UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

ASIGNATURA:
BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS
DOCENTE:
ING. SONIA ZANABRIA GALVEZ
ALUMNAS:

AREQUIPA – PERÚ
2017
Tabla de contenido
Escribir el título del capítulo (nivel 1) ................................................................................................................. 1
Escribir el título del capítulo (nivel 2) ............................................................................................................... 2
Escribir el título del capítulo (nivel 3) ........................................................................................................... 3
Escribir el título del capítulo (nivel 1) ................................................................................................................. 4
Escribir el título del capítulo (nivel 2) ............................................................................................................... 5
Escribir el título del capítulo (nivel 3) ........................................................................................................... 6

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 INTRODUCCIÓN

Desde el punto de vista biotecnológico, el vino es el producto de complejas interacciones entre

levaduras y bacterias que comienza desde que el fruto está en la plantación y continúa a lo largo de
todo el proceso de fermentación, hasta el momento en que el producto es embotellado. En el proceso
de elaboración de vino de uva, el tipo y cantidad de aroma depende de varios factores:
microorganismos fermentantes, condiciones ambientales (suelo y clima), estado de la fruta, proceso
de fermentación, pH del mosto, cantidad de dióxido de azufre, aminoácidos presentes en el mosto
(Lilly et al., 2000).

En la industria del vino se realizan diferentes tipos de mediciones, para cuantificar la evolución
de parámetros como etanol, biomasa, azúcares, en el caso de los vinos de uva está bien estudiado
que aunque el tipo de uva y las condiciones de cultivo son claves en el sabor del vino, los
microorganismos (en especial las levaduras) tiene un papel muy importante en las características
organolépticas (Fleet, 2003). se puede concluir que la interacción entre la materia prima y el proceso
de elaboración en la bebida son los responsables de las propiedades organolépticas de las bebidas
alcohólicas provenientes de la fermentación.

Tradicionalmente la producción de vinos se ha realizado a partir de fermentaciones espontáneas de

los mostos llevadas a cabo por cepas de levaduras endémicas residentes en las superficies de las
uvas y de los equipos de las bodegas. Estas fermentaciones espontáneas de mostos son un complejo
proceso que involucra la acción de diferentes géneros y especies de levaduras e incluso bacterias El
uso de inóculos con poblaciones mixtas y/o inóculos secuenciales, constituye una herramienta
importante para estandarizar el producto y preservar aquellas características deseables.. Además
del Saccharomyces cerevisiae que es la especie de levadura más importante en microbiología del
vino.se han reportado muchas otras levaduras presentes en la fermentación del vino: Hanseniaspora
guilliermondii, Kloeckera apiculata (Romano et al., 1992, 1997a; Zironi et al., 1993; Gil et al., 1996),
Pichia anomala (Rojas et al., 2001), Candida stellata, Torulaspora delbrueckii (Ciani & Maccarelli,
1998), Candida valida, Bretanomyces bruxellensis, Rhodotorula aurantiaca, Deckera intermedia
(Mateo et al., 1991;) y Candida catarellii (Toro & Vázquez, 2002).

El aporte de este trabajo en términos de la biomasa se localiza en comparar los resultados obtenidos
en fermentaciones de vino a pequeña escala con aquellos que se obtienen en fermentaciones
industriales, afín de poder extrapolar el conocimiento adquirido en el análisis de los experimentos de
laboratorio.

3
I. OBJETIVOS

 Determinar la curva de crecimiento microbiano en el proceso de

vinificación (Saccharomyces cerevisiae)

II. REVISION BIBLOGRAFICA

En general, los vinos elaborados a baja temperatura son más aromá- ticos y mejor
valorados en el análisis organoléptico, pero, en contraposición, su fermentación
puede ser incompleta. Teniendo en cuenta los aspectos anteriormente
mencionados, se deduce la necesidad de llevar a cabo la fermentación a una
temperatura óptima. De acuerdo a investigaciones realizadas por otros autores, la
fermentación para la obtención de vino blanco debe ser realizada alrededor de los
18ºC (Santamaría et al., 1995).

2.1. Proceso de Obtención de vino

Las levaduras son los microorganismos que conducen la fermentación
alcohólica, luego de su inoculación en el mosto (jugo de uva). Poseen un
papel relevante al contribuir positivamente en la generación de aromas del
vino. Producen etanol, CO2, glicerol, enzimas que transforman los
precursores de aroma neutro de las uvas en aromas activos y cientos de
metabolitos secundarios, tales como ácidos, alcoholes, ésteres, fenoles
(Fleet, 2003; Swiegers et al., 2005).
convirtiendo al vino en una mezcla de compuestos, que provienen tanto
de las uvas como del proceso de elaboración del vino o fermentación (Conde
et al., 2007)
La fermentación alcohólica la llevan a cabo principalmente levaduras del
género Saccharomyces cerevisiae, que en ausencia de aire transforman el
azúcar en alcohol etílico y dióxido de carbono, en mayor medida. Por esta
razón es común añadir cultivos de levaduras seleccionadas. Las dificultades
de la fermentación constituyen uno de los mayores problemas. La fermentación
alcohólica del mosto de uva es el resultado de la interacción de muchas
variables, entre las cuales se puede mencionar la composición del mosto

