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Vidrio. Este fue el sustrato original debido a sus propiedades ópticas y carga de superficie,
pero ha sido reemplazado en la mayoría de los laboratorios por plástico (generalmente
poliestireno), que tiene una mayor consistencia y propiedades ópticas superiores. Ahora el
vidrio se usa raramente, aunque es barato, se lava fácilmente sin perder sus propiedades
de soporte del crecimiento, se puede esterilizar fácilmente por calor seco o húmedo, y es
ópticamente transparente. El tratamiento con álcali fuerte (por ejemplo, NaOH o
detergentes cáusticos) hace que el vidrio sea insatisfactorio para el cultivo hasta que se
neutralice con un lavado con ácido (consulte la Sección 10.3.1). El vidrio de alta calidad
óptica es alcalino y, a menudo, tiene un alto contenido de plomo, lo que puede reducir el
crecimiento celular, por lo tanto, es posible que los portaobjetos y los cubreobjetos deban
lavarse con ácido y / o recubrirse para obtener mejores resultados (consulte la Sección
7.2.1).
Metales. Las células se pueden cultivar en discos de acero inoxidable [Birnie & Simons,
1967] u otras superficies metálicas [Litwin, 1973]. La observación de las células en un
sustrato opaco requiere microscopía de interferencia de superficie, a menos que se utilicen
películas metálicas muy finas. Westermark [1978] desarrolló un método para el crecimiento
de fibroblastos y glía en paladio. Utilizando equipos de microscopía electrónica de
sombreado, produjo islas de paladio en agarosa, que no permiten la unión celular en medios
fluidos. El tamaño y la forma de las islas se determinaron mediante máscaras hechas por
fotograbado y el paladio se aplicó a la sombra al vacío, tal como se utiliza en la microscopía
electrónica. Porque la capa era muy delgada, se mantuvo transparente.
7.2 SUPERFICIES TRATADAS
7.2.1 Recubrimiento de sustrato
Acondicionamiento. La unión celular y el crecimiento pueden mejorarse mediante el
tratamiento previo del sustrato [Barnes et al., 1984a]. Una pieza bien establecida en el
cultivo de tejidos dice que la cristalería usada apoya el mejor crecimiento que la nueva
[Paul, 1975]. Si eso es cierto, puede deberse a un grabado de la superficie o pequeños
rastros de residuos que quedan después del cultivo. El crecimiento de células en un matraz
también mejora la superficie para una segunda siembra, y este tipo de acondicionamiento
puede deberse al colágeno, fibronectina u otros productos de la matriz [Crouch et al., 1987]
liberados por las células. El sustrato también se puede acondicionar tratándolo con medio
gastado de otro cultivo [Stampfer et al., 1980], con suero o con fibronectina o colágeno
purificados (ver Protocolo 22.9).
El colágeno también se puede aplicar como un gel sin desnaturalizar (ver Sección 16.7.3),
un tipo de sustrato que se ha demostrado que apoya el crecimiento de neuritas en los
ganglios de la columna vertebral [Ebendal, 1976] y la diferenciación morfológica de las
células mamarias [Nicosia y Ottinetti, 1990 ; Berdichevsky et al., 1992] y hepatocitos [Sattler
et al., 1978; Fiorino et al., 1998], y para promover la expresión de funciones específicas del
tejido de varias otras células in vitro (por ejemplo, queratinocitos [Maas-Szabowski et al.,
2002]; ver la Sección 23.1.1). Diluir el colágeno concentrado 1:10 con medio de cultivo y
neutralizarlo a pH 7,4 hace que el colágeno se gelifique, por lo que la dilución y la
dispensación deben ser rápidas. Es mejor agregar el medio de crecimiento al gel durante 4
a 24 h más para garantizar que el gel se equilibre con el medio antes de añadir las células.
En esta etapa, se puede agregar al medio fibronectina (25–50 μg / mL) o laminina (1–5 μg /
mL), o ambos se pueden añadir al medio.
mata
Matrices. Los matrices disponibles comercialmente (consulte la Tabla 7.1), como Matrigel
™ (Becton Dickinson) del sarcoma de Engelbreth – Holm – Swarm (EHS), contienen laminina,
fibronectina y proteoglicanos, con predominio de la laminina (ver también la Sección
16.7.3). Otros productos de matriz incluyen Pronectina F (Protein Polymer Technologies),
laminina, fibronectina, vitronectina entactina (UBI), heparan sulfato, EHS Natrix (BD
Biosciences), ECL (US Biological) y Cell-tak (BD Biosciences). Algunos de estos productos se
purifican, si no están completamente definidos químicamente; otros son una mezcla de
productos de matriz que han sido mal caracterizados y también pueden contener factores
de crecimiento unidos. Si el objetivo principal es la adhesión celular para la supervivencia y
los sustratos definidos son inadecuados, el uso de estas matrices es aceptable, pero si se
están realizando estudios mecanísticos, solo pueden ser una etapa intermedia en el camino
hacia un sustrato completamente definido.
Las botellas de vidrio deben tener (1) una superficie razonablemente plana, (2) un tapón
de rosca profundo con un buen sellado y un forro no tóxico, y (3) hombros con poca
pendiente para facilitar la recolección de las células en monocapa después de la
tripsinización y para mejorar la eficiencia del lavado.
