riversano il loro contenuto sulla cellula uovo per farsi spazio. Anche nell’impianto embrionale nell’utero avviene
questo meccanismo. Durante invasioni cellulari da parte ad esempio di cellule neoplastiche, attiva la funzione liso
somale che provvede all’uccisione degli aggressori.
Cosa può digerire un lisosoma?
Ad esempio i batteri; essi vengono inglobati da un fagosoma che successivamente viene guidato (attraverso i soliti
meccanismi di riconoscimento proteico) fino al lisosoma dove il batterio viene ucciso e digerito. Ovviamente se i
lisosomi non funzionano il sistema immunitario non sarebbe più efficiente: il batterio sarebbe fagocitato ma non
digerito. Se non esistessero gli antibiotici, questo sarebbe un problema grandissimo per quanto riguarda le difese
dell’organismo.
Il lisosoma entra in gioco anche nei processi di turn-over delle strutture cellulari che non possono più essere utilizzate,
quindi nei meccanismi di autofagocitosi; immaginiamo ad esempio un mitocondrio che non funziona più: esso viene
chiuso all’interno di membrane che vengono poi fatte fondere col lisosoma; qui si attivano le pompe protoniche che
acidificano l’ambiente lisosomale attivazione idrolasi.
I micobatteri sono in grado di evadere il sistema di fagocitosi grazie alla liberazione di molecole specifiche che
impediscono la fusione con il lisosoma (vengono fagocitati ma non digeriti); in questo modo il micobatterio continua a
produrre sostanze tossiche che poi generano malattie come la tubercolosi o la lebbra.

Ovviamente se i lisosomi vengono danneggiati, le funzioni cellulari vengono alterate:


il cortisone stabilizza le membrane lisosomali, per cui in caso di infiammazione dovuta all’azione lisosomale, questo
farmaco ne abbassa di molto il contributo (evita che il contenuto lisosomale si riversi all’esterno); quei composti che
invece rendono più fragile la membrana dei lisosomi sono detti teratogeni  posso avere un effetto soprattutto nello
sviluppo embrionale, danneggiandolo con tutta una serie di conseguenze.

RICORDA: Il lisosoma riceve e manda messaggi al nucleo  si forma un network che fa percepire al lisosoma lo stato
metabolico cellulare.

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STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE
LEZIONE 15
13/12/2017

Alla fine dell’800 era stata notata una molecola estremamente lunga con una struttura tendenzialmente filamentosa:
quella che poi si sarebbe scoperto essere la molecola del DNA.
Il DNA è formato da quattro nucleotidi (A, G, T, C) che secondo le prime ipotesi si ripetevano casualmente all’interno
della molecola.
Inizialmente la funzione di questa grande molecola sembrava essere quella di una sorta di “appendiabiti”, ossia un
elemento del nucleoscheletro che permetteva al nucleo di mantenere un’organizzazione tale da legare le proteine,
importantissime visto che secondo un’ipotesi degli anni ‘30 dovevano essere i costituenti principali dei geni.

Nel tempo, grazie anche a studi su batteri, la molecola del DNA è stata studiata, ne è stata descritta la struttura
tridimensionale e ci si è accorti che il vettore dei caratteri ereditari è il DNA stesso e non le proteine come si pensava.
È risultato addirittura evidente che la funzione principale del DNA è proprio quella di portare l’informazione genica.

Secondo il modello di Watson e Crick (del 1953) il DNA è un acido nucleico formato da quattro basi azotate.
La molecola, con struttura tridimensionale a doppia elica, è costituita da due catene polinucleotidiche antiparallele (si
dicono antiparallele perché l’estremità 31 di un filamento fronteggia l’estremità 51 del complementare) avvolte ad
elica intorno ad un asse centrale ed unite tra di loro grazie ai legami ad idrogeno tra le basi che si fronteggiano nella
doppia elica.
Ognuno dei due filamenti è formato da uno scheletro di molecole di zucchero e gruppi fosfato alternati: il gruppo
ossidrilico del C in 31 di un’unità di zucchero è legato al gruppo fosfato del C in 51 successivo attraverso un legame
fosfodiesterico.
Ad ogni molecola di zucchero è legata una base azotata che sporge lateralmente dal filamento costituito da zuccheri e
fosfati.
Le basi azotate non si appaiano in modo casuale ma i legami si formano tra coppie complementari (una purina e una
pirimidina) :
- ADENINA –TIMINA tenute insieme da 2 legami ad idrogeno
- GUANINA – CITOSINA  tenute insieme da 3 legami ad idrogeno

Quando si è scoperto che il DNA è la molecola dell’ereditarietà è sorta una nuova problematica

“come avverrà la duplicazione di questa molecola?”

1
Il processo di duplicazione del DNA ha luogo prima che una cellula si divida ed è chiamato REPLICAZIONE DEL DNA , è
un processo molto dispendioso in termini di impegno energetico e metabolico.
La modalità di duplicazione del DNA è SEMICONSERVATIVA perché ciascun filamento può funzionare da stampo per la
sintesi di un nuovo filamento ad esso complementare:

ognuna delle due macromolecole figlie di DNA è costituita da un filamento del DNA parentale (conservativo) ed un
filamento sintetizzato ex novo.
La velocità di crescita dei filamenti duplicati è più o meno contemporanea sui due filamenti, uno è leggermente in
ritardo rispetto all’altro perché cresce sotto forma di frammenti che vengono poi saldati insieme.

Gli enzimi coinvolti nel processo sono le DNA polimerasi.


Le DNA polimerasi hanno un’unica direzione di sintesi: leggono il filamento in direzione 3I 5I e sintetizzano quindi
gli acidi nucleici in direzione 5I3I .

Questi enzimi sono molti e diversi tra di loro.


Le DNA polimerasi degli EUCARIOTI sono:
1. 𝛼 (𝑎𝑙𝑓𝑎), 𝛽 (𝑏𝑒𝑡𝑎), 𝜀 (𝑒𝑝𝑠𝑖𝑙𝑜𝑛)  Funzionano nella riparazione e nella sintesi del DNA dopo la rimozione
dei primer.
2. 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑠𝑠𝑜 𝛼/𝛿 (𝑎𝑙𝑓𝑎/𝑑𝑒𝑙𝑡𝑎)  Interviene nel processo di replicazione.
È un complesso macromolecolare formato dalla DNA polimerasi alfa (che è un enzima di riparazione del DNA,
molto piccolo) e dalla DNA polimerasi delta (che essendo molto più grande dell’alfa la includerà e legherà in
una certa regione).
È un complesso separabile infatti la DNA polimerasi alfa è in grado di funzionare anche in maniera autonoma,
staccata dal complesso alfa/delta.
3. 𝛾 (𝑔𝑎𝑚𝑚𝑎)  È deputato alla replicazione del DNA mitocondriale, si trova solo nei mitocondri (viene
portato dopo essere sintetizzato nel citosol).
È un enzima di natura batterica (la sua evoluzione si è fermata nel momento in cui è iniziata la convivenza dei
batteri e degli eucarioti) simile agli enzimi di riparazione perché come loro ha un solo sito attivo.
Funziona prevalentemente con i desossiribonucleotidi (lega la timina e in alcuni casi l’uracile) ma è in grado,
se non ce ne sono o se ne è presente una minoranza, di legare anche i ribonucleotidi (per questo motivo
risulta essere un enzima arcaico).
Probabilmente questo enzima è in grado di legare i ribonucleotidi e l’uracile perché nel DNA mitocondriale
sono presenti delle tracce di ribosio e di uracile.
L’uracile nella cellula eucariotica è presente solo nei mitocondri, all’esterno non si trova mai se non in seguito
a danni al DNA nucleare.

*normalmente negli eucarioti questi enzimi sono indicati con lettere dell’alfabeta greco

2
Le DNA polimerasi degli EUBATTERI ( batteri+ procarioti ) sono:
1. I e II  Intervengono nella riparazione e nella sintesi dopo la rimozione dei primer.
Sono abilitati a sintetizzare piccoli tratti di DNA: di solito decine o centinaia di nucleotidi ma possono arrivare
in qualche caso al migliaio.
Hanno un solo sito attivo e lavorano su un singolo filamento di DNA.
Sono piccoli e lenti.
2. Complesso III  Interviene nel processo di replicazione. È strutturalmente il risultato della somma di due
diversi tipi di DNA-polimerasi e NON si può separare, infatti se scisso non funziona più.
Il complesso comprende due DNA polimerasi indipendenti che lavorano ognuna su uno dei due filamenti.
Ogni DNA polimerasi ha due siti attivi: un complesso III e due enzimi.
È molto più grande e veloce del I e del II; mediamente sintetizza alcuni milioni di nucleotidi.

I complessi enzimatici (alfa/delta e III) che intervengono nel processo di replicazione sono grossi e apparentemente
diversi tra di loro ma in grado di catalizzare la stessa reazione; svolgono la stessa funzione quindi dal punto di vista
strutturale sono molto simili tra loro.

L’ingresso in fase S della cellula, quindi l’inizio della duplicazione del DNA, implica:
• Nel caso dei procarioti la sintesi della polimerasi III;
• Nel caso deli eucarioti l’attivazione dei geni che controllano la sintesi della DNA polimerasi delta.
Dopo che è stata sintetizzata ed assemblata nel citosol entra nel nucleo dove incontra la DNA polimerasi alfa
(enzima di riparazione); a questo punto i due si assemblano grazie all’intervento di altre proteine;

La polimerasi alfa/delta e la polimerasi terza sono tenute insieme da complessi di proteine (sono chiamati in causa vari
geni).
L’organizzazione di questa struttura macromolecolare o supermolecolare che tiene uniti i complessi non è facilmente
comprensibile; è troppo grande per essere studiata e quindi non se ne sa moltissimo.
Nel complesso di replicazione c’è tutta una regione che comprende attività ATPasiche, che ancora i catalizzatori ed è
in grado di legarsi al DNA.
La struttura in questione si ancora idrolizzando ATP: è una sorta di robot che si lega al DNA organizzandolo. C’è una
grande proteina (che può esistere in forma aperta o chiusa) di saldatura che chiude i due filamenti.
Entrando nella cellula in qualsiasi altro momento del ciclo cellulare non troveremo i complessi enzimatici delle DNA
polimerasi perché sono sintetizzati solo nel momento in cui la cellula comincia la sua duplicazione.
Una volta sintetizzati sono pronti per legarsi con il DNA e cominciare la replicazione.

All’inizio della duplicazione il DNA è organizzato (soprattutto per quanto riguarda gli eucarioti anche se il discorso vale
anche per i procarioti) in una struttura a doppia elica chiusa grazie ai legami ad idrogeno tra le basi complementari.

Il processo di replicazione inizia con l’apertura della doppia elica (=scollamento delle basi appaiate grazie alla rottura
dei legami ad H) in modo tale da avere due filamenti che facciano da stampo agli enzimi DNA polimerasi deputati alla
sintetizzazione di due nuovi filamenti figli.
La struttura della doppia elica non si apre spontaneamente.
Si potrebbe aprire spontaneamente solo aumentando la temperatura: per rompere i legami delle coppie C-G (le più
difficili da aprire perché tenute insieme da tre legami ad H) sono necessarie temperature che superino i 90°
(temperature alle quali gli enzimi non sono in grado di svolgere le proprie funzioni).

