UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Y TECNOLOGÍAS

PROGRAMA DE QUÍMICA
Abril 2019
INFORME DE LABORATORIO Nº 1: AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LA
CAFEINA POR HPLC-DAD DE UNA MUSTRA COMERCIAL DE TE.

José Leonardo Cano Botero

RESUMEN
Este trabajo se realizó en dos momentos en el primero se realizó la extracción con solventes, de la cafeína en un extracto
de te comercial, donde se obtuvo un sólido verdoso con un punto de fusión entre 235°variando en 3 grados con lo
reportado en la literatura 238°C. Para la segunda parte se utilizó la técnica de HPLC-DAD para identificar el sólido de la
primera parte. Donde por una metodología de estándar interno pudimos cuantificar la muestra arrojando como resultado
una concentración de 0.56979g/mL con un grado de pureza94,97%. Los cromatogramas del estándar interno y la muestra
comercial de te presentaron tiempos de retención muy parecidos 4,760 min y 4,777min respectivamente. Para la nuestra
problema la aparición de dos tiempos de retención es un indicador de algunas impurezas al hacer la extracción de la
cafeína. Se tomaron como referencia los espectros de absorción teóricos (205nm,273 nm) y del estándar (204,86nm,
273.70) y se compararon con la muestra problema (205,02 nm, 273.65 nm) dando un resultado positivo para la
identificación de la cafeína en una muestra comercial de té.

PALABRAS CLAVE: Alcaloide, Cafeína, Destilación, Extracción, HPLC-DAD.

INTRODUCCIÓN

La cafeína es un polvo inodoro, incoloro y amargo. Friedrich Ferdinand Runge la aisló del café en
1819 y del té en 1827, pero su estructura química no se describió hasta 1875 por E. Fischer. La
cafeína (1, 3, 7-trimetilxantina) y otros alcaloides metilxantínicos, son derivados del grupo de las
xantinas, que a su vez se derivan de las purinas. También es conocida por el nombre teína,
guaranína o mateína. (Gracia-Lor, 2017)

La determinación de cafeína ha adquirido mucha importancia, debido a su uso en la industria

farmacéutica y en la industria de alimentos; ya sea como ingrediente en la elaboración de refrescos
y bebidas energéticas o por su presencia en productos como el té, el mate, el cacao y el café. En
todos estos casos, el control de calidad del parámetro cafeína es necesario en los productos que la
contienen. Por esta razón, se han desarrollado nuevos métodos instrumentales para su determinación
en diversas matrices, especialmente en alimentos. (Calle Aznar, 2011)

Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos:
técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan,
para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características
estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los
componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o
cualitativos. En la actualidad, las separaciones analíticas se efectúan fundamentalmente por
cromatografía y electroforesis.

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su
identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros
cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está
basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la
concentración.(Calle,Aznar,2011)
METODOLOGÍA RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la primera parte de este trabajo se colocó 25 Después de utilizar la metodología descrita en

g de té comercial, 10 g de carbonato de calcio
en polvo, y 250 mL de agua destilada en un
balón de 500 mL. Ajustado a un condensador
de reflujo. Efectuando calentamiento suave
alrededor de 30 minutos (se agito
ocasionalmente durante este lapso). Mientras la
solución permanecía caliente, se filtró al vacío
utilizando un lienzo apropiado. El filtrado se
llevó a temperatura ambiente, en un embudo de
separación de 500 mL, se extrajo con una
porción de 50 mL de diclorometano. Agitando
la mezcla vigorosamente por un minuto. Se
Pasó la capa orgánica directamente desde el
embudo de separación a un recipiente seco que
contenga el agente secante.
la primera parte, se obtuvo un sólido de color
verdoso con un punto de fusión de 235°C,
después de comparar el punto de fusión teórico
238°C este dato nos da indicios que la cafeína
tiene impurezas.
La Cafeína obtenida 0.18g con un Rendimiento
0.72% en base seca.
En la segunda parte de este trabajo se verifico
que el producto de la extracción si fuera cafeína,
este experimento se realizó con un estándar
interno de cafeína comercial donde se utilizó la
metodología de la segunda parte del
experimento, dando como resultado los
siguientes Cromatogramas y sus espectros de
absorbancias.

