INFORME CUARTA PRACTICA

Viernes 20 de septiembre
2018-2

Determinación de la actividad enzimática de la fosfatasa ácida frente a la

variación de diferentes factores.

Gabriel Romeroa,, Juan Villalobosb,

a Universidad de la Sabana, estudiante de Ingeniería Química 4to semestre, código 0000160308

b Universidad de la Sabana, estudiante de Ingeniería Química 4to semestre, código 0000161811

Información del articulo Resumen

Palabras claves:
Fosfatasa ácida
Actividad enzimática
Temperatura óptima
pH óptimo
Velocidad máxima
Presencia de inhibidor
Tiempo de incubación
Saturación
Michaelis-Menten
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones biológicas. La funcionalidad
de las enzimas está directamente relacionada con los cambios en el ambiente, y,
por tanto, esta puede ser fácilmente alterada al variarse las condiciones en las que
se encuentre trabajando la enzima. [1]
La pérdida de estabilidad enzimática es causada por factores físicos, químicos o
biológicos, que pueden llevar a procesos como la desnaturalización. [1]
En está práctica se determino la actividad cinética de la fosfatasa ácida al variar
diversos factores que afectan el funcionamiento de está, como lo son la presencia
de inhibidores, la temperatura, la concentración de sustrato, etc.

1. Objetivos. conformar una socialización de resultados al

finalizar cada procedimiento.
1.1 Objetivo General. 2.1 Preparación de la curva de calibración de
- Identificar factores experimentales que resultan fósforo inorgánico: Este procedimiento se llevó a
críticos para la estimación de los parámetros de cabo con los siguientes volúmenes de reactivos.
actividad cinética de la enzima Fosfatasa ácida. Tubo Patrón de Agua Ácido
Fósforo de 0,04 (mL) Molíbdico
1.2 Objetivos Específicos. mg/mL (mL)
- Determinar la velocidad de reacción de la
B - 4 0,5
fosfatasa ácida en distintas condiciones.
1 0,1 3,9 0,5
- Estimar los parámetros cinéticos Km y Vmáx a
partir de datos experimentales. 2 0,2 3,8 0,5
3 0,3 3,7 0,5
2. Metodología 4 0,4 3,6 0,5
Esta práctica se desarrolló por medio de estaciones 5 0,5 3,5 0,5
las cuales tenían un constante movimiento alterno
con los demás compañeros de grupo para así

 Corresponding author. Tel.: +57 319 3878303; e-mail: gabrielrosa@unisabana.edu.co

 Corresponding author. Tel.: +57 319 5706645; e-mail: juanvilmor@unisabana.edu.co
 Tabla N°1. Volúmenes de reactivos utilizados en la preparación de la
curva de calibración 2.5 Efecto de la concentración de la enzima en la
velocidad de reacción: La concentración de la
2.2 Determinación del tiempo óptimo de incubación:
enzima para cada tubo se determino mediante la
El tiempo óptimo de incubación se determinó por medio
siguiente tabla.
de los siguientes volúmenes.
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
La siguiente tabla ilustra los valores de absorbancia
obtenidos a una longitud de onda de 660 nm. Buffer 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
(ml)
Tubo Buffer β-glicero Agua Extracto Sustrato – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
citrato 0.1 fosfato de (ml) enzimático (ml)
Agua (ml) 0.8 0.4 0.4 0.35 0.30 0.25 0.10 –
Mezcle bien los tubos y agregue
M de pH sodio (ml) (ml)
5.3 (ml)
Tabla N°7. Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de concentración de la
Blanco 5.6 – 2.4 – enzima
buffer (BB)
Blanco 5.6 1.6 0.8 – No obstante, en este caso la concentración de la
sustrato
(BS)
enzima fue diferente con respecto a las anteriores, por
Blanco 5.6 – 1.6 0.8 lo tanto, se utilizaron los siguientes valores:
enzima (BE)
Enzima
Tiempo 5.6 1.6 – 0.8 (µl)
– – 400 50 100 150 300 400
reacción
(TR) Tabla N°8.Concentracion de la enzima
Tabla N° 2. Volúmenes de reactivos para la prueba de tiempo optimo
2.6 Efecto de la concentración de sustrato,
2.3 Efecto del pH, determinación del pH optimo: Los determinación de la constante de Michaelis (Km):
volúmenes utilizados para en la prueba del pH optimo Las concentraciones de sustrato se pueden identificar
son los que se muestran en la siguiente tabla: a continuación.
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
Sustrato – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Buffer 1.4 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.0
(ml) (ml)
Buffer 2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 sustrato – 0.8 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8
(ml) (mL)
{s} mM – 100 – 5 10 20 40 60 80 100 100
pH del 5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2
buffer Agua 0.6 – 0.4 – – – – – – – –
(ml)
Tabla N° 3. Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de pH óptimo
Tabla N°9.Volumenes de reactivos para la determinación del efecto de la
La concentración de la enzima en cada tubo fue de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción
siguiente manera. La concentración de la enzima en cada tubo fue de la
Enzima – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 siguiente manera.
(ml) Enzima – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
(ml)
Tabla N°4. Concentración de la enzima en cada tubo
Tabla N°10.Concentracion de la enzima