NEL CASO DEI BATTERI l’apertura della doppia elica è affidata a proteine che riconoscono l’origine di replicazione.
Nel DNA circolare dei batteri normalmente c’è UNA SOLA ORIGINE DI REPLICAZIONE e quindi un solo replicone (o
unità di replicazione) ossia un tratto di DNA compreso tra l’origine di replicazione e le terminazioni della replicazione
(punti in cui le forche di replicazione adiacenti si fondono).
In qualche caso si può trovare un’origine di replicazione: ciò è dovuto al fatto che i plasmidi ( anelli di DNA al di fuori
del cromosoma) possono avere una duplicazione autonoma e contemporanea a quella del genoma batterico.
Se il plasmide è integrato nel genoma batterico allora il genoma batterico ha due origini di replicazione.

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L’origine di replicazione è caratteristica in termini di sequenza: se rappresentassimo le sequenze di origine di
replicazione di alcuni batteri sembrerebbero molto diverse le une dalle altre, in realtà sono piccole sequenze che si
ripetono.
Queste sequenze rientrano nell’ambito del 2% circa di DNA non codificante dei batteri.
L’origine di replicazione è dimensionalmente limitata e composta da sei nucleotidi ripetuti (composta da alcune
centinaia di nucleotidi) perché deve essere riconosciuta da proteine e mediamente una proteina di normali dimensioni
riconosce sequenze di circa 6 nucleotidi.

I vari tipi di proteine che si legano nella regione dell’origine di replicazione formano dei complessi che andranno a
ripiegare la molecola del DNA per formare una sorta di ansa che costringe la struttura a doppia elica a ripiegarsi.
La struttura ad ansa opera tensione nella molecola che a sua volta comporta la rottura dei legami ad H delle coppie A-
T (tenute insieme da due legami ad H)  a valle dell’origine di replicazione ci sono sequenze ripetute che contengono
soltanto adenina e timina, per questo motivo è a valle del ripiegamento del DNA che c’è tendenza a scollarsi.
Dopo che i due filamenti si scollano si forma la bolla di replicazione.
Si formano dei tratti di DNA a singola elica sui quali si legano delle proteine che svolgono un’attività elicasica.
Queste proteine sono delle ATPasi, in grado di legarsi al DNA a singola elica, che idrolizzano ATP e usano l’energia
liberata dall’idrolisi come energia conformazionale.
Sono proteine grandi che avanzando nella singola elica ne aumentano le dimensioni perché scollano altri tratti a
doppia elica.
Man mano che aumentano le dimensioni del tratto a singola elica si assembla il complesso di replicazione, che nel caso
dei batteri è la DNA polimerasi III.

Le due eliche vengono scollate in un solo punto, nella bolla entrano due DNA polimerasi III che duplicano in una
direzione e nell’altra rispetto all’origine di replicazione.
I due complessi che duplicano nelle due direzioni entrano una alla volta nella bolla di replicazione: il primo complesso
si lega e avanza in una direzione formando una forcella di replicazione e un tratto a singolo filamento abbastanza
grande da permettere l’ingresso del secondo complesso che avanza in direzione opposta al primo.
Il sistema viaggia velocemente: un complesso duplica metà del genoma batterico mentre l’altro duplica l’altra metà.

La sintesi avanza nelle due direzioni diversamente perché da una parte è continua mentre dall’altra è discontinua:
entrambi i filamenti sono sintetizzati in direzione 5I 3I e questo comporta che un filamento sia sintetizzato in modo
continuo (prende il nome di filamento precoce o leading strand) e l’altor in modo discontinuo (filamento ritardato o
lagging strand).

La terminazione della duplicazione si ha quando i due complessi vanno a collidere; a questo punto si staccano dal DNA
batterico.

Nei batteri tutto il processo è accelerato: inizia la duplicazione ma c’è ancora la trascrizione in corso.
Per questo c’è un problema di potenziale conflitto tra duplicazione e trascrizione e può avvenire la collisione tra
molecole che può generare danni al DNA: questo tipo di evento rientra nell’ambito di eventi e mutazioni che i batteri
vanno a cercare.

NEGLI EUCARIOTI la situazione è molto più complicata perché:


- c’è una quantità molto maggiore di DNA (intorno alle 1000 volte di più rispetto ai batteri).

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Alcuni tipi di cromosomi sono gruppi di 250/280 mila nucleotidi quindi complessivamente il genoma
eucariotico è enorme
- il DNA è lineare e rende molto più complesso il processo di replicazione (nei batteri era circolare e bastava
una sola origine di replicaizone)

Per il fatto che il DNA negli eucarioti è lineare CI SONO PIÙ ORIGINI DI REPLICAZIONE (ci sono una serie di evidenze
che dimostrano che ci sono origini multiple di replicazione che non sono facilmente distinguibili e comprensibili come
nel caso dei batteri).
La replicazione può quindi iniziare in vari punti e, mentre nei batteri ci sono dei requisiti specifici delle origini di
replicazione, negli eucarioti sembrano non esserci.
Per il fatto che negli eucarioti l’origine di replicazione può essere in qualsiasi punto se, mediante ingegneria genetica,
vengono indotte delle mutazioni/cambiamenti, in maniera tale che un certo tratto non possa essere utilizzato come
sito di origine, non si blocca la replicazione ma semplicemente un’altra origine di replicazione si attiverà.

Il sistema di replicazione degli eucarioti è robusto e a prova di errore.

Non solo un’origine può prendere il posto di un’altra ma, la sequenza del tempo della duplicazione è varia: ci sono
cioè vari tipi di origini che si attivano in tempi diversi  possiamo avere origini precoci e altre tardive.
Il fatto che ci siano più punti di origine e sequenze del tempo diverse ha un senso negli eucarioti la cromatina nucleare
è organizzata in eterocromatina ed eucromatina.
L’eterocromatina necessita di essere resa accessibile mentre l’eucromatina è direttamente accessibile (sono protne
per la duplicazione in tempi diversi).

Nel momento in cui le varie origini di replicazione si formano e si incontrano tra loro la replicazione si blocca e avviene
la saldatura, le origini vengono inglobate le une nelle altre.

Per il fatto che le diverse origini si inglobano le une nelle altre il processo da l’idea di essere complessivamente
continuo anche se ci sono state varie origini.

In ogni bolla di replicazione si lega un complesso alfa/delta che duplica complessivamente dei tratti di DNA che sono
dell’ordine di qualche centinaio di migliaia di nucleotidi (nel caso dei batteri invece il complesso terzo duplica alcuni
milioni di nucleotidi).

Il processo inizia con l’apertura della doppia elica ma non ad pera della DNA polimerasi alfa/delta.
Il complesso della DNA polimerasi non è infatti in grado di rompere i legami tra le basi per aprire la doppia elica.

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Questo in passato non si sapeva e c’era una sorta di mistero dietro al fatto che durante la duplicazione fatta avvenire in
vitro, isolando il complesso della DNA polimerasi che si assemblava al DNA da duplicare, ciò che si otteneva erano dei
tratti di DNA ramificati.
Una volta appreso che la DNA polimerasi non era in grado di aprire la doppia elica, avevano provato in vitro a mettere il
DNA ad alte temperature (90º).
Ad alte temperature avveniva la separazione delle due eliche e la demolizione della maggioranza dei nucleosomi.
In questo modo quindi si apriva il DNA e si poteva mettere l’enzima per duplicare.
Prima di posizionare l’enzima bisognava però far raffreddare un po’ il DNA perché ad alte temperature sarebbe stato
denaturato.
Il DNA raffreddandosi si ripiega (si riformano legami ad H tra le basi complementari) e quindi mettendo l’enzima,
incapace di aprire la doppia elica, si ottengono DNA ramificati/ figure strane di duplicazione.

L’enzima che in grado di aprire la doppia elica andando a rompere i legami ad H tra le basi azotate è l’ENZIMA ELICASI.
L’enizma elicasi è un complesso con un ingombro enorme che riesce:
• a rompere i legami nei punti di origine della replicazione e, una volta aperti i filamenti, è in grado di muoversi
lungo il DNA, organizzato in cromatina, aumentando la porzione di DNA a filamento singolo
• a spostarsi sulla doppia elica
ricava l’energia necessaria a svolgere le sue funzioni dall’idrolisi dell’ATP.

Le elicasi si spostano e aprono il DNA in direzione 51 a 31.


Le elicasi più importanti sono quelle che intervengono nel meccanismo di duplicazione e si spostano in direzione 51-31
ma esistono delle elicasi, che non intervengono nel processo di duplicazione ma possono intervenire in vari
meccanismi di riparazione per staccare un filamento, che possono aprire il DNA anche in direzione opposta.

Nel momento in cui avviene lo scollamento della doppia elica si origina la bolla di replicazione e si assembla il
complesso di duplicazione ai filamenti singoli.
La DNA polimerasi alfa/delta ha un’unica direzione di sintesi (che coincide con la direzione in cui opera l’elicasi)
AGGIUGNE LE BASI IN DIREZIONE 5I  3I

si ha quindi, anche nel caso degli eucarioti, una sintesi continua ed una discontinua.
Durante la replicazione del DNA, entrambi i filamenti sono sintetizzati in direzione 5 I  3I sullo stampo del filamento
guida.
Questo comporta che un filamento sia sintetizzato in modo continuo (filamento precoce o leading srand) e l’altro in
modo discontinuo ( filamento ritardato o lagging strand, prende il nome di “ritardato” perché è leggermente in ritardo
rispetto all’altro).
In arancione i primer di RNA, sintetizzati dall’enzima primasi (=RNA polimerasi in grado di sintetizzare piccolissimi
tratti), utilizzati come inneschi per la sintesi di DNA da parte della DNA polimerasi.
Servono degli inneschi perché le DNA polimerasi non sono in grado di iniziare la sintesi; l’unica capacità che hanno è
quella di prolungare un tratto di preesistente, aggiungendo delle basi complementari e creando una doppia elica.

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L’enzima primasi svolge la sua funzione una singola volta sul filamento precoce, mentre sul filamento ritardato
continua a sintetizzare dei piccoli frammenti di RNA complementari al filamento guida, sui quali la DNA polimerasi
aggiunge delle basi di DNA.
I corti filamenti che caratterizzano la fase iniziale della sintesi del filamento ritardato sono chiamati frammenti di
Okazaki.
Il filamento ritardato ha un andamento frammentario: nel corso della sua sintesi ci saranno dei sempre dei frammenti
a singola elica di DNA, ciò è “pericoloso” perché è possibile che un filamento di DNA a singola elica si possa ripiegare e,
se ci sono dei nucleotidi complementari, appaiarsi. Nel caso in cui si appaiano avviene mutazione.
Nel caso in cui si ha una situazione del genera la DNA polimerasi non è in grado di intervenire; infatti si formerebbe
un’ansa
nel filamento in ritardo e si avrebbe una delezione.
Per questo motivo bisogna impedire il ripiegamento dell’elica in ritardo.
L’impedimento avviene ad opera delle proteine SSB (Single-Strand Binding / ssDNA-binding proteins) ossia proteine
che si legano in modo aspecifico a livello del fosfato desossiribosio ai tratti di singola elica nel filamento in ritardo.

Le SSB tengono stirata l’elica e impediscono che si possa ripiegare.


Man mano che la DNA polimerasi avanza, e il filamento ritardato diventa a doppia elica, le proteine vengono sbalzate
via dalla primasi (che sintetizza il tratto ad RNA) e vanno a riattaccarsi più a valle.

Nel processo di duplicazione c’è un concorso di vari tipi di proteine: le SSB tengono separate le eliche, la primasi
sintetizza degli innesti a RNA e la DNA polimerasi va a sintetizzare DNA.
Queste proteine devono agire in maniera sincrona rispettando dei tempi ed una serie di geometrie.