Después de separar la capa orgánica, se añadio

el extracto orgánico seco en un balón y rota
evaporó, en baño de agua, hasta sequedad. El
residuo en el balón es la cafeína. (Agudelo A
Fernando 2019)

Figura2. Cromatograma obtenido para la solución

estándar de cafeína

El área de la cafeína en el análisis del patrón

comercial fue de 3.360 mAU, conociendo que
Figura 1. Procedimiento experimental para extracción su concentración es de 20ppm.
de cafeína (García M, Eva. Fuentes L, Ana. Fernández
S, Isabel.2014)

En la segunda parte de este trabajo se realizó en

el Laboratorio De Química Instrumental De
La Universidad Del Quindio se identificó la
cafeína por HPLC. donde se utilizó la siguiente
metodología para un patrón interno: se inyecto
un volumen 2,5 microlitros de muestra
utilizando como fase móvil la mezcla
MeOH/H2O en la proporción 50:50 v, a un
flujo de 0,5 mL/min, dando un tiempo de 8
minutos para la elución y detectados a longitud Figura 3. Espectro de absorción; obtenido para una
de onda de 273 nm. solución de cafeína estándar.
En la figura 2 podemos observar tres tiempos de
retención diferentes, el primer componente
4.777, componente dos 5.423 y un tercer
componente 6.143 minutos respectivamente. El
cromatograma del estándar nos muestra que la
cafeína no está pura ya que esta muestra tres
tiempos de retención diferente, donde el primer
componente se denota como cafeína.
Figura 4. Espectro de absorción teórico de la cafeína
(L.M. Sanabria, J.A. Martínez, Y. Baena2017)
Al comparar el espectro de absorción de la
figura número 3 con el teórico podemos decir
que tienen absorbancias características de la
cafeína mostrando en el estándar utilizado una
primera absorbancia 204,86nm muy similar al
dato teórico que es de 205nm, después un
segundo pico con una absorbancia de 273.70nm
muy similar al dato teórico 270nm.
Figura 5. Topogramas obtenidos del estándar de
cafeína por HPLC-DAD
La selectividad de la metodología también
puede ser complementada con el estudio
de los topogramas obtenidos del DAD (figura
5), en donde gracias a su conformación
tridimensional se puede comprobar mediante la
corrida cromatografía en un rango de longitudes
de onda, que en el tiempo de retención de la
cafeína únicamente está presente dicha
sustancia sin presencia de ningún interferente
que co-eluya al tiempo de retención del analito
de interés. (L.M. Sanabria, J.A. Martínez, Y.
Baena 2017)
Figura 6. Topogramas teorico HPLC-DAD L.M.
(Sanabria, J.A. Martínez, Y. Baena 2017)
Figura7. Cromatograma obtenido dé una muestra
comercial de té.
Después de obtener los datos experimentales de
la muestra comercial de té, se pudo observar en
cromatograma de la (figura 7) que los tiempos
de retención de la cafeína son de 4,760 minutos.
Cabe resaltar que los otros dos tiempos de
retención que presento la muestra se toman
como impurezas a la hora de la extracción.

