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net/publication/271202837
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Bernardo Villegas-Estrada
University of Caldas
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Evaluation and validation of RNAi mediated gene knockdown in Coffee Berry Borer (H. hampei). View project
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Programa de Maestría en Fitopatología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas, Manizales. Correo electrónico: oscar.guzman@ucaldas.edu.co
RESUMEN
ABSTRACT
Las enfermedades de las plantas ocasionadas por
microorganismos infecciosos como hongos, bacterias, DIAGNOSIS OF PLANT DISEASES OF
nematodos y protozoarios flagelados, y por agentes BIOTIC ORIGIN
como virus y viroides, son el producto de la interacción
dinámica entre un patógeno, un hospedante y el medio Plant diseases caused by living infectious microorganisms
ambiente. El primer paso para el manejo correcto de una such as fungi, bacteria, nematodes, and flagellate protozoa,
enfermedad es conocer su verdadera etiología. Se conocen and by agents such as viruses and viroids, are the result of
más de 1.300 especies de hongos que causan enfermedades the dynamic interaction between a pathogen, a host and the
en los principales cultivos alimenticios, además de 4.105 environment. The first step for the correct management of
especies de nematodos fitoparásitos, 950 especies de a plant disease is to know its real etiology. More than 1.300
virus y 30 de viroides, y alrededor de 100 especies de fungi species which cause diseases in the main foodstuff are
bacterias fitopatógenas. Existen varios procedimientos well recognized along with 4.105 phytoparasite nematodes
para determinar la etiología de enfermedades de plantas species, 950 viruses and 30 viroids species, and around 100
tales como, la observación directa del agente causante al phytopathogenic species of bacteria. There exists a variety
microscopio compuesto, técnicas inmuno-enzimáticas, of procedures to determine the etiology of diseases in
bioquímicas y moleculares, y microscopía electrónica. Para plants including direct observation of the causing agent
un diagnóstico correcto, se debe disponer de laboratorios through the compound microscope, immune-enzymatic,
adecuados de Diagnóstico Fitosanitario, a los cuales deben bio-chemical and molecular techniques, and electron
enviarse muestras frescas y representativas de plantas que microscopy. In order to carry out a correct diagnosis,
presenten síntomas típicos de la enfermedad, para poder adequate Phytosanitary Diagnosis Laboratories must be
conocer con exactitud su etiología. El diagnóstico es el available where fresh and representative plant samples, with
fundamento técnico y científico para adoptar medidas de typical symptoms of the disease, can be sent in order to
manejo rápido y oportuno. know exactly their etiology. The diagnosis is the technical
and scientific fundamental to take measures for a quick
Palabras clave: bacteria, etiología, hongos, nematodos, and appropriate management.
patógeno, viroides, virus.
Key words: bacteria, etiology, fungi, nematodes,
pathogen, viroids, viruses.
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Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
A. B.
C. D.
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Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
(Wollenweber) Behrens, respectivamente) producen para que se tornen susceptibles. Algunos factores
quistes que les permiten sobrevivir por más de 20 bióticos o abióticos pueden causar pérdidas indirectas,
años en el suelo (Perry & Moens, 2006). predisponiendo a las plantas a ataques subsecuentes
por otros patógenos como los nematodos, que
4. Pérdidas de poscosecha. En el departamento atacan las raíces de plantas y permiten la entrada
de Boyacá se ha registrado la Antracnosis de la curaba de otros microorganismos (Castaño-Zapata, 1994).
[Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk, El proceso de colonización de Fusarium oxysporum
anamorfo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Schlechtend.:Fr., en presencia de Meloidogyne javanica
Sacc. en Penz] como responsable del 50% del ataque (Treub) Chitwood, ha sido estudiado de tal manera
de frutos (Jácome & Barreto, 1984). que hay mayor colonización de los tejidos de las
plantas por Fusarium, a medida que aumenta el
5. Formación de productos tóxicos. Los número de individuos de Meloidogyne (Perry et al.,
patógenos de plantas, especialmente hongos, producen 2009).
toxinas como las aflatoxinas causadas por especies
de Aspergillus P. Mich. ex Link:Fr., en maíz y otros Las enfermedades que afectan las plantas pueden ser
productos almacenados. Por ejemplo, la aflatoxina causadas por diferentes microorganismos o agentes,
B1 es producida por tres especies estrechamente los cuales se describen a continuación.
relacionadas: A. flavus Link:Fr., A. parasiticus Speare y
A. nomius Kurtzman, Horn & Hesseltine. Se conocen Hongos. Esta palabra proviene del griego sphongos,
unas 300 toxinas fúngicas (Carrillo, 2003). que significa esponja (Harper, 2010). Las hifas miden
entre 2 y 10 µm de diámetro hasta varios centímetros
6. Incrementos en el costo de producción. de longitud. La mayoría de las especies están
Los patógenos causan enfermedades que resultan en compuestas por filamentos tubulares que pueden ser
reducción del rendimiento y calidad, lo cual provoca un cenocíticos o septados, cuyo conjunto se denomina
incremento en los costos de producción como el caso micelio. Los componentes principales de las paredes
de la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) del celulares de los hongos son celulosa, pectona y
banano, cuyos costos de control varían entre US$700 quitina, y se distinguen por la carencia de clorofila,
y 900 ha/año, representando cerca del 13,8% de los posesión de núcleos y nucléolos con membranas
costos totales de producción del cultivo y el 46% de los bien definidas (eucariotas). Su reproducción se realiza
costos de los agroquímicos (Chica et al., 2004). mediante esporas de origen sexual o asexual (Castaño-
Zapata, 1994).
7. Costos de manejo. El costo de la aspersión
semanal de un cultivo de maracuyá con productos Bacterias. Palabra que deriva del griego bakterion, y
cúpricos para manejar la Bacteriosis [Xanthomonas significa bastón pequeño cuyo tamaño oscila entre 1
campestris (Pammel) Dowson pv. passiflorae Pereira] y 2 mm (Harper, 2010). Estos microorganismos son
se refleja posteriormente en un incremento de unicelulares, cuyo material genético (ADN) carece de
precio al mayorista, al intermediario y, finalmente, al una membrana celular y por ello no está organizado
consumidor. A mayor número de aspersiones, mayor en un núcleo (procariotas). Sus células consisten
es el incremento en los costos de manejo (Botero et de citoplasma que contienen ADN y ribosomas
al., 2006; Castillo & Granada, 2005). pequeños (70S). El citoplasma está rodeado por
una membrana y una pared celular. La mayoría de
8. Predisposición a otras enfermedades. bacterias fitopatógenas tienen forma de bastón o
Según Paul Sorauer (1905), los patógenos afectan bacilo y poseen flagelos, usualmente en los polos, y
plantas solamente si el medio ambiente las predispone fimbrias o pili (Vidaver & Lambrecht, 2004; Agrios,
2005).
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Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
Mollicutes. Nombre proveniente del latín mollis Virus. Proviene del latín ‘virus’, que significa veneno.
(suave) y cutis (piel), son bacterias que carecen Los virus son agentes infecciosos compuestos de
de pared celular pero están provistas de una una o varias moléculas de ácido nucleico (ADN o
membrana celular trilaminar. Incluyen los llamados ARN de cadena sencilla o doble) cubiertas por una
anteriormente fitoplasmas y espiroplasmas, que son o varias capas de proteína o lipoproteína capaces de
organismos celulares más pequeños con un tamaño replicarse en las células de un hospedante susceptible
de 0,3-1,2 µm de diámetro y se autorreplican (Fletcher (Hull, 2009). Su tamaño oscila entre 20 y 70 nm de
& Wayadande, 2002). diámetro para los virus isométricos y 150 a 2.200
nm de longitud para virus con forma de varilla. La
Nematodos. Provienen de los vocablos griegos traducción del genoma (para producir proteínas) o
nema (hilo) y eidés u oidos (con aspecto de), son transcripción y replicación (para producir más ácido
definidos como animales filiformes con cuerpo sin nucleico) ocurre dentro de las células del hospedante
segmentos y más o menos transparentes, cubierto usando su “maquinaria” metabólica (Adams &
de una cutícula hialina, la cual está marcada por Antoniw, 2010).