2.4 Efecto de la temperatura, determinación de la 2.7 Efecto de la presencia de un inhibidor en la

temperatura optima: Los volúmenes utilizados para velocidad de reacción:
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
cada tubo en la prueba del efecto de la temperatura.
Buffer 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 0.8
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
(ml)
Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 sustrato – 0.8 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8
(mL)
Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 {s} mM – 100 – 5 10 20 40 60 80 100 100
Agua (ml) 0.6 0.2 0.4 – – – – – Agua 1.0 – 0.4 – – – – – – – –
Temperatura (°C) 18 18 18 0 18 37 60 92 (ml)
Inhibidor – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Tabla N°5.Volumenes de reactivos utilizados en prueba de temperatura optima (ml)
La concentración de enzima en cada tubo fue de la
Tabla N°11. Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la
siguiente manera. concentración del sustrato con inhibidor en la velocidad de reacción
Enzima – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Los resultados de cada una de las metodologías se
(ml) presentarán en la sección de discusión de resultados.
Tabla N°6. Concentración de la enzima en cada tubo
3. Discusión de resultados: Tubo Grupo 3 Grupo 4
Conforme se recolectaron los datos de cada uno de Be (2 min) 2,086 0,492
los grupos, se procedió a su análisis. Be (5 min) 2,056 0,519
Curva de calibración: Los valores implicados en la Be (10 min) 2,009 0,575
representación de esta curva de calibración fueron
Be (15 min) 2,006 0,613
aquellos que presentaron el mejor comportamiento
Be (20 min) 1,609 0,582
lineal, es decir, aquellos que, al momento de realizar la
Be (30 min) 2,024 0,497
regresión lineal, obtuvieron el valor más cercano a 1 del
Bs (30 min) 2,06 0,453
R2.
En la siguiente tabla se pueden identificar los valores Tr (2 min) 1,996 0,943
recolectados por los grupos, los valores seleccionados Tr (5 min) 2,006 0,753
fueron los del grupo N°7. Tr (10 min) 1,987 0,771
Tubo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Tr (15 min) 1,873 0,924
7 4 6 2 3 Tr (20 min) 2,022 1,265
1 0,089 0,105 0,146 0,246 0,004 Tr (30 min) 2,065 0,811
2 0,189 0,797 0,296 0,327 0,185 Tabla N°13. Resultados del tiempo de incubación

