UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA PROFESONIAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

TITULO:

“TORTA DESGRASADA DE SEMILLAS DE TRES VARIEDADES DE UVA (Vitis

Vinifera), COMO FUENTE DE ANTIOXIDANTES FENÓLICOS”

TESISTAS:

BARCO JARA MELISA

MIRANDA DIESTRA DANIA

ASESOR:

DR. GILBERT RODRIGUEZ PAUCAR

Nuevo Chimbote – Perú

2018
 INDICE

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES .................................................................................. 3

4.1. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA HARINA DE SEMILLA DE UVA............................. 3

4.1.1 OBTENCIÓN DE LA HARINA DE SEMILLA DE UVA ............................................................................. 3

4.1.2 CARACTERÍSTICAS PROXIMAL DE LA HARINA DE SEMILLA DE UVA .................................................. 3

4.1.3 DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES EN LA HARINA DE SEMILLA DE UVA 5

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................................... 6

VI. ANEXOS................................................................................................................ 10

ANEXO 1. METODOLOGÍA PARA EL ANÁLISIS PROXIMAL .......................................................... 10

ANEXO 2. CURVAS ESTÁNDAR PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES

Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE. ................................................................................................ 14

ANEXO 3. METODOLOGÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES Y

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .................................................................................................... 15

 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA HARINA DE SEMILLA DE UVA

4.1.1 OBTENCIÓN DE LA HARINA DE SEMILLA DE UVA

En el Cuadro 1 se reportan los resultados del proceso de obtención de la harina de

semillas de uva, los cuales serán usados como material para la obtención de la torta
desgrasada de semilla de uva, el cual será analizados en la presente investigación;
donde los mayores valores en cantidad en rendimiento es la muestra de Var. Red
GLobe, seguida de la Var. Italia y por último la Var. Criolla Negra.

SEMILLA SEMILLA RENDIMIENTO (%)

Uva SEMILLA
VARIEDAD HUMEDA MOLIDA
(kg) SECA (gr) SEMILLAS SEMILLAS
(gr) (gr) SEMILLAS
SECAS MOLIDAS
Criolla Negra 10.1 189.35 91.54 87.88 1.9% 48% 96%
Red Globe 10.5 205.65 105.80 103.68 2.0% 51% 98%
Italia 9.95 187.42 92.72 90.87 1.9% 49% 98%

4.1.2 CARACTERÍSTICAS PROXIMAL DE LA HARINA DE SEMILLA DE

UVA
En el Cuadro 2 se muestra la composición química proximal realizado a las muestras
de harina de semillas de uva.

Cuadro 2. Composición química proximal de la harina de semillas de uva

HUMEDAD CENIZAS GRASAS

VARIEDAD (g H2O/100g (g cenizas/100g (g grasa/100g
DE UVA muestra) muestra) muestra)
(𝒙
̅± s) (𝒙
̅± s) (𝒙
̅± s)
Criolla Negra 9.72 ± 0.04 2.15 ± 0.000462 14.3%
Red Globe 10. 07 ± 0.08 3.0 ± 0.0007 15.02%
Italia 9.87 ± 0.076 2.0 ± 0.0059 13.7%

[3]
Como se observa en el cuadro 2, los valores de humedad de las muestras de variedades,
Criolla Negra, Red Globe e Italia, fueron de 9.72 ± 0.04; 10. 07 ± 0.08 y 9.87 ± 0.076
respectivamente, siendo valores superiores a lo reportado por Moya García C. (2017)
8.69 ± 0.06, en su estudio de Extracción y caracterización de aceite vegetal de las
semillas de uva borgoña (Vitis Vinífera) utilizando enzimas”. Y presentaron valores
menores al reportado por Toro Zapata N. y Suárez Osorio l., (2013), de 13.71% de la
semillas de Vitis Labrusca L. (uva Isabella), secado a 40°C en un horno durante 48
horas.

