Aplicaciones de la biotecnología en

el país

Tema : Eritropoyetina (EPO)

Integrantes :
 Agliotta, Anabella
 Bardaro, Elizabeth
 Carignano, Eugenia
 Contreras, Débora
 Crespo, Martín
 Gamietea, Gisela
 Sortino, Darío

Comisión : Lunes (noche)

Materia : Biotecnología Farmaceútica
Docente : Dra. María Camila Martínez Ceron
Año : 2015

1
Biotecnología Farmacéutica 2015
 ÍNDICE

Resumen .......................................................................... 3
Introducción ................................................................... . 3
Aplicaciones….….......................................................... . 5
Materiales y Métodos…………………………………... 9
Proceso de Elaboración de Eritropoyetina ….................. 12
Proceso de Purificación de Eritropoyetina ….................. 13
Valoración Biológica de Eritropoyetina …...................... 15
Bibliografía y fuentes consultadas …............................... 18

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Biotecnología Farmacéutica 2015
 Eritropoyetina (EPO)
 Resumen ¹
La eritropoyetina humana recombinante se ha empleado por más de dos décadas en la
práctica clínica con resultados alentadores en el tratamiento de la anemia asociada a la
insuficiencia renal crónica y en los pacientes con cáncer. Recientes evidencias han
puesto al descubierto nuevas funciones no hematopoyéticas de esta proteína y han
abierto nuevas esperanzas en la terapéutica de las enfermedades con componente
isquémico.
En el presente trabajo se desarrolló un proceso de purificación de la hormona producida
en células de ovario de hámster chino (células CHO).

 Introducción ²
La hormona eritropoyetina (Epo) es el principal factor regulador de la producción de los
glóbulos rojos. Esta hormona, químicamente una glicoproteína, es elaborada
primariamente por el riñón aunque una pequeña fracción tiene un origen extra renal
(principalmente hepático) en el adulto. La Epo fue el primer factor de crecimiento
hematopoyético reconocido como tal. Su producción se relaciona estrechamente con la
demanda y oferta de O2 por los tejidos, de tal manera que la hipoxia activa un sensor de
O2 en los sitios celulares de elaboración de la Epo, promoviendo su biosíntesis y
secreción, mientras que la hiperoxia inhibe estos procesos. Constituye un típico
mecanismo de retroalimentación. La Epo interactúa sobre las células progenitoras
eritroides de la médula ósea, a través de la unión con receptores específicos de
membrana estimulando la proliferación y diferenciación celular. Actúa principalmente
sobre los progenitores celulares terminales, de mayor maduración, de la cascada celular
eritropoyética. Al contrario de otros factores de crecimiento, la Epo es altamente
específica actuando casi exclusivamente sobre las células eritroides medulares. El
conocimiento de la farmacología de esta hormona se ha incrementado progresivamente
en la última década, sobre todo a raíz de sus actuales usos terapéuticos y su
potencialidad en tal sentido. Además, la posibilidad actual de contar con cantidades
abundantes y suficientes de Epo humana, gracias a la aplicación de la tecnología del
ADN recombinante, ha permitido su franca incorporación como un agente terapéutico
más, útil para el tratamiento de la anemia de la insuficiencia renal crónica (IRC), su
principal indicación en el presente, o para el tratamiento de varias otras anemias hipo
proliferativas y otros padecimientos hematológicos del ser humano que afectan
básicamente la producción de los glóbulos rojos.

¹ Scielo: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1727-897X2010000300006&script=sci_abstract
² http://med.unne.edu.ar/ (Universidad Nacional del Nordeste, Pcia de Corrientes, Argentina)

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Biotecnología Farmacéutica 2015
Fig. 1. Participación de la EPO en la eritropoyesis.
Adaptado de Besarab y col. (2009).

Fig. 2. Estructura primaria de la hEPO.

Representacion grafica de la estructura primaria de la hEPO. En la
misma se pueden observar los puentes disulfuro y la ubicacion de la cadena de los carbohidratos.
Adaptada de Jamiri (2006).