Oltre al potenziale pericolo di ripiegamento e conseguente delezione a cui va incontro il DNA in duplicazione, c’è un
altro problema:
l’elicasi scorre sulla lunga doppia elica e la apre srotolandola; con questo meccanismo a valle si forma il cosiddetto
“super avvolgimento” perché la doppia elica si iper-avvolge.
Questi avvolgimenti comportano deformazioni della doppia elica in cui il DNA non si comporta come un filamento a
spessore costante ma è deformato  le deformazioni della doppia elica devono essere rimosse perché la resistenza
meccanica creata da questi iper-avvolgimenti bloccherebbe l’avanzamento della DNA polimerasi.

Per bloccare questo problema, leggermente a valle del complesso di duplicazione, avviene attività enzimatica di
topoisomerasi.
Le topoisomerasi sono enzimi che si muovono (scivolano sul DNA) in direzione opposta ad elicasi e polimerasi (in
direzione 3I  5I ) e che sono in grado di tagliare il DNA dove ci sono dei “super avvolgimenti”.
Le zone di superavvolgimento della doppia elica sono riconosciute in quanto lo spessore della doppia elica del DNA
risulta alterato.

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L’enzima topoisomerasi (pallina arancione) taglia un filamento: si ottengono un fosfato P e un OH che sporgono dal
filamento.
Il fosfato nella zona del taglio lo lega l’enzima su di se; nel momento in cui l’OH si libera la molecola comincia a ruotare
e la tensione elastica dovuta all’avanzamento dell’elicasi nell’ambito della doppia elica si interrompe.
Nel momento in cui non c’è più tensione elastica la topoisomerasi risalderà il fosfato con l’OH esercitando un’azione di
ligasi, la saldatura è un processo che richiede energia che la topoisomerasi ottiene dall’idrolisi di ATP.
Dopo aver risladato e sistemato il tratto di DNA l’enizma seguita a scorrere.

A fine sintesi si ha il filamento ex novo con un innesco di RNA che deve essere rimosso o dallo stesso enzima di
replicazione o dalla DNA polimerasi di riparazione o da RNAasi.
La rimozione dell’innesco genera un tratto a singola elica vuoto intervengono DNA polimerasi di riparazione che
sintetizzano dei pezzettini brevi di DNA, gli innesti vengono sostituiti da DNA, e la DNA ligasi salda il nuovo tratto di
DNA.

il DNA neo-duplicato è ridotto molto male: ci sono OH e fosfato P che non si possono saldare insieme  NICK (=
discontinuità in una molecola a doppia elica di DNA dove non c’è nessun legame fosfodiesterico tra i nucleotidi
adiacenti ).
Su queste discontinuità interviene l’enzima ligasi che va a saldare i vari pezzi in cui il DNA è spezzettato, rimuovendo
così.
La ligasi va a generare legame ad alta energia sul fosfato in questione.
La ligasi va a formare legame ad alta energia tra due fosfati andando a trasferire un AMP che solitamente nel processo
di duplicazione deriva dall’idrolisi dell’ATP (nucleotide trifosfato contenente adenina)oppure in certi casi, soprattutto
in meccanismi di riparazione , può derivare dal NAD+ (dinucleotide, comprende AMP, contenente nicotinammide) .

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Nel momento in cui il legame ad alta energia è stato formato l’enzima ligasi lo rompe e l’energia liberata dall’idrolisi di
questo legame tra i fosfati è sufficiente a far saldare i nucleotidi adiacenti (eliminando così il Nick o taglio sul singolo
filamento della doppia elica).
Se uno dei Nick non venisse saldato si avrebbe un’interruzione del DNA  in questo caso a seguito di una trascrizione
si avrebbe una perdita di informazioni.

L’enzima DNA polimerasi degli eucarioti è più lento rispetto a quello dei procarioti perché pur essendo molto grande
dimensionalmente (più di quello dei batteri anche se simili strutturalmente) Il DNA eucariotico è organizzato in
cromatina e il complesso di duplicazione deve avanzare tra i nucleosomi.
La DNA polimerasi alfa/delta incontrano quindi una resistenza maggiore vinta grazie alla notevole massa d’urto del
complesso.
La massa d’urto deve essere notevole perché per duplicare i DNA oltre a dover aprire i nucleosomi, l’enzima DNA
polimerasi deve aprire e smembrare l’intero complesso proteico; in questo meccanismo sono coinvolte circa 4000
proteine ( il processo è davvero molto complicato).
Le cellule figlie alla fine della duplicazione avranno lo stesso DNA e anche lo stesso livello di organizzazione a livello dei
promotori ( = stesso livello di differenziamento).
Attorno alla doppia elica ci sono proteine istoniche e proteine non istoniche.
Tra le proteine istoniche: H1, H3, H4, H2A, H2B.
Tra le proteine non istoniche ce ne sono 914 che si trovano stabilmente legate al DNA (vengono rimosse
temporaneamente ma dopo la duplicazione subito riposizionate; la loro concentrazione è inalterata) e 236 che sono
variabili e sconosciute (di molte non si conosce nemmeno la funzione) e possono trovarsi sul DNA neoduplicato ma
non su quello originale.
Tra le proteine che vengono rimosse momentaneamente ci sono i fattori di trascrizione; questi vengono posizionati su
ambedue le eliche a livello dei promotori, dei geni e dei complessi di trascrizione.
I fattori di trascrizione sono rimossi due volte dalla cromatina: durante la sintesi del DNA e durante la condensazione
dei cromosomi.
I fattori di trascrizione sono organizzati in cluster (=gruppi) intorno alla coesina.

L’apertura del nucleosoma prevede che si stacchino a coppie gli istoni H3-H4 e H2A-H2B.
Dopo la duplicazione il nucleosoma si riforma ed è un mix di istoni vecchi e nuovi: H3-H4 vecchi e H2B-H2A variabili
(possono essere sia i vecchi sia nuovi).

Il DNA neoduplicato è tenuto insieme dalle COESINE.

9
La COESINA è un complesso proteico quaternario con un gran numero di subunità, associato ai cromosomi (è
conservato negli eucarioti e ha stretti omologhi nei batteri), dimensionalmente grande (ha dimensioni tali da essere
visibile al microscopio elettronico), che si può chiudere in una sorta di anello.
I geni del complesso devono essere stati espressi in maniera singola ma insieme perché se si ha una subunità ma ne
manca un’altra non si assembla tutto il complesso.
Le funzioni della coesina sono:
1. mantenere coesi i cromatidi fratelli, dopo la duplicazioen del DNA e dopo la fase S quando inizia la
condensazione del cromosoma. Il processo di condensazione chiama in causa una struttura scura che si dilata
e poi vien tagliata da tutte le parti (tranne il centromero) e si possono distinguere i cromatidi. Inizialmente è
tutto quanto legato insieme. La coesina svolge ruolo importante.
2. Nella mitosi garantisce la segregazione dei cromosomi. L’orientamento dei cinetocori fratelli per facilitare il
loro attaccamento ai microtubuli del fuso provenienti da poli opposti, impedisce la separazione dei cromatidi
fratelli finoa quando tutti i cromosomi non hanno una biorientazione.
3. interviene nel processo di riparazione perché mantiene legati i filamenti neoduplicati e fa si che si possa
riparare utilizzando una sorta di crossing over.
4. Importanti funzioni nella regolazione dell’espressione genica, con conseguente ruolo in molte patologie
5. l’appaiamento dei cromosomi omologhi che si verifica nel processo di meiosi e porta alla formazione del
crossing over; la coesina mantiene legati i cromosomi omologhi
6. riposiziona i fattori di trascrizione che durante la replicazione del DNA sono staccati; vengono riposizionati
subito dopo. Tutto implica che il riposizionamento venga ad opera della coesina, che è una sorta di memoria
cellulare. È legata in quella zona, duplicato il DNA la coesina fa passare il complesso e si chiude. Sulla coesina
si legano certi tipi di proteine che poi verranno riposizionati.
7. Interviene nell’organizzazione dei domini topologici della cromatina a livello nucleare attraverso la
formazione di anse di cromatina. La coesina può promuovere la trascrizione facilitando l’interazione tra
enhancer e promotore e concorrendo alla regolazione trascrizionale di un cluster di geni.
8. È chiamata in causa per organizzare i loop di cromatina nel corso della duplicazione del DNA, facilitando in tal
modo la simultanea replicazione delle origini.

È chiaro che mutazioni ai geni che riguardano la formazione e l’assemblaggio della coesina sono legati a vari tipi di
patologie.

L’enzima DNA polimerasi ha un'unica direzione di sintesi che determina il problema della duplicazione dei TELOMERI
negli eucarioti.
Negli eucarioti il DNA lineare determina un serio problema di duplicazione a livello del telomero perché lo spazio fisico
occupato dalla molecola (enorme) del complesso di duplicazione fa si che nella direzione 5I il telomero non sia
duplicabile perché lo spazio è occupato dal complesso legato.
Per questo motivo ogni volta che si duplica un DNA lineare se ne dovrebbe perdere un piccolo pezzo alle estremità,
fenomeno che dovrebbe determinare l’accorciamento del cromosoma. (In realtà ciò non avviene in tutte le cellule)

La forma circolare del DNA nei procarioti fa si che questi non abbiano il problema della
duplicazione del telomero.
Se si fa un dispetto ad un battere e si linearizza il suo DNA, dopo qualche replicazione muore
perché perde troppi pezzi ( inoltre nei batteri il DNA è codificante quasi completamente e il
danno è molto più immediato).
Se duplico il DNA lineare non lo riesco a duplicare tutto perché c’è il problema della
duplicazione dei telomeri che si accorciano da entrambe le parti.

Le estremità dei cromosomi lineari prendono il nome di TELOMERI; sono formate da un DNA altamente ripetuto
una sequenza di 6 nucleotidi che si ripete e può legare a sé molti complessi di proteine.

Queste sequenze ripetute sono sintetizzate da una trascrittasi inversa particolare che prende il nome di telomerasi: la
telomerasi è un enzima che, se attivo, quando la cellula entra in fase S del ciclo cellulare, è in grado di prolungare le
estremità in 3I dei cromosomi con lo scopo di impedirne l’accorciamento.

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La telomerasi è un catalizzatore con una molecola di RNA (sintetizzatagli dalla RNA polimerasi III), ossia un enzima con
azione di trascrittasi inversa: è in grado di costruire DNA sullo stampo di RNA.
Aggiunge tre nucleotidi di DNA alla volta leggendo l’RNA.

Lo scopo della telomerasi è quello di mantenere invariata la lunghezza del DNA dei telomeri in alcune cellule
particolari.
Senza la telomerasi i cromosomi inevitabilmente si accorcerebbero ad ogni ciclo di divisione.
L’enzima telomerasi è attivo:
1) Nelle CELLULE GERMINALI  cellule responsabili della perpetuazione della specie, il cromosoma va
mantenuto integro anche in termini dimensionali:
2) Nelle CELLULE EMBRIONALI  cellule programmate a dividersi molte volte;

In tutte le altre cellule, incluse le staminali dell’adulto, viene spento perché il perdurare della sua espressione può
causare o predisporre al cancro.
Nell’organismo umano ci sono tuttavia dei distretti staminali (come ad esempio le staminali ematopoietiche) che
necessitano di avere i telomeri lunghi; in questi casi i telomeri sono mantenuti invariati con meccanismi alternativi che
funzionano mediante la ricombinazione.

