CONVERSIÓN FOTOSINTÉTICA DE CO2 A ÉSTERES ETÍLICOS DE ÁCIDOS GRASOS (FAEES)

USANDO CIANOBACTERIAS DE INGENIERÍA

RESUMEN
La ingeniería metabólica de las cianobacterias ha recibido atención como una estrategia sostenible para convertir
el dióxido de carbono a productos químicos derivados de ácidos grasos que son ampliamente utilizados en las
industrias química y alimentaria.
La Synechococcus elongatus PCC 7942, un modelo de cianobacteria, se diseñó por primera vez para producir
ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEEs) a partir de CO2. Debido a la falta de una ruta de producción de etanol
endógeno y la actividad de la éster de cera sintasa (AftA) en la cianobacteria de tipo salvaje, diseñamos
metabólicamente la PC107942 de S. elongatus expresando AftA heteróloga e introduciendo la ruta del etanol, lo
que resultó en picos detectables de FAEEs
Para mejorar la producción de FAEE, se introdujo una vía de fosfocetolasa heteróloga en la cepa productora de
FAEE para suministrar acetil-CoA. La posterior optimización del cultivo de cianobacterias con una superposición
de hexadecano dio como resultado la ingeniería de S. elongatus PCC 7942 que produjo FAEEs fotosintéticas
(10.0 ± 0.7 mg / L / OD730) a partir de CO2.
Este trabajo es el primer informe de la producción fotosintética de FAEEs de CO2 en cianobacterias
PALABRAS CLAVE: cianobacterias, ingeniería metabólica, éster etílico de ácidos grasos, conversión de CO2

INTRODUCCIÓN
Los productos químicos derivados de ácidos grasos utilizados en las industrias de alimentos, productos químicos
y energía (por ejemplo, fragancias, surfactantes, solventes, lubricantes y biocombustibles) se producen
típicamente a partir de aceites vegetales y
animales. Recientemente, las fábricas de
células microbianas se han desarrollado
para producir productos químicos
derivados de ácidos grasos (ácidos grasos
libres, alcoholes grasos, hidrocarburos
grasos y ésteres etílicos de ácidos grasos)
a partir de diversas fuentes de carbono
como glucosa, glicerol y lignocelulosa
(una biomasa renovable)
Además, la conversión directa de dióxido
de carbono a productos químicos
derivados de ácidos grasos ha recibido
atención como una solución sostenible
para responder a las emisiones de gases
de efecto invernadero y los problemas de
suministro de energía.La ingeniería
metabólica de las cianobacterias se ha
utilizado para producir productos
químicos derivados de ácidos grasos a
partir de CO
Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos
utilizados en este estudio
Se han producido ácidos grasos libres a partir de CO2 en Synechocystis sp PCC 6803 modificada genéticamente,
por eliminación de la acil-ACP sintetasa (slr1609), introduciendo una tioesterasa ('tesA) y debilitando las capas
de la pared celular.
La cianobacteria modificada secretó 197 mg / L de FFAs
Además, la Synechococcus sp. PCC 7002, una cianobacteria tolerante a FFA, se ha diseñado para la producción
de FFA (130 mg / l) al anular la acil-ACP sintetasa / CoA ligasa de ácido graso de cadena larga, y expresando
Escherihcia coli tioesterasa ('tesA) y RuBisCO adicional (rbcLS)
Además de FFA, alcoholes grasos (3 mg / g DCW) e hidrocarburos grasos (2.3 mg /L / OD730) se han producido
en cianobacterias diseñadas, expresando acil-CoA reductasa grasa de Marinobacter aquaeolei VT8 y expresando
la proteína reductora de acil-acil portadora y la aldehído-deformilante-oxigenasa.
Sin embargo, la ingeniería metabólica de las cianobacterias para producir ésteres etílicos de ácidos grasos
(FAEEs) a partir del CO2 aún no se ha informado.
El biodiesel está compuesto de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) y FAEEs que tienen características
similares con respecto a las propiedades químicas y físicas del combustible. Los FAEEs adecuados para uso en
biodiesel se produjeron primero a partir de oleato de glucosa y sodio en E. coli modificado por ingeniería genética
mediante la expresión de la éster de cera sintasa (atfA) de Acinetobacter baylyi.