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Biotecnología Farmacéutica 2015
Fig. 3. Representacion grafica de la estructura molecular de la EPO
humana.
Obtenida de http://glycam.ccrc.uga.edu/ccrc/

 Aplicaciones ³
Usos terapéuticos de la Eritropoyetina.
Implicancias clínicas de la determinación de los niveles plasmáticos de Epo.
La determinación de los niveles plasmáticos de Epo puede ser de gran utilidad en el
diagnóstico de enfermedades hematológicas que cursan con alteraciones de la
producción de la hormona y para establecer la terapéutica adecuada.
En la policitemia vera o primaria, los niveles de Epo plasmática están reducidos o son
indetectables. Por el contrario, en casos de policitemias secundarias el incremento de la
masa globular se asocia a incrementos de los niveles de Epo.
Los niveles séricos de Epo se encuentran elevados en las siguientes enfermedades:
anemia aplásica (pueden detectarse niveles de 800 a 15.000 mU/ml de Epo), anemia por
deficiencia de hierro, algunas anemias megaloblásticas, talasemia, y algunos síndromes
mielodisplásicos.
En cambio los niveles plasmáticos de Epo se encuentran disminuidos, absoluta o
relativamente, en los siguientes padecimientos: anemia de la IRC, anemia del cáncer,
anemias de graves infecciones crónicas, del SIDA, de la artritis reumatoidea, anemia de
la malnutrición, de la prematuridad y anemia del hipotiroidismo.
Indicaciones terapéuticas actuales de la Eritropoyetina.
1. Anemia de la Insuficiencia Renal Crónica (IRC).

La anemia de la IRC fue el primer padecimiento eficazmente tratado con Epo. La

anemia acompaña a la insuficiencia renal cuando la función de los riñones cae por

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Biotecnología Farmacéutica 2015
debajo del 30 %. El 90 % de los pacientes en plan de diálisis desarrolla anemia,
usualmente severa, con hematocritos por debajo del 25 %, y antes de contarse con rEpo
un importante porcentaje debía recibir frecuentes transfusiones, con los graves
inconvenientes emergentes como el desarrollo de anticuerpos citotóxicos, sobrecarga de
férrica, disfunciones orgánicas, posibilidad de contagios de enfermedades infecciosas o
virales (hepatitis, Sida ), alto costo. Es importante fijar pautas acerca de las condiciones
que debe tener un paciente con IRC para aceptar la prescripción de Epo
Condiciones que deben reunir los pacientes anémicos con IRC, para ser tratados
con rhEPO.
1. Hematocrito menor del 30 % y Hemoglobina menor de 10 g/dl.
2. Comenzar el tratamiento 4 meses después de iniciar regularmente las diálisis. La
aplicación de diálisis puede por sí corregir inicialmente la anemia.
3. Previamente debe excluirse otras causas de anemia, principalmente la ferropénica.
4. No administrar Epo a pacientes con ferritina sérica menor de 100 ug/L (algunos
prefieren 200ug/L).
5. No administrar Epo a pacientes con saturación de transferrina plasmática menor del
20 %.
6. No padecer de hipertensión arterial no controlada.
7. No recibir tratamiento inmunosupresor o antineoplásico.
8. No recibir tratamiento con drogas quelantes de los metales pesados (pueden disminuir
el hierro circulante).
9. No padecer de intoxicación alumínica, frecuente en pacientes dializados ya que la
anemia puede ser por aluminio.
10. No padecer insuficiencia hepática.
11. No padecer infecciones graves.
Evaluación de Pre tratamiento con Hierro
La causa más común de resistencia a la Epo es la deficiencia de Fe. En caso de una
relativa deficiencia de Fe (ferritina menor a 200 ug/L, o una saturación de transferrina
menor al 15 %) se puede suplementar la dieta con sulfato ferroso, 300 mg ,1 a 3 veces
por día vía oral. Si hay intolerancia se puede administrar Fe parenteral, Fe dextran, 100
mg, i.v., 3 veces por semana post diálisis. La administración del Fe debe continuar hasta
superar los valores mencionados de ferritina y saturación de transferrina.
Dosis de rhEPO: La Epo se administra por vía i.v. o por vía s.c.. Por vía i.v. Es usual
una dosis de inducción que puede es de 100/150 U/kg, 3 veces por semana, postdialisis.
No es conveniente producir una mejoría muy rápida de los valores hematológicos, por
ejemplo no pasar de un incremento de 1 g/dl de hemoglobina, o 4 puntos del
hematocrito, cada 15 días. El desarrollo de efectos adversos limita la rapidez de la
mejoría. Actualmente se tiende a preferir dosis menores, de 50 U/kg con una frecuencia
de 3 veces por semana. O 35 U/kg, vía s.c., también 3 veces por semana. Por esta vía, la
absorción es más lenta y los niveles plasmáticos, aunque menos elevados son más
sostenidos. La dosis de mantenimiento se debe fijar luego de alcanzado un hematocrito
de 30/33 % o un valor de 10/11 g/dl de hemoglobina. Esta dosis es variable de enfermo

