PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO CODIGO P-SA-78

Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus FECHA DE

27/05/2016
Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS EMISIÓN
PARA CONSUMO HUMANO VERSIÓN 01
ISO 6888-1:1999
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PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE

Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA
CONSUMO HUMANO
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ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO SECRETARIO DE SALUD REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN
REPRESENTANTE DE CALIDAD
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
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1 OBJETIVO

Describir la Técnica de Aislamiento y recuento de Staphylococcus aureus Coagulosa

Positiva para detectar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en análisis
microbiológico en alimentos de consumo humano.

2 ALCANCE

El procedimiento técnico de Aislamiento y recuento de Staphylococcus aureus

Coagulosa Positiva en Alimentos de consumo humano, aplica a todas las muestras para
análisis microbiológico que son recepcionadas y analizados en Laboratorio de Salud
Pública

3 DEFINICIONES

 Staphylococcus aureus: enterotoxigénico es un microorganismo que se encuentra

frecuentemente en alimentos crudos o cocidos de origen animal, especialmente en
aquellos que requieren manipulación directa para su preparación, como es el caso de
los alimentos preparados no industriales.

 Unidades formadoras de colonias (UFC): Término que debe utilizarse para reportar
la cuenta de colonias en placa.

 Recuento en Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del

alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el
método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las
características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como
en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la
flora psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse
en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando
concentraciones progresivamente más diluidas de la muestra.

4. RESPONSABLES

Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de

Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Pública del Meta cumplir con los
lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté
debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de
muestras.

5. GENERALIDADES

5.1 Taxonomía y morfología

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El género Staphylococcus, pertenece a phylum Firmicutes, clase III Bacilli, orden I 18

especies de Staphylococcus, han sido reportadas de importancia en alimentos, siendo S.
aureus la más relevante y siendo ésta indicadora de contaminación por manipulación
inadecuada. S aureus es una bacteria con morfología microscópica típica de cocos Gram
positivos agrupados en racimos de tamaño entre 0,5 a 1,5 μm, no esporulada
(asporógena) e inmóvil. Es organótrofa, catalasa positiva, con un contenido de G+C en la
composición del ADN de 30 a 40% Por lo general, las cepas productoras de coagulasa
son termonucleasa positiva. Es una bacteria ubicua y patógena que puede causar
intoxicación alimentaria.

5.2 Fisiología

Staphylococcus aureus es una bacteria mesófila aerobia facultativa capaz de crecer en

amplios rangos de pH y aw. Es uno de los patógenos humanos asporógenos más
resistente a condiciones ambientales adversas, logrando persistir a temperaturas de
congelación y descongelación. Las concentraciones máximas de sal que permiten el
crecimiento dependen de factores como: temperatura, pH, potencial redox, entre otros.
(Ver tabla 6).

Tabla 6. Parámetros de crecimiento de S. Crecimiento de S. aureus

aureus. Parámetros
Óptimo Rango
Temperatura (°C) 37 7 - 48
pH 6-7 4 - 10
aw 0,98 0,83 - > 0,991
0,90 - > 0,992
NaCl (%) 0 0 - 20
Potencial redox (Eh) (mV) > + 200 < - 200 - > + 200
Atmósfera Aerobia Anaerobia

6. REFERENCIAS

Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. INVIMA

7. DESARROLLO

7.1 FUNDAMENTO

La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus, consiste en los

siguientes pasos:

 Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el

desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite
reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado.
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 Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de

Staphylococcus aureus.
 Identificación bioquímica, en este punto se identifica el género y especie de
Staphylococcus aureus enterotoxigénico.

7.1.1 Agar Base Baird Parker:

Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y

recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de
importancia sanitaria.

El fundamento del medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto

de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto de levadura
aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el crecimiento de
los estafilococos.

Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y al

cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompañante. La yema de
huevo permite demostrar la actividad lecitinásica.

Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan colonias

de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevo produciendo
alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara más
externa.

Se pueden encontrar cepas no lipolíticas, que presentan igual características de

colonias pero sin la zona opaca y clara.

Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas bioquímicas.

7.2 MATERIALES

Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara

conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de
muestras de alimentos para consumo humano.