Además, la expresión combinada de tioesterasa 'TesA y acil-CoA ligasa, la eliminación de la vía de β-oxidación
y la introducción de una ruta heteróloga de etanol (pdc y adh) de Zymomonas mobilis han dado como resultado
una producción de FAEE de 674 mg / l a partir de glucosa (20 g / L) sola.
En Saccharomyces cerevisiae, FAEEs (520 mg / L) y etanol (1.4 g / L) se han coproducido a partir de glicerol (17
g / L) mediante la expresión de una aciltransferasa bacteriana.
Además, la sobreexpresión de la acetil-CoA carboxilasa nativa y las sintasas de ácidos grasos (FAS1 y FAS2)
con la eliminación de la vía de oxidación β y la expresión de AtfA de A. baylyi dio como resultado la producción
de FAEE (5,44 mg / l) y etanol ( 4.1 g / L) a partir de glucosa (20 g / L).
Además optimización del medio y de la ingeniería metabólica de S. cerevisiae han mejorado la producción FAEE
a 34 mg / L de glucosa (20 g / L)
Aquí, presentamos la primera ingeniería metabólica de Synechococcus elongatus PCC 7942 para producir FAEEs
fotosintéticos de CO2.En este estudio, la toxicidad de FAEE se alivió en S. elongatus PCC 7942 usando una
extracción in situ de dos fases. La producción de FAEE se mejoró reponiendo acetil-CoA intracelular a través de
una vía de fosfocetolasa heteróloga (PHK). Nuestra cepa se optimizará aún más para acelerar el desarrollo de las
fábricas de celdas biosolares para convertir el CO2 en FAEEs como biocombustible potencial.
Figura 1. Diagrama esquemático de la producción fotosintética de FAEE a partir de CO2 en S. elongatus PCC
7942 modificado por ingeniería genética.
(A) Vía esquemática para la producción de FAEE en cepas recombinantes S elongatus PCC 7942, introduciendo
una vía heteróloga productora de etanol y coexpresando el gen atf que codifica una éster de cera sintasa /
acilcoenzima A: diacilglicerol aciltransferasa de A. baylyi.La ruta productora de etanol requiere la expresión del
gen pdc que codifica para la descarboxilasa Z. mobilis piruvato heteróloga y el gen adh que codifica Z. mobilis
alcohol deshidrogenasa.Para suministrar las combinaciones de acetil-CoA, se requirió una vía de fosfocetolasa
heteróloga que coexpresa el gen xpkA que codifica una fosfocetolasa de A. nidulans y el gen pta que codifica
para una fosfotransacetilasa de B. subtilis.
(B) Diagramas esquemáticos de la construcción de cepas de S elongatus PCC 7942 que producen FAEEs.
Los genes pdc-adh se introdujeron en el sitio neutro II (NSII) para la producción endógena de etanol.
Posteriormente, los genes heterólogos atfA y atfA-xpkA-pta se introdujeron en el sitio neutro I (NSI) del ADN
genómico de S. elongatus. Una imagen de gel mostró resultados de colonia-PCR verificando cepas de S. elongatus
recombinantes usando un par de Se1-fw / rv y Se2-fw / rv para las integraciones NSI y NSII, respectivamente.
Las secuencias de ADN también se verificaron.
Tamaño objetivo de cada producto de PCR para cianobacterias de tipo salvaje o mutantes: tipo salvaje (1,6 kb),
Se1A-2Et (5,9 kb), Se1AXP-2Et (9,3 kb) en NSI y tipo salvaje (2,8 kb), Se2Et ( 7.8 kb), Se1A-2Et (7.8 kb),
Se1AXP-2Et (7.8 kb) en NSII.
Los genotipos de las cepas recombinantes Se2Et, Se1A-2Et y Se1AXP-2Et se describen en la Tabla 1
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas y plásmidos.
Todas las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. La cepa DH5α de
E. coli se usó para la clonación de genes y se cultivó en medio Luria-Bertani (triptona 10 g / l, extracto de levadura
5 g / l y 10 g / L NaCl) a 37 ° C en un agitador rotatorio a 200 rpm.