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Biotecnología Farmacéutica 2015
a enfermo y debe ser encontrada. La Epo ha sido también administrada, utilizando
similar dosificación, para el tratamiento de la anemia en enfermos renales crónicos en la
etapa previa al ingreso al plan de diálisis. De la misma manera que los enfermos
anémicos en diálisis permanente, el resultado del tratamiento demuestra un aumento de
la energía, del apetito, de la capacidad laboral, bienestar y mejor calidad de vida.
2. Anemia de enfermedades crónicas.
Esta patología se define habitualmente como la anemia que aparece en pacientes con
infecciones crónicas, o portadores de enfermedades inflamatorias de larga duración o en
pacientes oncológicos. En esta anemia, la médula ósea es normal (no ha sido invadida
por el tumor, no hay hemorragias ni hemólisis), generalmente evoluciona con
hipoferremia y depósitos de Fe normales (ferritina sérica normal). Es de moderada
intensidad, normocrómica y normocítica y los reticulocitos circulantes no se
incrementan en proporción al grado de la anemia. Se la define como de tipo
hipoproliferativa y se la puede observar en pacientes neoplásicos crónicos, con artritis
reumatoide o infecciones graves como tuberculosis, pielonefritis crónica y otras. La
fisiopatología de esta anemia se relaciona con la presencia de varias citoquinas
inhibidoras de la eritropoyesis “in vitro” e “in vivo”.
En tal sentido, se han demostrado niveles elevados del Factor de Necrosis Tumoral alfa,
aTNF, de la Interleukina 1, IL1, y del Interferon gamma, gINF, en pacientes con cáncer,
artritis reumatoidea, infecciones parasitarias y bacterianas, en pacientes con SIDA o con
complejos relacionados con SIDA. La administración experimental de estas citoquinas a
animales produce anemia. Además inhiben el desarrollo de colonias eritroides BFU-E y
CFU-E en cultivos de medula ósea. Otras citoquinas involucradas en la respuesta
inflamatoria e inmune y que también inhiben la eritropoyesis son el bINF, el TGFb
(Transforming Growth Factor beta) . La anemia de enfermedades crónicas es
eficazmente tratada con rhEPO, en dosis similares a las mencionadas anteriormente
3. Anemia de Recién Nacidos Prematuros.
Esta anemia observada con cierta frecuencia en prematuros, se debe a una deficiente
producción de Epo, posiblemente por una demora en el cambio de producción de Epo,
de hepática en el feto, a renal en el recién nacido. La administración de rhEPO, en dosis
de 250U/kg, s.c., 3 veces por semana, corrige la anemia y permite la aparición de los
mecanismos normales de producción renal de Epo.
4. Anemia de Enfermedades Hematológicas Crónicas.
En numerosas enfermedades hematológicas crónicas se observa el desarrollo de una
anemia refractaria a tratamientos convencionales. Ello ocurre por ejemplo en patologías
linfoproliferativas, linfomas malignos, mielofibrosis idiopática, leucemia mieloide,
mieloma múltiple y en síndromes mielodisplásicos. En el último caso es habitual la
presencia de otras varias cito peñas, aparte de la anemia.
La administración de rhEPO en las dosis mencionadas previamente corrige en un alto
porcentaje la anemia refractaria de estas enfermedades crónicas, mejorando la calidad
de vida de los pacientes. El tratamiento es generalmente bien tolerado. En los síndromes
mielodisplásicos en tratamiento combinado de Epo recombinante con Factor
Estimulante de Colonias de Granulocitos (CSF-G) produce una mejoría de la anemia y
de la neutropenia (104, 105).