4
inicial, la temperatura y la concentración de biomasa presente durante el
proceso de fermentación. Las levaduras de vino, presentes en el mosto o
inoculadas en el tanque de fermentación, son responsables de la conversión
del azúcar de jugo de uva en etanol. A menudo, sin embargo, las
fermentaciones toman mayores tiempos que los esperados para finalizar
(fermentaciones lentas) o dejan un vino incompleto con un poco de azúcar
residual (las fermentaciones estancadas). Desde la perspectiva de un
productor de vino, estas fermentaciones problemáticas resultan en la pérdida
de la capacidad del tanque, debido a los tiempos de procesamiento y reacción
de fermentación prolongados, que afectan el producto final, como la
inestabilidad microbiana causada por el azúcar residual o incluso, la oxidación
debido a la pérdida de la capa de dióxido de carbono protectora sobre el
elemento esencial (Ziraldo, 2002).

2.1.1. Recepción de la uva.

La uva que se recepciona en las bodegas proviene de la cosecha,
la cual se puede realizar de forma manual o automática,
dependiendo de las prácticas de cada viña. Una vez recibidos
los racimos de uva pueden pasar directamente a la prensa
(disminuye el daño mecánico de la uva, aumenta el rendimiento
de prensado, pero disminuye la capacidad de la prensa) o ser
sometidas al proceso de despalillado y molienda.

2.1.2. Despalillado y Molienda.

Esta etapa es opcional y consiste en separar las bayas del
escobajo, empleando un cilindro perforado y luego molerlas
mediante rodillos.

2.1.3. Prensado.
Se reciben los racimos enteros o la uva que proviene del
despalillado y molienda, para separar el jugo de las pieles. Este
proceso se realiza mediante una prensa neumática, la que
genera presión para lograr la separación. En esta etapa se puede
agregar anhídrido sulfuroso (SO2) para evitar contaminación
5
 microbiana e inhibir la oxidación

2.1.4. Clarificación en frío del mosto.

Este proceso se realiza entre 8° y 10°C aproximadamente, para
evitar la oxidación y pérdida de aromas. La decantación del mosto
se realiza para eliminar impurezas, las que al precipitar forma lo
que se denomina borras o sólidos decantados. Las borras
pueden ser posteriormente filtradas para recuperar el mosto que
se encontraba retenido en ellas.

2.1.5. Fermentación.
El mosto decantado se incorpora en una cuba de acero inoxidable
o concreto, en la cual se controla que la temperatura se encuentre
en el rango óptimo para fermentación de vinos blancos (12°-19°C).
Antes de comenzar la fermentación se deben medir algunos
parámetros importantes como el pH, sulfuroso libre, nitrógeno,
acidez total, entre otros; y realizar las correcciones necesarias del
mosto (agregar vitaminas, ácido tartárico, etc.). Cuando los
parámetros de importancia se encuentran en las condiciones
deseadas se inicia la fermentación, generalmente inoculando con
una levadura seleccionada. El criterio de término de fermentación
es mediante la cantidad de azúcar residual; cuando ésta se
encuentra bajo 2gr/L, se puede dar por terminada la fermentación.

2.1.6. Etapa post-fermentación o finalización.

Se baja la temperatura del vino y se trasiega con borra fina a la cuba
de destino donde, 5 a 7 días después, se corrige con SO2 hasta
alcanzar una concentración de 30-35 mg/L. Para eliminar las borras
del vino resultante y estabilizar las proteínas, se debe realizar
clarificación. Este proceso consiste en añadir bentonita (40-100
gr/hr·L) o Ictiocola (2gr/hr·L), los cuales “capturan” las borras. El
vino, posteriormente, se filtra con tierras para obtener un producto
más limpio. Antes de introducir el vino a las líneas de embotellado,
se filtra mediante la utilización de un filtro de placas (0.45 micras)
6
 esterilizante, chequeando que no exista turbidez (NTU finales ≈ 0),
se ajusta el SO2 libre a 30 ppm y se envasa el vino.
2.2. DIAGRAMA DE FLUJO

VINO

Recepción de la uva

Despalillado

Molienda

Parámetros:
Prensado
 PH
 Sulfuro libre
Clarificación del mosto  Acidez total
 °Brix

Fermentación Saccharomyces Cerevisiae 5%

Erapa post-fermentacion

2.3. Compuestos aromáticos del vino

“No sólo percibimos en una copa los aromas propios de la uva; un sin número
de otros compuestos comúnmente asociados a otras variedades sirven
para describir la expresión y tipicidad de los vinos. La relación entre vino y
frutas es directa, franca y profunda. Es poesía, pero también una compleja
correlación de elementos químicos” (Brethauer, 2006).
El vino es una solución hidroalcohólica que contiene cientos de compuestos
interactuando entre sí, otorgándole su identidad. Sin lugar a dudas, dentro
de los compuestos volátiles más relevantes, los aromas caracterizan el vino,
a pesar que su presencia sólo se encuentre entre los µg/L y los ng/L.
Los compuestos volátiles, pueden ser derivados de la uva, producidos

