Procedimiento para extracción de ADN Código: P-VEC-010

proveniente de simúlidos para la

detección de Oncocercosis Edición: 00
Macro-Proceso: Proceso Interno:
Laboratorios de Centro de
Fecha
Vigilancia Referencia Aprobación:
09/08/2018
Epidemiológica y Nacional de
Referencia Nacional Vectores

INDICE

Página

1. Objetivo 2

2. Alcance 2

3. Responsable 2

4. Definiciones 2

5. Descripción del Procedimiento 2

6. Referencia Bibliográfica 8

7. Registros 9

8. Anexos 9

9. Historial de Modificaciones 9

Elaborado Revisado Aprobado

Analista del Laboratorio de Responsable del Laboratorio
Coordinadora Zonal 9
Vectores de Vectores

Firma Firma Firma

Ing. Paúl Beltrán MSc. Diego Morales Dra. Mayra Wilca
Fecha: 26/12/2018 Fecha: 27/12/2018 Fecha: 2/12/2018
 Procedimiento para extracción de ADN Código: P-VEC-010
proveniente de simúlidos para la
detección de oncocercosis Edición: 00
Macro-Proceso:
Proceso Interno:
Laboratorios de
Centro de Fecha
Vigilancia 09/08/2018
Referencia Nacional Aprobación:
Epidemiológica y
de Vectores
Referencia Nacional

1. Objetivo

Establecer un protocolo estandarizado de extracción de ADN proveniente de moscas la familia

Simuliidae (simúlidos) para la detección de nemátodos del género Onchocerca causantes de la
enfermedad de oncocercosis.

2. Alcance
El presente procedimiento aplica desde la recepción del material biológico hasta el reporte de
los resultados.

3. Responsables

Responsable del Laboratorio de Vectores: Es el encargado de supervisar lo indicado en este

documento se realice adecuadamente.

Analista: Es el encargado de llevar a cabo las actividades que se detallan en este documento.

4. Definiciones

 Extracción de ADN: La extracción consiste en la separación y purificación del ADN con el

fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo.
 Simúlidos: Insectos voladores que pertenecen al orden de los dípteros, familia Simuliidae;
conocidos genéricamente como moscas negras.
 Oncocercosis: Enfermedad parasitaria causada por la picadura de moscas negras; éstas
moscas transmiten un gusano nemátodo del género Onchocerca.

5. Descripción del procedimiento

Consideraciones generales
 Añadir etanol al 95% a la solución (CWA; Column Wash Solution).
 Calentar el baño María a 58°C.
 Preparar solución de Proteinasa K a 20 mg/mL (Proteinasa K no incluida en el Kit).

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Epidemiológica y
de Vectores
Referencia Nacional

 Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente.

Instructivos,
Responsable SEC Descripción de Actividad Registros
Asociados
Recepción de material biológico

Recibir y colocar el material biológico en el lugar del laboratorio

asignado, de manera que las muestras no tengan contacto alguno
con reactivos, cambios bruscos temperatura, no se muevan o se
F-VEC-001,
Analista 01 golpeen exageradamente.
F-VEC-002

El analista se asegurará que el material biológico esté

debidamente etiquetado al momento de la recepción.

Las muestras serán transportadas a una temperatura de 4°C.

Protocolo de extracción

Formar pools de cabezas y pools de cuerpos con 50 individuos por

cada Eppendorf.

Rotular adecuadamente cada Eppendorf.

Analista 02 N/A

Preparar la solución de digestión siguiendo los volúmenes

detallados en la tabla adjunta (para evitar errores de pipeteo, se
recomienda preparar una solución madre, ver Anexo 1).

Dispensar 279 µL de la solución de digestión en cada Eppendorf.

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Instructivos,
Responsable SEC Descripción de Actividad Registros
Asociados

Triturar las muestras con el homogeneizador mecánico (para una

homogenización completa, colocar la muestra entre la pared del
tubo y el pistilo de maceración y, durante el proceso, evitar la
formación de burbujas).

Incubar la muestra por 3 horas a 58°C.

Homogenizar la muestra mediante vórtex por 30 segundos.

Opcional: En el caso de existir tejido sin digestión, centrifugar la

muestra por 1 min a 3000 x g y recuperar el sobrenadante en un
nuevo Eppendorf. Colocar la muestra a 58°C por 2 minutos antes
de continuar con los siguientes pasos.

Agregar 250 µl de Wizard SV Lysis Buffer en cada muestra y agitar

por vortex durante 20 s.

Procesar los tejidos lisados tan pronto como sea posible después
de haber agregado Wizard SV Lysis buffer (el lisado debe
mantenerse caliente).