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Biotecnología Farmacéutica 2015
5. Anemia de la Quimioterapia Antineoplásica y del SIDA.
La quimioterapia antineoplásica de distintos protocolos y la administración de
Azidothimidina para los pacientes con SIDA, habitualmente se limita por la aplasia o
hipoplasia medular o anemia aplásica que producen los tratamientos. La administración
concomitante de rhEPO, mejora o disminuye la reacción adversa, permite un
mantenimiento de dosis mayores y determina una mejor calidad de vida de los pacientes
(101, 106).
6. Usos de Epo para la Donación de Sangre Autóloga y para producir un
aumento de la Masa Globular Roja.
Las transfusiones de sangre, aunque bien toleradas por la mayoría de las personas, se
asocian sin embargo con algunos riesgos inevitables como el contagio del SIDA, o la
transmisión del virus de hepatitis, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y otras virosis.
Estos riesgos han determinado que la donación de sangre autóloga para cirugías
programadas sea cada vez más frecuente. Una persona normal puede donar 3 ó 4
unidades de sangre, que se conserva para su uso posterior, en un periodo de
aproximadamente 4 semanas, y su hematocrito desciende a 33 %, aproximadamente. La
administración de 600 U/kg de rEpoH, i.v. ó s.c., 2 veces por semana durante ese
periodo, permite habitualmente la donación de las unidades sin provocar el descenso del
hematocrito al tiempo de la cirugía.
La Epo está siendo también utilizada como una alternativa a la transfusión de sangre
autóloga, en periodos perioperativos. La Epo administrada en dosis de 600 U/kg los días
1 y 10 produce en personas normales, un marcado incremento del hematocrito, que llega
al nivel máximo a las 3 semanas. En un estudio controlado, 24 pacientes tratados de esa
manera incrementaron el hematocrito en 6.2 puntos a las 3 semanas, lo que corresponde
aproximadamente a 2 unidades de sangre. Este incremento permite la realización de una
cirugía sin transfusiones. Es importante la determinación de la ferritina sérica y la
saturación de la transferrina que deben estar en niveles normales. Aún en el caso que se
administre concomitantemente Fe por vía oral o i.v., los valores de la ferritina y
transferrina disminuyen significativamente durante el periodo de administración de Epo,
retornando a los niveles normales 2 semanas después de terminar el tratamiento con
Epo. La administración de rEpoH permite también una más frecuente donación de
sangre de personas donantes, portadores de grupos sanguíneos raros, lo que puede ser
considerado en bancos de sangre como una alternativa interesante.
La Epo ha sido usada para el tratamiento de hipotensión ortostática grave por neuropatía
autonómica que cursa con un descenso de la masa globular y anemia. La administración
de 50 U/kg, s.c., 3 veces por semana, durante 6 a 10 semanas, incrementa la masa
globular y elimina la hipotensión ortostática.
Una utilización irracional de Epo se ha observado en atletas que deben realizar grandes
esfuerzos físicos, ciclistas, maratonistas, corredores de cross-country y otros, quienes
podrían beneficiarse con un moderado incremento del hematocrito y de la masa
globular. En estos casos es posible que el incremento de la masa globular, unida a la
deshidratación propia del esfuerzo físico, produzca un aumento de la viscosidad
sanguínea que es perjudicial para el funcionamiento muscular y lo que es más grave,
capaz de producir trombosis.

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Biotecnología Farmacéutica 2015
 Efectos adversos de la Eritropoyetina
Los pacientes anémicos tratados con rhEPO, al mismo tiempo que incrementan la masa
globular, experimentan una mejoría general, una sensación de bienestar antes no
observada, disminuye la fatiga y la astenia, aumenta el apetito y la capacidad laboral.
Algunos pacientes mejoran su función sexual a medida que aumenta el hematocrito. No
se ha detectado la formación de anticuerpos a la Epo y la necesidad de recibir
transfusiones desaparece. Es decir que los efectos son en general, muy favorables para
una mejor calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, la Epo también puede
desencadenar efectos adversos, algunos graves. Algunos pacientes padecen dolores
óseos, mialgias, fiebre, dolores abdominales y síntomas de tipo gripal como congestión
de las conjuntivas y de la mucosa respiratoria. También diarrea, vómitos, nauseas,
cefaleas y mareos. Algunos pacientes experimentan una. En general, estos efectos
tienden a desaparecer con el tiempo. Los efectos adversos más importantes son de tipo
vascular. Frecuentemente se desarrolla hipertensión arterial, sobre todo diastólica, y si el
paciente ya padecía de hipertensión, que no es infrecuente, la misma tiende a agravarse
debiéndose incrementarse el tratamiento instituido. El incremento de la tensión arterial
parece relacionarse con el aumento de la viscosidad sanguínea por la mayor masa
globular y puede afectar al 25/30 % de los pacientes tratados con Epo. La Epo, aparte de
sus efectos sobre los progenitores eritroides, también estimula el compartimiento
megakariocítico y eleva el número de plaquetas circulantes. Este efecto parece ser
responsable de algunos fenómenos de trombosis observada en pacientes tratados con
Epo. Durante la hemodiálisis puede ser necesario establecer una terapia anticoagulante
con heparina, para evitar la formación de coágulos en el acceso vascular. Otros
accidentes trombóticos también han ocurrido, como trombosis coronaria, cerebral, en
vasos periféricos y episodios agudos transitorios de isquemia.

³ http://med.unne.edu.ar/ (Universidad Nacional del Nordeste, Pcia de Corrientes, Argentina)

 Materiales y métodos ⁴
1 REACTIVOS Y SOLUCIONES

Excepto en los casos donde se aclara expresamente, todas las soluciones acuosas fueron
preparadas con agua ultra pura obtenida por ósmosis inversa (resistividad 18,2 MΩ.cm)
y filtración (0,22 µm), empleando un equipo Milli QUF (Millipore, Francia). Todos los
reactivos fueron de grado de pureza analítico.

2 CULTIVO CELULAR

 Epoetina alfa y beta: línea celular de ovario de hámster chino (Células CHO) a las
que se transfiere el gen humano de la EPO:

3 MEDIO DE CULTIVO
Para la preparación del medio de cultivo y de todos sus suplementos se empleó agua
ultra pura obtenida por ósmosis inversa (conductividad 18,2 MΩ).