7
 durante la fermentación del mosto o desarrollados durante la crianza.
Cada vino es influenciado por una amplia variedad de compuestos
volátiles, principalmente alcoholes, esteres, terpenos y ácidos volátiles
(Howell et al., 2004; Mestres et al., 2000; Wilker et al., 2004).
Sin embargo, la importancia de cada compuesto en el aroma final depende
de la correlación entre la composición química y los umbrales de percepción,
porque la mayoría de los compuestos volátiles están presentes a
concentraciones cercanas o bajo su umbral de percepción individual (Falqué
et al., 2001).
Según su origen, los aromas pueden clasificarse en (Belancic y Agosin,
2002; Francis y Newton, 2005; Rapp, 1998):
 Aromas varietales: provienen del metabolismo propio de la uva y su
concentración depende de la variedad, el suelo, el clima y el «
terroir».
 Aromas pre-fermentativos: los compuestos clasificados en esta
categoría son obtenidos a partir de procesos físicos o de procesos
bioquímicos de oxidación e hidrólisis durante la extracción del jugo y
su maceración.
 Aromas fermentativos: producidos por el metabolismo de la
levadura durante la fermentación alcohólica, modificando y
multiplicando el aporte aromático inicial del mosto.
 Aromas post-fermentativos: formados durante la crianza del vino
y el envejecimiento a través de reacciones químicas y/o enzimáticas.
Distintas variables pueden afectar los compuestos volátiles (sean percibidos
por el consumidor o no) presentes en el vino. Los aromas varietales pueden
ser influenciados por el medio ambiente (clima, suelo), la variedad de la
uva, el grado de madurez, etc. Los aromas fermentativos, en cambio,
pueden potenciarse al modificar las condiciones de fermentación como la
temperatura y la levadura utilizada (Rapp, 1998).
2.4. Modelación de fermentaciones.
Por modelación de una fermentación debe entenderse su descripción cinética, no
únicamente al nivel del microorganismo, también al nivel del biorreactor. Para
llevar a cabo esto es necesario desarrollar una ecuación de balance del tipo,

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 Velocidad de Acumulación = Velocidad de Transporte + Velocidad Neta
de Conversión (1)

Para cada entidad dentro del biorreactor. Como se observa, es necesario

contar tanto con información sobre la entrada y salida (el transporte) de la
entidad en estudio e información sobre su consumo o producción dentro del
sistema. Esta última información es la micro-cinética del sistema y se muestra
a continuación, la descripción del biorrreactor o macro-cinética se muestra
posteriormente.

2.4.1. Generalización de los modelos no estructurados del

crecimiento microbiano.
El crecimiento microbiano puede ser modelado con diferentes grados de
complejidad. El tipo de modelos más utilizados son los modelos no
estructurados, en los cuales se considera que, para representar el estado
fisiológico de una población de microorganismos basta tomar en cuenta su
velocidad específica de crecimiento, la cual puede representarse como una
función sencilla de la composición del medio. Las entidades a modelar en una
fermentación son, la biomasa, el sustrato limitante, el producto, el oxígeno y el
calor fundamentalmente. A continuación se muestran los modelos que son
considerados en el módulo de simulación de fermentaciones.
2.4.2. Cinética de crecimiento
Se propone la utilización de un modelo generalizado que permite hacer un gran
número de combinaciones de diferentes modelos de afinidad por el sustrato,
inhibición por el producto y la muerte de los microorganismo. Este modelo es,

=oSk-kd (2)

donde o indica el tipo de inhibición del producto sobre la velocidad específica

de crecimiento; SK indica el tipo de afinidad del microorganismo por el sustrato
limitante y kd indica la velocidad específica de muerte. Cada uno de estos
términos se define de acuerdo a alguna de las ecuaciones del cuadro 1. Nótese
que en ninguna de estas ecuaciones se consideran efectos de temperatura,

9
pH, o sustancias inhibidoras distintas al producto o al sustrato limitante y que
al incluir la velocidad de muerte se modela únicamente a la fracción viable de
biomasa. Además, no se consideran sustratos múltiples o la existencia de más
de un sustrato limitante.
2.4.3. Cinética de producción
Puesto que el modelo de Luedeking y Piret puede ajustar a la gran mayoría de
las curvas de producción, se le consideró como un modelo generalizado. Sin
embargo, en su forma original presenta una limitación: en una fermentación en
que la producción es no asociada o parcialmente asociada al crecimiento,
cuando la concentración de sustrato es cero o negativa, predice la generación
de producto siempre que exista biomasa. Para corregir este problema basta
hacer que el término correspondiente () dependa directamente de la
concentración de sustrato. También puede ocurrir que el producto tenga
efectos inhibidores sobre la producción. En la producción asociada, si existe tal
inhibición, se considera directamente porque la producción depende
directamente de rX; en la producción no asociada este efecto puede
considerarse al incluir un término de inhibición que actúe sobre . Con tales
modificaciones el modelo queda,

rP   rX  0 X Sk (3)

a) sustrato
Otros factores vinculados a los sustratos
La estructura y origen de los sustratos (o reactivos) tienen un impacto
decisivo en la capacidad de los microorganismos de sobrevivir y en el
cumplimiento de la función que se desea. Cuando alguno de los sustratos
presenta una baja solubilidad en agua, se encuentra poco biodisponible para
los microorganismos y la reacción bioquímica se verá “demorada” por un
problema de transferencia de masa. La concentración de los compuestos
(tanto reactivos como productos) también es muy importante, por ejemplo
altas concentraciones de un compuesto pueden ser tóxicas e inhibir el
crecimiento de las bacterias.
b) Biomasa
En general, residuos orgánicos procedentes de las plantas, generalmente

