Exemplul XXX.

Identificarea cineticii Monod pentru procesul de oxidare enzimatica a D-Glucozei la keto-D-

glocozon (Treitz, Maria et al. 2001).

Oxidarea enzimatica a D-glucozei (DG) la 2-keto-D-glucoza (kDG) sub influenta unei enzime (Pyranose
oxidase) a fost studiata in conditii normale de Treitz et al. (2000) intr-un reactor discontinuu. Mediul lichid,
continand substratul, este amestecat eficient cu ajutorul unui agitator magnetic. Oxigenul necesar reactiei este
transferat din faza gazoasa (mentinuta in permanenta sub forma de 'perna' de oxigen pur), prin interfata gaz-
lichid, catre mediul de reactie.
S-au efectuat experimente continue, izoterme, pe un interval de timp t  [ 0 ,11350 ] s, cu doua injectii de
enzima (E), de volum neglijabil, respectiv la t  800 s , C E  0.5 mM , si la t  9450 s ,
C E  0.275mM . Concentratia initiala de D-glucoza este de C DG ,o  200 mM . Din totalul de 5 specii
chimice potential a fi considerate intr-un model cinetic ( DG ,kDG ,O2 , H 2 O2 , E ), s-a masurat continuu
concentratia de oxigen in faza lichida, COx , pe tota durata experimentului.

Intr-o prima faza, de tatonare a procesului, s-au retinut n=14 puncte experimentale:
t (s) 0 400 799 800 950 5000 6000 7000 8000 9400
u
(u=1,...,n)=
C (mM)= 0.000 1.210 1.197 1.19 0.145 0.639 0.850 1.028 1.144 1.176
Ox,u
7
t (s) 9450 9500 1105 11350
u
0
(u=1,...,n)=
C (mM)= 0.46 0.575 1.013 1.067
Ox,u
6

Intr-un experiment mai avansat, s-au determinat continuu, in aceleasi conditii, n=228 puncte experimentale:
t (s) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
u
C (mM) 0.000 0.285 0.700 1.062 1.176 1.198 1.206 1.209 1.210 1.209 1.209
Ox,u
t (s) 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050
u
C (mM) 1.208 1.208 1.207 1.190 1.195 1.19 0.940 0.191 0.145 0.152 0.162
Ox,u
7
t (s) 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600
u
C (mM) 0.173 0.182 0.193 0.202 0.214 0.225 0.233 0.244 0.253 0.264 0.271
Ox,u
t (s) 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150
u
C (mM) 0.284 0.291 0.300 0.308 0.317 0.325 0.336 0.346 0.359 0.368 0.377
Ox,u
t (s) 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600 2650 2700
u
C (mM) 0.388 0.395 0.410 0.417 0.432 0.451 0.468 0.479 0.480 0.498 0.507
Ox,u
t (s) 2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 3100 3150 3200 3250
u
C (mM) 0.518 0.533 0.546 0.553 0.559 0.566 0.578 0.581 0.588 0.597 0.600
Ox,u
t (s) 3300 3350 3400 3450 3500 3550 3600 3650 3700 3750 3800
u
C (mM) 0.602 0.611 0.614 0.618 0.620 0.623 0.624 0.632 0.639 0.643 0.643
Ox,u
t (s) 3850 3900 3950 4000 4050 4100 4150 4200 4250 4300 4350
u
C (mM) 0.635 0.635 0.643 0.657 0.664 0.679 0.685 0.695 0.702 0.715 0.723
Ox,u
t (s) 4400 4450 4500 4550 4600 4650 4700 4750 4800 4850 4900
u
C (mM) 0.729 0.739 0.747 0.759 0.777 0.786 0.800 0.808 0.826 0.833 0.845
Ox,u
t (s) 4950 5000 5050 5100 5150 5200 5250 5300 5350 5400 5450
u
C (mM) 0.850 0.863 0.867 0.877 0.887 0.892 0.911 0.896 0.890 0.889 0.892
Ox,u
t (s) 5500 5550 5600 5650 5700 5750 5800 5850 5900 5950 6000
u
C (mM) 0.912 0.926 0.935 0.943 0.950 0.959 0.966 0.975 0.984 0.991 0.998
Ox,u
t (s) 6050 6100 6150 6200 6250 6300 6350 6400 6450 6500 6550
u
C (mM) 1.006 1.012 1.019 1.028 1.032 1.040 1.045 1.053 1.058 1.065 1.068
Ox,u
t (s) 6600 6650 6700 6750 6800 6850 6900 6950 7000 7050 7100
u
C (mM) 1.075 1.083 1.087 1.091 1.096 1.104 1.110 1.112 1.114 1.121 1.124
Ox,u
t (s) 7150 7200 7250 7300 7350 7400 7450 7500 7550 7600 7650
u