Nella regione dei telomeri si legano complessi di 6 proteine (TRF1,TRF2, TPP1, POT1, TIN2 e RAP1) che vanno a
formare il COMPLESSO DEL TELOMERO O SHELTERIN, il quale protegge i cromosomi dai meccanismi di riparazione del
DNA.
Le estremità dei cromosomi lineari devono infatti essere distinte dalle estremità del DNA danneggiato che richiedono
la riparazione; senza tale distinzione, i cromosomi lineari vanno incontro a reazioni di saldatura delle estremità,
ricombinazioni che provocano effetti deleteri come mutazioni cromosomiche

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Il telomero è un complesso di proteine multifunzione, quindi complessivamente svolge tanti ruoli.
La funzione ovvia e principale del telomero è quella di far si che l’estremità di un cromosoma sia protetta e non finisca
improvvisamente ( altrimenti sarebbe simile ad un DNA spezzato).
Se i telomeri vengono accorciati possono essere intaccate tutte le funzioni alle quali è deputato.
Per esempio: visto che proteine che regolano la funzione mitocondriale possono essere sequestrate dai telomeri, il
loro accorciamento può comportare un’attivazione della respirazione mitocondriale.
Oppure se si accorcia e si liberano i fattori di trascrizione legati ad esso, si possono attivare certi geni.
L’integrità del telomero è essenziale, perché è come se fosse un’antenna o un meccanismo che va a recepire una serie
di stimoli e va a condizionare poi le funzioni della cellula.
Se non c’è il complesso del telomero partono tutta una serie di mutazioni, l’accorciamento del telomero va a
determinare instabilità nei cromosomi che possono legarsi insieme perché il DNA nei meccanismi di riparazione li
riconosce come zone “spezzate” da riparare.

Se il telomero si accorcia ciò giustifica lo spegnimento dei geni della telomerasi è che normalmente le cellule sono
destinate a dividersi un paio di volte e non di più.
Anche le cellule staminali più vengono utilizzate, più fasi S hanno, e più accorciano i loro telomeri.
Con l’accorciamento dei telomeri si attivano vari tipi di meccanismi come quelli di senescenza.

La senescenza è un processo i cui sintomi sono dovuti all’organizzazione sbagliata o all’accorciamento del telomero. La
senescenza è la conseguenza della modificazione della trascrizione a livello nucleare, del conseguente inizio della
respirazione della cellula che, se chiamata in divisione, esaurisce il compartimento staminale.

Cosa comporta l’attivazione del processo di senescenza?


Il processo di senescenza è un processo guidato che caratterizza il blocco della divisione cellulare perchè va ad
inattivare l’enzima telomerasi, il perdurare della sua espressione infatti può causare o predisporre al cancro.
È un processo che ci protegge dai tumori perché se una cellula impazzisce, grazie a questo processo, il suo destino è
quello di dividersi un certo numero di volte con conseguente accorciamento dei telomeri, blocco della divisione e
morte.

Se si riattiva la telomerasi, come avviene in certi casi in risposta a certi virus oncogeni, non c’è più un limite alle
duplicazioni e il meccanismo di controllo viene a mancare.

La scoperta dell’enzima telomerasi fu di interesse non solo scientifico; se ne interessarono addirittura i mass media:
la lunghezza dei telomeri era collegabile con la durata in vita delle cellule e quindi con il processo di invecchiamento.
Un individuo coi telomeri molto lunghi dovrebbe avere un’aspettativa di vita maggiore perché le sue staminali ci
mettono di più ad invecchiare ed andare in senescenza, fenomeno che interessa le assicurazioni.
Lo studio dei telomeri rappresenta tutta una serie di problematiche di natura etica/ legate alla privacy perché da un
capello o da cellule di sfaldamento (reperibili sul bordo di un bicchiere dopo che una persona ha bevuto) è possibile
misurare la lunghezza dei telomeri : se li si trova corti l’individuo ha un’aspettativa di vita più bassa (a livello teorico) e
le aziende o le assicurazioni potrebbero avere meno interessi a stipulare contratti.
Su internet c’era la possibilità di fare il test che dava la stima della lunghezza dei telomeri, inteso come una sorta di
modalità per capire la propria aspettativa di vita.
In realtà la lunghezza dei telomeri a livello pratico non dice molto; l’aspettativa di vita dipende dall’uso che l’individuo
ha fatto delle staminali.

I telomeri sembrerebbero collegati all’aspettativa di vita e allo stato di salute dell’individuo nel futuro:
le condizioni di stress accorciano i telomeri, per esempio uno stress dovuto a maltrattamenti o problemi di qualsiasi
genere ha anche effetto di degradamento dei telomeri.
Mamme depresse o stressate potrebbero generare figli con telomeri più corti.

RIPARAZIONE DEL DNA

Il DNA, come ogni cosa che esiste, è danneggiabile; anche se è una molecola con struttura molto resistente se ci sono
degli stimoli estremi si può danneggiare.

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La maggior parte dei danni al DNA si formano in relazione a reazioni indesiderate dovute al metabolismo (nel caso dei
batteri questi danni sono molto maggiori rispetto agli eucarioti. Ciò perché negli eucarioti il DNA è chiuso nel nucleo e
la maggioranza delle reazioni del metabolismo non si svolgono vicino al DNA): un esempio è la deamminazione.
La deamminazione è un danno molto comune per cui i gruppi amminici, in presenza di gruppi –CO (che possono
essere nelle aldeidi o negli acidi carbossilici), sono in grado di cambiare e determinare una variazione nella struttura
delle basi.
Non tutte le basi azotate possono andare incontro al fenomeno di deamminazione:
- L’uracile non ha gruppi amminici quindi non è deamminabile.
- La citosina ha un gruppo amminico e se viene deamminata diventa uracile.
- L’ adenina deamminata diventa xantina
- La guanina deamminata diventa ipo-xantina

Adenina e guanina deamminate sono basi chiamate diversamente perché strutturalmente sono differenti; non
possono più stare nella doppia elica del DNA perché se ci stessero la deformerebbero.
C’è un sistema di riparazione specifico che nota la deformazione dovuta alla base deamminata sporgente nella doppia
elica, la toglie e ripara.

La presenza della timina nel DNA è legata all’evoluzione di questi meccanismi di riparazione.
Nel DNA l’uracile metilato, ossia la timina, deriva dal meccanismo di riparazione di una citosina che era stata
deamminata ed era nella forma di uracile.

Il momento principale in cui il DNA può subire danni è durante la sua duplicazione; la fase S è un momento ad alto
rischio perché le basi azotate, che si trovavano all’interno della doppia elica difese e protette dall’ambiente esterno,
sono esposte all’esterno e sono danneggiabili.
Per questo motivo più sono le fasi S alle quali la cellula va incontro e più sarà alta la probabilità di danno.
Errori che si verificano nella fase S del ciclo cellulare durante la duplicazione del DNA sono errori che, se non sistemati
in tempo dai meccanismi di riparazione, possono portare a mutazione.

I danni al DNA possono essere di varia natura; oltre alla deamminazione ed errori durante la duplicazione, esistono:
1. danni dovuti ad eventi fisici come l’intervento di radiazioni ionizzanti, o radiazioni X, 𝛾,UV, o particelle cariche
ad alta energia che ionizzano la materia biologica cedendo energia.
Le radiazioni possono andare a spezzare la struttura della singola elica (compiono un taglio), possono
modificare delle basi oppure possono far dimerizzare delle pirimidine vicine su una singola elica.
Quando due pirimidine vicine dimerizzano formano una sorta di sistema 𝜋 dove gli elettorni dei doppi legami
vengono messi in compartecipazione.
Quando le due pirimidine sono legate tra di loro il complesso di duplicazione non le distingue come due
separate ma ne legge una sola; per questo motivo viene introdotta una mutazione.
I raggi UV non penetrano molto quindi interessano soprattutto l’epidermide, Invece le radiazioni ionizzanti
possono entrare e generare la rottura di un doppio filamento.

2. Danni dovuti ad eventi radiochimici come la formazione di radicali liberi, oppure molecoea che derivano da
xenobiotici (composti idrofobici che in certe particolari forme possono intercalarsi nel DNA )

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3. danni dovuti a forme alternative delle basi azotate nella doppia elica. Le basi azotate hanno delle forme
stabili con le quali le conosciamo ma per effetto del fenomeno della risonanza (effetto mesomerico) esistono
anche in altre forme, chiamate forme di risonanza.
In queste forme tautomeriche le basi hanno una diversa disposizione dei legami.
Il problema delle forme tautomeriche (che comunque sono rare) è che non sono più in grado di legare le basi
complementari (che legherebbero nel loro stato fondamentale) e avvengono appaiamenti errati (nelle
immagini rappresentati in rosso). Le coppie non saranno più C-G e A-T.

La citosina, che normalmente si appaia con la guanina, quando si trova nella forma imminica si comporta
come una timina.
L’adenina, che normalmente si appaia con la timina, nella forma imminica rara si accoppia con una citosina in
forma canonica.

La timina, che in forma canonica forma un solo legame ad idrogeno con la guanina (a sx nella figura), quando
si trova nella forma enolica si comporta come una citosina, formando con la guanina tre legami ad idrogeno.
D’altra parte, la guanina, quando si trova nella forma enolica, si comporta come un’adenina, appaiandosi con
la timina in forma canonica.
Le basi stanno nella forma tautomerica per un lasso di tempo limitato perché per motivi di stabilità non sono
favorite; se la polimerasi era già passata sul tratto del filamento e la base tautomerica era già stata appaiata,
nel momento in cui la base torna allo stato fondamentale non potrà più stare appaiata con quella che in
forma tautomerica era la sua complementare errori e danno nel DNA che si distorge.

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Su questo tipo di danno intervengono le DNA polimerasi che sono in grado di andare a catalizzare la
polimerizzazione ma hanno anche un’attività esonucleasica (tradotto: non sono in grado solo di aggiungere
nucleotidi ma sono in grado anche di rimuoverne uno alla volta fino a correggere il danno).
La DNA polimerasi capta errori di questo tipo perché dentro il complesso enzimatico il DNA non è più un
filamento costante ma la doppia elica risulta storta e deformata e tocca le pareti dell’enzima.
Quando c’è contatto tra DNA e complesso enzimatico si attiva un meccanismo esonucleasico per cui l’enzima
blocca la sintesi e comincia a togliere dei nucleotidi finché il tratto non è perfettamente a doppia elica.
Sono in grado di svolgere questa attività finché il tratto di DNA sul quale è presente la base in forma
tautomerica è dentro l’enzima; se per caso la base torna allo stato fondamentale quando è fuori dall’enzima
non c’è più nulla da fare e si avranno delle basi sporgenti.
Tutto questo genera serio problema: il sistema di riparazione riconosce che ci sono delle basi sporgenti ma
non sa riparare il danno perché le basi sporgenti sono normali e stabili (non c’è nulla che indichi che le basi
sono sbagliate).
Il sistema di riparazione riconosce in realtà le basi sporgenti perché il DNA è metilato (c’è un certo livello di
metilazione anche nei batteri quindi anche nei batteri agisce un sistema di riparazione).
L’elica vecchia è metilata, l’elica nuova invece viene metilata più avanti.

I sistemi di riparazione che intervengono sull’elica al di fuori del complesso enzimatico della DNA polimerasi
riconoscono le basi spaiate e tagliano il segmento di elica non metilato, cioè l’elica di nuova sintesi.
La metilazione permette di riconoscere il nucleotide sbagliato tra i due spaiati e indirettamente il segmento
da tagliare.
Dopo la rimozione dei nucleotidi la DNA polimerasi ne sintetizza di nuovi e la ligasi salda.