estrías o anillos; son redondeados, poseen boca y
carecen de apéndices; aunque las hembras adultas Viroides. Proviene de la unión de la palabra latina
de algunos géneros son abultadas, como Meloidogyne “virus” que significa veneno y del sufijo “oid” que
Goeldi y Heterodera Schmidt (Siddiqi, 2000; Perry & significa imperfecto o incompleto. A diferencia
Moens, 2006). La mayoría son microscópicos, con de los virus, los viroides son moléculas de ácido
una longitud entre 300 y 1.000 mm, y entre 15 y 35 ribonucleico (ARN) de cadena sencilla que ocasionan
mm de diámetro (Agrios, 2005; Luc et al., 2005; Perry enfermedades en varias especies de plantas. Sus
& Moens, 2006). genomas son de 239 a 401 nucleótidos de ARN
circular de cadena sencilla; además, no codifican
Los nematodos parásitos de plantas tienen un estilete proteínas (Hammond & Owens, 2006).
hueco, también llamado lanza, pero hay algunos con
estilete sólido modificado. El estilete es usado para
perforar o penetrar las células de la planta, y a través PROCEDIMIENTOS PARA EL
de él se extraen los nutrientes desde la célula (Luc et DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
al., 2005; Perry & Moens, 2006). DE PLANTAS
microscopio estereoscópico.
forma de huso con extremos aguzados, entre 12 y 18 C 1 Signos de hongos: Realice
µm de longitud y 1 a 2,5 µm de ancho y con un flagelo preparaciones microscópicas de las
de 12 a 18 µm de largo; su núcleo está situado a un tercio estructuras con tinción cuando sea
del extremo anterior; se multiplican en el floema, y son apropiado………………………I
transmitidos por hemípteros fitófagos (Agrios, 2005).
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Constituyen una metodología rápida para identificar adoptado para hongos y bacterias (Strange, 2003).
patógenos de plantas. El ensayo de inmuno-absorción
ligado a una enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) La principal herramienta de diagnóstico molecular
es el más ampliamente usado por su especificidad, de microorganismos fitopatógenos es la Reacción
simplicidad y bajo costo. Esta técnica que se realiza en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en
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inglés) basada en los genes ribosomales. La PCR ya que estos durante su proceso de replicación
es rápida, económica y permite producir un gran forman una cadena doble intermedia con un ARN
número de copias de moléculas de ADN vía catálisis complementario que sirve de molde para la síntesis
enzimática, para mostrar diferencias en secuencias de ARN mensajero (Fisher, 2008).
de genes del ARN ribosomal (rARN) o ADN
mitocondrial (mADN) (Luc et al., 2005; Atkins & Mapas de restricción: Esta técnica se basa en que
Clark, 2004). Para el caso de agentes fitopatógenos de una molécula de ADN se pueden obtener siempre
como los virus de ARN, es necesario sintetizar los mismos fragmentos cada vez que sea expuesta
una cadena de ADN complementario (cADN) por a una enzima de restricción particular. Una de las
medio de la enzima transcriptasa reversa (RT) como técnicas más utilizadas es el análisis de polimorfismos
paso previo. Esta técnica tiene muchas variaciones de longitud de fragmentos de restricción (RFLP,
como la PCR “anidada” que consiste en dos PCR por sus siglas en inglés), en la cual se determinan las
sucesivas cuyos amplicones de una reacción son variaciones en la constitución genética de la población
usados como molde de la siguiente. Otra variación (polimorfismo genético), demostrando diferencias
incluye la captura de partículas virales mediante entre los individuos en cuanto al número y longitud
anticuerpos llamada Inmunocaptura PCR (IC-PCR) de los fragmentos producidos (Granner, 1992).
cuando las concentraciones de partículas virales son
muy bajas (Harper et al., 1999; Webster et al., 2004).