7.2.1 Equipos

 Incubadora a 35°C ±1°C

 Asas estériles desechables o varillas de hockey
 Tubos Estériles

7.2.2 Medios de cultivo y reactivos

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 Agar Baird Parker

 Solución de Yema de huevo más Telurito
 Plasma de Conejo
 Caldo BHI

7.2.3 Cepas de Referencia

 Escherichia coli ATCC 25922
 Staphylococcus aureus ATCC 25923

7.3 PROCEDIMIENTO

7.3.1 Controles y o curvas de calibración

 Control Positivo: A partir de una siembra de Staphylococcus aureus ATCC 25923

sembrado en Agar TSAYE, Agar Pate Count o Agar Nutritivo, se toma una porción de
la colonia con la ayuda de un asa estéril y se siembra sobre el agar Baird Parker
Invertir las placas e incubarlas a 35°C +/- 1°C durante 24 - 48 horas.

 Control Negativo: A partir de una siembra de Bacillus cereus ATCC 11778 sembrado
en Agar TSAYE, Agar Pate Count o Agar Nutritivo, donde se toma una porción de la
colonia con la ayuda de un asa estéril y se siembra sobre el agar Baird Parker Invertir
las placas e incubarlas a 35°C +/- 1°C durante 24 - 48 horas.

7.3.2 Condiciones Ambientales y manejo de equipos

Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83

Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para
consumo humano.

7.4 Preparación de la Muestra

 Dejar secar la superficie de la placa preparada con anterioridad, con la tapa hacia
arriba dentro de la cabina de flujo laminar.

 Marcar la base de la caja de petri que contiene el medio de cultivo Baird Parker con los
4 últimos números del consecutivo asignado en el momento de la recepción de la
muestra. De la siguiente manera:

XXXX

XXXX
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7.5 Descripción del Método

Este procedimiento tiene como fundamento inocular diluciones decimales de la muestra

en agar Baird Parker, mediante método de extensión en superficie, e incubar a 35 ±1°C/
24 – 48 horas.

En condiciones asépticas, pesar 10g de muestra y depositarla en 90mL de Agua

peptonada al 0,1% de diluyente, (dilución1:10) Homogenizar (stomacher) durante 30
segundos. Conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos
de muestras de alimentos para consumo humano.

 Sembrar en superficie y en duplicado 0,1 ml (100µl) de la dilución de la muestra a

analizar en placas de agar Baird Parker y extender con varilla de hockey o asa redonda
estéril desechable.

 Diseminar el inóculo con asa redonda desechables estéril o varillas de hockey estéril
por toda la superficie del agar.

 Tapar las cajas y colocarlas invertidas en la incubar de 35°C ± 1°C / 24 - 48 horas.

 Observar las placas a las 24 horas y si la reacción no es clara dejar por 24 horas
adicionales.

7.5.1 Lectura
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7.5.1.1 Macroscópica

Medio de Cultivo Imagen Características

Agar Baird Parked - Colonias negras con borde

Merck incoloro, convexas, rodeadas de
una zona opaca, con una zona
clara externa.

Agar Baird Parked - Gris-negro brillante convexa

Oxoid diámetro de 1-1,5 mm (18 horas)
hasta 3 mm (48 horas) estrecho
margen entero blanca rodeada por
zonas clara de 2-5mm

7.5.1.2 Microscopio

Preparar una tinción de Gram y observar microscópicamente: cocos gram positivos

dispuestos en racimos.

7.5.2 Confirmación Colonias de Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva

Esta prueba bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima
coagulasa. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en esta
prueba es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva.

7.5.2.1 Recuperación de la Cepa

 Con ayuda del cuadro del Item 7.5.1.1, determinar el número de colonias a evaluar,
tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. aureus obtenidas en el agar
Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar la prueba cuantitativas -
coagulasa.

 Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son características
de este microorganismo, utilizando asa desechable recta estéril, en caldo infusión
cerebro corazón. Incubar a 35 ± 1° C durante 24 horas.
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 Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus ATCC 25923 y

Escherichia coli ATCC 25922 respectivamente de las pruebas bioquímicas.

7.5.2.2 Prueba de la Presencia de la enzima coagulasa

 En un tubo de ensayo estéril adicionar 0.2ml de la suspensión del microorganismo que

desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo.
Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen según las especificaciones del
fabricante.
 Incubar en incubadora, entre 35º±1°C y observar durante 3 horas. En intervalos de 1
hora.