Analisi su DNA di un organismo eucariote: una volta spezzato il DNA in piccoli pezzi se si effettua la separazione di
questi secondo il gradiente di densità si scopre che i pezzi si separano e si dispongono in base alle loro dimensioni
(quelli più grandi sono i più pesanti).
La distribuzione dei nucleotidi nel genoma non è casuale.
Ci sono zone ricche solo di adenina e timina e ci sono delle regioni ricchissime di guanina e citosina.
Nell’ambito dei genomi complessi c’è tendenza a perdere coppie CG, quindi il DNA si arricchisce in maniera
consistente di AT e diventa più instabile perché la doppia elica è tenuta meno strettamente legata (AT= 2 legami ad H,
GC=3 legami H) .
Zone importanti dove ci sono i geni con importanti funzionalità sono ricche di GC.
I geni nuovi invece si possono trovare nelle zone più ricche di AT.
La metilazione è importante come marcatura di certe regioni genomiche.
Dove non avviene metilazione sono delle zone nelle quali mancano delle posizioni sul DNA o delle posizioni a livello
dei geni ISOLE GC, zone ricche di coppie guanina-citosina.

I meccanismi di riparazione del DNA sono presenti in tutti gli organismi: anche i batteri, che normalmente si affidano
alle mutazioni come elemento determinante per la loro evoluzione, riparano il DNA.
La riparazione del DNA è essenziale; se non ci fosse la variabilità sarebbe talmente alta che non sarebbe possibile
avere le specie, queste sarebbero infatti in divenire continuo e il sistema imploderebbe. Il mantenimento della
stabilità del DNA è essenziale per i meccanismi di riparazione che, a loro volta, sono essenziali ai fini dell’esistenza
delle specie.
Specie che riparano il DNA meglio di altre sono stabili, ma possono essere più instabili rispetto alle specie che sono in
grado di limitare i danni.

I sistemi di riparazione del DNA negli eucarioti potrebbero aver avuto il massimo sviluppo nel periodo geologico del
pre-Cambriano.
Lo sviluppo nel cambriano di tante specie è probabilmente andato di pari passo con l’evoluzione negli eucarioti dei
meccanismi di riparazione. Abbiamo meccanismi di riparazione molto più complessi di quelli che ci sono nel caso dei
batteri anche se i batteri sono in grado di riparare.

Danni agli enzimi di riparazione sono associabili con patologie o fenomeni di invecchiamento precoci( il fenomeno
dell’invecchiamento è legato anche alla non riparazione del DNA).

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La riparazione del DNA si basa su:
1. LOCALIZZAZIONE DEL DANNO (nella zona danneggiata si assembla un complesso di proteine contenente un
enzima che effettua un Nick; è cioè presente una DNAasi che taglia il singolo filamento e permette di
riconoscere il sito danneggiato)
2. TAGLIO ad opera di DNAasi
3. RIMOZIONE DELLA ZONA DANNEGGIATA ad opera di DNAasi, i nucleotidi vengono tolti uno per volta finchè
tutto il sito danneggiato on è stato eliminato
4. SINTESI DI DNA ad opera della DNA polimerasi
5. SALDATURA ad opera della ligasi

Ci sono meccanismi multipli che impediscono o limitano gli errori durante la replicazione, come per esempio:
- l’attività esonucleasica dei complessi di DNA polimerasi
- meccanismi di segregazione dei cromosomi; per evitare mutazioni come perdita di pezzi oppure distribuzione
diseguale dei cromosomi
- formazione di dimneri di pirimidine
I vari meccanismi di riparazione si attivano nel momento in cui c’è qualcosa che non va.
L’organismo è in grado di riconoscere danni perché il DNA non è una molecola abbandonata al suo destino nel nucleo
ma la sua integrità viene costantemente monitorata.
La presenza di danni impedisce l’avanzamento del ciclo cellulare , la cellula attiva infatti i meccanismi di riparazione e
concentra tutte le sue energie nella riparazione dei danni.
Se i danni non sono riparabili si attivano i meccanismi di morte cellulare programmata e la cellula si autodistrugge.

Tutto va bene se i danni sono su un’unica elica; se i danni sono sulle due eliche normalmente non è possibile la
riparazione.

Nel caso dei batteri esposti a radiazioni ionizzanti, come avviene quando si cerca di sterelizzare qualcosa, si uccidono i
batteri perché si danneggiano ambedue le eliche.
Se ci sono danni su tutte e due le eliche non si può arrivare a capire qual era il nucleotide sano.
Nel caso di danno ad ambedue le eliche i batteri tentano la riparazione che chiama in causa un sistema impreciso
perché il battere è in difficoltà ad opera delle DNA polimerasi incomplete che sintetizzano DNA e riparano a caso.
La riparazione porta generalmente a mutazione o perdita di funzionalità e il battere muore mentre in qualche caso
potrebbe avere successo e generare una proprietà differente.

Nel caso degli eucairoti i danni a tutte e due le eliche possono essere riparati: uno dei vantaggi dell’essere diploide è
quello di avere una copia nell’altro cromosoma omologo.

I cromosomi omologhi non sono lontani tra di loro ma in certi casi sono tenuti vicini quindi si può riparare un danno a
tutte e due le eliche con un meccanismo tipo una sorta di crossing over/ricombinazione.

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La presenza della diploidia conviene di riparare il DNA danneggiato a tutte e due le elice.
Se un certo pezzo di cromosoma ha un danno su tutte e due le eliche ed è irreparabile può essere in realtà riparato in
maniera curata e precisa mediante la ricombinazione.
La coesina gioca un ruolo fondamentale in questo: le due eliche di DNA, i due cromosomi omologhi sono spesso tenuti
vicini.
Se la riparazione non c’è nella cellula ci sono problematiche che faranno evolvere la cellula verso il patologico.
Se la riparazione non è efficiente o tutte le condizioni in cui non si riesce a ripararlo, non riparare il DNA o danni a
livello dei meccanismi di riparazione si associano a patologie.
Tra queste c’è possibilità di invecchiamento rapido per cui l’individuo invecchia molto rapidamente, un esempio è la
sindrome di Cockayne.
Gli individui affetti dalla sindrome di Cokayne hanno un’età biologica diversa dall’età somatica dimostrata.

Altre patologie (che non sono state citate a lezione ma sono presenti sulle slide) causate da insufficiente riparazione
del DNA potrebbero essere:
- tricotiodistrofia: sensibilità della pelle e fragilità di unghie e capelli
- Xeroderma pigmentoso: ipersensibilità alla luce solare/UV, che determina aumentata incidenza di cancro alla
cute ed invecchiamento precoce

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STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE
LEZIONE 16
14/12/2017

CICLO CELLULARE

Il ciclo cellulare è la storia di quello che avviene nella cellula tra una divisione cellulare (mitosi) e la divisione cellulare
successiva. In questo lasso di tempo la cellula vive in una fase chiamata interfase o intercinesi, durante la quale si
prepara alla mitosi.
Il periodo di intercinesi è facilmente suddivisibile in 3 ulteriori sottofasi (G1, S, G2).
La fase di duplicazione del DNA è perfettamente individuabile, anche da un punto di vista morfologico (cambia la
geometria della cellula) e prende il nome di FASE S (S “sintesi”).
Se la cellula in fase di duplicazione è messa in presenza di timina radioattiva la incorporerà nel DNA e tramite
un autoradiografia si evidenzia che la cellula sta replicando il suo genoma: metto un vetrino contenente la
cellula vicino ad una lastra fotografica, l’argento precipita ed indica che è presente timina radioattiva.
In un tessuto, può entrare in fase S una sola cellula oppure più cellule in modo sincrono. Ci sono anche metodi che
permettono di sincronizzare l’entrata in fase S di più cellule.
Ci sono altri metodi per evidenziare che la cellula si trovi in fase S.
Esempio: si separano le cellule, vengono fatte passare in capillari sottilissimi sui quali incidono luci laser. Si
usano certi tipi di coloranti per misurare la quantità di DNA. Ho alcune cellule diploidi in fase G1, altre
tetraploidi, e altre a metà tra diploidi e tetraploidi. Questi metodi hanno comportato estrema facilità nel
determinare in quale fase si trovi la cellula.

FASE G1
(G “gap”, “intervallo”)
La cellula appena formata vive un lasso di tempo in G1 prima di iniziare la fase S.
La cellula fa esattamente quello che sa fare sulla base del suo livello di specializzazione. Essenzialmente la svolge le
sue normali funzioni ed accumula energia sotto forma di ATP. Solo nel momento in cui avrà accumulato una quantità
sufficiente di energia entrerà in fase S (tale fase ha un costo energetico elevato: la duplicazione della cromatina non
implica solo duplicazione del DNA ma anche degli istoni e delle proteine associate). Se non è raggiunta una soglia
minima di quantità di energia, la cellula non entrerà in fase S.
La durata della fase G1 è estremamente variabile. È quasi inesistente nelle cellule embrionali durante le prime fasi
dello sviluppo, poiché l’energia è stata accumulata dalla cellula uovo che ha controllato le prime divisioni mitotiche
dello zigote. Da un certo momento in poi, mentre l’embrione si forma, la velocità di divisione cellulare varia
moltissimo. Mano a mano che le cellule si differenziano, rallentano la divisione cellulare dovuto al fatto che allungano
la fase G1.
Perché il differenziamento conduce ad un allungamento della fase G1? Perché una cellula per svolgere le sue normali
funzioni ricava ATP dalle varie reazioni, ma ne spende quantità notevoli durante la sua esistenza. Più molecole di ATP
spende, più sarà difficile accumularle per entrare in fase S. Questo significa che la cellula impiegherà più tempo per
giungere alle condizioni energetiche ottimali per iniziare la fase S. Le cellule maggiormente specializzate, come quelle
somatiche hanno un G1 tanto prolungato da diventare fuori ciclo. Un eventuale ritorno al ciclo cellulare implica lo
smantellamento del differenziamento dal quale si ricava energia. Tale quota di energia, sommata all’ATP che ora la
cellula è in grado di accumulare, permette l’ingresso in fase S.
Le cellule con grande velocità di proliferazione hanno perso differenziamento. Cellule tumorali, altamente proliferanti,
vivono una G1 molto breve in quanto sono sdifferenziate (possiamo non conoscere l’origine di un tumore in quanto le
cellule hanno perso il loro differenziamento).

FASE S
A seguito del completamento della fase G1, la cellula entra in fase S.
L’ingresso in fase S implica un meccanismo articolato di variazione dell’attività genica. È necessario sintetizzare ad
esempio la DNA polimerasi δ, che normalmente non c’è e tutte le altre proteine necessarie per la fase S. La cellula non
dispone di quantità elevate di desossiribonucleotidi, bisogna costruire enzimi come le ribonucleotidi reduttasi che
costruiscono grandi quantità di desossiribonucleotidi. Tali enzimi sono presenti durante il ciclo cellulare ma hanno
bassa efficienza e sintetizzano piccole quantità di desossiribonucleotidi, sufficienti solo per i meccanismi di
riparazione. L’ingresso in fase S è determinato dall’attivazione di certi geni e dallo spegnimento di altri. Ad esempio è
necessario attivare geni per la sintesi di ribosio, il substrato di base per la sintesi di desossiribosio, e di basi azotate
(nella cellula ho solo elevata quantità di Adenina).
Il momento intermedio tra G1 e S rappresenta un primo punto di controllo. La condizione necessaria per l’ingresso in
fase S è l’attivazione o lo spegnimento di geni, se questo non avviene, anche avendo le quantità sufficienti di energia,
la cellula è bloccata.
Esempio: una cellula ha abbastanza energia, ma presenta un danno al DNA. Non si attivano i geni per la
divisione ma per la riparazione del danno.
Si tratta di una sorta di meccanismo ad orologeria: la cellula si fissa un tempo, si blocca in G1 per
intraprendere una serie di reazioni con lo scopo di riparare il danno. Se il danno è riparato si attiveranno poi i
geni per la divisione, nel caso non si riesca a riparare, la cellula va incontro a morte programmata.
Scopo: evitare che una cellula si divida quando non è in condizioni ottimali per farlo, se una cellula danneggiata va
incontro a divisioni cellulare tenderà a generare altre cellule danneggiate con conseguente alterazione dello stato di
differenziamento. Esso, infatti, è mantenuto da un’esecuzione ordinata di programmi genetici, se non li rispetto la
cellula diventa neoplastica. La cellula tenderà a fare ciò che caratterizza il sistema vita, cioè tenderà a proliferare.
I programmi di morte cellulare, basati su regolazioni geniche, esistono nell’eucariote multicellulare per impedire la
proliferazione di una cellula che non deve farlo. Il pericolo è che la cellula possa ritornare indietro nella sua scala
evolutiva. Il differenziamento è il freno a questo tipo di processo.
Nell’organismo pluricellulare la divisione delle cellule deve essere controllata, se una cellula del fegato crescesse a
dismisura non ci sarebbe spazio per altri organi.