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 desechos (podas, paja, etc.), aunque en algunos caso se utiliza la propia planta
entera(cardos, etc.) como biomasa.
En el caso del vino podemos considerar biomasa tanto los restos de la poda
(sarmientos) como los desechos de la producción del vino: hollejos, lias, orujos,
etc.
La biomasa puede ser utilizada, por incineración o fermentación, para producir
energía. La Bodega Emina es pionera en el uso de biomasa procedente de las
cepas y uvas para la producción de energía para consumo propio.
2.5. DESARROLLO DE LOS MICROORGANISMOS
Todo microorganismo vivo utiliza toda su maquinaria celular para multiplicarse.
La muestra más común de la viabilidad de un microorganismo es su capacidad
de dar células hijas a partir de una célula madre. El ciclo de desarrollo de una
levadura o de una bacteria comprende una fase de latencia durante la cual la
población no aumenta, pero se adapta a las condiciones del medio. Sigue la
fase de crecimiento exponencial donde la multiplicación se realiza a velocidad
constante: una célula bacteriana, por ejemplo, se divide en dos células hijas
que inmediatamente inician un nuevo ciclo. En un medio no renovado, como
es el caso en vinificación, la población aumenta de forma exponencial hasta
alcanzar una fase estacionaria. En este estadio, el crecimiento de la población
disminuye progresivamente o se para. Las causas son varias, falta de
nutrientes como el azúcar o el ácido málico, acumulación de moléculas tóxicas
o la «superpoblación» es decir pueden coincidir distintas poblaciones de
bacterias o de levaduras que hacen que unas impidan el crecimiento de las
otras y no realicen su fin destinado (parada fermentativa por ejemplo). En este
momento, una parte de la población sigue multiplicándose, mientras que otra
muere. Por último, llega la fase de decadencia donde se da la muerte de una
proporción cada vez mayor de la población y la lisis de las células. Para
efectuar este ciclo de desarrollo las levaduras y bacterias utilizan los
compuestos del mosto de uva y del vino. De éstos, retiran los elementos para
la síntesis de sus constituyentes. Estas reacciones proporcionan igualmente la
energía sin la cual numerosas síntesis claves no serían posibles. La reserva
energética de la célula es la molécula de ATP. Cualquier célula viva la contiene;
a la muerte de la célula, es rápidamente hidrolizada.
2.6. MICROORGANISMOS DETECTABLES EN VINO
11
Para poder determinar las poblaciones de estos microorganismos que existen
en el vino debemos conocerlos bien y saber que muchos de ellos son
beneficiosos en distintas etapas de la vinificación y otros se encuentran como
alterantes del vino. Las fuentes de contaminación en el vino son numerosas y
diversas, pero los principales focos son frecuentemente los mismos. Las
alteraciones microbianas sobre el vino pueden venir de levaduras
consideradas como contaminantes, como es el caso de Brettanomyces
(producción de fenoles volátiles como etilfenol y etilguaiacol),
Zygosaccharomyces (refermentación de azúcares residuales por la presencia
de antisépticos), bacterias acéticas del tipo Acetobacter/Gluconobacter
(producción de ácido acético, acetato de etilo y ácidos grasos volátiles),
bacterias lácticas como Lactobacillus sp. (producción de aminas biógenas y
degradación láctica del glicerol) y Pediococcus sp. (producción de aminas
biógenas, producción de acetiltetrahidropiridinas y producción de acroleína),
entre otros. (Pilatte 2005).
Saccharomyces: levadura unicelular que se presenta en forma de una
pequeña célula esférica uninucleada, de talla variable dependiendo su tamaño
de cepa, de su edad y de su estado. Se multiplica por brotación. Es la principal
levadura de vinificación, lo que significa que es capaz de realizar una
fermentación alcohólica completa sin producir defectos. Resiste al etanol y a
concentraciones elevadas de azúcar. Es la Saccharomyces Cerevisaie (Figura
2) es la que predomina durante la fermentación alcohólica. Se encuentra
esencialmente en las bodegas y sobre los materiales vinarios.
Zygosaccharomyces: levadura de forma
cilíndrica u ovoide, de gran tamaño, con una
brotación multilateral como vemos en el la
Figura 3. Las colonias observadas sobre
medio sólido son de gran tamaño. Levadura
muy fructófila y a la que no inhibe el etanol
pero sí la presión osmótica por lo que no
aparece en las primeras etapas de
fermentación. Vive en vinos con azúcares residuales y es la gran
refermentadora en la botella. Inhibe a las bacterias lácticas (también
fructófilas). Es muy común que crezcan en medios de Brettanomyces. Sin
12
azúcares residuales no debería preocuparnos su presencia porque en otro
sentido son bastante neutras, pero es mejor eliminarlas y con una filtración a
través de 2-3 micras suele ser suficiente ya que son con formas de hifas y
ramificadas lo que aumenta su porcentaje de retención. Esta especie está
presente tanto sobre las uvas como en las bodegas. Es particularmente
resistente al etanol (hasta un 18 % vol), al sulfuroso (hasta 50 mg/l) y al sórbico
(hasta 800 mg/l).
Brettanomyces: y su forma
ascosporógena Dekkera es
una levadura de forma
alargada (forma de bolo,
cabeza o barco), como vemos
en el la Figura 4, de tamaño variable, con brotación multilateral. Las colonias
observadas sobre medio sólido son de tamaño pequeño, de aspecto cremoso
y brillante. Una de las características de Brettanomyces es su fuerte resistencia
a la ciclohexamida. Aunque muchos microorganismos del vino como
Acetobacter, O. oeni, L. hilgardii, L. plantarum, L. brevis, P. pentosaceus, P.
damnosus y Saccharomyces pueden sintetizar el 4-vinil guaiacol o el vinil fenol
respectivamente a partir de los ácidos ferúlico y pcumárico, muchos de ellos
no son capaces de reducir los compuestos de vinil a 4- ertilguaiacol o a 4-
etilfenol. Por este motivo, el análisis el 4-etilfenol se usa como indicador de
contaminación por Brettanomyces.
Brettanomyces se caracteriza por un crecimiento lento en comparación con
otras levaduras, lo que ha justificado la aparición de medios selectivos. Es raro
que en los cultivos de los microorganismos a partir de las uvas, pongan en
evidencia la presencia de Brettanomyces. No obstante, en vinificación, su
desarrollo es sobre todo asociado al envejecimiento en barricas, lo que podría
ser explicado por una estimulación del crecimiento por oxígeno. No es raro que
esta levadura se desarrolle después del embotellado.
Bacterias Lácticas: están presentes durante todas las etapas de la
elaboración del vino. Se pueden aislar de las hojas de la viña, de la uva, del