NOTA: Si el lisado no puede ser procesado inmediatamente,

entonces congelarlo a -70°C. Para continuar con el proceso de
purificación, los lisados congelados deben ser calentados a 55°C
por una hora antes de continuar.
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Instructivos,
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Asociados

Preparar las columnas Wizard SV Minicolumn y los tubos de

colección para cada uno de los productos lisados.

Etiquetar adecuadamente las columnas y los tubos de colección

con el número de muestra.

Transferir el volumen de la solución a una columna de extracción.

Incubar la solución en la columna por 1 min.

Centrifugar a 13000 x g por 3 min y, del tubo colector, descartar el

precipitado y colocar, nuevamente, la columna (que contiene el
ADN de interés) en el tubo colector.

NOTA: Si parte del lisado se mantiene en la columna, repetir la

centrifugación durante 1 min.

Agregar 650 µl de Column Wash Solution (previamente preparado

con etanol al 95%).

Centrifugar a 13000 x g por 1 minuto.

Descartar el precipitado y colocar, nuevamente, la columna con el

ADN de interés en el respectivo tubo colector.

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Instructivos,
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Asociados
Repetir los pasos de lavado tres veces para obtener un total de
cuatro lavados de las columnas.

Vaciar las columnas y centrifugarlas a 13000 x g por 2 min para así

secarlas.

Transferir las columnas a un nuevo tubo colector de 1.5 mL.

Añadir, a las columnas, 50 µL de Nuclease-Free Water.

Incubar a temperatura ambiente por 3 min. Centrifugar por 1 min a

13000 x g.

Repetir el último y penúltimo pasos indicados anteriormente; en los

que se añaden 50 µL de Nuclease-Free Water en cada columna.

Desechar la columna y almacenar el ADN a -20ºC.

Protocolo PCR
Preparación de tubos

Los productos de la PCR a ser amplificados se llevan a una

Analista 03 solución, de volumen total de 50 uL, constituida por: N/A
60 mM Tris-HCl (pH 9.0)
15 mM (NH4)2SO4,
2 mM MgCl2,
0.2 mM de los nucleótidos: dATP, dCTP, dGTP y dTTP,
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Instructivos,
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Asociados
0.5 uM de cada primer,
2.5 unidades de Taq polimerasa y,
2.5 uL de la muestra de ADN

Las secuencias de cada primer a utilizar son las siguientes:

Foward: 5´ GATTYTTCCGRCGAANARCGC 3´
Reverse: 5´ B-GCNRTRTAAATNTGNAAATTC 3,

Donde:
N = A, G, C, T
Y = C, T
R = A, G
B = Biotina

CICLADO
Las condiciones para el ciclado son:
5 ciclos de 1 min a 94°C,
2 min a 37°C y,
30 s a 72°C
seguido de:
35 ciclos de 30 s a 94°C,
30s a 37°C y,
30 s a 72°C

La reacción se completa mediante incubación a 72°C por 6 min.

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Asociados
Las reacciones se llevan a cabo en sets de 96 para lo que se
incluyen 2 controles negativos y 2 positivos (Los controles positivos
consisten en 1 ng de ADN plásmido pOVS134 - concentración final
20 pg / µl - y los controles negativos consisten en 5 µl de agua
destilada).

NOTA: El equipo a ser utilizado para el procedimiento de PCR es

CFX96 Touch Deep Well BIO RAD.

Reporte de resultados
Quipux
Responsable 04 Entregar a al personal o a las entidades requirentes un informe con
Informe
los resultados referentes a la presencia o ausencia de nematodos
del género Onchocerca.

6. Referencia Bibliográfica

Rodríguez-Pérez, M; Gopal, M; Adebayo, M. Detection of Onchocerca volvulus in Latin American

black flies for pool screening PCR using high-throughput automated DNA isolation for
transmission surveillance, 2013. DOI: 10.1007/s00436-013-3583-0.

Lagatie, O; Merino, M; Batsa, L; Debrah, A & Stuyver, L. An isothermal DNA amplification method
for detection of Onchocerca volvulus infection in skin biopsies. 2016. DOI: 10.1186/s13071-016-
1913-7.

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Referencia Nacional

7. Registros
Registro de colecta en campo (F-VEC-001).

Registro para recepción de muestras (F-VEC-002).

Informe.

8. Anexos

Anexo 1. Tabla de volúmenes para la preparación de la solución de digestión.

Volumen por
Master Mix Volumen por muestra
N(muestras)

Solución para digestión (µL) (µL)

Nucleic Lysis Solution 200 (N+1) * 200

EDTA [0,5 M] 50 (N+1) * 50

Proteinasa K [20 mg/mL] 20 (N+1) * 20

RNase A solution 5 (N+1) * 5

Dithiothreitol [1M] 4 (N+1) * 4
Total 279 (N+1) * 279

9. Historial de modificaciones

EDICIÓN FECHA CAUSA DE LA MODIFICACION

00 09/08/2018 Versión Inicial

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