Evaluación de la microencapsulación de microorganismos probióticos en matrices de

alginato y alginato-quitosano
Espinosa Moreno Carlos Alberto*, Sarabia Arellano Jose Luis, Tamer Meyer Miguel Ángel,
Montalvo Paquini Claudia, Alvarado Castillo Ma. Gabriela.
Universidad Politécnica de Puebla. Tercer carril del Ejido “Serrano” s/n San Mateo Cuanalá. Juan C. Bonilla, Puebla, Pue. C.P. 72760
*carlos.espinosa@uppuebla.edu.mx

Resumen: En este trabajo se presentan los resultados de la evaluación de la microencapsulación de

probióticos a partir de matrices de alginato y alginato-quitosano. Se aislaron tres cepas a partir de Queso Oaxaca
y Queso crema, las cuales fueron identificadas mediante pruebas morfológicas, fenotípicas y genotípicas como
E. faecium, Streptococcus, y una mezcla entre E. faecium y E. faecalis. También se realizó la extracción de
quitosano a partir de exoesqueletos de camarón mediante el método de desacetilación química y su calidad fue
evaluada por valoración potenciométrica, porcentajes de ceniza y humedad. La microencapsulación de las cepas
aisladas fue realizada en las matrices: alginato 2%, Alginato 2%-Quitosano 0.4% y Alginato2%-Quitosano2%,
y se evaluó la viabilidad y liberación celular a pH: 4.0 y pH: 7.0.
Palabras clave: Microencapsulación, probióticos, alginato, quitosano