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Biotecnología Farmacéutica 2015
La esterilización del medio de cultivo se realizó por filtración empleando filtros estériles
con un tamaño de poro de 0,22 µm (Millipore). Para controlar la esterilidad, los medios
filtrados se incubaron durante 48 h a 37 ºC.
El suero fetal bovino (SFB) (PAA, GE Heathcare) empleado para la suplementación del
medio de cultivo fue previamente descomplementado por incubación en baño de agua
termostatizado a 56 ºC durante 30 min.

4 SISTEMA DE CULTIVO
Mantenimiento celular y ensayos biológicos
La línea celular se cultivo en estufa gaseada a 37 ºC, en atmósfera de CO2 al 5%
saturada de humedad (Nuaire, EE.UU)
Se emplearon los siguientes sistemas de cultivo:
• Placas multipozos de poliestireno [Greiner Bio-one (GBO), Alemania] de 96, 24, 12 y
6 pozos con una superficie de 0,4; 2,0; 5,0 y 9,6 cm2 por pozo, respectivamente.
• Frascos T (GBO) de 25, 75 y 175 cm2 de superficie.
Se mantuvo una relación constante de 0,4 ml de medio por cada cm2 de superficie, de
acuerdo a lo establecido por Freshney (Freshney, 2000a).

5 BIORREACTOR
El clon rhEPO se cultivó en un biorreactor de 25 l (MBR Bio Reactor AG, Suiza) cuyo
volumen máximo de trabajo fue de 23,5 l, operando en modo de perfusión. Este proceso
consiste en agregar medio de cultivo fresco en forma continua, a medida que se retira la
misma cantidad de sobrenadante de cultivo libre de células del interior del reactor. De
esta forma, las células permanecen en el interior del biorreactor, siendo alimentadas con
nutrientes y removiéndose los productos del catabolismo en forma continua,
permitiendo alcanzar altas densidades celulares con una productividad incrementada del
producto de interés durante períodos prolongados de tiempo.

 Esquema del biorreactor empleado

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Biotecnología Farmacéutica 2015
 6 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CÉLULAS VIABLES
El recuento celular se realizó en cámara de Neubauer, estimando la proporción de
células muertas por el método de exclusión con azul de tripán (Cook y Mitchell, 1989).
Esta técnica se basa en el hecho de que las células viables no captan ciertos colorantes,
mientras que las células muertas presentan una alteración de la membrana plasmática
que permite el ingreso del colorante hacia su interior. Con este fin, la suspensión celular
se incubó durante 1 min con una solución de azul de tripán (Sigma) 0,4% (V/V) en PBS
y posteriormente se sembró en la cámara de recuento, empleado diluciones convenientes
de acuerdo con la densidad celular de la muestra. Se contaron las células vivas
(refringentes) y las muertas (azules), contenidas en cada uno de los cuadrantes de los
extremos.
La concentración de células (X), ya sean vivas o muertas, se determinó de acuerdo con
la siguiente ecuación (1):
X(cél.ml-1)=Nº de células contadas × 104 × 1/4× (dilución)-1 (1)
La viabilidad del cultivo se determinó calculando el porcentaje de células viables con
respecto a las totales (ecuación 2), teniendo en cuenta que la concentración de células
totales (XT) es la suma de la concentración de células muertas (XM) y vivas (XV).
Viabilidad (%)= XV/XT×100 (2)

⁴ Universidad Nacional del Litoral – Facultad de Ciencias Veterinarias.

http://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8080/tesis/bitstream/handle/11185/465/tesis.pdf? sequence=1

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Biotecnología Farmacéutica 2015
Proceso de Elaboración de Eritropoyetina (materia prima) ⁵¯⁶

 Recombinación.
La obtención recombinante de eritropoyetina se realiza por lo general en células CHO,
añadiendo suero fetal bovino y eventualmente insulina bovina al medio de cultivo. Por
ello los preparados de EPO obtenidos de este modo contienen, incluso después de la
purificación, al menos trazas de sustancias que proceden de estos aditivos. Estas trazas
pueden ser por ejemplo: virus bovinos y agentes similares, cantidades residuales de
proteínas bovinas y/o DNA bovino.

 Fermentación:
La ejecución de una fermentación sin suero en el medio de cultivo de células CHO
recombinantes que contienen un gen EPO, asegurará que el producto esté libre de trazas
de antibióticos o agentes inductores. Un cambio de temperatura induce la expresión y
producción del polipéptido.