equipamiento de la bodega, de las barricas, etc. En las primeras fases de la
vinificación (mosto y principio de la fermentación) hay entre 103 -104 ufc/ml y
pertenecen a variadas especies. Las más abundantes son L. plantarum, L.
13
 casei, L. hilgardii, Leuconostoc y Pediococcus, y en menor proporción O. Oeni
y L. Brevis. Su número y proporción varían en función del grado de madurez y
el estado de la vendimia. Sin embargo, a medida que avanza la transformación
del mosto llevada a cabo por las levaduras y se reduce la microbiota, se
disminuye en su número y variedad seleccionándose sólo las más resistentes
al alcohol y al bajo pH.
2.7. IDENTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS DEL VINO
La capacidad de las levaduras y bacterias de vino de transformar compuestos
del medio depende no solamente del nivel total de su población, sino también
de la naturaleza de los géneros, las especies y las cepas presentes. Para que
las reacciones que efectúan, influyan en la calidad del vino, las variaciones de
concentración de las diversas moléculas formadas deben sobrepasar el umbral
de sensibilidad. Por eso es importante conocer la especificidad de las cepas
presentes. Y de ahí su interés por su identificación. Los métodos a emplear se
adaptan en función de las necesidades. Los análisis convencionales se basan
en la observación de caracteres fenotípicos de orden morfológico, fisiológico o
metabólico. Los métodos moleculares más recientes utilizan directamente el
genoma del microorganismo y determinan todos sus caracteres fenotípicos. En
resumen, los métodos convencionales identifican los microorganismos a través
de la expresión del genoma, mientras los moleculares apuntan directamente el
ADN. Estos últimos son los más precisos y fiables.
2.7.1. Los métodos convencionales:
Se identifican los microorganismos tras haber sido aislados por cultivo sobre
medio de agar nutritivo. A partir de una muestra de vino, es fácil separar las
levaduras de las bacterias por adición en el medio de pimaricina para eliminar
las levaduras, o de cloranfenicol para eliminar las bacterias. Para distinguir
entre levaduras noSaccharomyces y Saccharomyces es necesario adicionar
cicloheximida (actidiona) que tiene por efecto impedir el crecimiento de
Saccharomyces. Por último, para separar las bacterias lácticas de las bacterias
acéticas, se añade penicilina al medio. El antibiótico permite solamente el
desarrollo de las bacterias acéticas. La incubación para las bacterias lácticas
se hace en aerobiosis. Sobre cápsulas de Petri incubadas en atmósfera de
CO2. Después se pueden tomar estérilmente las colonias, y ponerlas en cultivo
líquido para poder tener más población y realizar más pruebas precisas.
14
  Las levaduras: La observación microscópica permite examinar la forma
y el tamaño de las células, la formación de esporas, el modo de
reproducción de las levaduras. Cierto número de especies puede ser
fácilmente reconocido por la simple observación microscópica de las
células en crecimiento. Las levaduras Kloeckera apiculata y
Saccharomyces ludwigii se reconocen con facilidad por su forma de
limón, denominada levadura apiculada, siendo la primera
aproximadamente diez veces más pequeña que la segunda. Candida
stellata se caracteriza por una gemación con forma de estrella
específica. Contrariamente a la mayoría de las levaduras del vino que
se multiplican por gemación, Schizosaccharomyces pombe se
diferencia del resto de especies utilizando la escisiparidad para su
multiplicación vegetativa.
 Las bacterias: La observación microscópica es indispensable. La forma
de las células, redondeadas o en bastón, su disposición en cadenas o
en tetradas, da una idea del resultado. Si la observación se efectúa
después de la tinción según el método de Gram, se distinguen además
las bacterias lácticas (Gram + violeta) de las bacterias acéticas (Gram -
rosa).
Lista de las especies de bacterias lácticas más corrientes en el mosto
de uva y el vino:
 Bacilo: Lacotabillus plantarum, L. casei (homofermentativo);
Lactobacillus hilgardii, L. brevis (heterofermentativo).
 Coco: Pediococus damnosus, P. parvulus (homofermentativo);
Leuconostoc mesenteroides; Oenococcus oeni (heterofermentativo).
2.7.2. Identificación por métodos moleculares:
El principio de base es identificar las levaduras o las bacterias refiriéndose a
su contenido genético, total o parcial. El método recurre a las similitudes de los
genomas que definen el grado de parentesco entre las cepas. Así, los genomas
de dos cepas de Oenococcus oeni presentan mayor similitud entre ellos que el
de un Oenococcus oeni y de un Lactobacillus plantarum, por ejemplo. Es a
nivel de la secuencia del genoma que se establecen las comparaciones. Por
supuesto, no se trata de analizar la secuencia de los genomas completos. Los
métodos analíticos que se basan sobre las diferencias, o similitudes, de las
15
 secuencias, permiten las comparaciones. Éstos utilizan cuatro importantes
propiedades de la molécula de ADN.
Se denomina secuencia la sucesión de bases sobre la hebra de ADN. Las dos
hebras son llamadas «complementarias» debido al aparejamiento de las bases
que siempre es respetado: a la secuencia ATGC de una hebra corresponde la
secuencia TACG de la hebra opuesta. Se emplean cuatro propiedades de la
molécula de ADN para la identificación:
 La capacidad de ser “desnaturalizada”: Las dos hebras paralelas se
separan fácilmente por calor: es la desnaturalización. El retorno a la
temperatura ambiente permite el reaparejamiento de ambas cadenas.
 Las enzimas, llamadas enzimas de restricción, hidrolizan la cadena
nucleotídica en sitios bien específicos para cada una de ellas; la
especificidad viene dada por la secuencia a nivel del sitio de corte.
 El ADN puede ser sintetizado in vitro a partir de nucleótidos, por una
polimerasa que los junta siguiendo la secuencia complementaria de un
ADN llamado matriz. La «Taq polimerasa», enzima termoresistente. Por
otra parte, la polimerasa sólo puede funcionar a partir de cebos. Éstos
son secuencias cortas de ADN escogidas. Debido a su secuencia, éstas
hibridan al ADN y delimitan la región del genoma que es copiada varios
millones de veces. La acumulación de copias hace fácil la visualización
de esta región tras electroforesis. . Las moléculas de ADN están
cargadas negativamente en un tampón de electroforesis. En función de
su tamaño, migran más o menos hacia el cátodo bajo la acción del
campo eléctrico. El ADN es señalado en los geles por tinción al bromuro
de etidio e iluminación bajo UV.
III. DIAGRAMA EXPERIMENTAL