La humedad óptima de las semillas varía ampliamente según las distintas clases de éstas
y el método de extracción que se emplee. Los procesos de degradación de las semillas
suministran productos nutritivos para el crecimiento de la microflora, a la vez que
estimulan la actividad enzimática; por ello la alteración es un proceso autocatalítico que
se ve favorecido por la humedad.

Respecto a los valores obtenidos de cenizas, la Var. Red Globe presento el valor más
alto con 3.0 ± 0.0007, valor que se asemeja al reportado por Hidaldo et al. (2016) de
3%, la Var. Criolla y Var. Italia, presentaron Negra presento un valor de 2.15 ± 0.0004
% y 2.0 ± 0.0059 % de cenizas, valores menores al reportado por Yedro et al. (2014)
2,4 %.

El contenido de grasa de la Var. Red Globe fue el valor más alto con 15.02% seguido
de la Var. Criolla Negra con 14.3% y un valor menor de 13.7% para la Var. Italia, cuyos
valores son menores al reportado por Yedro et al. (2014) 17 por ciento, pero mayores al
reportado por el mismo autor en la variedad Tempranillo de la Vitivinícola Matarromera
S.A

[4]
4.1.3 DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES
EN LA HARINA DE SEMILLA DE UVA

Cuadro 3: contenido de Polifenoles Totales en harina de semilla de uva

Variedades de semilla de Harina de semilla de uva

uva (gGAE/ kg muestra)
Criolla Negra 194.5
Red Globe 169.1
Italia 125.2

Como se observa en el cuadro 3, el mayor valor del contenido de polifenoles totales fue
de la harina de semilla de uva de Var. Criolla negra con 194.5 gGAE/kgmuestra, valor
que es menor al reportado por Thorsten M. et al. (2013), en la variedad Lemberger con
197.1 gGAE/kgmuestra.

Seguido de la Var. Red Globe con 169.1 gGAE/kgmuestra, valor menor al reportado
por el mismo autor en la Var. Samtrot, con 177.8 gGAE/kgmuestra.

El contenido de polifenoles totales en la harina de semilla de uva de Var. Italia fue 115.2
gGAE/kgmuestra, valor mayor al reportado por Thorsten M. et al. (2013), en la variedad
kerner, 122.4 gGAE/kgmuestra y menor a la Var. Müller-Thurgau con 181.1
gGAE/kgmuestra

[5]
 V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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plantas recolectadas en la ecorregión cafetera. Tesis Ing. Pereira, Colombia,
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- 20 de Setiembre del 2013. Revisado el 15 de Noviembre del 2013. Lima –
Perú

[9]
 VI. ANEXOS

ANEXO 1. METODOLOGÍA PARA EL ANÁLISIS PROXIMAL

A. Determinación de la Humedad

Procedimiento:

- Secar la placa petri durante 15 minutos y transferir al desecador hasta que enfríe.
- Pesar la placa petri y agregarle 5g de muestra.
- Colocarlos en la estufa a 100-105 °C por 6 horas.
- Por la diferencia de peso se obtiene la humedad de la muestra y luego se lleva a
porcentaje.

Cálculos:

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = × 100
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Dónde:

Peso total = peso de la placa + muestra fresca

Peso final = peso de la placa + muestra seca

B. Determinación de Cenizas

Procedimiento:

- Colocar el crisol limpio en un horno de incineración a 600 °C durante una hora.

- Trasladar el crisol del horno al desecador y enfriarlo a la temperatura de laboratorio.
Pesarlo utilizando pinzas de metal.
- Pesar por diferencia 2g de muestra en el crisol previamente tarado.
- Colocar el crisol en el horno incinerador a una temperatura de 600°C durante 3 a 5
horas.

[10]
 - Luego, sacar del horno y trasladar el crisol a un desecador para enfriarse a temperatura
ambiente.
- Pesar lo más pronto posible para evitar la absorción de humedad.

