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Universidad de Los Andes | Biología Molecular

Estudio fenético en el cual se evalúa la divergencia de


la cepa Escherichia coli C600 con respecto a distintas
enterobacterias.
Carlos A. Ariza C., Juan F. González V., Valeria Salazar.

RESUMEN
E. coli, es una bacteria del orden enterobacteriales, la cual ha sido ampliamente
estudiada en el ámbito científico. Respecto a esto, se han estudiado diferentes
cepas de E. coli, las cuales tienen diferentes mutaciones genéticas debidas a
diversos factores, ya sea resistencia a antibióticos o por aspectos ambientales.
En este caso se estudió a la cepa E. coli C600, la cual es una cepa ampliamente
modificada genéticamente, por lo tanto su relación con otras cepas de la misma
especie bacteriana se puede considerar relativamente lejana. Empleando
electroforesis en gel de poliacrilamida, se evaluó la cantidad de proteínas
expresadas por E.coli W, E.coli K12, E.coli C600, Yersinina enterocolitica,
Proteus sp, Salmonella sp. A partir de los resultados obtenidos, se encontró que
aunque la cepa de E. coli C600 presenta variabilidad proteica, con respecto a
otras cepas de la misma especie, están no están muy alejadas fenéticamente
entre sí.
Palabras clave: E.coli-C600, proteoma, divergencia fenética.

INTRODUCCIÓN
Los mecanismos moleculares para la El proteoma, el cual hace parte del
trasferencia de información biología ya sea mecanismo de traducción en los seres
vertical u horizontal, han sido vivos y, al ser codificado por el genoma,
ampliamente estudiados, a partir de estos permite el estudio del organismo en el que
mecanismos, los cuales son, replicación, es expresado, ya que esta totalidad de
traducción y transcripción se han proteínas le confiere características de
desarrollado técnicas que se emplean funcionalidad esenciales para la
generando avances en el ámbito científico, supervivencia de un organismo en cierto
dando explicación a procesos asociados a ambiente especifico. Si bien, el campo de
procesos metabólicos o bioquímicos, y la proteomica, es relativamente nuevo que
dando solución a problemáticas se basa en la espectrometría, ha sido de
relacionadas con el desarrollo social y gran ayuda en áreas médicas por ejemplo,
científico. Esta investigación se enfoca en
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en la determinación de condiciones producidas en determinada etapa del ciclo


fisiológicas y patológicas generadas por celular, de las cepas de E. coli (W, K12,
cierto tipo de bacterias. C600), Proteus sp., Salmonella sp. y
Yersinia enterocolitica estudiadas en
En el ámbito bacteriológico, la familia
nuestra investigación. Debido a las
enterobacteriaceae agrupa
modificaciones aplicadas con fines
filogenéticamente bacterias Gram
investigativos a E. coli C600, su genotipo
negativas y anaeróbicas facultativas, esta
resultó siendo: thr-1, leuB6, lacY1,
última característica es la que les permite
supE44, rfbD1, thi-1, mcrA1, cyn-1
fermentar carbohidratos como glucosa y
(Category:Strain:C600, 2011), por lo tanto
lactosa en ausencia o con pocas cantidades
se puede deducir que E.coli C600 presenta
de oxígeno, consecuente a esto, dichos
menor parentesco con otras cepas de su
organismos se caracterizar por generar
propia especie y esto conlleva a que se
infecciones en el tracto digestivo de los
pueda relacionar en mayor proporción con
seres humanos con una prevalecía global,
otras especies.
por ende esta característica confiere un
grave problema de salud pública a nivel MATERIALES Y MÉTODOS
mundial.
Selección de cepas y cultivo bacterial
Primeramente E. coli puede comportarse
Para realizar el estudio se utilizaron tres
como patógeno oportunista en infecciones
cepas de Escherichia Coli ( K12, C600 Y
respiratorias donde el paciente presenta un
W) , una cepa de Proteus sp., una cepa de
sistema inmune suprimido (tasa de
Salmonella sp y una de Yersinia sp.
mortalidad del 50%). Además, tiene alta
incidencia en infecciones asociadas al Se hizo un cultivo ON de bacterias en
tracto urinario y es responsable de la caldo lb a una agitación de 120 RPM la
mayoría de casos asociados a meningitis noche anterior a la recolección de la
bacterias en recién nacidos e infantes. Por muestra para que estas se reprodujeran
otro lado, Proteus sp. Es también significativamente.
responsable de infecciones en el tracto
urinario, especialmente en huéspedes con Extracción y visualización de proteínas
tracto urinario funcionalmente deficiente; La extracción de proteínas se llevó a cabo
en cuanto, a Salmonella sp. Es responsable mediante la centrifugación de cada una de
de patologías como la fiebre tifoidea, las muestras de cada cepa (por cinco
gastroenteritis aguda, bacterimia e minutos a 13.000 RPM) y se empleó buffer
infecciones focales. En cuanto a Yersinia de muestra que contiene detergente SDS,
sp., es capaz de desarrollar afecciones glicerol, azul de bromofenol y DTT a
como diarrea, septicemia o adenitis, 100°C por un tiempo aproximado de 5
dependiendo de la especie. (Rodriguez y minutos.
Puertas).
La visualización de las proteínas se hizo
De acuerdo a lo dicho anteriormente el mediante un gel de poliacrilamida, en el
objetivo del presente artiulo es establecer gel de separación se utilizó per-sulfato de
relaciones feneticas entre diferentes amonio al 10%, así como solución de
bacterias, todo esto a partir de proteínas
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acrilamida concentrada de 3.5% a 20 %, remplazando la solución de destinación