16
 VINO

Recepción de la uva

Despalillado

Molienda Perdidas 5%

Parámetros:
Prensado  PH
 Sulfuro libre
 Acidez total
 °Brix
Clarificación del mosto

Fermentación Saccharomyces Cerevisiae 0.05%

T 1: 0 Horas
T 2: 24 Horas
T 3: 49 Horas
T 4: 73 Horas
T 5: 98 Horas
T 6: 122 Horas
T 7: 168 Horas
T 8: 216 Horas

17
IV. MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES
4.1. Insumos
 Saccharomyces Cerevisae
 Mosto de uva blanca
 Fosfato de amonio
 Acido cítrico
 Sacarosa
 Agua destilada
4.2. Equipos e instrumental
 Matraz
 Vaso
 Tubo de ensayo
 Termómetro
 Autoclave
 Centrifuga
 Balanza
 Cocina
 Refractómetro
 Espectrofotómetro
 Estufa (graduable 30°C) o baño maría Shaker

4.3. Recolección y Conservación de los Mostos

La materia prima (Uva Negra Criolla) se compró en el mercado “FERIA EL
ALTIPLANO” ubicado en el Distrito de Miraflores.
El proceso de estrujado fue realizado en las Instalaciones de la Escuela De
Ingeniería de Industrias Alimentaria (laboratorio de Licores).
El mosto extraído se deposita en recipientes para un previo filtrado antes de
fermentación.