Figura 8. Topogramas obtenido de una muestra
comercial de te por HPLC-DAD
Figura 9. Espectro de absorción; obtenido para una
muestra de te comercial.
Después de hacer un análisis comparativo entre
el teórico, el estándar y la muestra problema se
puede evidenciar que la absorbancia no se sale
del rango dando como resultado dos bandas en
la en la muestra problema una de 205,02 nm y
otra a 273.65 nm.
El área de cafeína en el análisis del patrón
comercial fue de 3.360 mAU, conociendo que
su concentración es de 20ppm, entonces
sabiendo que el área en el análisis de la muestra
de cafeína extraída de té fue de 95.724 mAU,
entonces podemos determinar que esta tiene una
concentración de 569.79ppm (0.56979g/mL)
CONCLUSIONES
El punto de fusión de la muestra no nos da una
confirmación de la pureza de la cafeína
extraída, siendo necesario utilizar HPLC-DAD
para confirmar que el resultado de la extracción
en él te comercial.
Queda evidenciado que para el estándar no se
utilizó una muestra de cafeína pura debido a los
otros dos tiempos de retención que se mostraron
en la (figura 2) 5,423 min y 6,143 min.
Los espectros uv nos ratificaron las
absorbancias características de la cafeína donde
logramos comparar la muestra con el estándar y
el dato teórico.
En 0.6g en 1mL de metanol, se puede obtener la
pureza de la muestra comercial de té sabiendo
que la concentración real fue de 0.56979g/mL,
dando como resultado una pureza del 94,97%.
CUESTIONARIO
¿EN QUE CONSISTE LA
DERIVATIZACIÓN?
La derivatización consiste en realizar un
proceso químico de modificar la molécula
original mediante el uso de otros reactivos para
obtener propiedades químicas diferentes de
mayor utilizad para un procedimiento
determinado, como, por ejemplo, propiedades
farmacológicas, solubilidad, estabilidad,
reactividad, polaridad o capacidad higroscópica.
¿CUÁLES SON LOS CRITERIOS PARA LA
ELECCIÓN DE UN REACTIVO DE
DERIVATIZACIÓN?
Cuando se desee realizar una derivatización es
necesario tener en cuenta las propiedades
químicas que se desean obtener, de esta manera,
se puede predecir el comportamiento químico
del derivado. Del mismo modo hay que tener en
cuenta la naturaleza química de la molécula a
derivatizar, de tal manera de garantizar la
reacción con el reactivo elegido. El origen
químico de los productos formados debe ser
predecible. El reactivo de derivatización debe
formar un número de productos igual al número
de analitos iniciales, es decir, que no se forme
más de un producto por analito. Que genere el
producto de derivatización en la menor cantidad
de etapas posible (no más de dos). Un reactivo
que permita que las condiciones de operación
sean la más simples posibles. Aunque en
ocasiones no es posible, en lo posible que el
agente derivatizante sea lo menos toxico
posible.
ENUNCIE Y EXPLIQUE LAS PRINCIPALES
TEORÍAS DE DERIVATIZACIÓN EN GC.
A menudo los compuestos no pueden analizar
porque no están en una forma adecuada para
una técnica analítica particular. Los ejemplos
incluyen compuestos no volátiles para análisis
por GC compuestos insolubles en análisis por
HPLC y materiales no estables en las
condiciones analíticas, El procedimiento de
derivatización modifica la estructura química de
los compuestos permitiendo el análisis por la
técnicam deseada.
Reacciones: Sililación
Los derivados con silicio son los más
ampliamente usados en aplicaciones de
cromatografía de gases. En general se forman
por substitución de los hidrógenos activos de
ácidos, alcoholes, tioles, aminas, amidas y
cetonas y aldehídos enolizables con grupos
TMS (TriMetilSilil). Existe una amplia gama de
reactivos disponibles para la introducción de
estos grupos, que difieren en su los hidrógenos
activos, es importante que no se inyecten en
columnas con fases estacionarias que contengan
dichos grupos funcionales. Ejemplos de fases
no compatibles son los polietilénglicoles (TR-
WAX o TR-WaxMS) y fases para ácidos libres
(TR-FFAP).
Reacciones: Acilación
La acilación es la conversión de compuestos
que contengan hidrógenos activos como -H, -
SH y -NH en ésteres. tioésteres y amidas
mediante la acción de una ácido carboxílico o
un derivado de un ácido carboxílico. En
aplicaciones cromatográficas, la reacción de
acilación se usa principalmente para convertir
las clases anteriores de compuestos en
derivados que sean más adecuados para