solución de pH 8.8% (básico), agua y por una nueva.
TEMET; en el gel de agrupamiento se usó
Análisis de relaciones fenéticas.
per-sulfato de amonio al 10%, solución de
acrilamida, TEMET, agua (H2O) y Para poder identificar las relaciones
solución de pH ácido 6,8. fenéticas entre las cepas E.coli-C600, Eco-
W, Eco-K12, Salmonella sp, Yersinia sp y
Una vez completado el proceso anterior se
Proteus sp, se utilizó| un método mediante
realizó el corrido electroforético, mediante
el programa PAST 3X- The past of the
la aplicación de 150V durante un tiempo
future.
de 90 minutos; el fijado se produjo a la
acción de 50% de etanol, 10% de ácido Neighbor-Joining (NJ)
acético y 40% de agua des ionizada ,
cuando se terminó la electroforesis se - El principio de este método es
vertió la solución de fijado en unas cubetas encontrar pares de unidades
Pade tinción; por último se vertió el gel en taxonómicas operativas (OTU [=
la cubeta con la solución de fijado y esta a vecinas]) que minimicen la
su vez se guardó en una bolsa de Ziplock a longitud total de la rama en cada
cuatro centígrados durante ocho días. etapa del agrupamiento de OTU a
partir de un árbol en forma de
Tinción de proteínas estrella.
- El uso de este método permite
Se usó la técnica de tinción con azul
obtener rápidamente las longitudes
Coomassie. Para la tinción se usó una
de las ramas y la topología de un
solución de 100mL la cual contenía 50%
árbol parsimonioso.
de metanol, 10% de ácido acético; 40% de
agua des ionizada y 0.05% de Coomassie
y se dejó en agitación contigua de Unweighted Pair Group Method using
aproximadamente 60 RPM a 37C por 45 Arithmetic averages. (UPGMA).
minuto.
Para la distinción se preparó una solución
- El método UPGMA es un método
de 100 mL, la cual constaba de 50%
basado en la agrupación
metanol, 10% de ácido acético y 40% de
secuencial, este inicia mediante la
ácido acético de agua destilada; luego
agrupación de los dos OTU’s con
agregamos 30 mL de esta solución de
la menor distancia.
distinción al gel y se dejó en agitación
constante de aproximadamente 50 RPV a
- Un nodo interior es colocado en el
37 grados centígrados por 10 minutos, este
punto medio entre ellos y se crea
proceso se repitió hasta que los dos OTU’s
una matriz reducida al considerar
con la menor distancia.background fue
el nuevo grupo como un único
bajo (es decir que la coloración de fondo
OTU.
se había desvanecido bastante y se
lograban observar de mejor manera las
bandas.) Cada repetición se hizo
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RESULTADOS
Se obtuvo mediante el programa PAUP
dos árboles de relación fenética, uno de
A partir de la electroforesis se logró
ellos con el algoritmo NJ y el otro con
identificar cierto número de proteínas en
UPGMA. Las muestras usadas son los
cada cepa bacteriana, En la Figura 1 se
siguientes tipos de células bacterianas: E.
observa que entre las bacterias comparadas
coli C600. Salmonella sp., Yersinia
la expresión proteica varía, teniendo E.coli
enterocolitica, Proteus sp. En la Figura 2,
C600 aproximadamente 19 proteínas
es utilizado el algoritmo NJ (Neighbour-
expresadas, Yersinia enterocolitica,
joining) estas muestras se encuentran
aproximdamente 21 proteínas expresadas,
relacionadas de la siguiente manera: la
E. expresadas, Proteus sp. 22 proteínas
primera y la segunda están en diferentes
aproximadamente expresadas, E. coli W
bifurcaciones; donde se evidencia a
aproximadamente 17 proteínas coli K12
Proteus sp. y a Salmonella sp. en una
aproximadamente 25 proteínas expresadas
misma bifurcación; esta bifurcación a su
y Salmonella sp. 24 proteínas expresadas
vez está bajo un mismo nodo junto a
aproximadamente.
Proteus sp., E. coli W y E. coli K12 están a
su vez unidas entre sí bajo una misma
bifurcación que a su vez están unidas en un
mismo nodo junto a E.coli C600, por
aparte.
En la Figura 3, es utilizado el algoritmo
UPGMA, donde las muestras se ven
relacionadas de la siguiente manera: al
principio se generan dos bifurcaciones; en
la primera, hay tres (3) de las seis (6)
muestras separadas por una bifurcación
más, donde E. coli C600, se encuentra
aislado y de las muestras de E. coli K12 y
E. coli W separadas entres si por otra
Figura 1: Gel de electroforesis; columnas bifurcación; la segunda bifurcación se
de izquierda a derecha: E.coli W, E.coli K12,
E.coli C600, Proteus sp., Yersinia
encuentran, al igual que en la primera, una
enterocolitica,Salmonella sp.. primera separación que aísla la muestra de
Proteus sp. de las otras dos (2) muestras de
Relaciones feneticas según los Salmonella sp. y Yersinia enterocolitica
algoritmos neighbor-joining y separadas entre sí por una última
Unweighted pair Group method using bifurcación.
Arithmetic averages
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en la cual difieren poco con respecto a las


