MÉTODOS DE DETECCIÓN Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

Integrantes: Carla Garrido.

Daniela Herrera.
Maycol Miranda.
Yessica Ruíz.

Docente: Dr. Jorge Vera Garcés.

Asignatura: Bioquímica Clínica Básica.

27 agosto de 2018.-

INTRODUCCIÓN
La determinación de concentración de proteínas por colorimetría es una técnica de rutina en
los laboratorios donde se busca cuantificar la cantidad de proteína que hay en una muestra
biológica por ejemplo. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas por
colorimetría, una de ellas es la reacción química con el reactivo de Biuret que le otorga un
color violeta a la solución debido a la formación de un complejo de coordinación entre el
𝐶𝑢+2que se encuentra en el reactivo de Biuret en medio alcalino y los péptidos, polipéptidos
o proteínas que sean cuantificar. Se deben utilizar las técnicas de colorimetría ya que la
mayor parte de las proteínas no absorben en el espectro de luz visible.

Materiales:

● 8 tubos de ensayo
● Gradilla
● Micropipetas
● Vaso precipitado
● Baño termoregulador
● Espectrofotómetro
● Cubeta de plástico
Reactivos:

● Reactivo de Biuret
● Albúmina
● Suero fisiológico
OBJETIVOS

● Conocer distintos métodos de detección y cuantificación de proteínas.

● Realizar curvas de calibración para cada método.
● Determinar la concentración de proteínas para una muestra desconocida.

METODOLOGÍA

a) Para realizar la curva de calibración del método de Biuret se utilizaron diferentes

concentraciones del estándar BSA. Se comenzó rotulando 8 tubos de ensayo en los cuales
se añadió con micropipeta las siguientes soluciones (observar tabla nº1). Después de realizar
la mezcla de los reactivos con el estándar, se procedió a homogeneizar e incubar la
reacción a Tº ambiente (37ºC) por 10 minutos. Luego se utilizó un espectrofotómetro para
medir Absorbancia, el cual hay que calibrar con un blanco de reactivo, las absorbancias
fueron medidas a una longitud de onda de 540 nm.

Tabla Nº1:

Tubos 0 1 2 3 4 5 6 7

ALBÚMINA(5 mg/dl) (UL) 0 100 200 300 350 400 450 500

SUERO FISIOLÓGICO (UL) 500 400 300 200 150 100 50 0

REACTIVO DE BIURET(ML) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

b) Posteriormente para la cuantificacion de proteinas de la muestra problema, se

prepararon 2 diluciones iguales a partir de esta muestra problema, la dilución se hizo en
suero fisiológico. Una vez rotulados los tubos se añadió con micropipeta 200 ul de
albúmina, 300 ul de suero fisiológico y 1 ml de reactivo de biuret , para el tubo A y el tubo B,
una vez realizado esto se incubó la reacción a Tº ambiente en un baño termoregulado por
10 minutos. Para medir absorbancia se calibró el equipo con el blanco de reactivo y se
midió absorbancia a 540 nm.

RESULTADOS

Al medir absorbancia en el espectrofotómetro se obtuvieron diferentes resultados, a los

cuales se calculó la concentración de proteínas en cada solución, además se obtuvo la
absorbancia por duplicado de la muestra problema. Los resultados son los siguientes:

Tubos 0 1 2 3 4 5 6 7
Blanco

Absorbancia 0 0,063 0,023 0,055 0,076 0,096 0,119 0,141

Concentración 0 1 2 3 3,5 4 4,5 5

albúmina
(mg / ml)

Muestra Muestra Promedio Muestra

problema 1 problema 2 problema

Absorbancia 0.211 0.180 0.1955

Concentración muestra 6.9

problema (mg/ml)

Se utilizó la siguiente ecuación para determinar la concentración de albúmina:

C1*V1=C2*V2

Ejemplo tubo Nº 1: 5 *100 = X * 500ml

X= 100*5/500
X= 1 mg/ml

Metodologías cálculo concentración MP.

1-INTERPOLACIÓN: En este método sabemos que tomando el punto de absorbancia

promedio de la muestra problema nos da una concentración de 6.9 mg/ml.
2-REGLA DE TRES: Tomando la absorbancia 0,141 con una concentración de 5mg/ml
podemos calcular cuánta concentración tienen los 0,195 de absorbancia de la muestra
problema.

abs 0,141→ 5 mg/ml

abs MP 0,195→ X mg/ml

X : 6.9 mg/ml (concentración mp)

3-ECUACIÓN DE LA RECTA: a través de esta ecuación podemos obtener la concentración

de la muestra problema.

1.(5 , 0,141) 2.(6,9 , 0,195)

𝑦2 − 𝑦1 0,195 − 0,141 0,054

((𝑚 = )𝑚 = = = 0,028)
𝑥2 − 𝑥1 6.9 − 5 1,9
[𝑦 − 𝑦1 = 𝑚 ∗ (𝑥 − 𝑥1)]
[𝑦 − 0,141 = 0,028 ∗ (𝑥 − 5)]
[𝑦 − 0,141 = 0,028𝑥 − 0,14]
[𝑦 = 0,028𝑥 − 0.14 + 0,141]
𝑦 = 0,028𝑥 + 0,001
[0,195 = 0,028𝑥 + 0,001]
0,001 + 0,195
[𝑥 = = 6.9]
0,028

4- FACTOR DE CALIBRACIÓN: Se puede extraer de la ecuación de la recta el factor de

calibración y obtener concentración de muestra problema.

𝑥+𝑐 6.9 + 0
FC= = = 35.4
𝑦 0.195
FC= 35.4 * 0.195= 6.9 mg/ml (concentración muestra problema)

MÉTODO DE MÍNIMOS CUADRADOS: Para obtener una recta en la gráfica se

utiliza este método, utilizando la siguiente expresión:

y=(
(6∗2,101)−(22∗0.51)) 𝑥 + ((0.51∗86.5)−(22∗2.101))
(6∗86.5)−484 (6∗86.5)−484
y=(0.0396x)+(-0.06)
y=0.0397x - 0.06

DISCUSIÓN:

Como se logró demostrar, el cálculo de concentraciones de proteínas es rutinario en los

laboratorios y para ello se debe contar un el equipo adecuado, así realizar una sola
medición que sea confiable y veraz. Algunos factores que pudieron tener influencia en los
resultado y en los datos obtenidos son el haber tenido de medir más de dos veces y en
espectrofotómetros distintos, además el estado del reactivo que no fue revisado por el
grupo, también pudo haber influido. A Pesar de esos puntos a destacar lo principal es
aprender a manejar el equipo y a utilizar los datos entregados por esto e interpretarlos.

BIBLIOGRAFÍA

● Bioquímica clínica ,Allan gaw, quinta edición,2015

● Análisis químico cuantitativo, 3° edición. Daniel C.Harris 2006