cromatografía o que dan una mayor respuesta
en la detección cromatográfica que el
compuesto original.
Un ejemplo importante de esta aplicación es la
inserción de grupos perfluoroacetilo en una
molécula para incrementar la respuesta en
detectores de Captura de Electrones (ECD).
Los acilderivados resultan también útiles en
aplicaciones de Espectrometría de Masas en las
que modifican los perfiles de fragmentación de
los compuestos a estudiar(28).
Reacciones: Alquilación
La alquilación es la substitución de un
hidrógeno activo por un grupo alifático o
alifático-aromático (bencilo).Esta técnica se usa
para modificar los compuestos con hidrógenos
activos como ácidos carboxílicos y fenoles. La
aplicación principal de esta técnica es la
conversión de ácidos orgánicos en ésteres, que
permiten mejores cromatogramas que los ácidos
libres.
Además la reacciones de alquilación pueden
usarse para preparar éteres, tioéteres y
tioésteres, N-alquilaminas y amidas. A medida
que disminuye la acidez de los hidrógenos
activos, ha de aumentarse la fuerza del agente
alquilante. Al ser las condiciones más extremas
y los reactivos más potentes, la selectividad y
aplicabilidad de los métodos resulta más
limitada.
EXPLIQUE POR LO MENOS TRES
EJEMPLOS DE LA UTILIDAD DE LA
DERIVATIZACIÓN.
Los compuestos que contienen grupos
funcionales con hidrógenos activos (-COOH, -
OH, -NH y -SH) se suelen derivatizar antes de
su análisis por cromatografía de gases. Estos
grupos funcionales tienden a formar enlaces de
hidrógeno intermolecular que afectan a la
volatilidad, pueden interactuar negativamente
con la fase estacionaria de la columna y pueden
ser térmicamente inestables. La sililación,
acilación y la alquilación son las técnicas de
derivatización usadas para alterar estos grupos
funcionales mejorando sus características
térmicas y cromatográficas.
reactividad, selectividad y reacciones
secundarias y en el carácter de los productos de
reacción. Existe una amplia literatura disponible
que permite seleccionar el reactivo de sililación
más adecuado para cada problema analítico
particular.
Los reactivos de sililación y los derivados TMS
son inestables hidrolíticamente y deben ser
protegidos frente a la humedad. Sin embargo el
grado de hidrólisis de cada reactivo y derivado
es diferente, y, en algunos casos, es posible
preparar derivados en presencia de pequeñas
cantidades de humedad, o aislar y purificar
derivados por extracción en un solvente
orgánico y lavado con soluciones acuosas. Los
reactivos que introducen un grupo t-Butilsililo
en lugar de un grupo TMS se desarrollaron para
presentar una estabilidad hidrolítica mayor.
Estos derivados ofrecen una mayor estabilidad
frente a la hidrólisis y generan perfiles de
fragmentación específicos, lo que los hacen
muy útiles en aplicaciones de GCMS.
La mayoría de los derivados TMS o TBDS
tienen una excelente estabilidad térmica y
resultan adecuados para una amplia gama de
condiciones de inyector y columna. Sin
embargo, puesto que los reactivos de sililación
modificarán prácticamente todos
CONSULTAS:
Rotación Óptica: La rotación óptica o actividad
óptica es la rotación de la polarización lineal de
la luz cuando viaja a través de ciertos
materiales. Suele ser un fenómeno que ocurre
en soluciones que presentan moléculas quirales.
Espectrometría de masas: La espectrometría de
masas es una técnica de análisis que permite
determinar la distribución de las moléculas de
una sustancia en función de su masa.
EIMS: Es un método de ionización en el que los
electrones energéticos interactúan con los
átomos o moléculas de fase sólida o gaseosa
para producir iones.
ES-TOF: Consiste en una ionización suave del
analito que provoca la vaporización de intactas
moléculas termolábiles, no volátiles tales como
proteínas y lípidos en un rango de peso
molecular entre 2 a 20 kDa, a un relativo bajo
costo y resultado inmediato. Muy utilizada para
obtener, mediante espectrometría de masas, un
espectro propio de un organismo y
comparándolo con bases de datos, identificar a
nivel de género, especie e incluso cepa aislados
bacterianos y fúngicos. También es posible
identificar virus.
RMN: Aprovecha que los núcleos atómicos
(por ejemplo, dentro de una molécula) resuenan
a una frecuencia directamente proporcional a la
fuerza de un campo magnético ejercido, de