7.5.3 Cálculos

Nota: el factor de dilución es 10 veces mayor, debido a que solamente se inoculó 0.1 ml
de cada dilución, en lugar de 1ml.

Para realizar el cálculo, aplicar la siguiente fórmula:

Colonias positivas* N. de la dilución

____________________________________
Colonias examinadas
Ejemplo:

10-2: 6 colonias = 600

Colonias examinadas: =3 600 x2 = 400ufc/g ó mL
Colonias positivas: =2 3

7.5.4 Expresión de Resultados

 El resultado se expresa en ufc de Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva por

gr o ml de producto analizado según corresponda

 Ausencia de colonias, expresar el resultado como:

Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva <100ufc/g ó mL

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8. VERIFICACIONES

8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados

 Para comprobar la capacidad del laboratorio de detectar Staphylococcus aureus

Coagulosa Positiva con el método técnico de Aislamiento y Recuento, realizar los
siguientes controles con material de Referencia y analizados en las mismas
condiciones que la muestra.

 Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa
de siembra estéril e inoculo en una caja del medio selectivo utilizado una muestra
(actividad 7.5)

Medio de Cultivo Control Imagen

Control Positivo Staphylococcus

aureus Coagulosa Positiva ATCC
25923

Agar Baird Parker

Control Negativo Escherichia coli

ATCC 25922

Registrar en los formatos

 F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

 F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas
 F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos
 F-SA-34 Control Interno de Equipos
 F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos.
 F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico
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Criterio de Aceptación o Rechazo

RANGO DE ACCION PARA

CRITERIO LECTURA ACEPTACION INCUMPLIMIENTO
CRECIMIENTO DE CRITERIOS
Colonias negras con borde
Control Positivo
incoloro, convexas, rodeadas Repetir Análisis
Staphylococcus Inhibido
de una zona opaca, con una Verificar.
aureus ATCC 25923
zona clara externa.
Control Negativo Repetir siembra de
Escherichia coli Verificar el Crecimiento en el Masivo cepas ATCC y
control Positivo
ATCC 25922 repetir el Análisis

Descartar
Reactivos y adquirir
Vigencia del reactivo dentro de Reactivo Vigente a la
Reactivos vigentes y procesar con
la fecha fecha de utilización
reactivos en fechas
vigentes

Ajustar control de
Temperatura y
Temperaturas de Temperatura ajusta a Temperatura tomar nuevamente
Incubadoras 35 +/- 1 ºC 35 +/- 1 ºC hasta obtener
temperatura
deseada.

Solicitar y ejecutar
los mantenimientos
Mantenimiento de Calibración, verificación y Calibración, verificación y o verificaciones
equipos mantenimiento vigente mantenimiento vigente pendientes para
realizar análisis con
equipos idóneos

Descartar el
Material y realizar
Verificar la fecha de
Control de Fecha de esterilización de el proceso con
esterilización de Material,
Esterilización de Material. Controles de material que
verificar el cumplimiento de los
Material esterilización. cumpla con los
controles de esterilización.
controles de
esterilización.

Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis

Microbiológico F-SA-101
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9. REGISTROS

Como Tiempo de
Registro Responsable Donde conservarlo Disposición final
conservarlo conservación
F-SA-18 Hoja
de Vida de Profesional
Equipos Universitario o
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Profesional del Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Laboratorio Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Físico
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-34
Control Interno Auxiliar de
de Equipos. Laboratorio,
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Profesional Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Profesional del Físico
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-46
Control De Auxiliar de
Temperatura, Laboratorio,
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Limpieza y Profesional Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Desinfección Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
de Equipos Profesional del Físico
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-64
Identificación Auxiliar de
de Sustancias Laboratorio,
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Químicas Profesional
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Profesional del Físico
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-75
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Resultados Profesional
Microbiológico Universitario o Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
s de Alimentos Profesional del Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
Físico tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental
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Como Tiempo de
Registro Responsable Donde conservarlo Disposición final
conservarlo conservación
F-SA-101 Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Control de Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
calidad Profesional del Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
análisis Laboratorio Físico maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
microbiológico tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

10. HISTORIAL

VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS

1 27/05/2016 Versión inicial