Cálculos:

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎
%𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = × 100
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

C. Determinación de Proteína

Procedimiento:

- Pesar de 0,25g de muestra, luego agregar 1g del catalizador (mezcla de sulfato de

potasio con sulfato de cobre) para acelerar la reacción.
- Limpiar con un poco de agua el cuello del balón de digestión.
- Agregar 2,5mL de ácido sulfúrico concentrado y colocar el balón en la cocina de
digestión. La digestión termina cuando el contenido del balón es completamente
cristalino.
- Colocar la muestra digerida en el aparato de destilación.
- Adicionar 5mL de hidróxido de sodio concentrado al 80% e inmediatamente conectar
el vapor para que se produzca la destilación.
- Conectar el refrigerante y recibir el destilado en un matraz Erlenmeyer de 125mL
conteniendo 5mL de la mezcla de los indicadores de pH.
- La destilación termina cuando ya no pasa más amoniaco (5mm) y hay viraje titulando
con ácido clorhídrico 0,05N. Anotar el gasto.

Cálculos:

- La cantidad de nitrógeno de la muestra se obtiene por la siguiente fórmula:

(𝐺)(𝑁𝐶)(𝑀𝑒𝑞. )
%𝑁𝑖𝑡𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜 = × 100
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Dónde:

G = Gasto del HCl

[11]
 NC = Normalidad corregida

Meq. = peso miliequivalente del nitrógeno

- Para obtener la cantidad de proteína bruta, se multiplica por el factor 6,25:

-
%𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 = %𝑁𝑖𝑡𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜 × 6.25

D. Determinación de Grasa

Procedimiento:

- Usar muestras deshidratadas, secadas en una estufa, y colocarlas en un desecador.

- Poner a secar en una estufa (110 °C) el número de matraces que se van a utilizar.
- Luego de una hora, sacar los matraces de la estufa y ponerlos a enfriar en una campana
que contengan una sustancia deshidratante. Pesar los matraces fríos.
- Pesar la muestra seca de 3-5g, empaquetarla en un pedazo de papel filtro.
- Colocar el paquete en el cuerpo del aparato de soxhlet y luego agregar éter, hexano
hasta que una parte del mismo sea sifoneado hacia el matraz; conecta la fuente de calor
de la cocina.
- El solvente (hexano o éter) al calentarse se evapora (69 °C - 34,6 °C) y asciende a la
parte superior del cuerpo del equipo. Allí se condensa por refrigeración con agua y cae
sobre la muestra, regresando posteriormente al matraz por sifón, arrasando consigo la
grasa. El ciclo es cerrado, y la velocidad de goteo del hexano debe ser de 45-60 gotas
por minuto. El proceso dura 3 horas.
- El matraz debe sacarse del aparato cuando contiene poco hexano o éter.
- Evaporar el solvente remanente en el matraz en una estufa y enfriarlo en una campana
que contenga sustancia deshidratante.

Cálculos:

(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑎𝑧 𝑐𝑜𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎) − (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑎𝑧 𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜)

%𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎 = × 100
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

[12]
E. Determinación de Fibra

Procedimiento:

- Digestión ácida: Pesar 3g de muestra exenta de grasa en un vaso de 600mL.

- Añadir 200mL de H2SO4 al 1,25%. Hervir durante 30 minutos. Luego, filtrar y lavar
con agua destilada caliente hasta neutralizar la acidez.
- Digestión alcalina: Añadir 200mL de NaOH 1,25% y hervir por 30 minutos.
- Filtrar y lavar con agua destilada caliente.
- Poner a la estufa el papel filtro y la muestra por 2 horas, y pesar. Este peso se llamará
P1.
- Luego se coloca a la mufla para eliminar la materia orgánica y obtener las cenizas por
3 horas. Se pesa nuevamente siendo el P2.