Cuando fue apropiado, el medio se complementó con 50 μg / ml de kanamicina y 100 μg / ml de espectinomicina.
Todos los plásmidos se derivaron de plásmidos de expresión SyneBrick (vectores estándar para la integración
cromosómica en el sitio neutral I (NSI) o neutro II (NSII); pSe1Bb1s-GFP y Se2Bb1k-GFP) utilizando el método
de clonación estándar BglBrick18 como plataforma sintética para la expresión del gen en S. elongatus PCC 7942
El gen atfA (A. baylyi), el gen xpkA (Aspergillus nidulans), el gen pta (Bacillus subtilis) y los genes pdc y adh
(Z. mobilis) se optimizaron mediante codones utilizando el software Gene Designer 2.0 (DNA2.0; Menlo Park,
CA, EE. UU.)
(ver detalles en la Información de respaldo).
Luego fueron sintetizados (Genscript Inc., Piscataway, NJ, USA) para una expresión heteróloga eficiente en S.
elongatus PCC 7942. Los genes pdc y adh también se clonaron en pSe2Bb1k-GFP para construir pSe2Bb1k-pdc-
adh para la producción endógena de etanol. El gen atfA para la producción de FAEE se clonó en pSe1Bb1s-GFP
para construir pSe1Bb1s-atfA. Para mejorar la disponibilidad de acetil-CoA, se clonaron genes xpkA y pta
adicionales con pSe1Bb1s-atfA, obteniéndose pSe1Bb1s-tfA-xpkA-pta.

Transformación de S. elongatus PCC 7942

La transformación de S. elongatus PCC 7942 se realizó como se describió previamente
Los vectores SyneBrick construidos en este estudio se transfirieron para la integración cromosómica. Las cepas
recombinantes Se2Et, Se1A-2Et y Se1AXP-2Et se obtuvieron después de transferir colonias a placas frescas
selectivas para obtener un mutante completamente segregado debido al oligoploide en cianobacterias
Las cepas se confirmaron mediante PCR para verificar la integración cromosómica de los objetivos en NSI o NSII
(Figura 1).
Las secuencias de ADN también se verificaron utilizando Se1-fw (5'-AAG CGC TCC, GCA TGG ATC TG-3 ')
y Se1-rv (5'-CAA GGC AGC TTG GAA GGG CG-3') para NSI y Se2-fw ( 5'-GGC TAC GGT TCG TAA TGC
CA-3 ') y Se2-rv (5'-GAG ATC AGG GCT GTA CTT AC-3') para NSII.

Condiciones de crecimiento para la producción de FAEE a partir de cianobacterias de ingeniería

Recombinante S. elongatus PCC 7942 para la producción de FAEEs se cultivó a 30 ° C bajo luz fluorescente
continua (100 μMol fotones / m2 / s) medida usando un medidor de LightScout Quantum (3415FXSE; Spectrum,
Aurora, IL, EE.UU.).
El cultivo se realizó utilizando un volumen de muestra de 100 ml (botella Duran con tapa de tres puertos) en
medio BG-11 (UTEX) suplementado con MOPS 10 mM a pH 7,5, con gas CO2 al 5% (v / v) (monitoreado
mediante un analizador de gases en línea) y un 95% (v / v) de aire filtrado suministrado a un caudal constante de
10 cm3 / min en el medio.
Además, se suplementaron 10 μg / ml de espectinomicina y 10 μg / ml de kanamicina para la selección de presión.
A continuación, se añadió 1 mM de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al medio de cultivo 24 h después
de la inoculación para la inducción. Las muestras se recogieron en hexadecano al 20% (v / v) para la extracción
de FAEE en el sitio

Cuantificación de FAEE fotosintéticos y etanol

Para cuantificar los FAEEs secretados, se recogieron muestras (200 μL) de la capa de hexadecano en el cultivo y
se diluyeron con acetato de etilo (800 μL) que contenía nonadecanoato de metilo 10 mg / L como patrón interno.
Para cuantificar los FAEEs intracelulares, las muestras de suspensión celular (600 μL) se añadieron a 600 μL de
acetato de etilo que contenía un patrón interno.
