Ferreira Mendes Liliana, Marzon Patricia Carolina, Schieve Marlene

Beatriz, Sosa Cinty Patricia .

Microscopio de
Campo oscuro.
Biología Molecular y celular. Profesora: Fernández Andrea.
Introducción:

El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios ópticos.

Desde muchos años atrás el microscopio óptico posibilitó el descubrimiento de las células y la
elaboración de la teoría de que todos los seres vivos están constituidos por células al cual se le
acondiciona un condensador especial, éste tiene como fin producir una difracen de los rayos
luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto e forma de una cono y de ésta forma no
penetran directamente al objetivo.

Fue diseñado por el físico Ricgard Zsigmond en el año 1.903.

Microscopio de campo oscuro

El microscopio óptico se compone de dos partes principalmente:

1. Parte Mecánica: Sirve de soporte.

2. Parte Óptica: constituida por tres sistemas de lentes.

* Condensador.

* Objetivo

* Ocular

El condensador del microscopio óptico convencional tiene como finalidad proyectar un cono de
luz sobre los elementos que están siendo analizados en el microscopio. Después de atravesar
el elemento, ese haz luminoso en forma de cono penetra en el objetivo, proyectando una
imagen aumentada en el plano focal del ocular que nuevamente la amplia y es recibida por la
retina como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular.

El microscopio de campo oscuro está constituido por un microscopio óptico al cual se le

acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una disfracen de los rayos
luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminosos, y de esta
forma tampoco penetran directamente al objetivo.

La Microscopía de fondo oscuro también es llamada ultramicroscopia, y se funda en la

dispersión de la luz por medio de un condensador de campo oscuro. Con éste instrumento así
como con los que tienen óptica de fase es posible reconocer objetos menores que la longitud
de onda de la luz, aunque no pueden resolverse. (Robertis)

Con el condensador de Campo oscuro no entra luz directa en el objetivo, y por lo tanto éste
aparece brillante a causa de la dispersión de la luz, mientras que el fondo permanece oscuro.
Por ejemplo, una célula en tejido de cultivo puede mostrar brillante el nucléolo, la membrana
nuclear, las mitocondrias y las gotas de lípidos, que se destacan sobre el fondo oscuro del
citoplasma (Biología,Hilda L. D´Aiello)

El efecto es semejante al que producen las partículas de polvo en el haz luminoso de un

proyector de días positivas cuando la habitación está oscura. La luz reflejada por las partículas
de polvo alcanza las retinas del ojo y eso permite verlas como puntos Brillantes.

Se pueden observar diminutos organismos acuáticos vivos, diatomeas, pequeños insectos,

huesos, fibras, cabellos, bacterias teñidas, levaduras, células sanguíneas y protozoos.

La resolución del microscopio de campo oscuro no puede ser mejor que la del campo claro
dado que ambos usan luz de la misma longitud de onda.

En clínica, la microscopia de campo oscuro se aplica para la detección de cristales en la orina-

como los de oxalato o ácido úrico-, y para la identificación de células específica como las
epiroquetas, en particular , Treponema palliáum, el microorganismo causante de la sífilis,
enfermedad de transmisión sexual. (Histología Ross Paulina)

Entre las muestras no biológicas se incluyen los minerales y cristales químicos, coloides,
muestras de polvo y materiales polímeros con diferentes porosidad.
Existen dos clases de condensador de campo oscuro:

* Cardiode, sistema de campo oscuro basado en espejos internos que proyectan un cono de
luz hacia la muestra sin generar aberraciones.

* Caraboloide

Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la
investigación con Treponemas.

Para que el efecto de campo oscuro se logre, la apertura numérica del condensador debe ser
mayor que la del objetivo, lo cual ocurre con los de pequeño y gran aumento no así con los de
inmersión los cuales deberán adicionarse de un diagrama de suspensión para la reducir la
apertura numérica.

Resolución de microscopia en campo oscuro:

Se llama poder de resolución de un sistema óptico a la capacidad de separar detalles y es

expresado por el límite de resolución que es la menor distancia que existe entre dos puntos
para que estos aparezcan individualizados. Lo que determina la riqueza del detalle de la
imagen provista por un sistema óptico es su límite de resolución y no su poder de aumentar el
tamaño de los objetos.

El límite de resolución depende de la apertura numérica (AN) del objetivo y de la longitud de

onda de la luz utilizada.

En la microscopia de campo oscuro la AN no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador

debe tener siempre una apertura numérica superior a este valor. El límite de resolución del
objetivo está dado por la siguiente formula:

LR = k x Long. Onda

AN * k = Constante (0.61)

* Log. Onda = 0.55 Se toma la longitud de onda de la franja verde –

Amarilla por ser el ojo humano más sensible a estos colores que a otros.

* AN = Apertura numérica no superior a 1.0

Métodos para observación en fondo oscuro

Existen diferentes métodos para observar un objeto sobre un fondo oscuro es decir, utilizando
únicamente la luz difractada por él.

