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Métodos de 1 proteína
purificação isolada
Gel Filtração
• Medidas do conteúdo proteico (diversos)
- absorbância de luz UV de 280 nm
1 Proteína apenas - métodos colorimétricos
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
Absortividade molar, e
Comprimento de onda
O gráfico mostra o espectro de absorção de luz UV dos aminoácidos aromáticos Trp, Tyr ou Phe.
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
tecidos
Homogenado
Material
ou
Extrato bruto de
por pressão liquefação partida
(prensa francesa) (Potter)
Sendo a proteína de interesse detergente micelas
uma proteína de membrana, é
necessário solubilizá-la. Para
esse fim são utilizados
detergentes, que dissolvem a
Dependendo da concentração
membrana plasmática e
formando complexos solúveis
com as proteínas.
Proteínas
Complexos
integrais da
Detergentes podem ser membrana
não micelares
Detergentes iônicos
Detergentes
não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide
SDS
Octilglicosídeo
Dodecil sulfato de Deoxicolato de sódio (octyl-b-D-glucopyranoside)
sódio
A centrífuga
Amostra A centrifugação frequentemente é uma das primeiras
Câmara blindada sedimentando
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através
do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força
centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-
nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme
a técnica.
rotor
ângulo Através de sucessivas etapas de centrifução com
fixo
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-
se obter diferentes frações de um homogenado de células
ou tecidos.
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Centrífuga Ultracentrífuga
(necessitam vácuo
Clínica para evitar atrito do ar,
além de refrigeração)
Ficoll-Hypaque leucócitos
Sacarose mitocôndrias
Cloreto de césio ácidos nucléicos
As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por: O gráfico ao lado ilustra o efeito de
- adição de sais (Precipitação salina) diferentes sais sobre a solubilidade
- adição de solventes da hemoglobina.
- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
Em baixa concentração salina, a
solubilidade das proteínas aumenta,
Salting-in X Salting-out
NaCl pois os íons do sal ajudam a reforçar
a camada de solvatação.
Solubilidade da hemoglobina (S/S’)
KCl
Em alta concentração salina, a
solubilidade das proteínas diminue
MgSO4 pois os íons do sal competem pelas
moléculas de água disponíveis para
formar a sua própria camada de
(NH4)2SO4 solvatação.
Proteína P.I.
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI
Pepsina <1,0 tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam
Ovalbumina galinha 4,6 a camada de solvatação menos organizada.
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Constante Momento
Gama-globulina 6,6
Solvente
Dielétrica Dipolar
Colágeno 6,6 Água 78.5 1.85
Mioglobina equina 7,0 Dimetilformamida 48.9 3.96
Hemoglobina humana 7,1
Metanol 32.6 1.66
Etanol 24.3 1.68
Ribonuclease A bovina 7,8
Acetona 20.7 2.72
Citocromo C equino 10,6
Clorofórmio 4.8 1.15
Histona bovina 10,8 Benzeno 2.3 0.00
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação
das proteínas.
solvente
Ao precipitado obtido com variação
de pH, retornar ao pH original.
solução a
ser dialisada
início final
Dt
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as
etapas iniciais de purificação de
Lisossomos proteínas, como a centrifugação
Mitocôndria diferencial e precipitação
SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi fracionada.
Núcleo
Precipitação com Sal/Solvente Esses métodos, apesar de terem
baixo poder de resolução (exploram
diferenças grosseiras entre as
F1 F2 F3 F4 proteínas), permitem processar
Precipitação com Sal/Solvente grandes volumes ou massas, típicos
das etapas iniciais de isolamento.
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
Quando já houve redução significa-
Cromatografia Troca Iônica
tiva dos montantes de proteínas a
serem processados, iniciam-se as
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N cromatografias, que irão explorar as
Cromatografia Troca Iônica diferenças mais sutis entre as
(pH ou resina diferente)
moléculas.
F 2 .3.N.X
Não esquecer que todas as frações
Gel Filtração obtidas devem ter o conteúdo de
proteínas e de atividade biológica
1 Proteína apenas medidos, para se decidir qual/quais
deverão passar para o passo
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
seguinte da purificação.