La durata della fase S è fissa, circa 1 ora, ma dipende dall’efficienza dei complessi di duplicazione e dalla quantità di
DNA. Una volta che la cellula è entrata in fase S, nulla si può più bloccare perché è tutto pronto per la duplicazione.
La fase S si considera ultimata quando la cellula è tetraploide (4n).
Tra la fase S e l’inizio della mitosi M, intercorre la fase G2.

FASE G2
Corrisponde alla fine della sintesi ma la cellula non è ancora pronta per iniziare la divisione. Bisogna ad esempio
costruire le membrane nucleari, perché la cellula tetraploide dovrà originare due nuclei (mitosi= duplicazione del
nucleo). In generale devo arricchire la quantità di proteine dell’apparato mitotico.
La durata è fissa, circa 1 ora.
È il completamento di un processo che una volta iniziato non può fermarsi, ormai c’è la giusta quantità di energia e di
enzimi.
La fine di G2 porta alla mitosi e questo implica variazioni nelle strutture e delle attività geniche.

Momento tra G2 e M è il secondo punto di controllo.


Esempio: supponiamo di avere una cellula pronta per entrare in mitosi. Se microiniettassi nella cellula un po’
di DNA questa cellula non entrerà in mitosi perché si accorge di avere DNA non duplicato.

L’ingresso in mitosi richiede processi attivi di fosforilazione che consentono la condensazione dei cromosomi ed anche
lo sfaldamento dell’involucro nucleare.
MITOSI
Raggiunta la metafase, quando i cromosomi sono tutti agganciati può iniziare l’anafase, cioè la separazione dei
cromosomi in cromatidi, la retrazione di alcune fibre del fuso e una serie di meccanismi che comporteranno la
traslocazione dei cromatidi in zone opposte della cellula.
Questo meccanismo richiede processi esattamente opposti a quelli necessari per l’entrata in mitosi:
FASE G2  MITOSI: FOSFORILAZIONE (l’involucro e altre strutture cellulari si sfaldano)
METAFASE  ANAFASE: DEFOSFORILAZIONE. Il complesso che prima fosforilava è eliminato. Ora si iniziano a tagliare
gruppi fosfato, si attiva il macchinario che spezza i cromosomi in cromatidi e le membrane, che si erano frammentate
in minuscole vescicole, tenderanno a riaggregarsi. Esse erano tenute separate perché fosforilate, la carica negativa del
fosfato ne impediva la riaggregazione. Mentre i cromatidi migrano si riformano le membrane nucleari. Si riposiziona
tutto, compreso i pori che, essendo complessi proteici, si erano sfaldati con la membrana. I pori in particolare una
volta disassemblati dalla membrana vanno a costituire strutture a livello dei centromeri durante la mitosi.

Una volta che la cellula ha duplicato il nucleo, la mitosi è completata. A seguito della mitosi ci può essere uno stadio
opzionale che è la citodieresi.
Alcune cellule infatti duplicano il nucleo senza dividersi.
Esempio: la fibrocellula muscolare è un sincizio, ha tanti nuclei. Si sono verificate tante mitosi senza mai
citodieresi.
Al contrario, nella meiosi la separazione delle cellule è obbligatoria, è parte integrante.
Rappresentazione del ciclo cellulare. Varia il numero n, quantità di DNA. La cellula in G1 è 2n=46
cromatidi. Durante la fase S da 2n  a 4n (varia la ploidia). In G2 a cellula è 4n, tutto è duplicato. Nella
mitosi da 4n  a 2n (due nuclei, o due cellule se con citodieresi)

Momento tra metafase e anafase è il terzo momento di controllo.


La mitosi ha lo scopo di suddividere il DNA in parti uguali, per garantire che tutte le nostre cellule abbiano stesso DNA.
Ciò che può variare è il contenuto di proteine, come quelle di regolazione. Questa distribuzione diseguale delle
proteine di regolazione permette di avere, durante lo sviluppo, cellule con stesso DNA che però ad un certo momento
svolgono funzioni differenti. Se fosse il numero di cromosomi ad essere differente lo sviluppo embrionale si
bloccherebbe (un cromosoma in più o uno in meno ecc.).
Nei primi stadi di sviluppo embrionale, quando si forma lo zigote e inizia la prima mitosi (cariogamia) essa non è
dovuta al fatto che i due nuclei si fondono, ma iniziano mitosi insieme. Scompaiono le membrane, si formano i
cromosomi e si trovano insieme agganciati da fibre del fuso che derivano: una dal mezzo centriolo dello spermatozoo
e l’altra dalla cellula uovo (l’altro mezzo centriolo dello spermatozoo è servito a fare il flagello). Quindi il centriolo
dello spermatozoo aggancia sia cromatidio maschile sia quello femminile, ma non è scontato che avvenga. È
sufficiente una leggera modificazione o mutazione strutturale di una proteina che il processo potrebbe non riuscire.
Solo se i cromosomi sono ben agganciati, e c’è tensione nelle fibre del fuso si entra in anafase, in caso contrario il ciclo
cellulare si blocca.
Durante l’inizio della vita embrionale, il gamete femminile, che si è appropriato di quasi tutto il citoplasma, è molto
ricco di energia. Non c’è fase né fase G1 nè G2. È un susseguirsi di S-M-S-M-S-M….
Le prime divisioni sono estremamente rapide perché tutto ciò che serve è già contenuto nella cellula uovo. Un altro
elemento importante è che la cromatina non entra ancora in azione, il DNA è compattato, quasi tutto eterocromatico,
pronto a dividersi perché, tutto, comprese le proteine, è programmato dalla cellula uovo. Ci sono RNA di lunga vita già
programmati, ribosomi pronti.
Finora queste divisioni rapide non hanno comportato aumento di massa, è come se lo zigote si dividesse in celluline
più piccole, ma con stesso volume totale (morula).
Il momento critico coincide con lo sviluppo della blastula, e di tutti i movimenti attivi che saranno tali da far
ricominciare l’attività genica. Il nuovo genoma comincia a funzionare. È il momento della competizione tra maschile e
femminile, ricominciano le metilazioni e le marcature di specificità, un genoma prevarrà su alcuni aspetti e l’altro su
altri aspetti. A questo punto si può osservare se ci sia compatibilità tra i genomi. Se qualcosa impedisce la loro
interazione il processo si blocca e non nasce niente.
Il genoma funziona, non avviene trascrizione ma traduzione, ci sono RNA a lunga vita (circondato da proteine, non può
ripiegarsi). Mano a mano che si attiva il genoma compare la G1, inizialmente molto breve, poi G2, fino a che la G1 si
allungherà in funzione del differenziamento.
CENTRIOLI
I centrioli sono strutture cilindriche formate da microtubuli.

Duplicazione dei centrioli. La particolare struttura dei centrioli in fase G1 è data dal fatto che la cellula
derivi da una precedente divisione cellulare, c’è un centriolo ma l’altro è mancante. Nel corso del tempo
i due mezzi centrioli vengono duplicati e si formano i veri e propri centrioli costituiti da due cilindretti,
posti tra loro con un angolo di 90°. All’ingresso della fase M i centrioli si attivano e si spostano ai poli
opposti della cellula. Tale spostamento è regolato da elementi del citoscheletro, complessi contrattili
vari che comprendono anche actina e miosina, idrolizzano ATP e si muovono (nel caso della meiosi, che
deve originare due cellule di diverse dimensioni il fuso viene spostato in periferia, c’è un cambiamento
da fuso meiotico a mitotico).

Relazione tra le fasi G0, G1 e Gz


In base al differenziamento della cellula, la fase G1 può durare ore, giorni, settimane o molto più a lungo. E’ una fase
senza ritorno e, poiché può anche essere eterna, si dice che la cellula esca dal ciclo.
La cellula può uscire in due modi dal ciclo:
• G0
Si tratta di un’uscita dal ciclo definitiva ma che è potenzialmente reversibile.
La reversibilità o irreversibilità dipenderà dall’evento che ha portato la cellula in G0. Esempi:
PROBLEMA ENERGETICO: DIFFERENZIAMENTO  G0 REVERSIBILE (vedi EPATOCITA)
Nel caso dell’epatocita, esso si presenta come una cellula differenziata che rimane in G0 poiché non è in
grado di accumulare la quantità di ATP necessaria per l’ingresso in mitosi. Si tratta però di una fase reversibile
perché posso smantellare il differenziamento, esso è spinto ma la cellula ha ancora una sua struttura. Se lo
smantello la cellula ritorna indietro e può tornare a proliferare. Il fegato è un organo che può rigenerare non
solo grazie alle cellule staminali epatiche ma a molti epatociti che si sdifferenziano.
G0 SMANTELLAMENTO DIFFERENZIAMENTO  G1.
Nell’epatocita si smantella ad esempio l’estesa quantità di reticolo che comprende il sistema di
detossificazione. (deperoni autofagici smantellano e libera l’energia interna)

DANNI GENICI IMPEDISCONO IL DIFFERENZIAMENTO  G0 NON REVERSIBILE (vedi TUMORE DEL SANGUE)
G0 è irreversibile nel caso di una cellula che ha già avviato il suo programma di differenziamento ma non
riesce a completarlo a causa di danni genici, dunque non per problemi energetici.
Alcuni tumori del sangue non sono dovuti a cellule in rapida proliferazione ma a cellule che si accumulano in
G0 e che quindi non maturano. Condizione di leucemia. Se ho accumulo di cellule in G0 non ho elementi
maturi come i globuli rossi. (N.B.: una manifestazione neoplastica non è sempre causata da proliferazione).
• GZ
Si tratta di un’uscita definitiva, senza ritorno nel ciclo cellulare.
La causa di un’uscita senza ritorno è il differenziamento. Esso ha comportato modificazioni irreversibili
nell’architettura della cellula tali che non è più possibile smantellarlo. Alcune cellule in GZ:
ERITROCITA, non ha il nucleo, non può più dividersi.
FIBROCELLULE MUSCOLARI, sincizi contenenti tantissimi nuclei con complessi di actina, miosina ed altre
proteine condivise. Non possono essere smantellate, le cellule possono solo morire ed essere ricostituite.
NEURONE. È tanto differenziato da non poter nemmeno originare un tumore.

Nell’individuo adulto le uniche cellule che possono avere un ciclo cellulare sono solo le cellule staminali.
Esse hanno la telomerasi bloccata  si possono dividere solo un certo numero di volte. Questo non è valido per tutte
le staminali, le staminali midollari devono dividersi molte volte così come quelle che vanno a formare l’epidermide, un
tessuto che cambio in maniera continua.
Le staminali non hanno la telomerasi ma attivano meccanismi alternativi che si basano sulla ricombinazione.
Allungano i telomeri per dividersi più volte ma questo può comportare un rischio, qualche cellula può degenerare in
senso neoplastico.
Le cellule che quindi hanno ancora un ciclo sono la minoranza, la maggioranza è differenziata.