 Purificación:
Para la purificación de la EPO obtenida en cultivo sin suero se podría realizar una
cromatografía de intercambio iónico a través de S-Sepharose, una cromatografía
preparativa HPLC en fase inversa con una columna C8 y una cromatografía de filtración
a través de gel

12
Biotecnología Farmacéutica 2015
La EPO purificada se este modo tiene una pureza en torno al 99%, pero sigue
conteniendo cantidades considerables de proteínas y de ADN de las células
hospedadoras.

El método propuesto entonces sería el siguiente:⁸

*En primera instancia se obtiene un sobrenadante de cultivo libre de células por

centrifugación o filtración.

*El segundo paso consiste en acondicionar ese sobrenadante por diafiltración. Se trata
de una modificación de la ultrafiltración en la cual se adiciona agua a la alimentación
con el fin de facilitar el permeado de algunos componentes a través de la membrana
(principalmente lactosa y minerales)

* el tercero, en purificar la EPO rh por cromatografía de afinidad con péptidos

inmovilizados en un soporte adecuado. Estos péptidos son seleccionados por screening
de una biblioteca combinatoria sintética ⁸

Cromatografia de afinidad en la Eritropoyetina

La proyección de un una perla - un péptido- de la biblioteca combinatoria X1- X2- X3-

Phe -X5 -X6 -Ala - Gly permitió la identificación de péptidos con afinidad por
eritropoyetina humana recombinante ( rhEPO ) . La figura muestra el análisis de los
datos de frecuencia para los aminoácidos encontrados en las posiciones X1 , X2, X3 ,
X5 , X6 y de los péptidos . Las matrices cromatográficas con los ligandos de péptidos
sintéticos inmovilizados purificaron rhEPO de manera eficiente.

Los péptidos pequeños que contengan menos de 10 aminoácidos son prometedores

candidatos a ligando, con ellos se construyen sistemas cromatográficos de afinidad para
la purificación de proteínas a escala industrial. La aplicación de estrategias de síntesis
de péptidos combinatoria, facilita en gran medida el descubrimiento de ligandos

13
Biotecnología Farmacéutica 2015
adecuados para cualquier proteína dada de interés. Aquí hemos tratado de identificar
ligandos peptídicos con afinidad por eritropoyetina humana recombinante (rhEPO), que
se utiliza para el tratamiento de la anemia. Una biblioteca combinatoria que contiene los
octapéptidos XXX-Phe-XX-Ala-Gly, donde X = Ala, Asp, Glu, Phe, His, Leu, Asn, Pro,
Ser, o Thr, se sintetizó en resina HMBA-ChemMatrix por un método recombinante.
Para la selección de la biblioteca, rhEPO se acopló a cualquiera de Texas Red o biotina.
Las perlas fluorescentes o los granos que muestran una reacción positiva con
estreptavidina-peroxidasa fueron aislados. Después de la escisión, los péptidos fueron
secuenciados por láser de desorción / ionización por espectrometría de masas asistida
por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS). Cincuenta y siete perlas mostraron
una reacción positiva. Los péptidos que muestran más consensos fueron sintetizados y
su afinidad con rhEPO se evaluó mediante un biosensor de resonancia de plasma. Se
obtuvieron valores de constante de disociación en el intervalo de 1-18 mM. Los dos
mejores péptidos se inmovilizaron sobre Sepharose, y las matrices cromatográficas
resultantes mostraron afinidad por rhEPO con valores constantes de disociación entre
1,8 y 2,7 mM.. Las células de ovario de hámster chino (CHO) en el sobrenadante de
cultivo celular, se añadieron con rhEPO, y la mezcla artificial se cargó en columnas de
péptido-Sepharose. La rhEPO se recuperó en la fracción de elución con un rendimiento
del 90% y una pureza de 95% y 97% para P1-P2-Sepharose y Sepharose,
respectivamente.

 Formulación:
La proteína altamente pura se filtra y mezcla con agentes estabilizadores.
Posteriormente se envasa en viales bajo condiciones de estricta asepsia y se liofiliza
para obtener la más alta pureza , potencia y estabilidad del producto.
Finalmente, cada vial es acondicionado para obtener el producto terminado.

 Control de calidad:
Cada lote de producto terminado se somete a estrictos análisis de control de calidad para
asegurar pureza, esterilidad, potencia y estabilidad.