acuerdo con la ecuación de la frecuencia de
precesión de Larmor, para posteriormente
perturbar este alineamiento con el uso de un
campo magnético alterno, de orientación
ortogonal.
HMBC: es un conjunto de métodos de
espectroscopia de resonancia magnética nuclear
(RMN) que proporcionan datos representados
en un espacio definido por dos ejes de
frecuencia en lugar de uno. Los tipos de RMN
2D incluyen espectroscopia de correlación
(COSY), espectroscopía J, espectroscopia de
intercambio (EXSY) y espectroscopia de efecto
Overhauser nuclear (NOESY)
HMQC: se utiliza con frecuencia en la
espectroscopia de RMN de moléculas orgánicas
y es de particular importancia en el campo de la
proteína RMN.
HOHANA: En la técnica se observan picos de
protones acoplados. Sin embargo, los picos
cruzados se observan no solo para los núcleos
que están directamente acoplados, sino también
entre los núcleos que están conectados por una
cadena de acoplamientos. Esto lo hace útil para
identificar las redes interconectadas más
grandes de acoplamientos de espín. Esta
capacidad se logra mediante la inserción de una
serie repetitiva de pulsos que causan la mezcla
isotrópica durante el período de mezcla.
HETCOR: es un experimento de RMN 2D en el
que dos tipos diferentes de núcleos se
correlacionan a través de acoplamientos de
espín-espín de un solo enlace. El cambio
químico de un núcleo - heteronucleus o núcleo
X, generalmente 13C, se detecta en la
dimensión medida directamente, mientras que
el cambio químico del segundo núcleo,
generalmente 1H se registra en la dimensión
indirecta.
NOESY: La relajación cruzada del Overhauser
nuclear entre giros nucleares durante el período
de mezcla se utiliza para establecer las
correlaciones. El espectro obtenido es similar a
COSY, con picos diagonales y picos cruzados,
sin embargo, los picos cruzados conectan las
resonancias de los núcleos que están
espacialmente cerca en lugar de los que están
unidos a través de enlaces. Los espectros
NOESY también contienen picos axiales
adicionales que no proporcionan información
adicional y se pueden eliminar mediante un
experimento diferente invirtiendo la fase del
primer pulso.
DQF-COSY: Es la aplicación de la
espectroscopia de resonancia magnética nuclear
(RMN) al análisis estructural y conformacional
de carbohidratos. Este método permite a los
científicos elucidar la estructura de
monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos,
glicoconjugados y otros derivados de
carbohidratos de fuentes sintéticas y naturales.
TOCSY: es similar al experimento COSY, en el
que se observan picos cruzados de protones
acoplados. Sin embargo, los picos cruzados se
observan no solo para los núcleos que están
directamente acoplados, sino también entre los
núcleos que están conectados por una cadena de
acoplamientos. Esto lo hace útil para identificar
las redes interconectadas más grandes de
acoplamientos de espín. Esta capacidad se logra
mediante la inserción de una serie repetitiva de
pulsos que causan la mezcla isotrópica durante
el período de mezcla. Los tiempos de mezcla
isotrópicos más largos hacen que la
polarización se extienda a través de un número
creciente de enlaces.
DEPT: Este experimento permite determinar la
multiplicidad de la sustitución de átomos de
carbono con hidrógenos. ara este propósito, se
deben registrar tres experimentos, donde el
pulso con φ3 tiene un ángulo de giro de 45º (a),
90º (b) y 135º(c).
REFERENCIAS
Agudelo A Fernando PRACTICA Nº 1 Té:
Aislamiento de Cafeína (2019)
Calle Aznar Silvia “Determinación analítica de
la cafeína en diferentes productos comerciales”
Barcelona, 12 de Junio de 2011
Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Zuccato, E., Bade,
R.,Baz-Lomba,J.A., Castrignanò, E.,Castiglioni,
S. (2017). Estimation of caffeine intake from
analysis of caffeine metabolites in wastewater.
Science of The Total Environment
García Martínez, Eva. Fuentes López, Ana.
Fernández Segovia, Isabel. Extracción y
cuantificación de cafeína mediante
espectroscopia UV-Visible en café, té y cacao.
Valencia agosto 2014
L.M. Sanabria, J.A. Martínez, Y. Baena,
Validación de una metodología analítica por
HPLC-DAD para la cuantificación de cafeína
en un ensayo de permeación in vitro
empleando mucosa oral porcina, Rev. Colomb.
Cienc. Quím. Farm., 46 (2), 202-219
(2017).