Introducción. Los efectos benéficos para la salud
obtenidos por las bacterias probióticas las han llevado a
su uso creciente en productos alimenticios fermentados,
lácteos y otros (1). Sin embargo la viabilidad en estos
productos suele ser baja debido a factores tecnológicos
y de supervivencia en el tracto gastrointestinal humano.
Lo cual conlleva a optar por nuevas estrategias para
asegurar la supervivencia de las bacterias probióticas y
su transporte al tracto gastrointestinal para así, cumplir
con su función benéfica. La microencapsulación es
definida como la protección de compuestos bioactivos
por una barrera física que evite su exposición a
condiciones adversas del entorno por lo que incrementa
su biodisponibilidad, lo cual la hace una técnica
prometedora para el mejoramiento de la supervivencia
de probióticos. Una técnica ampliamente aplicada es la
encapsulación con alginato para bacterias ácido lácticas
(BAL) principalmente para observar su viabilidad en
medios ácidos, puesto que presenta ventajas tales como:
Fácil formación de gel en las matrices de las células
bacterianas, no es toxica para el ser humano ya que es
biocompatible y segura, económica y fácil de preparar,
sin embargo presenta inconvenientes tales como el
deterioro en matrices ácidas, pérdida de estabilidad
mecánica (2). El uso de quitosano, biopolímero que
debido a su grado de desacetilación y a su peso
molecular resulta ser un buen material encapsulante (3).
A escala industrial, el uso de este biopolímero resulta
bastante favorable en términos económicos debido a que
éste compuesto puede ser extraído de desechos
pesqueros, mediante la desacetilación de la quitina
presente en el exoesqueleto de crustáceos (4). Aspecto
importante ya que en México el aprovechamiento de los
residuos pesqueros es incipiente y únicamente orientado
a la producción de harina y aceite de pescado además de
que estos desechos ascienden al 65% de la materia
original por lo cual son factibles de transformarse en
subproductos (5). El objetivo del presente trabajo
consistió en la evaluación de la microencapsulación de
microorganismos probióticos a partir de matrices de
alginato y alginato-quitosano para el mejoramiento de la
supervivencia de bacterias ácido lácticas en alimentos.
Materiales y métodos
Recolección y procesamiento de la muestra: El
aislamiento de bacterias acido lácticas se llevó a cabo a
partir de muestras de Queso Oaxaca (QO) y queso crema
(QC) de la localidad de Chipilo de Francisco Javier
Mina, Puebla, con el uso de agar MRS a 37°C durante
24 h.
Aislamiento de cepas: Las cepas aisladas fueron
seleccionadas por su característica Gram-positiva,
catalasa negativa y por su potencial probiótico,
característica evaluada en un trabajo previo.
Pruebas de identificación morfológica y bioquímica:
Las cepas con potencial probiótico fueron identificadas
a partir de su morfología microscópica y macroscópica,
pruebas de fermentación de azucares (lactosa, glucosa,
sacarosa, ribosa, fructosa, xilosa, manosa), crecimiento
en NaCl (6.6%), producción de CO2, crecimiento a
diferentes temperaturas (10°C y 45°C) y hemolisis en
agar sangre.
Pruebas de identificación molecular: La
caracterización genotípica de las cepas fue desarrollada
como a continuación se describe: Para la extracción del
DNA se utilizó el método de CTAB (Cetyl Trimetyl
Amonium Bromide) (6). La calidad y cantidad del DNA
obtenido de este modo se verificó mediante la
electroforesis de 5µl de cada una de las muestras de
DNA en un gel al 0.8% m/v de agarosa, aplicando una
corriente eléctrica de 80 V, por 45 minutos. Se llevó a
cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
múltiple con iniciadores específicos para las cepas de
Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium,
utilizando en cada tubo de reacción; 1 µl de cada
iniciador (7, 8) a una concentración de 10µM, 10 µl del
Buffer de reacción, 0.4 µl de DNApolimerasa
(Promega), 3.5 µl de MgCl2 1.5 µM y 2 µg de ADN a
un volumen final de 25 µl. La mezcla de la reacción se
procesó en un termociclador marca Biorad, MyCycler
bajo el siguiente programa: 94º C por 10 segundos para
la desnaturalización, 55º C a 30 segundos para la
hibridación, y 72º C por 40 segundos para la extensión,
repitiendo esto durante 30 ciclos. La integridad y el peso
molecular de los fragmentos obtenidos de la
amplificación fueron verificados por su migración
electroforética en un gel de agarosa al 2.3%.
Antibiograma: Para la determinación de la
susceptibilidad antimicrobiana de las cepas
seleccionadas se realizaron antibiogramas para
Enterococcus spp. De acuerdo a la metodología
empleada descrita en el “Manual de procedimientos
para la prueba de sensibilidad antimicrobiana por el
método de disco difusión” (9).
Extracción de quitosano: Para la extracción de
quitosano se llevó a cabo la metodología descrita por
Hernández y col. (4) la cual consiste en la extracción a
partir del método químico de desacetilación a partir de
exoesqueletos de camarón los cuales fueron
recolectados de restaurantes de mariscos en el mercado
municipal de San Pedro Cholula “Cosme del raso”.
Caracterización de quitosano: Se realizaron las
siguientes técnicas descritas por Hérnandez y col. (4):
determinación potenciométrica para obtener el grado de
N-desacetilación, determinación del porcentaje de
ceniza, porcentaje de humedad
Microencapsulación: Para la microencapsulación de
microorganismos probióticos se obtuvo un inoculo de
24 hrs en caldo MRS el cual fue centrifugado a 8000
rpm durante 10 minutos, una vez obtenida la pastilla, se
ajustó a la escala 7 de McFarland en SSI como inóculo
para la encapsulación en matrices de alginato al 2% y
alginato al 2% - quitosano al 0.4% y alginato al 2%-
quitosano al 2%. La microencapsulación en alginato-
quitosano de la bacteria se realizó de acuerdo a lo
descrito por Zhou y col. (10) y Overgaard y col. (11).
Evaluación de viabilidad y liberación celular: Para la
evaluación de viabilidad y liberación celular, se
suspendieron las capsula de alginato en soluciones a pH
4 y 7, las cuales fueron ajustadas utilizando una solución
de HCl 1N, durante 8 h en agitación constante (50rpm)
a 28ºC. Para determinar la viabilidad celular las capsulas
fueron retiradas una vez transcurridas las 8 h y se
sembraron en agar MRS a 37°C durante 24 h al igual
que el sobrenadante. Finalmente para determinar la
liberación celular se midió a una λ=620nm de
absorbancia muestras de sobrenadante obtenidas cada 2
horas durante las 8 horas de agitación (1).
Resultados y discusiones
Identificación morfológica y bioquímica: A partir del
procesamiento de las muestras de queso Oaxaca y queso
crema se lograron aislar dos cepas con potencial
probiótico, las cuales fueron sometidas a pruebas de
identificación molecular, morfológica, fenotípica y
genotípica. De acuerdo a los resultados obtenidos