pruebas bioquímicas de cada especie.
Las cepas de E. coli están estrechamente
relacionadas entre sí por sus amplias
similitudes proteómicas, sin embargo
E.coli C600 se evidencia como grupo basal
con respecto a las demás cepas. Lo
anterior, debido a que esta última ha sido
modificada en gran medida, por lo tanto,
su expresión de proteínas es distinta.
Y. enterocolitica y Salmonella sp. están
relacionadas entre sí y a su vez su
expresión proteica es parecida a la que
Figura 2. Árbol de relaciones fenéticas obtenido por el
algoritmo NJ.
presentan las cepas mutadas de E. coli,
estas similitudes se ven reflejadas en
pruebas bioquímicas como: fermentación
de lactosa, Movilidad a 35ºC, producción
de Ureasa, utilización de Citrato
producción de SH2, en las cuales
presentan resultados parecidos (Merino &
Losch).
Proteus sp. Se caracterizó por ser un
outgroup en el árbol de relaciones
fenéticas, debido a que esta bacteria difiere
de las otras en ciertas pruebas bioquímicas
como: fermentación de Lactosa, movilidad
a 35ºC, producción de Ureasa, utilización
Figura 3. Árbol de relaciones fenéticas obtenido por el de Citrato y producción de SH2.
algoritmo UPGM

CONCLUSIÓN
DISCUCIÓN
Este estudió exploró las relaciones
Se observan diferencias entre los arboles fenéticas entre diferentes cepas de E. coli
de relación fenética, esto debido a que se y otras bacterias del orden
utilizaron distintos algoritmos para enterobacteriacea, dando a un mayor
analizar los datos obtenidos en la énfasis en la cepa E.coli C600, se esperaba
electroforesis. Sin embargo, el árbol que que la cepa en cuestión presentara una alta
más se acercó a la realidad según variación con respecto a las otras cepas y
investigaciones pasadas fue el realizado especies estudiadas, esto debido a la gran
con el algoritmo UPGMA, porque, en este cantidad de modificaciones genéticas que
las bacterias se relacionan de una manera se le han hecho a E.coli C600. Sin
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embargo es importante resaltar que aunque


esta cepa es ampliamente modificada
genéticamente, se esperaba que tuviera
más relación con las cepas de su misma
especie que con proteus sp., Yersinia
enterocolitica y Salmonella sp.,.
Con respecto a los resultados, se concluye
que efectivamente presenta lejanía a las
cepas de su misma especie pero mucho
más lejanía con las otras especies
estudiadas. Sin embargo, los datos aquí
presentados no son suficientes para
determinar que efectivamente presenta una
relación más estrecha con las cepas de su
misma especie que con las otras bacterias
evaluadas.
REFERENCIAS

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