3 0,272 0,273 0,355 0,387 0,286 El tiempo de incubación es importante durante una
4 0,369 0,369 0,411 0,471 0,37 reacción catalizada por una enzima, debido a que, con
5 0,524 0,452 0,51 0,514 0,474 un tiempo mayor o menor al adecuado para la enzima,
se puede presentar un comportamiento menor al
Tabla N°12. Resultados de la curva de calibración
esperado o incluso puede que no se pueda realizar una
En donde la ecuación de la grafica permite identificar la
correcta toma de datos, por la baja producción que se
concentración de fosforo en las muestras implicada
puede presentar una vez se ha pasado el tiempo
posteriormente.
óptimo. En esta sección se decidió realizar un promedio
𝑦 = 1,05𝑥 − 0,0264
Ecuación N°1. Ecuación de la grafica
a los datos obtenidos debido a que se encontró que los
Además, el valor de R cuadrado permite descartar los del Grupo 3 no son muy adecuados para graficar puesto
demás datos propuestos con anterioridad ya que no que se pasan del límite de 2 en los valores de
poseen exactitud con respecto al patrón de fósforo. absorbancia.
𝑅 2 = 0,9851 Grupo Grupo
Tubo Tiempo Promedio Velocidad
Ecuación N°2. Valor de R cuadrado 3 4
1 1,996 0,943 2 1,4695 0,14695
Patrón de Fósforo Vs Absorbancia 2 2,006 0,753 5 1,3795 0,13795
0,6
3 1,987 0,771 10 1,379 0,1379
0,5 y = 1,05x - 0,0264 4 1,873 0,924 15 1,3985 0,13985
Absrobancia

0,4 R² = 0,9851
5 2,022 1,265 20 1,6435 0,16435
0,3 6 2,065 0,811 30 1,438 0,1438
0,2 Tabla N°14. Promedio de los resultados del tiempo de incubación con el
cálculo de la velocidad.
0,1 Así mismo, la velocidad de la reacción se define como
0 la variación o generación de producto sobre la variación
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 del tiempo, o en el caso del sustrato, como la variación
Patron de fósforo (mg/ml)
Grafica N° 1. Curva de calibración o el consumo de sustrato sobre la variación del tiempo.
Tiempo de incubación óptimo: La actividad [2]
enzimática se puede determinar mediante el uso de En la gráfica se puede estimar que el valor de tiempo
intervalos de tiempo los cuales permitan el consumo donde se presentó una mayor velocidad fue a los 20
cuantitativo de substrato con un exceso de este en el minutos, después de este tiempo, la velocidad tiende a
medio, siguiendo la metodología los siguientes valores presentar un comportamiento que decrece.
por los siguientes grupos.
 4 0,939 1,684 0,948
Efecto del Tiempo 5 1,363 1,7 0,947
0,17 6 0,077 2,234 0,862
0,165 Tabla N°14. Resultados del pH
0,16 Cabe resaltar que un pH muy ácido o muy básico puede
Velocidad

0,155
afectar no solo las interacciones del sustrato con el sitio
activo, sino que también la estructura terciaria de la
0,15
misma puede tener daños en su estructura hasta su
0,145
desnaturalización, generando su desactivación y
0,14 evitando su correcto funcionamiento.
0,135
Efecto del pH
0 10 20 30 40 1,6
Tiempo