La detección conjunta de diferentes virus a partir de 5. Técnicas de microscopía de luz
la combinación de cebadores específicos para cada
uno de ellos es una variación de esta técnica llamada La microscopía de luz permite la observación
RT-PCR múltiple (Ito et al., 2002). de inclusiones virales, es decir, la acumulación
de partículas virales, proteínas, material celular
Hibridación molecular mediante sondas: Se modificado o mezcla de estos. Las inclusiones
basa en la capacidad que tienen los ácidos nucleicos deben observarse a magnificaciones de 1.000X con
de desnaturalizarse y volverse a unir con hebras el objetivo 100X. Se hacen cortes de los tejidos
complementarias en condiciones apropiadas en epidérmicos de hojas de muestras frescas y se ponen
membranas de nylon o nitrocelulosa (Conci, 1999). en contacto con soluciones de tintes como, por
Las técnicas de hibridación más utilizadas son ejemplo, calcomina naranja o Azure A. Esto permite
el “Southern blot”, la cual detecta secuencias la clasificación de varios géneros de virus (Christie &
específicas de ADN, el cual se aísla del tejido mediante Edwardson, 1977; Conci, 1999).
extracción y separación por electroforesis, se purifica
y se digiere (fragmenta) con enzimas de restricción
específicas. Northern blot” es una variante del 6. Técnicas de microscopía electrónica
método anterior en el que se usa el ARN como objeto
de estudio (Corvalán, 2002). “Dot blot” y “Slot blot” Permite la observación del macerado de tejidos de
son procedimientos similares al “Northern blot” plantas infectadas con virus, con el fin de detectar
con la diferencia de que las muestras son colocadas y medir el tamaño de partículas virales a través del
directamente sobre la membrana de nitrocelulosa Microscopio Electrónico de Transmisión, usando la
(Dijkstra & De Jager, 1998; Hull, 2002). técnica de tinción negativa con acetato de uranilo.
También con la ayuda de antisueros específicos se
ARN de cadena doble (cdARN): Es utilizada para aplica la técnica de inmuno-microscopía electrónica
el diagnóstico de virus fitopatógenos, asociados con la (ISEM, por sus siglas en inglés) para atraer partículas
infección de virus de ARN monocatenario (csARN), virales a las rejillas de observación en caso de
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Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
existir relación antigénica (Morales et al., 2006). El o base del tallo. Por consiguiente, la muestra debe
microscopio electrónico permite magnificar entre corresponder al sitio real de ataque de la enfermedad
200.000 y 600.000 veces el tamaño de las partículas. (Figura 2F).
(deshidratación). Estas muestras pueden empacarse de diferente topografía (plana, ondulada, pendiente),
en sobres de manila, papel grueso parafinado o cajas áreas de diferente cultivo (maíz, frijol, café) y áreas
de cartón (Figura 2M). de diferente textura (arenosos, arcillosos, limosos)
(Figura 2R). La muestra debe estar conformada por
Hojas, yemas y flores afectadas se envían secas o 40 submuestras/ha, tomadas a la profundidad de las
sin humedad exterior, extendidas en medio de papel raíces alimenticias (entre 5 y 30 cm) con un palín.
toalla, servilletas, papel periódico o bolsas de papel Para cubrir todo el terreno, la distancia entre sitios
absorbente. Después, se pueden envolver en papel donde se tomen las submuestras debe ser similares,
aluminio o protegerlas dentro de bolsas plásticas, por ejemplo, cada 7 m (Dees et al., 1986) (Figura 2S).