(Cuadro 1) y lo reportado por Konneman (12) las cepas
“E3-QO-C3” y “E2-QC-C1” concuerdan con la especie
Enterococcus faecalis. Los Enterococos son
microorganimos nativos del tracto gastrointestinal de
humanos y animales, su presencia en alimentos puede
indicar contaminación alimentaria, sin embargo, se ha
reportado su presencia en cultivos iniciadores para la
elaboración de quesos y su uso como probióticos (13) y
su uso como aditivo de ensilaje para la preservación de
forrajes (14). Sin embargo, dichas cepas también han
cobrado relevancia como causales de infecciones
nosocomiales, tendencia exacerbada por el desarrollo de
resistencia antibiótica (15) además de su capacidad de
intercambiar material genético con otras cepas de la
misma especie y género e incluso con cepas de otros
géneros bacterianos (16). En cuanto a la cepa E2-QO-
C1, con los resultados obtenidos y lo reportado por
Konneman, y col. (12) corresponde al género de
Streptococcus, las especies pertenecientes a este género
tienen gran importancia en la industria de los alimentos,
tanto en la elaboración de productos lácteos como lo es
S. thermophilus el cual además de ser calificado como
GRAS (Generalmente Reconocido como Seguro) (17)
es ampliamente usado como agente de maduración en
quesos. En el aspecto clínico algunas especies como S.
pyogenes, S. viridans y del grupo Enterococo son
causantes de distintas enfermedades relacionadas con
los alimentos (18) por lo anterior es importante realizar
antibiogramas para la caracterización de su resistencia a
los antibióticos.
Pruebas de identificación molecular: De acuerdo a los
resultados obtenidos en la identificación molecular
(Cuadro 2) se puede observar que la cepa E3QOC3
pertenece a la especie Enterococcus faecalis mientras
que en el caso de E2QCC1 se obtuvo resultado positivo
para dos especies E. faecium y E. faecalis lo cual indica
un mezcla de ambas. Para la cepa E2QOC1 se realizó la
identificación molecular utilizando primers
correspondientes a Streptococcus thermophilus,
Lactococcus lactis y el género Enteroccocus, sin
embargo, no hubo amplificación positiva por lo que se
de acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas
fenotípicas nos indica que pertenece al género
streptococcus descartando la especie thermophilus
debido a esta última prueba.
Antibiograma: Como se observa en los resultados
obtenidos (Cuadro 3) de los antibiogramas
correspondientes a las cepas E3-QO-C1 y E2-QC-C1
correspondientes a las cepas Enterococcus faecium y
enterococcus faecalis presentan sensibilidad a todos los
antibióticos empleados, sin embargo, presentan menor
resistencia en todos los casos a la vancomicina lo cual
es característico de dicho género debido a su adaptación
de mutaciones especificas en diferentes ambientes (15).
En la Figura 1 se muestran los halos de inhibición de la
cepa E3-QO-C3.
Extracción de quitosano: Se obtuvieron rendimientos
en las extracciones de quitosano de un 20% de quitosano
a partir de polvo de exosqueleto tamizado con un tamiz
para obtener un tamaño de partícula de 250µm.
Caracterización de quitosano: En la Figura 2a se
muestra la curva de titulación del quitosano en donde se
observan los dos puntos de inflexión x y y
respectivamente. Los valores de estos puntos fueron
determinados mediante el método de la primera
derivada y se muestran en la Figura 2b con valores de
x=56ml y y=76ml, con estos datos se determinó un
grado de desacetilación del 64.4%, el cual es un
porcentaje mayor al que presenta el quitosano comercial
de un 60% (4). En cuanto al porcentaje de cenizas se
obtuvo un valor del 17.9% el cual es un valor mayor al
del quitosano comercial de 1.4% (4). De acuerdo con
Hernández y col. (4) este resultado está influenciado por
la alta concentración de disolución del NaOH (50%), lo
cual incrementa la viscosidad y asociado a las
características estructurales del quitosano, se facilita la
retención de impurezas y por ende se generan mayores
productos de ignición. El porcentaje de humedad
obtenido fue de un 24% el cual es un valor mayor al del
quitosano comercial (11.69%-13.67%) (4), lo cual
puede estar relacionado con tiempos insuficientes de
secado ya que debido al alto grado de desacetilación
obtenido la posibilidad de formación de moléculas de
agua disminuye por una menor cantidad de grupos
amino presentes (4).
Evaluación de viabilidad y liberación celular: De
acuerdo al ensayo de liberación celular (Figura 3) se
obtuvieron valores de liberación menores con el
tratamiento alginato 2%-Quitosano 0.4% a un pH: 4.0 y
mayores en el tratamiento de alginato 2% a un pH: 7.0.
El quitosano es una poliamina cargada positivamente
que forma una membrana semipermeable alrededor de
un polímero de carga negativa como lo es el alginato,
esta membrana no puede ser disuelta en presencia de
Ca+2 lo cual brinda estabilidad y forma una barrera que
disminuye la liberación celular (10). Sin embargo se
obtuvieron valores mayores a una mayor concentración
de quitosano lo cual puede justificarse ya que la
metodología empleada no asegura que el espesor del
recubrimiento de quitosano sea el mismo para todas las
perlas de alginato lo cual puede afectar directamente a
la liberación celular. Los valores de liberación celular a
pH: 4.0 del tratamiento de alginato al 2% son bastante
cercanos al tratamiento alginato 2%-quitosano 0.4% lo
cual puede justificarse debido a que de acuerdo con
Zhou y col. (10) la liberación celular se lleva a cabo en
la superficie de las perlas por el crecimiento de
microcolonias, sin embargo, la hidratación del ácido
algínico en soluciones acidas disminuye su solubilidad
conduciendo al aumento de viscosidad del alginato
precipitándolo (19), ésta viscosidad contribuye a la
disminución de liberación celular. En cuanto a la
viabilidad se obtuvo un buen crecimiento en placa para
todos los tratamientos lo cual indica la supervivencia de
las células a los tratamientos y a las condiciones de pH
además de que el crecimiento del cultivo a partir del
sobrenadante asegura la liberación celular durante el
proceso de agitación.
Conclusiones: De acuerdo a los resultados obtenidos se
logró aislar tres cepas: Enterococcus faecium, una
mezcla de Enterococcus faecium y Enterococcus
faecalis, Streptococcus siendo todas sensibles a
vancomicina. Se logró extraer quitosano a partir de
exoesqueletos de camarón un grado de desacetilación
del 64.4%, sin embargo se obtuvieron valores de
porcentaje de ceniza y humedad de un 17.9% y 24%. El
mejor tratamiento es la matriz alginato 2%-Quitosano
0.4% debido a que con este tratamiento se obtuvieron
valores menores de liberación celular.
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Bifidobacterium, Lactobacillus and
Streptococcus thermophilus.
 18. A.P. Barragán, G.R. Serrano, I.F. González, Cuadro 1. Resultados de pruebas fenotípicas realizadas
Prueba Cepa Cepa Enterococcus Cepa Streptococcus