Observación incidente o por reflexión

La observación por reflexión con iluminación oblicua o anular es la más frecuentemente

utilizada con los microscopios estereoscopios o lupas binoculares. Generalmente no nos
damos cuenta de que observamos en fondo oscuro cuando el material ocupa todo el campo
visual.

Observación por transmisión (fondo negro central)

La observación por transmisión con una pantalla central necesita la utilización de un objetivo
con pantalla interna de Spierer; con una pantalla anular, la de Wilska: anoptral, versión original
y no la fabricada industrialmente que es un contraste de fase negativa a fuerte absorción.

Observación por transmisión (fondo negro anular)

La observación con iluminación anular de abertura superior a la del objetivo, es la única que, en
la práctica corriente, se denomina campo oscuro. Debe indicarse que difícilmente puede
utilizarse objetivos de gran aumento, de apertura numérica superior a 1.0.dado que el
condensador debe presentar una abertura superior a esta. Debe entonces practicarse la
inmersión, evitando las burbujas de aire.

Observación birrefringente (polarización)

La observación de un objeto birrefringente entre nicoles cruzados da una imagen sobre fondo
negro de naturaleza muy particular.

Observación haz perpendicular (Fondo Negro ultramicroscópico)

La observación con un haz perpendicular a la dirección de la observación según Ziedentopf y

Szimondy da informaciones sobre la orientación de las partículas observadas.

Naturaleza y estructura de la imagen en fondo oscuro

Las imágenes en autentico fondo negro son remarcables por un efecto de borde, con
numerosas franjas de difracción muy brillantes si le objeto es refringente. Los planos, en el
centro de una estructura parecen ópticamente vacíos. Es por ello que deben adoptarse
grandes precauciones en el momento de interpretar las imágenes. Dado que la imagen solo se
forma con la luz difractada, siempre más débil que la luz directa deben formarse en fuentes
lumìnicas muy intensas, lo que no siempre es fácil sobre todo cuando los objetos son vivos y,
por consiguiente, sensibles a fuertes iluminaciones.

Preparación de la muestra y procedimiento de lectura.

El material a estudio se emulsiona sobre un porta-objetos sobre el cual se coloca una gota de
solución salina, se cubre con una laminilla y se monta sobre la platina , se baja el condensador
de campo oscuro y se corre con el carro de la platina la preparación de forma tal que al subir
completamente el condensador la cara superior de su lente quede cubierta por su preparación
solamente en su mitad posterior.

Sobre la parte descubierta del lente se coloca aceite de inmersión en cantidad adecuada; este
por capilaridad se extiende entre la cara inferior del portaobjetos y la superior del lente del
condensador. Se centra la preparación y se observa con objetivo de pequeño aumento
colocando el foco luminoso en la mitad del campo mediante los tornillos de centraje del
condensador, luego se observa el campo microscópico con el objetivo de gran aumento, esto
permite conocer el estado del microscopio al observar los treponemas bucales.

Ventajas:

 Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo.

 Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas.
 Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.
 Visualiza los bordes destacados delas muestras.
  Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum,
espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um.

Desventajas:

 Inadecuada preparación de la muestra.

 Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo.
 No deja visualizar estructuras celulares específicas, solo bordes de células o
partículas.
De igual manera, al observar el brillo de las estrellas en el cielo nocturno o al iluminar con una
linterna se vuelven visibles porque reflejan o difractan la luz, las muestras observadas se ven
blancas y brillantes sobre un fondo oscuro. La iluminación de campo oscuro, se puede realizar
mediante luz transmitida (trans – iluminación) o con luz incidente (epi – iluminación).

En el primer caso, para lograr el efecto deseado, se debe bloquear la parte central del haz de
luz que suele pasar alrededor y a través de la muestra iluminada por haces oblicuos. La forma
más sencilla, consiste en colocar un filtro circular opaco bajo el condensador del microscopio.

Aplicaciones: Estudio de especímenes no coloreados, como microorganismos acuáticos,

ovocitos, células en cultivo con índices de refracción que oscilen entre 1,2 a 1,4 sin diferencia
aparente con el índice de 1,3 de la solución acuosa en la cual se encuentran.

Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de la

sífilis.

Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.

Conclusión:

Podríamos definir la microscopía sanguínea en campo oscuro como la técnica que estudia en
vivo, sin colores ni sustancias añadidas a la sangre humana para comprender mejor la salud
del individuo; carencias y excesos relacionados con la alimentación, anemias, vitaminas,
residuos tóxicos, predisposiciones patológicas.
BIBLIOGRAFÍA

1. Karp Gerard. Biología Celular y Molecular, 2 edición McGraw Hill. México

1991. Pag 864-867, 870-871.

2. Guzman U. Miguel A. Sífilis Diagnostico y Manejo Serològico. 2 Edición

Instituto Nacional de salud. Santafè de Bogotá 1979. Pag 83-86.

3. Kupper Terranc. Instrumentos y Tècnicas Intrumentales. BarcelonaEspaña. 1984. Pag. 34-

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4. Robertis, Biología celular y molecular, Editorial El Ateneo

5. Biología Plus Ultra de Hilda L. D´Aiello

6. Histología de Ross Pawlina.