procurando que no se dañen en el transporte (Figura
2N). En cultivos anuales o perennes la muestra se recolecta
del plato de 20 plantas que estén bien distribuidas
Si se trata de frutos, tubérculos y bulbos enfermos, en una hectárea. En cada planta, se recolecta una
se seleccionan como muestra aquellos que presenten submuestra por punto cardinal (Oriente, Occidente,
síntomas iniciales e intermedios de la enfermedad. Norte y Sur) a una distancia que varía según el área de
Cuando se requiera, dejarlos secar al ambiente raíces en el plato del árbol (ejemplo: 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0
para eliminarles el exceso de humedad y evitar m para frutales como guayabo y cítricos; 10, 20, 30 y
su daño. Posteriormente, se envuelven en papel 50 cm, para plátano y pitahaya) y a una profundidad
toalla, servilletas, papel periódico o bolsas de papel entre 5 y 30 cm, se toman 200 g de raíces y suelo de
absorbente; y cuando sea posible, envolverlos en cada planta, y se depositan en un balde. Después de
papel aluminio para luego empacarlos dentro de una recolectar las 20 submuestras, se mezclan bien para
caja de cartón o bolsa de plástico (Figura 2O). conformar una muestra compuesta de 2 kg de suelo
y raíces que se depositan en una bolsa de plástico
Tejidos que se sospechen están afectadas por virus (Figura 2T).
y mollicutes no deben estar muertos o demasiado
afectados; las hojas deben presentar síntomas como
amarillamientos, mosaicos, clorosis o necrosis foliar, CONSIDERACIONES PARA TENER
deformaciones y manchas anulares; las flores con EN CUENTA DESPUÉS DE LA
variegación y deformaciones, y los frutos con necrosis RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
y deformaciones (Figura 2P). El tejido vegetal se
envuelve en papel toalla, servilletas, papel periódico o 1. Evite que los tejidos se deterioren por el
bolsas de papel absorbente. Para evitar que se dañen calor, metiendo la muestra en una caja de
deben colocarse dentro de dos láminas de cartón, icopor con hielo, nevera o en un lugar fresco,
después empacarlas en papel aluminio y, luego, ya que el diagnóstico se dificulta cuando las
en bolsa de papel. Nunca en bolsa plástica. Las muestras llegan al laboratorio marchitas,
muestras de diferentes plantas deben empacarse por maltratadas o podridas.
separado, no deben mezclarse. Así mismo, no deben 2. La muestra debe ser entregada tan rápido
refrigerarse ni congelarse, y preferiblemente se deben como sea posible al Laboratorio de
enviar al laboratorio inmediatamente (Figura 2Q). Diagnóstico (máximo en dos días). En caso
extremo, debe colocarse en un refrigerador
De un lote donde se va establecer un cultivo y o en un cuarto frío, entre 4 y 8ºC, para evitar
se quiere recolectar una muestra para análisis de su deterioro y enviarla al día siguiente.
nematodos, las arvenses (malezas) y residuos deben 3. Las muestras de suelo o raíces para análisis
ser retiradas del sitio. Recolecte las muestras según las de nematodos fitoparásitos deben conservar
condiciones de suelo, muestreando por separado áreas humedad para evitar su muerte.
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Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
Figura 2. A. Muestra vegetal. B. Muestra óptima. C. Componentes de una buena muestra. D. Cantidad
óptima de una buena muestra. E. Muestras de plantas de porte bajo, arbustos o árboles. F.
Muestras indicando el sitio real de infección. G. Muestras con presencia de lesiones agallas o
cáncros. H. Muestras con signos del agente causante. I. Muestras con exceso de humedad. J.
Síntomas de enfermedades en plantas completas. K. Muestras de raíces de plántulas y plantas
de porte bajo o anuales. L. Muestras de raíces de arbustos, plantas anuales, bianuales y perennes.
M. Muestras de tallos y ramas. N. Muestas de yemas y flores. O. Muestras de frutos, tubérculos
y bulbos. P. Muestas afectadas por virus y fitoplasmas. Q. Empaque de muestras afectada por
virus y Mollicutes. R. Recolección de muestras para nematodos. S. Recolección de submuestras.
T. Recolección de muestras en cultivos anuales y perennes. (Fotos: Autores).
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agron. 17 (2): 7 - 24, 2009
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