K.S. Matsumoto “Manual de prácticas de E3-QO-C3 E2-QC-C1 faecium

(10)
E2-QO-C1 (10)

Catalasa - - - - -
laboratorio, Microbiología de los alimentos.” Bilis + + + + V
Universidad Autónoma Metropolitana Esculina
Crecimiento + + + - -
a 10 °C
Iztapalapa. (2013) Crecimiento + + + + V
a 45 °C
19. B.P. Lupo, C. Gonzalez, A. Maestro Producción - - - - -
“Microencapsulación con alginato en
de CO2
Crecimiento + + + + V
en NaCl al
alimentos. Técnicas y aplicaciones” Revista 6.5 %
Hemolisis γ γ α,γ γ α,γ,β
Venezolana de Ciencia y Tecnología de en Agar
SBA
Alimentos. Vol. 3 (2012) 130-151. Lactosa + + + + +
Glucosa + + + + +
Sacarosa + + + - V
Ribosa + + + + +
Fructuosa + + + + ND
Xilosa - - - - ND
Control Ampicilina Manitol + + + + +

Cuadro 2. Resultados de identificación molecular de las

Gentamicina Vancomicina diferentes cepas aisladas
Especie Longitud Cepa Cepa Cepa
(pb) E3QOC3 E2QOC1 E2QCC1
Figura 1. Halos de inhibición de la cepa E3-QO-C3 E. faecalis 941 + - +
E. faecium 556 - - +
15 S. 967 - - -
y Thermphilus
10 L. .Lactis 602 - - -
pH

x
Enterococcus 1178
5 spp.
- - -

0
0 50 100 Cuadro 3. Diámetros de inhibición (mm) de las diferentes
a) VNaOH (ml) cepas aisladas
y
0.6 Antibiótico Cantidad Cepa Cepa Cepa
E3-QO-C3 E2-Q0-C1 E2-QC-C1
ΔpH/ΔV

x
0.4 Ampicilina 10ug 29(S) 30(S) 21(S)
Vancomicina 30ug 24.5(S) 24.5(S) 17.5(S)
0.2 Gentamicina 120ug 32(S) 29(-) 24(S)
Eritromicina 15ug 33(S) 31(S) 30(S)
0 Ciprofloxacina 5ug 27(S) 25(-) 24(S)
b) 0 50 100
VNaOH (ml)

Figura 2. Curva de titulación de quitosano a) y

su primera derivada b)
0.18 Alginato 2%
pH:4.0
0.16
Alginato-
0.14 Quitosano 0.4%
pH: 4.0"
0.12
Alginato-
Abs (620nm)

Quitosano 2%
0.1 pH:4.0
0.08 Alginato 2%
pH:7.0
0.06
Alginato-
0.04 quitosano 0.4%
pH:7.0
0.02 Alginato-
quitosano 2%
0 pH:7.0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (h)

Figura 3. Absorbancia de liberación celular de los

diferentes tratamientos