Las muestras se mezclaron con 150 mg de perlas de zirconia / sílice de 0,1 mm.
Las muestras celulares se homogeneizaron a continuación con un calentador de perlas [90 s; 0,15 g de perlas de
vidrio (0,1 mm de diámetro)] y se centrifugó a 13000 g durante 5 min.
Se analizaron muestras de hexadecano / acetato de etilo y extracto celular / acetato de etilo usando cromatografía
de gases - espectrometría de masas [GC-MS; Agilent serie 6890N GC acoplada con TOF-MS (LECO)].
La solución de muestra (2 μL) se inyectó en modo dividido (5: 1) a una temperatura del inyector de 250 ° C y se
separó en una columna capilar Ultra-2 (17 m × 0,2 mm id, grosor de película de 0,11 μm; Agilent Technologies ,
Santa Clara, CA, EE. UU.).
La temperatura del horno fue de 50 ° C durante 1,50 min, se aumentó a 200 ° C a 20 ° C / min y luego a 250 ° C
a 10 ° C / min, y se mantuvo durante 3 min durante un tiempo total de ejecución de 17.00 min.Se usó helio
(99,9999%) como gas portador (flujo constante de 1,0 ml / min a una temperatura del horno de 150 ° C).
El espectrómetro de masas fue operado a 70 eV con monitoreo de iones seleccionado (SIM), y el rango de masa
fue m / z 50-650. La temperatura de la fuente de iones se mantuvo a 220 ° C. FAEE (C4-C24 pares de números
de carbono, número 49454-U, Sigma-Aldrich) se utilizó como un auténtico estándar para el análisis cuantitativo.
Para la cuantificación del etanol, se centrifugó una suspensión de células de cianobacteria de 1 ml de la botella
de recogida a 10000 g durante 10 minutos y se filtró con un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,2 μm).
Las muestras filtradas (1 μL) se analizaron mediante GC (modelo 6890; Agilent Technologies) equipado con una
columna de polietilenglicol HP-INNOWAX (30 m × 0.25 mm x 0.25 μm) y un detector de ionización de llama
(FID) en las siguientes condiciones:
temperatura del horno de 50 a 240 ° C calentada a una velocidad de 10 ° C / min, temperatura del inyector de
250 ° C, temperatura del detector de 250 ° C con gas portador He a un caudal de 25 ml / min, y una relación de
división de 10: 1.
 Figura 2. Prueba de toxicidad celular de FAEEs para S.
elongatus PCC 7942. (A) salvaje cultivada y medida a OD730
en diferentes condiciones: (1) 5% (v / v) de CO2 burbujeante
como control, barra negra; (2) hexadecano al 20% (v / v)
agregado al control, barra azul; (3) hexadecano al 20% (v / v)
agregado al control y adición de FAEEs (10 mg / L,
concentración final en el medio), barra roja; (4) control con
FAEE añadidos, barra verde.
(B) Imagen fotográfica de la botella de cultivo celular de
cianobacterias para la prueba. FAEEs (10 mg / L,
concentración final en el medio) fueron añadidos a los medios
de los experimentos 3 y 4, indicados por la flecha roja en el
día 1 de (A).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
S. elongatus PCC 7942 no produce FAEEs por su metabolismo natural debido a la falta de capacidad para producir
etanol y que tiene actividad de una éster de cera sintasa que esterifica acil-CoA con etanol. Por lo tanto, la
ingeniería de vías en S. elongatus PCC 7942 debe ser necesaria para la producción heteróloga de FAEE (Figura
1)
Antes de la producción de FAEE por las cepas recombinantes, se investigó la toxicidad celular de FAEEs para el
huésped cianobacteriano mediante la adición de FAEEs en el medio (concentración final de 10 mg / l de estándar
FAEE en el medio) 24 h después de la inoculación.
El S elongatus PCC 7942 de tipo salvaje mostró inhibición grave del crecimiento con FAEE (Figura 2), aunque
E. coli es tolerante hasta 100 g / l.
Un trabajo previo mostró que la adición de ácido graso libre (ácido linolénico) inhibió el crecimiento de la
cianobacteria de tipo salvaje debido a la fotosíntesis reducida, el estrés celular y la permeabilidad alterada de la
membrana.