Grafica N°2. Estimación del tiempo óptimo
Con el fin de verificar el tiempo estimado, se encontró
en la literatura que el valor recomendado es de 15
minutos, [5] sin embargo, se encontró también que en
condiciones estándares de ensayo, el tiempo de
incubación puede subir hasta 20 minutos, y a partir de
este tiempo, la velocidad tiende a disminuir
considerablemente, [6] confirmando así el
comportamiento experimental obtenido para el tiempo.
Efecto del pH: La actividad enzimática de cualquier
enzima se ve afectada por el valor del pH en el medio,
ya que la carga neta de la proteína varia dada a su
naturaleza polieléctrica, No obstante, a cierto valor de
pH los aminoácidos participes en el sitio activo estarán
en condiciones óptimas para la actividad catalítica
sobre el sustrato correspondiente. La estabilidad que
presenta determinada enzima dentro de un rango de pH
se debe a el número de grupos cargados presentes en
la enzima, el cambio en la acidez o basicidad afecta las
cargas de estos grupos, alterando la estructura nativa
de la proteína, generando que esta se precipite o
desnaturalice, [1] lo que establece entonces un punto
de pH donde la velocidad va a ser la máxima posible, y
al variar el pH a partir de este punto hacia valores
menores o mayores de pH, la velocidad debería tender
a disminuir.
Los resultados obtenidos durante la práctica se pueden
identificar en la siguiente tabla mostrada a continuación.
tubo Grupo N° 5 Grupo N°6 Grupo N°7
BS 0,797 1,27
BE 0,872 1,247
1 1,087 1,433
2 0,948 1,481
3 1,022 1,636
Velocidad de reaccion
1,4
1,2
1
0,8
0,6
2 3 4 pH 5 6 7
Grafica N°3. Estimación del pH óptimo
En la anterior gráfica se puede observar que el punto
máximo de velocidad se alcanza en un pH cercano a 4,
lo que indicaría que manteniendo un buffer de 4 se
obtendría la velocidad de reacción más alta, claro esta
que esta sería manteniendo también el resto de los
factores constantes, así mismo, al consultar en la
literatura, se reporta que, para la fosfatasa ácida, el
rango de pH óptimo es varia de 3.8 a 6.8, [3] indicando
que el pH óptimo estimado experimentalmente,
concuerda con el comportamiento esperado, sin
embargo, en otra fuente se encontró que el pH
adecuado para la reacción catalizada por la fosfatasa
ácida es de 5.2, [4] es decir que, a pesar de haber
obtenido un valor dentro del rango teórico, este no
corresponde con el valor recomendado para el
funcionamiento de la enzima.
Temperatura óptima:
La actividad catalítica aumenta con el incremento de la
temperatura dentro de un determinado rango, al igual
que el pH cada enzima posee un comportamiento único
frente a estos valores, el punto en el cual alcanza la
0,374 máximo valor se conoce como temperatura óptima. Sin
0,491 embargo, todas las enzimas al ser sometidas a
0,883 temperaturas muy altas pueden perder la actividad en
1,471 su sitio activo y por lo tanto ser desnaturalizadas.
1,027
En la siguiente tabla se representan los valores Efecto de la concentracion de la enzima
obtenidos por cada grupo
0,16

Velocidad de reacción
Tubo Grupo 5 Grupo 4 Grupo 6 Grupo 7 0,14
0,12
BS 1,864 1,827 0,437 0,396

(mg/min)
0,1
BE 1,757 1,496 0,536 0,432 0,08
1 1,956 1,857 0,804 0,792 0,06
2 1,88 1,842 1,058 0,913 0,04
0,02
3 1,084 1,878 1,145 0,943
0
4 1,904 1,896 1,098 0,891 0 1 2 3 4 5 6
[S] (mM)
5 1,894 1,902 1,309 0,91
Grafica N° 5 Efecto de la enzima
Tabla N°16. Resultados del cambio de la Temperatura Efecto de la concentración del sustrato:
En este caso se seleccionaron los datos Al mantener la cantidad de la enzima constante y
proporcionados por el grupo N°7 debido a que estos comenzar a variar la concentración se sustrato
datos presentaron el comportamiento más apropiado, gradualmente, la velocidad de la reacción tiende a
puesto que, al graficar, este era el set de datos que más incrementar hasta que alcanza un punto máximo, es
se acercaba a la gráfica de una campana. decir, que, a partir de este punto, la velocidad no va a
Temperatura Vs Velocidad de reaccion aumentar más independientemente de que se siga
0,15 adicionando sustrato, esto se debe a que alcanza un
punto de saturación donde la enzima no va a catalizar
Velocidad de Reacción

