UNIVERSIDAD NACIONAL DEL

SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA

E.A.P Agroindustria

Título: Azucares Reductores

Nombre: Rodríguez Morales Fiorela

Curso: Análisis Instrumental de Productos Agroindus.

Profesor: Julio Abraham Acuña

Ciclo: VI

Código: 0201612048
 PRACTICA 08:
DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES DE UN ALIMENTO POR
ESPECTROFOTOMETRÍA (MÉTODO DNS)

I. INTRODUCCIÓN

La determinación cuantitativa de los monosacáridos se realiza, frecuentemente

basándose en su oxidación en solución alcalina mediante Cu2+, Ag+, o
ferrocianuro, originándose una mezcla de azucares ácidos. En otras palabras los
monosacáridos pueden reducir a los compuestos mencionados por lo que reciben el
nombre de azucares reductores.

Hoy en día la industria alimenticia utiliza varios tipos de métodos analíticos parala
determinación azúcar y alcohol en los licores y/o bebidas a utilizar como medio de
venta. Uno de los métodos más acordes y con mejor resultados en la determinación
de los azucares con carácter reductor, es el método (DNS), método que ha sufrido
varias modificaciones a través de los años para adecuarse al análisis de diferentes
materiales y su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido
a que es un método espectrofotométrico;

El procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los
azúcares reductores presentes en la muestra, sin embargo a nivel industrial no es
recomendable utilizarlo cuando dicha trata sustancias tales como mieles y caldos
defermentación que lo contengan, esto debido a según estudios realizados en la
materia, a los altos niveles de dispersión. El presente informe desarrollara el
procedimiento respectivo para la determinación de azucares reductores a partir de
una solución patrón de glucosa de concentración 1g/L, que permitirá realizar y
ajustar una curva de calibración, y una solución desconocida; por el método delácido
3,5 dinitro salicílico (DNS).
II. MARCO TEÓRICO

El método DNS (técnica de miller) es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5
dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra.
Determina las absorbancias por medio de un espectrofotómetro a 540nm. Esta
técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una
fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. La curva
de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas, de la
Absorbancia (eje de ordenadas: Y) frente a la Concentración (eje de abscisas: X).
Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus
absorbancias, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. La
concentración de una solución problema (desconocida), se averigua por
interpolación de la Abs de la solución en la curva de calibración, o a través de la
ecuación de la recta (y = mx + b) donde: Absorbancia (y) = constante (m) x
concentración + absorbancia del blanco. Fundamento. El DNS reacciona
únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un disacárido no reductor,
pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son
reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La
intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es
proporcional a la concentración de sacarosa.

III. OBJETIVOS

o El alumno utilizara un método espectrofotométrico para azucares

o Preparar una curva patrón de glucosa con el 3,5-dinitrosalcílico (3,5 - DNS)

IV. MATERIALES Y METODOS

 Tartrato de Sodio y  Zumo de mango

Potasio
 Zumo de naranja
 Hidróxido de Sodio
 Vasos de
 Metabisulfito de precipitación
Sodio
 Tubos de ensayo
 Reactivo DNS
 a. Procedimiento

Se extrajo el zumo de mango cortando pequeños pedazos, colocándolos en un

mortero para triturarlos, luego se filtró utilizando una gaza. De igual forma se
extrajo el zumo de naranja filtrando con una gaza para obtener el zumo lo más
puro sin ninguna impureza.

Se pesó 0.1 gramos de glucosa luego se colocó en una fiola de 100 ml,
posteriormente se aforo. Después se extrajo 1 ml, 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml
de la fiola anterior colocando cada cantidad en una fiola distinta y aforando cada
una con agua destilada. Obteniéndose concentraciones de concentraciones 0.2,
0.4, 0.6, 0.8, 1.0.

Luego se extrajo 1 ml de cada concentración y de cada zumo y se colocaron en

distintos tubos de ensayo, después se le añadió a cada tubo 1 ml de DNS a cada
tubo luego se llevaron a la ebullición por 10 min, se dejaron enfriara y finalmente
se llevaron al espectrofotómetro a 540 nm para leer su absorbancia.

V. RESULTADOS

concentración absorbancia
2 ml 0.0042
4ml 0.0048
6 ml 0.0065
8 ml 0.0087
10 ml 0.0108
1 ml de mango 0.8198
 0.012

0.01

0.008
Absorbancia

0.006

0.004 y = 0.0017x + 0.0019

R² = 0.9663
0.002

0
0 1 2 3 4 5 6
Concentracion

𝑌 = 𝑚𝑥 + 𝑏𝑋 = (𝑦 − 𝑏)/𝑚
𝑦 = 0.0017𝑥 + 0.0019

𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = (𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) 𝑥 𝑑𝑖𝑙.

Concentración 0.2

𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = (𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) 𝑥 𝑑𝑖𝑙.

0.0042
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = ( )𝑥1
0.0017
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 2.4705

Concentración 0.4

𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = (𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) 𝑥 𝑑𝑖𝑙.

0.0048
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = ( )𝑥1
0.0017
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 2.8235
Concentración 0.6

𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = (𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) 𝑥 𝑑𝑖𝑙.

0.0065
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = ( )𝑥1
0.0017
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 3.8235

Concentración 0.8

𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = (𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) 𝑥 𝑑𝑖𝑙.

0.0087
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = ( )𝑥1
0.0017
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 5.1176

Concentración 1.0

𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = (𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) 𝑥 𝑑𝑖𝑙.