Modelarea proceselor celulare - cap. 3. Pag 60

 C (mM) 1.130 1.131 1.134 1.137 1.140 1.141 1.144 1.146 1.150 1.150 1.151
Ox,u
t (s) 7700 7750 7800 7850 7900 7950 8000 8050 8100 8150 8200
u
C (mM) 1.154 1.154 1.155 1.157 1.159 1.158 1.161 1.164 1.166 1.168 1.167
Ox,u
t (s) 8250 8300 8350 8400 8450 8500 8550 8600 8650 8700 8750
u
C (mM) 1.169 1.172 1.173 1.174 1.173 1.177 1.177 1.163 1.157 1.157 1.158
Ox,u
t (s) 8800 8850 8900 8950 9000 9050 9100 9150 9200 9250 9300
u
C (mM) 1.161 1.164 1.163 1.165 1.165 1.168 1.168 1.169 1.172 1.173 1.174
Ox,u
t (s) 9350 9400 9450 9500 9550 9600 9650 9700 9750 9800 9850
u
C (mM) 1.175 1.175 1.17 0.466 0.575 0.604 0.622 0.645 0.666 0.686 0.708
Ox,u
6
t (s) 9900 9950 1000 1005 1010 1015 1020 1025 1030 1035 10400
u
0 0 0 0 0 0 0 0
C (mM) 0.735 0.756 0.769 0.787 0.800 0.809 0.830 0.843 0.858 0.867 0.879
Ox,u
t (s) 1045 1050 1055 1060 1065 1070 1075 1080 1085 1090 10950
u
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C (mM) 0.889 0.903 0.910 0.922 0.933 0.944 0.953 0.965 0.977 0.984 0.996
Ox,u
t (s) 1100 1105 1110 1115 1120 1125 1130 11350
u
0 0 0 0 0 0 0
C (mM) 1.007 1.013 1.023 1.032 1.050 1.047 1.057 1.067
Ox,u

Se cere sa se imagineze un model cinetic al procesului care sa ia in considerare inhibitia enzimei cu produsii de
reactie. Structura modelului va fi adaptata in functie de informatia cinetica disponibila.

Solutie.

Instalatia experimentala pentru culegerea datelor cinetice o reprezinta un bioreactor discontinuu (de
volum 1mL), cu un mediu lichid considerat perfect amestecat cu ajutorul unui agitator magnetic. Experimentele
se desfasoara izoterm, intr-un nediu mentinut cu o solutie buffer la pH=7.
Pentru determinarea coeficientului de transfer masic a oxigenului in mediul lichid, se efectueaza
experimente si masuratori de oxigen in absenta reactiei biochimice. Considerand un echilibru la interfata intre
concentratia de oxigen din faza gazoasa si cea de la interfata ( C * Ox ), ecuatia de bilant a concentratiei
oxigenului in lichid COx in absenta reactiei este:

dC Ox
 k Oxl a( C *Ox  C Ox ) .
dt

Prin integrare in raport cu timpul t (s), si inlocuire cu valorile experimentale se determina k Oxl a =0.02 1/s,
respectiv este produsul dintre coeficientul partial de transfer de masa si aria interfaciala de transfer. Pentru
calculul concentratiei la echilibru a oxigenului a fost folosita relatia lui Henry, C Ox*  p
Ox / H , rezultand
o 6
C*Ox =1.21 mM la 25 C si 1 atm (H= 2.61´10 Pa.L/g, Blanch & Clark, 1996). Experimentele au fost facute
in absenta azotului, prin mentinerea solutiei sub barbotare si saturare cu oxigen pur.
In prezenta reactiei chimice, bilantul masic al speciilor considerate (de concentratie C j ) este cel tipic
dintr-un reactor discontinuu ideal (Moser, 1988):

dCOx
 kOxl a( C*Ox  COx )  rOx ,
dt
dC j
 rj ,
dt

in care rOx = viteza de consum a oxigenului in reactie (mM/s), r j = viteza de reactie a speciei j.

Modelarea proceselor celulare - cap. 3. Pag 61

 enzima
oxygen addition gaz
evacuat

membrana agitator

proba
oxigen

Fig. XXX. Celula de reactie cu prelevarea automata a probei de oxigen (electrod Rank Brothers Ltd.) si
oxigenare continua (volum lichid 1 mL).
 OH OH
O O
HO POx HO
HO OH HO OH
OH O

2-ceto-D-
D-glucoza O2
glucoza
H2O2

( POx din Peniophora gigantea )