 Productos:

-EPO alfa (Eprex®, Procrit®, Epopen®, EPO Delta (Dynepo®)

-EPO beta (Neorecormon®, EPO omega (Epomax®, Hemax®)

⁵ http://www.espatentes.com/pdf/2211961_t3.pdf

⁶http://tesiuami.izt.uam.mx/uam/aspuam/presentatesis.php?recno=6346&docs=UAM6346.PDF

⁸ http://www.dicyt.com/ Desarrollan un método eficaz y económico para purificar la eritropoyetina

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Biotecnología Farmacéutica 2015
  VALORACIÓN BIOLÓGICA DE ERITROPOYETINA ¹²
Recursos:
1. Definición: El método se basa en la medición de la estimulación de producción
de reticulocitos en ratones normocitémicos. La actividad biológica de la especialidad
medicinal es comparada con la del estándar BRP y expresada en Unidades
Internacionales (UI).
2. Equipos: 2.1) Microscopio binocular; 2.2) micropipetas automáticas; 2.3)
Propipeta; 2.4) Balanza para pesar los animales; 2.5) Baño Termostatizado; 2.6)
agitador mecánico tipo vórtex; 2.7) agitador magnético con calefacción.
3. Materiales: 3.1) vasos de precipitados de vidrio de diferentes volúmenes; 3.2)
papel para pesar; 3.3) probetas de vidrio de diferentes volúmenes; 3.4) pipetas de vidrio
2-5-10 ml; 3.5) papel de filtro; 3.6) tips para micropipeta; 3.7) tubos de hemólisis; 3.8)
jeringas descartables; 3.9) agujas; 3.10) Cámara de Neubauer; 3.11) jaulas.
4 Reactivos:
4.1 Agua reactivo: agua bidestilada o calidad Milli Q.
4.2 Buffer Muestra:
* Fosfato ácido de sodio ( PO4HNa212H2O) 2,16 g.
* Fosfato diácido de sodio( PO4H2Na2H2O) 0,23 g.
* Cloruro de sodio (NaCl) 1,91 g.
* Agua reactivo c.s.p. 250 ml
Pesar los componentes sólidos, disolver en 150 ml de agua reactivo con agitación
constante. Llevar a un volumen final. Envasar y rotular consignando los siguientes
datos: nombre de la solución, fecha de preparación, operador, fecha de vencimiento (un
mes) y condiciones de almacenamiento (2-8° C).
4.3 Buffer Muestra con albúnina 0,05%.
Pesar c.s de albúmina bovina fracción V y espolvorear sobre c.s de Buffer muestra.
Homogeneizar la solución sin agitar.
Nota: La solución debe ser preparada el día del ensayo.
4.4 Solución Fisiológica
- Cloruro de Sodio 9 g
- Agua reactivo c.s.p. 1000 ml
Pesar 0,9 g de cloruro de sodio y disolver en 800 ml de agua reactivo con agitación
constante. Llevar a un volumen final. Envasar y rotular consignando los siguientes
datos: nombre de la solución, fecha de preparación, operador que la preparó, fecha de
vencimiento (un mes) y condiciones de almacenamiento (2-8° C).

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Biotecnología Farmacéutica 2015
4.5 Solución Colorante: preparar según la siguiente fórmula:
- Azul de Metileno 0,1 g
- Citrato de sodio 3,8% c.s.p. 10 ml
Disolver 0,38 g de citrato de sodio en 10 ml de agua reactivo con agitación constante.
Espolvorear sobre la solución resultante 0,1 g de Azul de metileno. Una vez disuelto
filtrar la solución a través de un filtro de papel.
Nota: La solución de colorante debe ser preparada el día del ensayo.
4.6 Heparina sódica 1667UI/ml.
Tomar 0.67 ml de Heparina sódica 5000UI/ml y llevar a volumen final de 2ml con
Solución Fisiológica.
4.7 Agente Hemolítico LYSES II (libre de azida): Ingredientes Activos
- Sal cuaternaria de amonio 35,00 g/l
- Cianuro de potasio 0,25 g/l
- Vehículo c.s.p. 1000 ml
Preparar una solución al 5% Buffer muestra. Tomar 0.15 ml y llevar a volumen final de
3 ml.
Nota: La solución debe ser preparada el día del ensayo.
4.8 Ácido pícrico al 1%
Pesar 0.1 g de ácido pícrico y disolverlo en 10 ml de agua reactivo.
4.9 Estándar
Utilizar el Estándar Internacional BRP vigente. Reconstituirlo en Buffer Muestra con
albúmina 0,05% siguiendo las indicaciones de uso y diluirlo en el mismo solvente para
obtener la concentración requerida.
4.10 Animales:
Solicitar al Bioterio ratones CF1 hembra entre 5-6 semanas de vida, de 30 – 35 g de
peso, y realizar la recepción de los mismos según ABIO036.
5- Procedimiento
Día 1
5.1 Realizar diluciones independientes en matraz del Estándar BRP con Buffer muestra
con albúmina 0.05% para obtener las dosis seleccionadas. (APB030)
5.2 Reconstituir las especialidades medicinales (Muestra) según el instructivo de uso y
realizar diluciones independientes en matraz con Buffer muestra con albúmina 0.05%
para obtener las dosis seleccionadas, las que serán equipotentes a las del Estándar. Para
preparar estas soluciones se considera que la muestra posee la potencia declarada en el
rótulo. (APB030)