Para superar la toxicidad, se utilizó una fermentación en dos fases para extraer los FAEE añadiendo una
superposición de hexadecano.
El crecimiento de cianobacterias en presencia de la superposición de hexadecano con la adición de FAEE se
restauró al nivel de tipo salvaje. Por lo tanto, utilizamos una superposición de hexadecano para la extracción de
FAEE in situ.
Como primer paso hacia la producción de FAEE, la cepa Se2Et coexpresando Pdc y Adh se construyó y se cultivó
con 5% (v / v) de CO2 burbujeante. Esto dio como resultado 232 ± 1.4 mg / L de etanol después de 7 días (Figura
3, panel izquierdo). No se detectaron FAEEs.
Posteriormente, se insertó el gen de la cepa sintasa aftA en la cepa productora de etanol (Se2Et), dando como
resultado la cepa Se1A-2Et. La cepa Se1A-2Et mostró una reducción del 40% de etanol en comparación con la
cepa Se2Et (Figura 3, panel central), secretando 139 ± 5,6 mg / L de etanol en el medio.
La formación de FAEEs de Se1A-2Et se determinó usando un análisis GC-MS basado en un extracto de
superposición de hexadecano. Se detectó un pico cromatográfico en un tiempo de retención de 10.5, y su patrón
de fragmentación de iones se combinó con el pico de éster etílico del ácido palmítico (C18H36O2) del estándar
auténtico FAEE (figura S1).
Aunque los niveles de FAEEs fueron demasiado bajos (más bajo que el límite de detección, 42 μg / L) para
determinar la concentración, esta fue la primera detección de formación de FAEE a partir de CO2 en
cianobacterias. El motivo de la reducción en la producción de etanol en Se1A-2Et no fue claro porque el etanol
endógeno correspondiente no se esterificó con acylCoA para producir FAEEs. Por lo tanto, la ingeniería
metabólica de S. elongatus PCC 7942 se aplicó para aumentar la producción de FAEEs a partir de CO2. En S.
cerevisiae, los niveles de producción de FAEE se potenciaron con éxito al sobreexpresar el gen de fosfocetolasa
para aumentar el conjunto de acetil-CoA, un precursor de acil-CoA.
Estudios previos también han demostrado que el cuello de botella para la producción química derivada de acetil-
CoA se debe a los bajos niveles de grupos de acetil-CoA en las cianobacterias.
Esta limitación se ha superado aumentando el conjunto de acetil-CoA de la ruta de la pentosa fosfato a través de
una vía de fosfocetolasa heteróloga. Para aumentar la producción de FAEE en S. elongatus PCC 7942, se introdujo
una ruta de fosfocetolasa heteróloga, produciendo una cepa Se1AXP-2Et que coexpresa fosfocetolasa y
fosfotrasacetilasa (Figura 1B).
La cepa Se1AXP-2Et mostró un 63% de reducción de etanol en comparación con la cepa Se2Et (Figura 3, panel
derecho), secretando 85,7 ± 7,6 mg / L de etanol en el medio.
Se observaron FAEEs intracelulares y FAEEs secretados en la cepa Se1AXP-2Et. Se cuantificó el éster etílico
del ácido palmítico (C18H36O2, C16: 0-etil éster) tanto para el recubrimiento de hexadecano como para el
extracto intracelular. Además, el éster etílico del ácido esteárico (C20H40O2, C18: 0-etil éster) se detectó solo en
el extracto intracelular. La producción específica de FAEEs intracelulares disminuyó gradualmente de 1.4 ± 0.1
a 0.1 ± 0.02 mg / L / OD730 para los cultivos (10 días). Por otro lado, FAEEs secretados en la superposición
aumentaron gradualmente de 0.7 ± 0.1 a 3.9 ± 0.6 mg / L durante 10 días.
Sin embargo, 3 días después de la inoculación, Se1AXP-2Et mostró una reducción del crecimiento del 45% en
comparación con su cepa parental (Se1A-2Et). La producción de FAEE intracelulares inhibió el crecimiento de
células cianobacterianas.