0.0108
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = ( )𝑥1
0.0017
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 6.3529

VI. CONCLUSIONES

Con esta práctica pudimos determinar de manera cuantitativa la concentración de

azucares en determinadas muestras con concentraciones conocidas para poder
obtener dos curva patrón de la absorbancia en la muestra y nuestras
concentraciones u/o diluciones como ya observados, con las curvas obtenidas se
realiza una gráfica de tendencia lineal que se ajusta a los datos, el R2 obtenido para
la ecuación de la recta 0.9663

El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido dinitrosalicílico

para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la
determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores. Así
comprobamos también que la espectrofotometría es el método de análisis óptico
más adecuado para la determinación de una concentración en una muestra. Dicho
de otro modo es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o
transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y
una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia en este caso la
glucosa.

VII. DISCUSIONES

Las posibles razones de la diferencia en los resultados ser la manipulación ya que

el análisis fueron realizados por la misma persona y error cometido es diferente. Otra
de las razones seria al momento de preparar la disolución por un mal manejo de
nosotros las prácticas, a falta de práctica en el manejo de los instrumentos.

VIII. BLIBLIOGRAFIA

- Borsfort R. y Scholz, M. 1964. Spektroskopische Methoden in der organischen.

Chemie. Berlin.
- Jacobs M. 1962. The Chemical Analysis of Foods and Food Products – Third
Ediition. D. van Nonstrand Company. INC.
- Sánchez. D. 1995. Instrumentación en Bioquímica. Concejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONCYTEC). Lima.
- Walton y Reyes. 1978. Análisis Químico e Instrumental Moderno. Editorial
Reverté S.A. España.
IX. CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los métodos que determinan cualitativamente los azucares

reductores? Descríbelos.

 La reacción o prueba de Benedict. Identifica azúcares reductores (aquellos

que tienen su OH anomérico libre), como la lactosa, la glucosa, . En
soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu2+ que tiene color azul a Cu+, que
precipita de la solución alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. El
fundamento de esta reacción radica en que en un medio alcalino, el ion
cúprico (otorgado por el sulfato cúprico) es capaz de reducirse por efecto del
grupo Aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se
observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso
(Cu2O). y todo esto por que conta de Sulfato cúprico; Citrato de sodio;
Carbonato anhidro de sodio. Esta ración dio positiva para la lactosa y glucosa
porque en el medio alcalino facilita que el azúcar esté de forma lineal, puesto
que el azúcar en solución forma un anillo de piranósico o furanósico. Una vez
que el azúcar está lineal, su grupo aldehído que tiene un oh libre que puede
reaccionar con el ion cúprico en solución; en la sacarosa, no dan positivo
puesto que sus OH anoméricos están siendo utilizados en el enlace
glucosídico. En resumen, se habla de azúcares reductores cuando tienen su
OH anomérico libre, y éstos son los que dan positivo en la prueba de
Benedict.

 Reacción de Seliwanoff: Los carbohidratos se clasifican como cetosas o

aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una función
cetona, que en presencia de un ácido fuerte producen rápidamente derivados
furfúricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que está
contenido en el reactivo de Seliwanoff. La fluctos da positiva porque
pertenece al grupo cetona y como Esta prueba es específica para cetosas y
se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro- metil-furfural y su posterior
condensación con resorcinol formando así complejos coloreados rojo o
rosado. La razón por que dio negativo en la glucosa es sencillo porque esta
pertenece al grupo aldehído como ya aviamos mencionado anterior mente y
de esta forma no puede reaccionar con esta reacción.
  Reacción de molish: En la reacción de Molish, el agregado de ácido
sulfúrico concentrado a a la leche provoca la deshidratación del glúcido en la
interfase, para dar un anillo de furfural o hidroximetilfurfural que reacciona
con alfa-naftol, para dar un producto de color púrpura. La presencia de
carbohidratos en nuestra muestra se pone de manifiesto por la reacción de
Molisch, Basada en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico
sobre los hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza
la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a
furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos
furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción
de Molisch) dando un producto coloreado.

2. Explique por qué la sacarosa y el almidón no son reductores.

La sacarosa: no presenta poder reductorporque la unión glucosídica se estable

ceentre el carbono 1 de la glucosa y el carbono 2 de la fructosa, con lo cual se
estabilizan las estructuras cíclicas, pues se constituye un acetal y no queda
ningún hemiacetal capaz de dar una cadena abierta por hidrólisis.
El almidón: se considera un azúcar no reductor porque a pesar de que tiene
carbonos anoméricos libres capaces de oxidarse, hay muy pocos en
comparación a la cantidad de unidades de monosacáridos que componen el
almidón. Es decir, solo los de los extremos de la larga cadena que compone al
almidón, puede oxidarse y calculando que una cadena de almidón (que a su vez
tiene ramificaciones) tiene más de 10000 residuos de monosacáridos, entonces
se concluye que si bien el almidón puede oxidarse, su poder de reductor es
prácticamente nulo debido al muy bajo rendimiento y que la cantidad de
carbonos libres son muy pocos, conociéndose esto como un azúcar no reductor.

3. ¿Qué función cumple el blanco en la medición de absorbancia?

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia

de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la
misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución
patrón o estándar. La absorbancia de una solución es la resultante de la
absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros
 componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa
longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe
descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer
siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos
aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de
éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el
blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de
transmisión.

X. ANEXOS

Imagen 1: Concentraciones de glucosa Imagen 2: Concentraciones de glucosa con

DNS

Imagen 3: Zumo de mango Imagen 4: ebullición de las soluciones

de glucosa más DNS