Fig. XXX. Reactia globala de sinteza enzimatica (POx) a 2-ceto-D-glucoza ('zahar rar').
 Din punctul de vedere al schemei de reactie, oxidarea enzimatica a D-glucozei este insotita de
formarea de produsi secundari, respectiv forme partial oxidate ale glucozei, intermediari enzimatici cu
activitate partiala, apa oxigenata, s.a. Este constat experimental faptul ca produsii de reactie inactiveaza enzima
(POx). Prin urmare, modelul cinetic propus trebuie sa considere, pe langa reactia principala de sinteza si reactii
secundare de inactivare cu produsi a POx (notata cu E). Pentru reactia principala se propune o exprese cinetica
de tip Michaelis-Menten cu limitare de substrat si oxigen:

E
DG  O2  H 2 O i  kDG  H 2 O2
In ce priveste inhibarea enzimei, lipsa de date cinetice complete privind intermediarii de reactie a facut ca sa fie
propuse mai multe mecanisme posibile:

Mecanismul M1 - inhibarea progresiva a POx prin reactii succesive cu produsul kDG si formarea de baze
Schiff:
E
DG  O2  H 2 O i  kDG  H 2 O2
;

C DG C ox
ri  k cat, i CE ,
K M  C DG K ox  C ox i
k
kDG  E VIII
 ED1 ; r  - kVIII C E C kDG
k
kDG  ED1 IX ED2; r  - k IX C ED1C kDG
k
kDG  ED2 X ED3; r  - k X C ED2 C kDG
E i  ED1, ED 2 , ED 3 .

Mecanismul M2 - inhibarea POx printr-o reactie globala de degradare a aminoacizilor cu apa oxigenata,
catalizata de impuritatile de fier din mediul de reactie:

E C DG C ox
DG  O2  H 2 O  kDG  H 2 O2 ; r  k cat CE
K M  C DG K ox  C ox
,

k
H 2 O2  E III E d ; r  rE  k III C E C H 2O2
b ) ; (C
k III  k o (1  aC Fe -5
Fe  3 ´ 10 mM) .

Mecanismul M3 - inhibarea POx print reactie cu radicalii HO* rezultati din descompunerea apei oxigenate:
E
;
DG  O2  H 2 O  kDG  H 2 O2
 C DG C ox
rDG  rOx  rkDG  k cat CE ,
K M  C DG K ox  C ox
k k k
2H 2 O2   2H 2 O  O2 ; H 2 O2  2HO* ; HO *  E VII
IV V 
 E d
rE   kC E C H 2O2 ; rH 2O2  rkDG  rE .

Functia obiectiv aleasa pentru estimarea parametrilor cinetici in fiecare mecanism de reactie in parte este unul
ECMMP, ce corespunde cazului erorii eperimentale s constante:
2
Mink f ( k )  ĈOx  COx
2
; k 0 ,

Rutina de minimizare neliniara cu restrictii utilizata este MMA (© Maria, 1986-1998), bazata pe algoritmul de
optimizare al lui Mihail & Maria (1986), modificat de Maria (1998). Algoritmul utilizeaza o cautare aleatoare
adaptiva multi-nivel, cu periodice expansii si contractii ale regiunii de cautare. Metoda este performanta pentru
cautarea extremului global al functiilor multimodale in prezenta multiplelor restrictii implicite si explicite de
complexitate ridicata.

Modelul cinetic identificat ce indica cea mai buna adecvanta si calitatea cea mai buna a parametrilor este cel cu
numar minim de parametrii, respectiv modelul M2. Parametrii cinetici identificati k= [ K O , K m , kcat , k ]
utilizand setul redus de date experimentale (n=14) sunt prezentati in Tabelul XXX.

Tabel XXX. Teste statistice ale solutiei modelului cinetic M2 (n=14; s  0.1 mM; se2  0.083mM 2 ; f=
0.83; K Ox , K m in mM; kcat in mM ! s ! kU 1 ; k= k III in mM ! s ! ).
Parameru Estimat Incredere t-test Matrice de intercorelatie  j / s~ 2

K Ox 0.2613 ± 0.007 74 1 1.3e+4

Km 63.523 ± 1.71 72 -0.79 1 2.2e+9
kcat 0.0891 ± 0.0007 264 0.19 0.16 1 1.3e+11
k 9.2827e-6 ± 6e-8 303 0.06 -0.13 0.73 1 2.4e+20

Figura XXX. Observatii experimentale, predictii si grafice reziduuri pentru procesul de oxidare enzimatica a D-
glucozei (setul redus de date).