Para reducir la posible inhibición intracelular de FAEE, Se1AXP-2Et se cultivó con inóculo de mayor densidad
(comenzando en una DO730 de 1) que el cultivo anterior (comenzando en una OD730 de 0,5) (Figura 3, panel
derecho). Luego, la inducción de IPTG para Se1AXP-2Et se realizó a una OD730 de 2. La cantidad de FAEE
intracelulares producidos a partir de Se1AXP-2Et (comenzando a una OD730 de 1, 4,6 ± 0,8 mg / L / OD730)
aumentó 3 veces en comparación con los FAEEs intracelulares producidos a partir de Se1AXP-2Et (comenzando
en una OD730 de 0.5, 1.5 ± 0.2 mg / L / OD730).
Además, los FAEEs secretados de Se1AXP-2Et (comenzando con una OD730 de 1, 4.9 ± 0.5 mg / L / OD730)
aumentaron 1.93 veces en comparación con Se1AXP-2Et (comenzando con una OD730 de 0.5, 2.5 ± 0.2 mg / L
/ OD730 ) Finalmente, Se1AXP-2Et produjo FAEEs (10.0 ± 0.7 mg / L / OD730) a partir de CO2.
Curiosamente, la cepa Se1AXP-2Et (que comienza en una OD730 de 1) mostró una reducción del 68% de etanol
en comparación con la cepa Se2Et (Figura 3, panel derecho). La disminución de los patrones de producción de
etanol y el crecimiento de células cianobacterianas fueron causados por el aumento de la producción de FAEEs
en cianobacterias. Por lo tanto, una mayor optimización del tiempo de inducción de IPTG y la dosificación podría
mejorar los niveles de producción de FAEE en Se1AXP-2Et. Además, equilibrar la producción y secreción de
FAEE y disminuir la actividad de la acil-CoA deshidrogenasa también podría ser crucial para el crecimiento
sostenible de las cianobacterias y la producción de FAEE.Nuestra plataforma de producción FAEE podría
ampliarse para probar el uso de varias aciltransferasas bacterianas y para producir FAEE acortados diseñando una
proteína transportadora de acilo con especificidad de ácidos grasos de cadena media.
Demostramos la producción fotosintética de FAEEs a partir de CO2 utilizando cianobacterias diseñadas
metabólicamente por primera vez. Redirigir el flujo de carbono a través de la vía de fosfocetolasa heteróloga en
cianobacterias recombinantes dio como resultado la producción de FAEE a partir de CO2. La optimización del
cultivo condujo a la producción fotosintética de FAEEs (10.0 ± 0.7 mg / L / OD730) de CO2.
Para una producción mejorada, un enfoque de biología de sistemas (es decir, transcriptómica o metabolómica)
podría ser útil para comprender el cuello de botella del metabolismo celular en cianobacterias para la producción
de FAEE y su toxicidad celular. La optimización adicional de nuestras cepas de cianobacterias es necesaria para
permitir la producción de FAEEs a partir de CO2.
La ingeniería del genoma guiada por ARN programable reciente y la ingeniería metabólica podrían aplicarse
para mejorar la producción de FAEEs de CO2 como un candidato potencial para biodiesel.

Figura 3. FAEEs fotosintéticas producidas a partir de CO2 en S elongatus PCC 7942 modificado. Se cultivaron
cepas de S elongatus PCC 7942 modificadas con 5% (v / v) de burbujeo de CO2 en presencia de una superposición
de hexadecano al 20% (v / v). Las mediciones del crecimiento celular, la producción de etanol (mg / L) y la
producción específica de FAEEs (mg / L / OD730) se realizaron para las cepas recombinantes. Las muestras
extraídas in situ del recubrimiento de hexadecano utilizando cepas de S. elongatus modificadas mediante
ingeniería genética se analizaron usando GC-MS. La producción de FAEE en celdas y la superposición de
hexadecano se representan como barras grises y barras verdes, respectivamente.
Se muestran los tiempos de retención de FAEEs y nonadecanoato de metilo usados como patrón interno (IS). Los
genotipos de las cepas recombinantes Se2Et, Se1A-2Et y Se1AXP-2Et se describen en la Tabla 1. Todos los datos
son la media ± desviación estándar de los cultivos administrados por triplicado.