0,1 la reacción con el sustrato agregado. [8]

Para la determinación del efecto del sustrato se
0,05 utilizaron los siguientes valores ya que poseían una
mayor concordancia en su comportamiento lineal con
0 respecto a los demás, estos fueron recopilados por el
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 grupo N° 2, estos datos están presentes en la sección
-0,05 de anexos. (Ver anexo 1)
Temperatura
Grafica N°4. Temperatura óptima
A partir de la gráfica se puede determinar inicialmente Efecto del sustrato
que el rango de temperatura óptima varia de 20 a 40 oC, 0,12
pero al visualizar con mayor detalle, el punto de 0,1
temperatura que corresponde a la velocidad máxima es 0,08
aproximadamente 35 oC, valor que, de acuerdo con la 0,06
literatura, se encuentra cercano al valor reportado como 0,04
recomendado a la hora de realizar la reacción, el cual 0,02
es de 37oC, [4] confirmando así que el valor estimado 0
para la temperatura optima es coherente con el 0 20 40 60 80 100
[S] (mM)
reportado en la literatura, es decir, el valor real.
Grafica N° 6. Efecto del Sustrato
Efecto de la concentración de la enzima:
Para identificar los valores asociados de Km y Máx. se
Para evaluar correctamente el efecto de la
utilizó el método de linealización para su respectivo
concentración de la enzima el sustrato se debe
calculo, no obstante, su respectiva gráfica, se ilustrará
encontrar en exceso, con el fin de que la reacción sea
a continuación.
independiente de la concentración del sustrato. En este
caso, cualquier cambio en la cantidad de producto
formado, va a depender de la concentración de la
enzima presente. [8]
 Linealizacion [s] Linelizacion del efecto del inhibidor
30
60
25
1/[V] (mg/min)

50
20
y = 63,222x + 12,487 40
15 y = 164,51x + 18,051

1/V
R² = 0,9308 30 R² = 0,8911
10
5 20
y = 70,002x + 11,495
0 10 R² = 0,9243
0 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 0,175 0,2
1/[s] (mM) 0
Grafica N°7. Linealización del efecto del sustrato 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
1/[S]
Los presentes valores relacionados de Km y Máx, son:
𝑚𝑔
𝑉𝑚á𝑥 = 0,087 ( ) Conclusiones.
𝑚𝑙
Una vez realizada la practica y el correspondiente
𝐾𝑚 = 5,499 (𝑚𝑀)
análisis, se llegó a la conclusión de que la actividad
Efecto de la presencia de un inhibidor:
enzimática es especifica de cada enzima, debido a que
Ciertas sustancias reducen la velocidad de las
el comportamiento es dependiente de las condiciones a
reacciones enzimáticas, estas se conocen como
la que se encuentre la reacción enzimática.
inhibidores. Para evaluar el comportamiento de una
Adicionalmente se concluye que la estimación de la
enzima frente a un inhibidor, se grafica generalmente,
velocidad máxima al variar un factor es una tarea
un set de datos donde se evalué la actividad de la
sencilla siempre y cuando se realice manteniendo los
enzima sin inhibidor y se compara con la gráfica donde
otros factores constantes y en el rango óptimo para la
la enzima si este actuando frente a un inhibidor. [7]
enzima. Por último, se concluye que:
La respectiva tabla está presente en la sección de
• Se identifico como la variación en diversos
anexos (Ver anexo 2).
factores o condiciones en el medio de reacción
En las siguientes representaciones se puede identificar
y alrededores afectan la cinética enzimática de
el comportamiento del inhibidor de coloración azul y la
la fosfatasa ácida.
del sustrato de color naranja, de igual manera sus
• Se determinó experimentalmente la velocidad
distribuciones son iguales en la curva de linealización
máxima de la reacción al variar condiciones de
Efecto del inhibidor reacción, como la temperatura, el pH y la
0,1 concentración de las especies.
• Se estimaron los parámetros cinéticos Km y
Velocidad (mg/ml)

