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REDUTASE DE PANTAS
INTRODUÇÃO
A maior parte da atmosfera terrestre é constituída por nitrogênio molecular (N2), sendo então
a fonte mais abundante deste elemento, no entanto, pouquíssimos organismos são capazes de
converte-lo em formas químicas úteis para os organismos vivos. Para que isso seja possível existem
mecanismos que conseguem reempregar o nitrogênio biologicamente disponível. Isso se dá pelo ciclo
do nitrogênio (Figura 1). Onde o primeiro passo do ciclo é a fixação do Nitrogênio atmosférico pelas
bactérias fixadoras de nitrogênio, que produzem amônia, que depois é oxidada a nitrito, e
posteriormente a nitratos por bactérias, processo conhecido como nitrificação.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Reagentes
Solução de Nitrito de Potássio (KNO2) 100 µM:.
Reagente de nitrito:
Tampão: fosfato de potássio 0,2 M:
Nitrato de potássio 100 mM
Folhas de gramíneas recém-colhidas
1- Curva Padrão de Nitrito
Inicialmente, pegou-se 6 tubos de ensaios e estes foram enumerados de 1 a 6. Adicionou-se
H2O, nitrito de sódio 100 µM e reagente de nitrito conforme mostra a tabela 1.
Após a adição dos reagentes, agitou-se os tubos e incubou-se por 15 minutos a 30 °C.
Determinou-se as absorbâncias usando fotocolorímetro equipado com filtro verde 54 (540 nm). Fez-
se o branco com o tubo 1 e determinou-se as absorbâncias dos outros tubos.
Após a adição dos reagentes, agitou-se os tubos e incubou por 30 minutos a 30 °C. Em
seguida, tomar 1 mL de solução de cada tubo e reagiu com 4 mL de reagente de nitrito, por 15 minutos
a 30 °C. Determinou-se as absorbâncias como na experiência anterior, usando o tubo 1 para zerar o
fotocolorímetro. Calcular a quantidade de nitrito formado por grama de folha usando o gráfico do 1°
experimento.
Imediatamente após a adição das folhas, agitou-se e incubou-se a 30°C, durante 30 minutos.
Após esse tempo, retirou 1 mL de amostra de cada tubo e dosou nitrito como descrito anteriormente.
Determinar o número de nanomoles de nitrito presente em cada tubo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após aquecer em banho-maria por 15 minutos a 30°C, a presença de nitrito foi observada
pela coloração vermelho-purpura, em seguida, mediu a absorbância das soluções em 540 nm. Traçou-
se o gráfico (Absorbância) vs (concentração de nitrito) (figura x):
0,50
0,45
Equation y = a + b*x
Weight No Weighting
Residual Sum of 0,00132
Squares
Pearson's r 0,992
0,40 Adj. R-Square 0,97876
Value Standard Error
B Intercept -0,009 0,02203
B Slope 0,00904 6,64129E-4
0,35
absorbância
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
10 20 30 40 50
mg/ml
A partir da curva de calibração, traçou-se o ajuste linear: onde e possível aplicada a Lei de
Beer, no qual a absorbância medida é proporcional à concentração da espécie analisada de acordo
com a equação.
A partir dos valores obtidos dispostos na tabela 05, podemos por meio dos valores obtidos
nos tubos tubo 2 que contem NO3- e teve como objetivo determinar o quanto de nitrito está
contaminando o nitrato; Tubo 3 contendo as folhas e servirá para analisar o quanto de nitrito será
obtido a partir do nitrato das folhas. Com isso, fazendo-se as somas das absorbâncias dos tubos 2 e 3,
e possível estabelecer quanto de nitrido foi obtido (0,111). No tubo 4 continha tanto o nitrato como
as folhas, este é o sistema completo é a nitrato redutase foliar catalisará a redução do nitrato a nitrito,
com isso e possível substituir o valor de absorbância da nitrato redutase e subtraímos pela somatória
do tubo 2 e 3
Neste experimento determinamos a quantidade de nitrito que foi transformado em NH4+ por
ação da nitrito redutase foliar.
Tubos Absorbância
1 0
2 0,109
3 0,091
4 0,210
Conclusão
Por meio do experimento e técnicas de fácil aplicação foi possível fazer um estudo sobre a
atividade catalítica da nitiro e nitrato redutase em folhas de grama. Dessa forma, com a coleta e
tratamento dos dados foi quantificado a quantidade de nitrito e nitrato catalisado por ambas as
ensimas, 1,36 mg/mL para o experimento 2 e 0,828mg/ml para o experimento 3. Assim, foi possível
por meio de técnicas simples, fazer a análise e quantificação da atividade de ambas a enzimas.
Bibliografia
1 Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006.
2https://www.feis.unesp.br/Home/Eventos/encivi/viencivi2012/sanches_redutase_nitrato_sering
ueira_37_final.pdf
3-http://www.ledson.ufla.br/assimilacao-e-transporte-de-nitrogenio-2/assimilacao/reducao-do-
nitrato/