Come avviene la regolazione del ciclo cellulare?


Sapendo che ci sono 3 punti di controllo analizziamo come questi vengano regolati.
La regolazione avviene in eucarioti pluricellulari, unicellulari come lieviti, e negli archea. Non esiste nel caso dei batteri
perché a regolare è la disponibilità di cibo.
Tutto viene regolato con un cambiamento di espressione genica affidato a complessi
ciclina/CdK.
Le cicline sono proteine che si trovano solo in certi momenti del ciclo cellulare, vengono poi
eventualmente degradate in maniera selettiva (questo fatto sottolinea l’importanza dei
meccanismi di proteolisi).
Se la ciclina è presente, il ciclo cellulare si blocca, se voglio ricominciare il ciclo devo
distruggere la ciclina. Per farlo devo staccarla dall’enzima CdK per poi degradarla con il
proteasoma.
L’enzima CdK (ciclina dipendente kinasi) appartiene alla famiglia delle Kinasi, enzimi
fosforilanti. Utilizzano come substrato ATP ed un’altra molecola X. Idrolizzano ATP in ADP e sfruttano l’energia
liberata, per legare il gruppo fosfato all’altra molecola X (la piruvato kinasi fosforila il piruvato).
Sono enzimi specifici, portano sempre legato ATP con un’altra molecola X che può variare.
Alcune kinasi che svolgono funzioni fondamentali portano legate proprio proteine, le cosiddette protein kinasi. Non
legano gruppi fosfato a caso sulle proteine ma ne riconoscono solo certe classi per geometrie particolari. Queste
proteine substrato possono avere sequenze di amminoacidi anche molto diverse tra loro ma condividono una stessa
geometria che le fa interagire con il sito attivo dell’enzima. Solitamente il gruppo fosfato è legato all’ossigeno, quindi
ad amminoacidi con gruppi -OH (serina, treonina e tirosina).

Le protein kinasi sono enzimi a controllo allosterico. La loro peculiarità è che hanno 2 siti di legame. Uno è il sito attivo
che lega il substrato, nell’altro legano in modo specifico e selettivo una proteina, ad esempio la ciclina.
Cosa succede quando il CdK lega la ciclina? È un legame che deriva da alta affinità, la ciclina è una molecola di grandi
dimensioni, si modifica la geometria della protein kinasi, e di conseguenza del sito attivo che si attiva verso un certo
substrato.
Il Cdk è inattivo nel citosol, non perché non presenti il sito attivo ma perché non si presenta con la giusta geometria.
Nel momento in cui lega la ciclina l’enzima si attiva.

Funzionamento Cdk/ciclina negli eucarioti unicellulari

Il lievito ha:
• 1 Cdk;
• 2 cicline (ciclina verde e azzurra);

In fase G1 il lievito ha Cdk non attivo perché non ha la ciclina legata.

Il passaggio tra G1 e S avviene quando la ciclina (celeste)


sintetizzata al termine di G1, si lega al Cdk che cambia geometria e
fosforila alcune proteine come:
• fattori di trascrizione. Vengono fosforilati i complessi
quaternari che li tenevano bloccati nel citosol. Vengono
esposte le sequenze segnale per entrare nel nucleo.
Risultato: attivazione e spegnimento di geni. Ad esempio
sono attivati i geni per la sintesi della DNA polimerasi δ e
della ribonucleotide reduttasi.

Una volta iniziata la fase S, il processo è bloccato distruggendo la


ciclina. Gli eventi di espressione o repressione genica sono già
attivati, inizia la fase di duplicazione del DNA. Il Cdk rimane inattivo
per tutta la fase S e la fase G2.

La transizione tra S e M è dovuta al legame dello stesso Cdk con un’altra ciclina, sintetizzata alla fine di G2. Il legame
con le due diverse cicline non è assolutamente identico. La geometria del sito attivo cambia, così come cambiano i
bersagli.
Il complesso di protein kinasi che attiva il programma per effettuare la mitosi prende il nome di MPF “mitosi
promoting factor”. MPF fosforila tante proteine tra le quali:
• proteine della lamina, in modo tale che l’involucro nucleare scompaia.
Il complesso resta attivo fino alla metafase, con l’inizio dell’anafase la ciclina è distrutta e quindi il CdK ritorna inattivo.
Facendo questo si blocca la fosforilazione e il processo di defosforilazione prende il sopravvento. In realtà le fosfatasi
erano già attive durante la metafase ma la velocità con cui staccavano gruppi fosfato non era confrontabile con quella
del CdK che invece li aggiungeva. Una volta distrutta la ciclina, il CdK è inattivo e si assiste solo alla defosforilazione,
che comporta frammentazione del cromosoma in cromatidi, depolimerizzazione delle fibre del fuso e riformazione
delle membrane (compresa quella nucleare).

Il CdK essendo un enzima allosterico può legare molecole diverse con reazioni diverse. È l’effetto allosterico che
orienta l’attività di un enzima, e dipende dal legarsi di un qualcosa in un sito periferico.
Esso è legato ad interazione tra proteine (il prof fa un esempio dell’interazione tra proteina G α e l’adenilato ciclasi,
sostenendo che nel momento in cui si legano entrambi si attivano).
Funzionamento Cdk/ciclina negli eucarioti pluricellulari
Gli eucarioti hanno sia diversi tipi di CdK, sia diversi tipi di cicline.

Alternanza delle cicline nelle varie fasi del ciclo cellulare


Durante la fase G1 è sintetizzata la CICLINA D. Essa attiva un CdK che fosforila substrati proteici come
fattori di trascrizione o complessi quaternari che li tengono bloccati. Nel caso in cui distruggessi la ciclina
D il sistema non entrerebbe più in fase S, perché non si attiverebbero i geni che portano alla sintesi della
CICLINA E. Essa attiva a sua volta altre CdK.
In fase S sempre CICLINA A.
Alla fine della G2 si sintetizza la CICLINA B che lega un CdK per formare l’MPF. Questo fosforilerà le
lamine e farà iniziare la mitosi. Se impedissi la sintesi della ciclina B, il CdK non si attiverebbe e la cellula
non entrerebbe in mitosi.
Con l’ingresso in anafase la ciclina B è distrutta.
Il processo poi si ripete in modo analogo.

Analisi complesso MPF (ciclina B+ CdK 1). Il complesso MPF è responsabile delle modificazioni che
caratterizzano la profase della mitosi, è quindi tale complesso a fare entrare il sistema in mitosi. Si nota dalla
figura che l’attività di MPF cessa bruscamente quando distruggo la ciclina B. E’ nella transizione tra metafase ed
anafase che è necessario degradare la ciclina, in caso contrario la cellula resterebbe in metafase per un certo
lasso di tempo fino a quando il fuso non si disgregherebbe  Risultato: 1 cellula 4n (ha duplicato il DNA ma
non si è divisa).

In generale MPF non regola


attivazione di geni, ormai la
cellula deve entrare in divisione,
ma induce modificazioni
strutturali.

Le lamine tengono
legata la cromatina,
la carica negativa
del fosfato si
respinge con la
carica negativa della
cromatina e questa
si distacca.
GLI ELEMENTI DEL CITOSCHELETRO: MICROTUBULI, FILAMENTI INTERMEDI E MICROFILAMENTI

La mitosi è l’esecuzione di un meccanismo che prevede la sintesi di una serie di strutture e la disgregazione di altre,
per mettere alla cellula di dividersi. Tutti i componenti cellulari, dalle membrane al reticolo fino al Golgi devono
disgregarsi in vescicole affinché l’interno della cellula sia liquido. Anche i mitocondri cambiano morfologia. Si assiste,
infatti, alla clearance del citoplasma.
La cellula deve essere liquida al suo interno affinché si possa permettere alle fibre del fuso di non incontrare ostacoli
durante la migrazione dei cromosomi.
Cambia anche la geometria della cellula: se si osserva una cellula in coltura, che sta per iniziare la mitosi, si nota
chiaramente che ha acquisito conformazione sferica. L’acqua al suo interno, che prima era più o meno immobilizzata
dai campi elettrici generati, ora è libera di muoversi e la cellula torna in condizioni di fluidità. Nel caso si verifichi
citodieresi tale fluidità, statisticamente garantisce una distribuzione omogenea dei vari componenti cellulari.
Sempre legati al programma di mitosi, sono i riarrangiamenti dei componenti del citoscheletro.

CITOSCHELETRO
Il citoplasma contiene una rete tridimensionale e dinamica di polimeri proteici, che costituiscono il citoscheletro.
Immagine slide. Immagine al microscopio a fluorescenza di una cellula priva di membrana (eliminata con
tensioattivi, saponi particolari) trattata con anticorpi contro componenti del citoscheletro marcanti con
fluorocromi diversi.
Il citoscheletro è responsabile del mantenimento e del cambiamento della forma cellulare e della disposizione degli
organelli.
Una funzione importante è quella di immobilizzare l’acqua. Essa non è libera di muoversi all’interno della cellula
perché immobilizzata da campi elettrici (c’è un certo valore di pH, i gruppi R degli aa. possono essere acidi o basici
ecc.).
I vari organuli, come i mitocondri, sono spostati da motori molecolari ATP-dipendenti, che utilizzano elementi del
citoscheletro come microtubuli o microfilamenti.
Esempio: Ruolo del citoscheletro per l’efficienza della glicolisi.
Dalle osservazioni sperimentali si è notato sia che una cellula è in grado di regolare la velocità di reazione
della glicolisi sia che una volta rotta la cellula, tale velocità diminuisce.
Questo perché il processo glicolitico è in parte influenzato dall’assemblaggio di elementi citoscheletrici.
I molti enzimi impiegati nella glicolisi, non si trovano liberi e separati gli uni dagli altri, ma vanno ad
assemblarsi per costituire un complesso sovramolecolare, chiamato complesso glicolitico, e a realizzare
l’effetto tunnel. Tale effetto consiste nel fare entrare la molecola di glucosio nel primo enzima, modificarlo e
non lasciare libero il prodotto ma indirizzarlo all’enzima successivo. Il prodotto è quindi immediatamente
captato dal secondo enzima. Così facendo la reazione si velocizza perché il secondo enzima non deve più
aspettare di interagire con il substrato, ma questo avviene in modo istantaneo.
La formazione del complesso è affidata ad elementi del citoscheletro  la cellula regola la velocità di
produzione del piruvato agendo sul citoscheletro.
Nei batteri tale complesso è piuttosto stabile e può anche essere isolato, negli eucarioti è altamente instabile
e non si hanno notizie di esperimenti che siano riusciti ad isolarlo.

Le componenti principali del citoscheletro sono i microfilamenti, i microtubuli e i filamenti intermedi. Microfilamenti
e microtubuli derivano dalla polimerizzazione di elementi sulla base di un supporto energetico fornito da ATP o da
GTP.