0,08
Vmáx para las gráficas linealizadas por
0,06
Lineweaver-Burk, donde se estaba evaluando
0,04 el comportamiento de la enzima frente a la
0,02 concentración de sustrato y frente a la
presencia de un inhibidor.
0
0 20 40 60 80 100 120 Referencias
[S] (mM)
[1] Flórez Wilches, A. (2018). Evaluación de la
Grafica N° 8. Efecto del Inhibidor
estabilidad de un extracto enzimático, obtenido
Para identificar los valores asociados de Km y Máx. se
de Penicillium sp. HC1, con actividad
utilizó el método de linealización para su respectivo
endoxilanasa bajo condiciones de
calculo, no obstante, su respectiva gráfica, se ilustrará
almacenamiento. [Tesis de Grado].
a continuación.
Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias.
Los presentes valores relacionados de Km y Máx, son:
Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá D.C,
𝑚𝑔
𝑉𝑚á𝑥 = 0,0554 ( ) Colombia. Recuperado de
𝑚𝑙
https://repository.javeriana.edu.co:8443/bitstrea
𝐾𝑚 = 9,114 (𝑚𝑀)
Grafica N° 10. Linealización del efecto del inhibidor
 m/handle/10554/35026/Florez.Angie_TG2018.p
df?sequence=1&isAllowed=y Firmas:
[2] Universidad Semmelweis. (2014). Experimental Gabriel Romero
determination of enzyme kinetics parameters. ___________________________________________
Instituto de Bioquímica Medica. Universidad
Semmelweis. Budapest, Hungría. Recuperado Juan Villalobos
___________________________________________
de
http://semmelweis.hu/biokemia/files/2014/08/E
N_lab_enzyme-kinetics_ver20120831.pdf
[3] Guija, E., Soberón, M. & Haak-Mares, H. (2007).
Anexos.
Mecanismo de acción de las fosfatasas ácidas
de bajo peso molecular. Anales de la Facultad
1.
de Medicina, 68 (4). Universidad Nacional Tubo Absorbancia mM 1/[S] Concentración v 1/v

Mayor de San Marcos. Lima, Perú. pp. 356. 1 0,404 5 0,2 0,409904762 0,04099048 24,3959108
ISSN 1025-5583. Recuperado de 2 0,475 10 0,1 0,47752381 0,04775238 20,9413642
http://www.scielo.org.pe/pdf/afm/v68n4/a11v68 3 0,698 20 0,05 0,689904762 0,06899048 14,4947543
n4.pdf 4 0,748 40 0,025 0,73752381 0,07375238 13,5588843
[4] Wiener Laboratorios S.A.I.C. (s. f.). Fosfatasa 5 0,734 60 0,01666667 0,724190476 0,07241905 13,8085218
ácida Total y Protática cinética. Método cinético 6 0,936 80 0,0125 0,916571429 0,09165714 10,9102244
para la determinación de fosfatasa ácida total y
7 0,899 100 0,01 0,881333333 0,08813333 11,3464448
prostática. Wiener Lab. Rosario, Argentina.
8 1,161 100 0,01 1,130857143 0,11308571 8,84284992
Recuperado de http://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademec
um%20espanol/fosfatasa_acida_total_y_prosta 2.
tica_cinetica_sp.pdf
Tubo Absorbancia [S] Concentración V (mg/ml) 1/[S] 1/V
[5] Tsuboi, K., Wiener, G. & Hudson, P. (1956).
1 0,166 5 0,183238095 0,01832381 0,2 54,5738046
Acid phosphatase VII. Yeast
2 0,345 10 0,353714286 0,03537143 0,1 28,2714055
Phosphomonoesterase; Isolation procedure and
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