4.4. Cepa de levadura y Condiciones de Cultivo

18
 4.4.1. Preparación del precultivo:
Preparar un precultivo de la levadura Saccharomyces cerevisiae (1%),
peptona (1%),glucoa anhicra (1%,), agua destilada ( ); seguidamente hicimos
la corrección del pH con 0.03g de acido cítrico pH igual a 4.5 , luego lo llevamos
a ebullición durante 15 minutos, una vez qse escuche el zizeo de la olla a
presión, finalmente se le agrega la levadura (1g) e incubamos a 30 °C por 24
horas
4.4.2. Preparación del cultivo:
4.4.2.1. Cuantificación:

 Preparación de la curva de D.O. versus biomasa: se tomara una

muestra de 50 ml de precultivo, luego de 48 hrs de incubación una vez
sembrado, se prosederaa centrifugar la muestra a 4000rpm y se lavara
dos veces con agua destilada, obteniéndose al final un precipitado que
vienen a sr las células. Al precipitado obtenidose le harán diferentes
dilucionescon agua destilada, en promedio 6 y cada dilución será
medida en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 600nm.
Tomamos de cada dilución 10 ml de muestra y las colocamos en placas
Petri, previamente taradas, seguidamente las llevamos a la estufa a
105°C hasta peso constante durante 6 horas, finalmente pesamos
cada placa y hallamos la cantidad de masa seca por volumen de
medio.

 Preparacion de la curva D.O. Vs tiempo: procedimos enumerando

10 erlenmeyer a los cuales se les añadió 20 ml del cultivo lo
esterilizamos durante 15 minutos e inoculamos 5% del precultivo,
el cual se someterá a baño maria hermeticamentea una
temperatura de 30°C, luego realizamos la centriifugacion (4000rpm )
y el lavado con agua destilada (2 veces el precipitado sera llevado a
un volumen de 10 ml) , para realizar las lecturas D.O.con una longitud
de onda de 600n

19
V. DIAGRA MA EXPERIMENTAL
VI. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1. DETERMINACION DE MATERIA SECA

Peso del precipitado = 3.02gr

Peso de la biomasa = 1.32gr

 Hallar la humedad

3.02 𝑔𝑟−1.32𝑔𝑟
%𝐻 = 𝑥100%
3.02

%𝑯 = 𝟓𝟔. 𝟐𝟗%

 Materia seca

Ms = 100% - H%

Ms = 100% - 56.29%

Ms = 43.71%

 Hallando peso seco

43.71% 100%
X 0.02gr

(43.71% ∗ 0.02𝑔𝑟)
𝑥=
100%

𝒙 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟖𝟕𝒈𝒓
 Tabla N°1:

Muestra Dilución D.O Volumen Peso X(g/L)

de muestra seco
(L) (g)
M1 0.01 0.243 0.01 0.006 0.6
M2 0.02 0.439 0.01 0.012 1.2
M3 0.03 0.590 0.01 0.018 1.8
M4 0.04 0.979 0.01 0.024 2.4
M5 0.05 0.998 0.01 0.030 3.0
M6 0.06 1.024 0.01 0.036 3.6
Elaboración: Fuente propia

 ACOTACIÓN

M1 60gms 100 mh
X 0.01gmh
X = 0.06gms

Tabla N°2:

Tiempo D.O
0 0.249
1 0.260
2 0.287
3 0.294
5 0.353
7 0.399
9 0.432
10 0.679
24 0.691
Fuente: Elaboración propia
 Tabla N°3: Equivalencia de D.O hallada respecto a la biomasa

Tiempo D.O Peso seco celular (g/L)

0 0.249 1.10
1 0.260 1.16
2 0.287 1.28
3 0.294 1.30
5 0.353 1.56
7 0.399 1.78
9 0.432 1.92
10 0.679 2.08
24 0.691 3.10

Fuente: Elaboración propia

GRAFICA N°1: D.O VERSUS BIOMASA

CURVA DE BIOMASA (LINEAL)

1.2

1 0.998 1.024
0.979

0.8

0.6 0.59

0.4 0.439

0.2 0.243

0
0.6 1.2 1.8 2.4 3 3.6

Fuente: Elaboración propia

Observamos que el D.O aumenta en proporción a la biomasa

GRAFICA N°2: D.O VERSUS TIEMPO

 CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 5 7 9 10 24

Fuente: Elaboración propia

Observamos que la muestra que estuvo más tiempo en baño maría su

D.O es mayor

GRAFICA N°3: CRECIMIENTO MICROBIANO

CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

4
3.5 3.6
3 3
2.5 2.4
2
1.8
1.5
1.2
1
0.5 0.6
0
2 3 5 7 9 24

Fuente: Elaboración propia

La curva en relación del tiempo de inoculación es positivo

 Velocidad de crecimiento (um)

 𝑥2 = 𝑥1 ∗ 𝑒 (𝑢𝑚(𝑡2 −𝑡1 )

7 = 3𝑒 ∗ 𝑢𝑚(1.78 − 1.30)