Cálculos:
𝑃1 − 𝑃2
%𝐹𝑖𝑏𝑟𝑎 = × 100
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

F. Determinación de Carbohidratos
- Son los valores calculados por diferencia que incluye el valor de fibra. Se obtiene
restando de 100, el peso en gramos de los macro componentes, según la siguiente
fórmula:
𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 = 100 − (𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 + 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 + ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 + 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎)

[13]
ANEXO 2. CURVAS ESTÁNDAR PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS
FENÓLICOS TOTALES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.
A. Curva Estándar para los compuestos fenólicos totales en la harina y torta
desgrasada de semilla de uva

CURVA ESTANDAR DE ÁCIDO GALICO

0.8
y = 0.0384x - 0.0199
0.7 R² = 0.9994
Absorbacia a 726nm

0.6

0.5
CURVA ESTANDAR DE
0.4 ÁCIDO GALICO

0.3 Linear (CURVA

ESTANDAR DE ÁCIDO
0.2 GALICO)

0.1

0
0 5 10 15 20 25
mg AGE/L

(𝐴𝑏𝑠 + 0.0199)
𝑋=
0.0384

X: mg de ácido gálico equivalente/L (mgAGE/L)

Abs: Absorbancia a 726 nm

B. Curva Estándar para la capacidad antioxidante en la torta desgrasada de semilla

de uva

 Curva estándar para determinar la capacidad antioxidante en la torta

desgrasada de semilla de uva mediante el método DPPH.

[14]
 Curva Estándar Capacidad Antioxidante DPPH
0.7

0.6 y = -0.1045x + 0.8498

Absorbancia 517 nm
R² = 0.9989
0.5

0.4 Curva Estándar Capacidad

Antioxidante DPPH
0.3
Linear (Curva Estándar
0.2 Capacidad Antioxidante
DPPH)
0.1

0
0 2 4 6 8 10
umol TROLOX/ml

(𝐴𝑏𝑠 + 0.8498)
𝑋=
0.1045

X: umol de Trolox Equivalente/mL

Abs: Absorbancia a 517 nm

ANEXO 3. METODOLOGÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS

FENÓLICOS TOTALES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

A. Determinación de compuestos fenólicos totales.

El contenido total de polifenol (TP) se determinó mediante un método colorimétrico

utilizando el ensayo de Folin-Ciocalteu siguiendo el mismo procedimiento que se
informó anteriormente (Kurabachew S. et al. 2015). Las medidas se llevaron a cabo a
726 nm y la curva de calibración se realizó con soluciones estándar de ácido gálico,
todos los análisis se realizaron por triplicado. El rendimiento de TP se expresó en
miligramos de ácido gálico equivalente por gramo de sustrato seco (mgGAE / g).

Preparación de soluciones

- Preparación de la solución stock de ácido gálico

[15]
 Pesar 25mg de ácido gálico y agregar en una fiola de 100ml y aforar con agua
destilada. De esa solución extraer 2ml y agregar a una fiola de 10 ml y enrasar con
agua destilada, tapar y mezclar completamente.
- Preparación de la solución Folin Dennis

Medir 1.25 ml de Folin y agregar en una fiola de 10 ml y aforar con agua destilada

- Preparación de la solución de Na2CO3

Pesar 2g de Na2Co3 y vaciar a una fiola de 10 ml y aforar con agua destilada y
calentar (70-80°C) hasta diluir

Preparación de la curva estándar

Agregar a 7 tubos de ensayo las cantidades de 150, 300, 600, 900, 1200, 1500 y 180
µL de Acido Gálico, respectivamente. Añadir a cada tubo de ensayo 300 µL de Folin
Dennis, agitar cada tubo y dejar reposar por 5 min. Luego añadir a cada tubo 150 µL
de Na2CO3 y agitar, enrasiar con agua destilada cada tubo hasta 3750 µL,
homogenizar y reposar 2 min, al final leer en absorbancia a 726 nm.

Blanco: 150 µL de Ca2CO3 y aforar con agua destilada hasta 3750 µL

Agua
Ac. Galico Folín Na2Co3 Total
destilada
µL µL µL µL
µL
1 150 300 150 3150 3750
2 300 300 150 3000 3750
3 600 300 150 2700 3750
4 900 300 150 2400 3750
5 1200 300 150 2100 3750
6 1500 300 150 1800 3750
7 1800 300 150 1500 3750
Blanco 0 - 150 3600 3750

Preparación de extracto de muestra

[16]
 Pesar 5g de torta desgrasada de semilla de uva y agregarlo un matraz, añadir 100 ml de
metanol, vaciar a un tubo de ensayo con tapa. sonicaron mediante la sonda ultrasónica.
(Cole- Parmer 8892) a 20 kHz de frecuencia y 150 W durante 15 minutos a una
temperatura inferior a 30 C.