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Biotecnología Farmacéutica 2015
5.3 Distribuir randomizadamente en jaulas como mínimo seis ratones con marcas
identificatorias realizadas con Ácido pícrico al 1% de manera que cada jaula contenga
un animal con cada una de las dosis de Estándar y de Muestra utilizados (APB030).
5.4 Pesar y registrar el peso inicial de los animales en la Planilla del ensayo. (APB030).
5.5 Inocular por vía subcutánea una única dosis 0.5 ml de cada una de las dosis a los
ratones con la marca correspondiente según BIO019 (APB030).
Día 4
5.6 Preparar las series de tubos correspondientes (APB030).
5.7 Obtener muestras de sangre por vía submaxilar según BIO029 y recolectarla en los
tubos de hemólisis de la Serie1 (APB030).
5.8 Realizar la coloración y hemólisis de reticulocitos según APB030.
5.9 Realizar el recuento de reticulocitos en Cámara de Neubauer con microscopio
binocular.
El mismo se realiza de a pares en el retículo de Hematíes (central). Se cuenta el número
de reticulocitos que están comprendidos en los cuatro cuadrantes de los extremos y en el
central. Si se cuentan los reticulocitos en contacto con la línea reforzada superior de
cada cuadrante, no se cuentan los de la inferior y si se cuentan los que están en contacto
con el margen derecho, no se cuentan los del margen izquierdo.
5.10 Registrar los valores de cada uno de los cuadrantes y el total en la planilla
Recuento de reticulocitos (APB030)
5.11 Registrar los recuentos totales en la Planilla del ensayo (APB030).
5.12 Realizar el análisis estadístico de datos Factorial 3+3 ó múltiples rectas paralelas
según PB019.
5.12.1 La potencia y los límites de confianza de cada ensayo son válidos si se cumplen
los criterios de validez especificados según PB019.
5.12.2 Realizar no menos de dos ensayos válidos.
5.12.3 Combinar los ensayos válidos según Farmacopea Europea (Combinación de
ensayos).
5.12.4 Los criterios de aceptabilidad de la potencia son del 80 al 125% de la potencia
declarada.
5.12.5 Los criterios de aceptabilidad de los límites de confianza de la combinación son
del 64 al 156% de la potencia estimada cuando la muestra cumple la potencia.

¹²Farmacopea Europea

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Biotecnología Farmacéutica 2015
Bibliografía y fuentes consultadas
- ¹ Scielo: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1727-
897X2010000300006&script=sci_abstract
- ² http://med.unne.edu.ar/ (Universidad Nacional del Nordeste, Pcia de
Corrientes, Argentina)

- ⁴ Universidad Nacional del Litoral – Facultad de Ciencias Veterinarias.

http://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8080/tesis/bitstream/handle/11185/465/tesi
s.pdf? sequence=1
- http://glycam.ccrc.uga.edu/ccrc/
- Jamiri. (2006). Schematische Darstellung des EPO-Molekuls, Corel Draw
9.0.
Wikipedia.
- Besarab, A., Horl, W.H. y Silverberg, D. (2009). Iron metabolism, iron
deficiency,thrombocytosis, and the cardiorenal anemia syndrome.
Oncologist 14: 22-33.

- http://med.unne.edu.ar/ (Universidad Nacional del Nordeste, Pcia de

Corrientes, Argentina)
- http://www.biosidus.com.ar/biofarmacos_en_el_mercado.php

- https://www.google.com.ar/search?q=adn+recombinante+pasos&espv=2&biw=12
80&bih=923&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0CAYQ_AUoAWoVChMI_f2t2rPl
yAIVghuQCh34GArL#tbm=isch&q=adn+recombinante+epo+en+celulas+cho&imgrc
=xOpsy-Z-crk95M%3A -- -
- ⁵ http://www.espatentes.com/pdf/2211961_t3.pdf

- ⁶http://tesiuami.izt.uam.mx/uam/aspuam/presentatesis.php?recno=6346&docs=
UAM6346.PDF

- ⁸ http://www.dicyt.com/ Desarrollan un método eficaz y económico para

purificar la eritropoyetina

- ¹²Farmacopea Europea
ffinity Chromatography Based on a Combinatorial Strategy for rErythropoietin
Purification.
María C. Martínez-Ceron, Mariela M. Marani, Marta Taulés‡, Marina
Etcheverrigaray, Fernando Albericio∥, Osvaldo Cascone, and Silvia A. Camperi
Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, (1113) Buenos Aires, Argentina

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