7 = 3𝑒(0.48)𝑢𝑚

𝑙𝑛7
= ln(𝑒(0.48)𝑢𝑚)
3

𝒖𝒎 = 𝟏. 𝟕𝟔𝟓𝒖𝒎

Tabla N°4: Determinación de la fase logarítmica mediante regresiones lineales

sucesivas

Tiempo Peso seco celular

0 0.10

1 1.16 R1 = 0.054

2 1.28

1 1.16

2 1.28 R2 = 0.908

3 1.30

2 1.28

3 1.30 R3 = 0.968

5 1.56

3 1.30

5 1.56 R4 = 1

7 1.78
5 1.56

7 1.78 R5 = 0.991

9 1.92

7 1.78

9 1.92 R6 = 0.865

10 3.08

9 1.92

10 3.08 R7 = 0.560

24 3.10

Fuente: Elaboración propia

 Tiempo de generación

g= Ln 2/ um
g= Ln 2/ 1.765
g= 0.3927 h

 Productividad máxima

P= X / t
P= 1.78gm s/L / 7h
P= 25gms / Lh
VII. CONCLUCIONES

 Se determinó la curva de crecimiento microbiano para la levadura

Saccharomyces cerevisiae en la fermentación del vino con una variedad de
uva negra criolla.

 La materia seca obtenida fue 43.71%.

 El crecimiento microbiano más eficiente fue a las 10 horas, lo que nos indica
que la muestra que estuvo más tiempo en baño maría alcanzo su velocidad
máxima de crecimiento.

 Durante la vinificación se estudia una gran cantidad de parámetros, los

cuales deben ser estudiados antes de inferir conocimiento a partir de ellos.
En este estudio, 4 parámetros se emplearon para determinar la
consistencia de los datos (biomasa, glucosa, tiempo y etanol) utilizando un
programa computacional desarrollado con esta finalidad.
VIII. BIBLIOGRAFÍA

 Pilatte E. y Alexandre H. 2005.Microorganismos de la uva y el vino.

Sarl Microvitis.

 SANTAMARÍA, P.; LÓPEZ, R.; GUTIERREZ, A.; GARCÍA-ESCUDERO, E.

(1995). Influencia de la temperatura en la fermentación alcohólica, en: Zubía,
Nº 7: 137-149.

 ZIRALDO, D. (2002). Anatomy Of A Winery: The Art Of Wine At Inniskillin.

Toronto: Key Porter Books.

 Brethauer, E. (2006). Vino y Frutas: ¿Pura Química? [Electronic Version].

Retrievedwww.brethauer.cl.

 Conde, C., Silva, P., Fontes, N., Dias, A. C. P., Tavares, R. M., Sousa, M. J.,
et al

 (2007). Biochemical changes throughout grape berry development and fruit

and wine quality.

 Falqué, E., Fernández, E., & Dubourdieu, D. (2001). Differentiation of White

wines by their aromatic index. Talanta, 54, 271-281.106

 Fleet, G. H. (2003). Yeast interactions and wine flavour. International Journal

of Food Microbiology, 86(1), 11-22.

 Howell, K. S., Swiegers, J. H., Elsey, G. M., Siebert, T. E., Bartowsky, E. J.,
Fleet, G.

 H., et al. (2004). Variation in 4-mercapto-4-methyl-pentan-2-one release by

Saccharomyces cerevisiae comercial wine strains. FEMS Microbiology
Letters, 240, 125-129.

 Mestres, M., Busto, O., & Guasch, J. (2000). Analysis of organic sulfur
compounds inwine aroma. Journal of Chromatography, 881, 569-581.
ANEXOS

Anexo A: Ajuste de Parámetros

FOTOS DEL TRABAJO REALIZADO

8.1. DETERMINACION DE MATERIA SECA

Peso del precipitado = 3.02gr

Peso de la biomasa = 1.32gr

 Hallar la humedad

3.02 𝑔𝑟−1.32𝑔𝑟
%𝐻 = 𝑥100%
3.02

%𝑯 = 𝟓𝟔. 𝟐𝟗%

 Materia seca
Ms = 100% - H%

Ms = 100% - 56.29%

Ms = 43.71%

 Hallando peso seco

43.71% 100%
X 0.02gr

(43.71% ∗ 0.02𝑔𝑟)
𝑥=
100%

𝒙 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟖𝟕𝒈𝒓

 ACOTACIÓN

1 60gms 100 mh
X 0.01mh

(𝟎. 𝟎𝟏𝒎𝒉 ∗ 𝟏𝟔𝟎𝒈𝒎𝒔)

𝑿=
𝟏𝟎𝟎𝒎𝒉
𝑿 = 𝟎. 𝟎𝟔𝒈𝒎𝒔

 Velocidad de crecimiento (um)

𝑥2 = 𝑥1 ∗ 𝑒 (𝑢𝑚(𝑡2 −𝑡1 )

7 = 3𝑒 ∗ 𝑢𝑚(1.78 − 1.30)

7 = 3𝑒(0.48)𝑢𝑚

𝑙𝑛7
= ln(𝑒(0.48)𝑢𝑚)
3

𝒖𝒎 = 𝟏. 𝟕𝟔𝟓𝒖𝒎
 Tiempo de generación

g= Ln 2/ um
g= Ln 2/ 1.765
g= 0.3927 h

 Productividad máxima

P= X / t
P= 1.78gm s/L / 7h
P= 25gms / Lh