Determinación de polifenoles totales

Tomar 900 µL del extracto de muestra, agregar 300 µL de Folin, 150 µL de Ca2CO3 y
aforar hasta 3750 µL con agua destilada. Realizar la lectura en el espectrofotómetro a
726nm la absorbancias obtenida, y se remplaza en la curva de calibrado concentración
(mg/L) vs absorbancia. Por medio de la regresión lineal ajustada a cero (0) se determina
la ecuación (y = bx) con la cual se pueden obtener los polifenoles totales expresados en
mg ácido gálico/L.

Esto se realiza por triplicado.

B. Determinación de la capacidad antioxidante con el método FRAP

Este método se basa en un aumento de la absorbancia a 593 nm debido a la formación
de complejos de tripiridil-S-triazina con Fe2 + [TPTZ-Fe (II)] en presencia de un agente
reductor (Benzie & Strain, 1996; Benzie & amp; Szeto, 1999)
Preparación de Soluciones
- Solución FeCl3.6H2O 20 nM
Pesar 0.054 g de FeCl3.6H2O agregar a un afional de 10 ml y enrasiar con agua
destilada y almacenar a 4°C en ausencia de luz. Reactivo preparado en el mismo
dia.
- Solución TPTZ 10 nM
Pesar 0.031 g de TPTZ en fiola de 10 ml y aforar con HCl 0.04 M
- Acido clorihidrico 0.04 M
1.64 ml de Ácido Clorihidrico concentrado en una fiola de 500 ml y aforar con
agua bidestilada
- Buffer 0.03 M, pH 3.6
1.55 g CH3COONa. 3H2O, 8 ml de ácido acetico en una fiola de 500 ml y aforar
con agua destilada, sonificar 4 min. Verificar y corregir pH.
[17]
 - Reactivo FRAP:
100 ml Buffer 0.03 M, pH 3.6, 10 ml de TPTZ 10 nM y 10 ml de FeCl3.6H2O 20
nM

Determinación de la capacidad antioxidante

Para la determinación de la capacidad antioxidante, en cada pocillo de la placa se

agrega 20 µL de muestra (diluida si es necesario), luego se inyecta 280 µL de solución
FRAP. La mezcla se dejó reposar durante 4 minutos a temperatura ambiente antes de
medir la absorción a 593 nm. La calibración se realizó con Trolox como se describió
anteriormente.

C. Método ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity)

 Preparación de reactivos

Buffer Fosfato PBS (75nM, pH 7.4). Disolver 13.063 g de K2HPO4, en

100 ml de agua destilada, disolver en otra fiola 9g de NaH2PO4 en 100 ml
de agua destilada. Sacar 61.6 ml de K2HPO4 diluida y 38.9 de NaH2PO4
diluida, y agragar ambos a una fiola de 100 ml, diluir esa solución (1:10),
ajustar el pH a 7.4

Solución de AAPH. Pesar 0,40668g de dihidrocloruro de 2,2´- azobis-2-

amidinopropano, mas 5 ml de PBS. De aquí retirar 2.5 ml y agregar 0.5 ml
PBS, de esa solución volver a retirar 1 ml y agregar 1 ml PBS.

Solución de fluoresceína disodico (116.66 nM), disolver 0,01097 g de

fluoresceina en 25 ml de disolución reguladora de fosfato (75 mM pH=7,4),
conservando a T° 4°C

Solución de florescencia para análisis diarios. Tomar un alicuato de 100

µl de la solución disodico en 10 ml de PBS. De aquí se toman 250 µl y se
llevan hasta 25 ml con la misma disolución reguladora.

Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre

se prepara disolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5 ml de agua
destilada. A partir de esta se hacen diluciones que serán los distintos puntos

[18]
de la recta, con unas concentraciones de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y
100 µM.

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