Adecvanta modelului matematic, apreciata global prin raportarea dispersiei predictiilor in raport cu dispersia
experimentala, este comparata cu repartitia  2 teoretica, fiind de dorit un raport cat mai mic:
 r n 2
ˆy  y ) 2   ( ŷui  yui )
( 2  i 1 u 1 0.83 ;
se2    0.083
( nr  p ) ( nr  p ) 14 x1  4
se2 0.083
  8.3   2 ( nr  p ;95%)  18.3 .
2 0 .01
s

(in care y  C Ox , r=1, p=4). Testul de adecvanta al modelului este completat de analiza reziduurilor
(‘residuals plots’), redata in Figura XXX (stanga), pentru concentratia de oxigen masurata. In grafice sunt
reprezentate si predictiile modelului cinetic privind evolutia concentratiei celorlalte specii incluse in model.
Desi testul  2 este satisfacator, curba prezisa pentru concentratia de oxigen dizolvat este destul de
aproximativa in raport cu putinele date experimentale. In plus, graficul reziduurilor ( yui  yui ); u = 1,..,n; i
= 1,...,r, arata o repartitie ne-uniforma, infirmand ipoteza de eroare experimentala constanta.
Semnificatia parametrilor modelului (vectorul k) se analizeaza pe baza matricii de varianta -
covarianta a estimatului V, evaluata numeric in exemplul de fata. Testele de semnificatie Student, respectiv
testarea egalitatii intre valoarea medie a parametrului estimat si cea adevarata, sunt pozitive (Tabelul XXX),
prezentand valori mai mari decat cuantila teoretica t(14-4;97.5%) = 2.2. Intervalelor individuale de incredere a
parametrilor sunt de asemenea mici, cativa parametrii fiind ceva mai intercorelati in model (coeficienti de
intercorelatie mai mari decat 0.7). Parametrii sunt foarte semnificativi, testul  j / s~ 2 prezentand valori
superioare limitei recomandate 3 (Maria & Rippin, 1993).

Desi parametrii apar ca semnificativi in model, totusi discrepanta mare a predictiilor pentru multe din
punctele experimentale, ca si repartitia neuniforma a reziduurilor necesita date experimentale suplimentare
pentru o clarificare deplina a problemei de adecvanta. In acest scop este considerat un al doilea set de date
(n=228), respectiv o mai fina masurare continua a concentratiei de oxigen dizolvat in mediul de reactie (vezi
Fig. XXX). Repetand estimarea parametrilor cinetici si analiza estimatului cu aceste date, se obtin valorile din
Tabelul XXX.

Tabel XXX. Teste statistice ale solutiei exemplului XXX (n=228; s  0.1 mM; se2  0.0046 mM 2 ; f=
1.038; K Ox , K m , units in mM; kcat in mM ! s ! kU 1 ; k in mM ! s ! ).
Parameru Estimat Incredere t-test Matrice de intercorelatie  j / s~ 2

K Ox 0.2613 ± 0.001 448 1 5.6e+5

Km 63.523 ± 0.3 475 -0.45 1 3.6e+10
kcat 0.0891 ± 0.0002 1168 0.71 0.11 1 6.5e+12
k 9.2827e-6 ± 1e-8 1639 0.44 -0.45 0.59 1 3.4e+21

Figura XXX. Observatii experimentale, predictii si grafice reziduuri pentru procesul de oxidare enzimatica a D-
glucozei (setul de date extins).
Adecvanta modelului matematic apreciata prin testul global 2 este considerabil imbunatatita:
 c2  0.46   2 ( nr  p ;95%)  124 . Testul de adecvanta a modelului, completat de graficul reziduurilor
redat in Figura XXX (stanga) pentru concentratia de oxigen, arata o repartitie satisfacatoare, confirmand
ipoteza de eroare experimentala constanta si deci validitatea estimatorului ECMMP utilizat. Semnificatia
parametrilor modelului este de asemenea mult imbunatatita, rezultand valori ale testului Student mai mari,
intervalelor de incredere ale parametrilor mai mici, si valori corespunzatoare  j / s~ 2 mai mari. Cu toate
acestea suspiciunea asupra generalitatii acestui model cinetic redus persista, deoarece dintr-o singura observatie
masurata este putin probabil a se dovedi validitatea unei scheme de reactie in care sunt implicate 5 specii
chimice. In plus, masuratori suplimentare calitative indica mult mai plausibil un mecanism de tipul M3. Prin
urmare, planificarea unor masuratori suplimentare pentru determinarea curbelor cinetice a altor intermediari
din sistem devine absolut necesara in acest scop.
In concluzie, testele de adecvanta si calitate a estimatului trebuiesc aplicate cat mai complet, analizate
comparativ si in detaliu, in scopul unei evaluari a calitatii modelului din toate punctele de vedere. Chiar in
situatia unor testele de adecvanata si de semnificatie ale parametrilor aparent bune, aprecierea calitatii unui
model nu este suficienta daca nu sunt testate predictiile modelului si in alte conditii experimentale decat cele
considerate. In plus, o inconsistenta intrinseca a datelor experimentale (de pilda observatii insuficiente,
corelate, degenerate), precum si determinari incomplete si neglijarea unor intermediari cheie de reactie, pot
diminua considerabil gradul de generalitate al modelului identificat.
¦