Microtubuli
I microtubuli hanno dimensioni nell’ordine dei nanometri e le subunità fondamentali che li costituiscono sono le
TUBULINE, proteine globulari appartenenti alla famiglia delle GTPasi (la polimerizzazione avviene per idrolisi di GTP).
Tubuline
La superfamiglia genica delle tubuline comprende almeno cinque famiglie: α, β, γ, δ, ε.
Sono proteine ubiquitarie e molto conservate: il flagello che permette il movimento dei batteri è costituito di
microtubuli così come le fibre del fuso mitotico e meiotico dell’eucariote. Le tubuline dei batteri funzionano
similmente a quelle degli eucarioti.
Le principali sono le tubuline α e le tubuline β. Entrambi legano GTP e così facendo formano un dimero α/β. La
polimerizzazione è legata all’idrolisi di GTP della subunità β, α mantiene sempre GTP legato. Un microtubulo è formato
da un insieme di polimeri α/β ( ).
La tubulina γ svolge un ruolo importante nella nucleazione dei microtubuli, l’inizio della polimerizzazione. Le tubuline
infatti si legano quando c’è una struttura già nucleata, la funzione dei centrioli come elementi di polimerizzazione di
microtubuli è legata al fatto che sono strutture in cui già si è verificata la fase di nucleazione.
La depolimerizzazione è legata allo scambio di GDP con GTP.

I microtubuli hanno una struttura orientata perché la subunità α non idrolizza GTP, dunque la parte in crescita è
all’estremità in cui c’è β. L’estremità che espone la subunità β è l’estremità (+) mentre l’estremità che espone la
subunità α è l’estremità (‐).
La depolimerizzazione avviene per smantellamento delle strutture β.
Funzioni:
I microtubuli hanno una funzione strutturale e contribuiscono al posizionamento ed al mantenimento della posizione
degli organelli citoplasmatici.
Sono gli elementi motori di ciglia e flagelli e sono i principali componenti dei macchinari di mitosi e meiosi.
A far collimare i fasci che andranno a comporre il fuso mitotico* ci pensano motori molecolari che si assemblano sui
microtubuli: le DINEINE e le KINESINE. Sono entrambi ATPasi ma si muovono in direzioni opposte, usano l’energia
liberata dall’idrolisi di ATP per cambiare forma e camminare sul microtubulo. Esistono diversi tipi di Dineine e
Kinesine, ma tutte condividono la capacità di legare qualcosa, come vescicole o mitocondri.
*Le fibre del fuso sono date da fasci di microtubuli tanto grandi da essere in parte visibili anche al microscopio ottico.

Microfilamenti
I microfilamenti derivano dalla polimerizzazione di un’ATPasi, l’ACTINA.
La regolazione dell’assemblaggio degli elementi citoscheletrici è affidata alle GTPasi della famiglia Rho.
Actina
La proteina actina si presenta in due geometrie diverse:
• La G-actina è la proteina globulare libera, non polimerizzata.
• La F-actina è la proteina polimerizzata che ha formato il filamento.
La F-actina, che non è altro che G-actina post-polimerizzazione, ha una struttura più compatta perché il microtubulo è
formato da filamenti doppi attorcigliati come una corda, che devono quindi essere in grado di esercitare delle forze.
L’actina ha ATP nel sito attivo, con la polimerizzazione avviene l’idrolisi e la proteina passa da una struttura aperta ad
una più rigida.
Il processo di polimerizzazione è più veloce rispetto a quello dei microtubuli; ci sono anche in questo caso le due
estremità. Estremità – è la prima actina con ADP, estremità + con ATP e quindi l’estremità in crescita.
Il filamento di actina avanza in una direzione perché la velocità di crescita
dell’estremità – è inferiore alla velocità di crescita dell’estremità +. In
generale le actine sono a polimerizzazione rapida e depolimerizzazione
lenta.
Funzioni:
L’actina è responsabile del movimento ameboide della cellula: polimerizza,
porta la membrana in avanti fino a quando tutta la cellula si stacca.
L’actina può poi legarsi ad altre proteine come le miosine, ed è il complesso
di acto-miosine che controlla la citodieresi.
Filamenti intermedi
I filamenti intermedi sono strutture di grandi dimensioni derivate dalla polimerizzazione di proteine filamentose che
non sono né GTPasi né ATPasi. Le proteine che costituiscono i filamenti intermedi non sono del tutto uguali ma hanno
sequenze altamente ripetute di amminoacidi che consentono la formazione di complessi quaternari. Danno luogo ad
un alto meccanismo di polimerizzazione, si intrecciano tra di loro per dar luogo a strutture più grandi.
Principali classi di proteine che formano filamenti intermedi:

• Cheratine. Esistono diversi tipi di cheratine, in generale formano strutture rigide. Si trovano nelle cellule
epiteliali e derivati (unghie, peli). Non dimenticatevi che sono anche nel corno del bue!!!!!
• Vimentine. Si trovano nelle cellule mesenchimali (fibroblasti, endotelio), cellule muscolari, astrociti, cellule di
Schwann, neuroni del SNP.
• Proteine dei neurofilamenti. Si trovano in neuroni, cellule muscolari.
• Lamine nucleari. Vanno a costituire il rivestimento interno della membrana nucleare.

Il fatto che queste proteine condividano sequenze amminoacidiche sottolinea ancora una volta che:
Strutture complesse che la cellula riesce a realizzare non sono il risultato di tanti geni completamente diversi, ma
spesso di adattamento di un gene preesistente. Funzioni complesse della cellula non sono dovute alla scoperta di
nuovi geni ma adattamento di qualcosa che c’era prima.

MITOSI
Nel ciclo cellulare la M può solo rappresentare la mitosi e non la meiosi. Questo perché le cellule derivanti dalla meiosi
non entrano in G1, sono cellule aploidi, incomplete che se non avviene la fecondazione andranno a degenerare. Con la
fecondazione originano qualcosa di nuovo, con un nuovo genoma. Esse non danno luogo ad un ciclo.
La mitosi è tipica di tutte le cellule, sia somatiche che germinali (è sbagliato affermare che le cellule geminali si
dividano per meiosi e che le cellule somatiche si dividano per mitosi. Le cellule geminali, come gli spermatogonii nella
gonade maschile, aumentano di numero con la mitosi. L’esecuzione del programma di meiosi avviene nelle cellule che
sono predisposte a farlo, quelle che dovranno diventare sparmatocita e ovocita).
Scopo della mitosi: ripartire il DNA in due parti assolutamente uguali.
La mitosi mantiene la ploidia della cellula portando alla formazione di due nuclei con lo stesso DNA (o due cellule
figlie).
Ciò che non è ripartito è la quantità di proteine ( lo sviluppo embrionale è dovuto ad una differente distribuzione di
proteine di regolazione).
Fine della mitosi: formazione dei due nuclei. La mitosi è una divisione nucleare.
L’esecuzione del programma di mitosi comporta la formazione di elementi specializzati del citoscheletro ma anche
smantellamento dei vari organuli. Questo comporta variazioni nella forma della cellula: forma appiattita solita 
forma semisferica.
Lo smantellamento delle strutture interne avviene anche perché a seguito della citodieresi si devono ottenere due
cellule identiche. La ripartizione del citoplasma si verifica su base statistica, più fluido è l’ambiente interno più la
suddivisione avviene al 50%. Se tale divisione non avviene in modo omogeneo è probabile che una delle due cellule
figlie muoia perché non ha quantità sufficienti di particolari strutture.
La progressione mitotica è associata a variazioni dinamiche della morfologia e del movimento dei cromosomi che si
realizzano in 4 FASI:
1. PROFASE
2. METAFASE
3. ANAFASE
4. TELOFASE

Modificazioni dell’involucro nucleare durante la


mitosi
(vedi stelle)

Profase
I centrioli che erano stati duplicati subiscono una
variazione, si attivano e migrano ai poli opposti della cellula. Cominciano a polimerizzare i microtubuli, che vengono
collimati in fasci sempre più grossi e diretti verso l’interno della cellula (i centrioli sono presenti anche nelle altre fasi
del ciclo ma sono inattivi).
La formazione del fuso non incontra ostacoli perché si è già conclusa la chiarificazione del citoplasma, l’acqua che era
immobilizzata è libera e la cellula acquisisce fluidità.
Con la fosforilazione delle lamine la cromatina è sganciata e le membrane nucleari scompaiono. Anche i pori nucleari
sono disassemblati e prima di essere riposizionati sono inclusi nella regione cromosomica del centromero. Si
fosforilano anche condensine che permettono la condensazione della cromatina in cromosomi.
La profase mitotica, in cui essenzialmente si formano i cromosomi, è semplice e breve rispetto alla profase meiotica:
è molto più lunga e complessa, divisa in sottofasi. Non si verifica la condensazione della cromatina ma una
decondensazione. Leptotene: fase che richiede tempo, durante la quale avviene la depolimerizzazione
completa. La cromatina viene depolimerizzata e i filamenti si appaiano punto per punto. A seguito c’è la fase
chiamata zigotene e poi una decondensazione, ricompaiono le strutture dense formate da 4 cromatidi,
cromosomi omologhi appaiati nel centromero  tutto questo per permettere il crossing over.

Anafase
Consiste nel blocco della fosforilazione con successiva prevalenza del meccanismo di defosforilazione. Mano a mano
che i cromatidi sono allontanati e viaggiano verso i poli opposti, su di essi si ricostituiscono le membrane nucleari.

I cromosomi
Si sta cominciando a chiarire come un lungo filamento di DNA genomico sia
compattato in un cromosoma mitotico.
I cromosomi mitotici di cellule HeLa umane sono costituiti principalmente da fibre di
cromatina irregolari piuttosto che da fibre di 30 nm.
Il cromosoma mitotico sembra costituito da fibre irregolarmente disposte, con una
natura frattale, che permette un’organizzazione del genoma più dinamica e flessibile
di quanto sarebbe consentito dalle strutture regolari statiche.
La specificità con cui le fibre del fuso legano il centromero può essere spiegato dal
fatto che a tale livello ci sia una cromatina particolare; i nucleosomi centromerici
differiscono dai nucleosomi convenzionali perché:
• Sono formati da tetrametri;
• Hanno un istone centromero (CenH3) al posto del canonico istone H3.
Diverse modalità d’attacco dei microtubuli ai cinetocori
Aggancio corretto: i due cinetocori sono legati a microtubuli
provenienti dai poli opposti, in questo caso il sistema è posto in
trazione e tale tensione attiva certi tipi di proteine (es. kinasi
Aurora) che comportano la separazione dei cromatidi fratelli.
Aggancio sbagliato: la mitosi non prosegue.
Focus Anafase
L’anafase si compone di due fase:
1. La prima fase comporta l’attivazione di enzimi che taglieranno il cromosoma in cromatidi.
2. La seconda fase comporta movimenti attivi con i quali i centrioli si sposteranno e porteranno con sé tutto il
sistema.

La mitosi finisce con la formazione di due nuclei, a seconda di quale sia la predisposizione del citoplasma può avvenire
o non avvenire la citodieresi. Una cellula che vuole fare citodieresi ha reso il suo citoplasma il più fluido possibile per
ripartirlo in modo omogeneo nelle cellule figlie. L’anello contrattile che provoca la strozzatura è costituito di actina e
miosina.

Fallimento del processo di mitosi


Il fallimento del processo di mitosi è un evento possibile, ad esempio nel caso in cui le fibre non abbiano agganciato
bene i centromeri. Il fallimento della mitosi genera cellule con anormale numero di cromosomi che possono diventare
tumorigene e che quindi debbono essere rimosse dalla popolazione per evitare la formazione del cancro.

Differenze tra mitosi e meiosi


Nel processo di mitosi l’aggancio
dei cromatidi avviene
singolarmente. Anche se un
cromosoma reca un danno, ad
esempio è mancante di un
pezzo, la mitosi prosegue e
questo provoca gravi danni a
seguito di molte mitosi. Nel caso
della meiosi invece il preciso
appaiamento tra cromosomi
omologhi rappresenta un filtro
di integrità. Una cellula che reca
delezione su un cromosoma non
completerà meiosi perché
l’appaiamento punto per punto
non riesce.