Si necesita rendimientos de células grandes (por ejemplo, carcin 1 × 10^9 células HeLa de
carcinoma cervical o 2 × 10^8 diploides MCR-5 humanos fibroblastos), y luego aumentar el
tamaño y el número de botellas convencionales se vuelve engorroso, y se requieren vasos
especiales. Frascos con superficies onduladas (Corning, Becton Dickinson) o matraces de
varias capas (Corning, Nunc) ofrecen un paso intermedio para aumentar el área de la
superficie (Fig. 7.6). Los rendimientos celulares más allá de eso requieren grandes
superficies múltiples propagadores o botellas de rodillos en bastidores especiales (consulte
la Sección 26.2.2). Aumentar el rendimiento de las células que crecen en suspensión solo
requiere que se aumente el volumen del medio, siempre que las células en cultivo profundo
se mantengan agitadas y rociadas con 5% de CO2 en el aire (consulte la Sección 26.1). Si
necesita rendimientos de células grandes (por ejemplo, carcin 1 × 10^9 células HeLa de
carcinoma cervical o 2 × 10^8 MCR-5 diploides humanos fibroblastos), y luego aumentar el
tamaño y el número de botellas convencionales se vuelve engorroso, y se requieren vasos
especiales. Frascos con superficies corrugadas (Corning, Becton Dickinson) o frascos de
varias capas (Corning, Nunc) ofrece un paso intermedio para aumentar el área de superficie
(Fig. 7.6). Los rendimientos celulares más allá de eso requieren grandes propagadores
multisuperficiales o botellas de rodillos en bastidores especiales (consulte la Sección
26.2.2). Aumentar el rendimiento de las células que crecen en suspensión solo requiere que
se aumente el volumen del medio, siempre que las células en cultivo profundo se
mantengan agitadas y rociadas con 5% de CO2 en el aire (ver Sección 26.1).
7.3.3 Desfogue
Las placas Multiwell y Petri, elegidas para el muestreo o clonación por duplicado, tienen
tapas de ajuste holgado para facilitar el acceso al plato. Por consiguiente, no están sellados
y requieren una atmósfera húmeda con la concentración de CO2 controlada (consulte la
Sección 8.2.2). Como se puede formar una capa delgada de líquido alrededor del interior de
la tapa, sellando parcialmente algunos platos, se deben usar tapas ventiladas con soportes
de plástico moldeado en el interior (Fig. 7.8a, flecha). Si se requiere un sello perfecto,
algunos platos de varios pocillos se puede sellar con película autoadhesiva (ver Apéndice II:
Selladores de placas). Los matraces pueden ser ventilados aflojando las tapas una vuelta
completa, cuando se encuentran en una incubadora de CO2, para permitir que el CO2 entre
o para permitir que el exceso de CO2 se escape en el exceso de líneas celulares productoras
de ácido. Sin embargo, son preferibles los casquillos con filtros permeables que permitan el
equilibrio con la fase gaseosa, ya que permiten Difusión de CO2 sin riesgo de contaminación
(Fig. 7.8b). Las tapas sólidas, o "tapones", todavía deben usarse en una incubadora o sala
caliente que no sea CO2.
7.3.6 Costo.
El costo siempre tiene que ser equilibrado contra la conveniencia; por ejemplo, las placas
de Petri son más baratas que los matraces con una superficie equivalente, pero requieren
condiciones húmedas y controladas con CO2 y son más propensas a las infecciones. Sin
embargo, son más fáciles de examinar y procesar. Las botellas de vidrio de soda baratas,
aunque no siempre son de buena calidad óptica, a menudo son mejores para el cultivo que
el Pyrex de grado superior, o el vidrio ópticamente transparente, que generalmente
contiene plomo. Una desventaja importante del vidrio es que su preparación requiere
mucho trabajo, ya que debe lavarse y reesterilizarse cuidadosamente antes de poder
reutilizarse. La mayoría de los laboratorios ahora usan plástico. Por su comodidad, claridad
óptica y calidad.
7.4 Sistemas especializados.
7.4.1 Soportes permeables.
Las membranas semipermeables se utilizan como sustratos permeables a los gases y
también permitirán el paso del agua y las moléculas pequeñas (<500–1000 da), una
propiedad que se explota en algunos biorreactores a gran escala (consulte las Secciones
25.3.2, 26.2.5). El crecimiento de células en un sustrato permeable al agua aumenta la
difusión de oxígeno, CO2 y nutrientes. La unión de las células a un sustrato natural como el
colágeno puede controlar la expresión fenotípica debido a la interacción de los receptores
de integrinas en la superficie celular con sitios específicos en la matriz extracelular (consulte
las Secciones 2.2.1, 2.2.3, 16.7.3). El crecimiento de células en colágeno flotante
[Michalopoulos y Pitot, 1975; Lillie et al., 1980] se ha utilizado para mejorar la supervivencia
de las células epiteliales y promover la diferenciación terminal (ver Secciones 16.7.3,
25.3.8).
Filtrar los pozos. La permeabilidad de la superficie a la que está anclada la célula puede
inducir polaridad en la célula simulando la membrana basal. Dicha polaridad puede ser vital
para la expresión funcional completa en epitelios secretores y muchos otros tipos de células
[Gumbiner y Simons, 1986; Chambard et al., 1987; Artursson & Magnusson, 1990; Mullin et
al., 1997]. Los soportes permeables están disponibles en forma de insertos de pozos de
filtro desechables de diferentes tamaños, materiales y porosidades de membrana (consulte
el Apéndice II: Insertos de pozos de filtro). También están disponibles los insertos
recubiertos previamente con colágeno, laminina u otros materiales de matriz (por ejemplo,
Matrigel, BD Biosciences). Las inserciones de los filtros se han utilizado ampliamente en
estudios de interacción célula-célula, interacción célula-matriz, diferenciación y polaridad,
permeabilidad transepitelial y modelado de tejidos (ver Sección 25.3.6).