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo zero Tempo 1 Tempo 2 Tempo n
Amostra com
diferentes Líquido
componentes Componentes da que sae
Mais tampão é
amostra se da coluna
colocado na
Resina separam e saem é
coluna,
embebida da coluna com recolhido
forçando os
em diferentes em tubos
componentes
tampão volumes de de um
da amostra a
tampão coletor de
interagirem
frações
com a resina
Concentração
• massa molecular
• carga elétrica Um cromatograma, como o
• solubilidade gráfico ao lado, é a maneira
• afinidade usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia. Tempo ou volume
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
Moléculas com massas diferentes
proteína grande
proteína pequena
Fluxo do tampão
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina
Ler a massa
Absorbância a 280 nm
correspondente
20 40 60 80 100 120 mL
Medir o volume de eluição volume
25 50 75 100 125 mL da fração mais ativa.
volumeKav
de eluição Transportar para a curva de
calibraçao.
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo
de moléculas ou partículas a serem separadas
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de
gel-filtração.
DEAE CM
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
Cromatografia de troca iônica
---
-
-
-
O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla
faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de
10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições
em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou +
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): +
+ +
+
+
+ + +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: ++
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a Moléculas com a mesma carga,
mesma carga; ou sem carga, não interagem com a resina,
2) eluição das proteínas adsorvidas. sendo as primeiras a sair da coluna
Eluição
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
+
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a +
interação entre as proteínas e a resina. +
+
+
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da Na+Cl- + +
++
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
_ (+)
(-) =
+
_ = Não retidas +
Não retidas
+
Carboximetil~celulose Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de cátions) (trocadora de ânions)
Tipos de Resina de troca Iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1
Tipos de
Fortemente básica
Resina de troca
Ø - CH N (CH )
Iônica
+ Troca aniônica
2 3 3
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3-H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração
básico - CH 2CH 2N+(C2H 5)2 e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH 2COOH e troca iônica de proteínas
básicas e neutras
Passo 2. Acoplar
o ligante
Molécula-alvo (analito)
ligante
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade
diferentes, um polar e outro apolar.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença
de solvente orgânico.
Duas Possibilidades
- Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel
- Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária
AMOSTRAS
tempo 0 t1 t2 tn
Papel direção do
ou placa fluxo do
de sílica solvente distância de migração da substância
Rf =
Amostra Compostos distância de migração do solvente
na origem separados
Detector
Controle e
análise dos Duas bombas permitem eluição em gradiente
dados
Moléculas
Absorbância a 214 nm
Moléculas 100
não retidas retidas
% de acetonitrila
Tempo ou volume de retenção
Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila
3. adicionar detergente
camada de
H2O
[Proteína]
solvatação
Força da interação hidrofóbica aumenta com o [sal]
tamanho da cadeia de C na resina:
Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8) volume
c Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação
d Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.
Uma tabela como a vista acima é a maneira usual de se descrever o resultado de uma
purificação. No exemplo acima, a mesma proteína foi isolada por duas “marchas” diferentes de
purificação (A e B). Observe os parâmetros de purificação.
Se você fosse que repetir essa purificação, qual esquema de purificação escolheria ?
A porção hidrocarboneto do
detergente interage com as
regiões hidrofóbicas da proteína,
dispondo o grupo sulfato
carregado na superfície, em
contacto com o meio aquoso. A
repulsão entre os grupos fosfato
desestabiliza os laços não
covalentes que mantém a
estrutura 3D da proteína,
desnaturando-a. Efeito do SDS
• desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através
dos poros da poliacrilamida;
• mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas
migrem para o anôdo;
• facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
Padrões
A
ss
B
AB
2 - Mercaptoetanol
A A
SH SH
B B
Sem Com
massa molecular. Mr
(-) 97.4
Mobilidade relativa =
87.0
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida
45.0
29.0
21.0
12.5
Mobilidade relativa (+) 6.5
Curva de calibração de SDS-PAGE
Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Uma boa semana de estudos!!
BIOTECNOLOGIA II