UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

MICROBIOLOGIA

“PRACTICAS”

PRESENTADO POR:

WILDER DONET OBLITAS ABANTO

PROFESORA:

BLGA. PEREZ FLORES FIORELLA

CELENDÍN-CAJAMARCA

2016
 A:

Mis padres por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, en toda mi educación, tanto académica,
como de la vida, por su incondicional apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo
 AGRADECIEMIENTOS

A Dios y a todos nuestros maestros de la Universidad Nacional de Cajamarca por brindarnos sus
conocimientos que nos llevaran al mundo del saber.

Le doy gracias a mis padres María y Wilder por apoyarme en todo momento, por los valores que me han
inculcado, y por haberme dado la oportunidad de estudiar esta carrera. Sobre todo por ser un ejemplo de
vida a seguir.

A mis hermanos por apoyarme cuando mas los necesite y representar la unidad familiar. A karito y
Manuel por ser un ejemplo de estudio y superación.
 PRESENTACION

El presente trabajo consta de seis prácticas realizadas en el laboratorio de la escuela de Ingeniería

Ambiental de la universidad nacional de Cajamarca en el curso de microbiología a cargo de la Bióloga
Fiorella Pérez Flores.

En cada práctica se presentan una breve introducción y los objetivos para facilitar la comprensión de los
mismos. El objetivo general de este trabajo practico es que iniciemos en el conocimiento de la biología
básica de los microorganismos, en sus características morfológicas, nutricionales de crecimiento, control
y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio.

PRACTICA 1: BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA 2: LA MICROSCOPIA

PRACTICA 3: MATERIALES Y QUIPOS DE USO COMUN

PRACTICA 4: METODOS DE ESTERILIZACION

PRACTICA 5: MEDIOS DE CULTIVO “PREPARACION Y ESTERELIZACION”

PRACTICA 6: METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO

 PRACTICA 1: BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCION

La bioseguridad difiere una serie de medidas las cuales cuyo propósito es el cuidado de los practicantes
a través de un ambiente seguro y ordenado. Las normas generales para el trabajo en los laboratorios de
microbiología incluyen temas tales como el ingreso dirigido por un responsable encargado, formación
de equipos de trabajo internos en el laboratorio, rotulación de áreas uso de pipetas, tono de voz en el
laboratorio, adecuada vestimenta, higienización, entre otra.

Todas estas normas con el propósito de prevenir y asegurar el buen desarrollo de la práctica, como
también , la salud de los alumnos.

OBJETIVOS

Objetivos generales

 Conocer los protocolos de seguridad que debemos observar cuando hagamos uso del laboratorio.

Objetivos específicos

 Hacer énfasis sobre las normas de higiene de las personas respecto así mismas como con los
elementos utilizados.
 Capacitarnos para darle un buen manejo a nuestro laboratorio.
 INFORMACION TEORICA

Con el desarrollo de ésta práctica lo que se pretende es crear conciencia y buenos hábitos en los
estudiantes que vamos a utilizar los equipos y dependencias de los laboratorios, para realizar nuestras
prácticas de manera exitosa sin poner en riesgos de contaminación o biológicos a nosotros mismos como
personas o al medio ambiente.

Como primera medida debemos utilizar los elementos de protección como son la bata, los tapabocas,
guantes y abstenernos de consumir alimentos, bebidas, chicles dentro de los instalaciones del laboratorio,
hacer uso de los instrumentos de manera correcta y una vez utilizados dejarlos limpios, observar con
detenimiento las indicaciones y contraindicaciones de las diferentes sustancias y reactivos y
almacenarlos en los sitios indicados; alejar de los mecheros y zonas de altas temperaturas las sustancias
que puedan hacer combustión, hay instrumentos que para su uso a temperaturas altas debemos hacerlo
mediante el baño María únicamente y no cambiarles la temperatura de forma brusca.

Un aspecto importante que debemos tener en cuenta es que para la toma de nuestras de las diferentes
sustancias o pipeteo, por ningún motivo utilizaremos la boca como fuente se succión, para ello hay
instrumentos especiales.

Los guantes una vez utilizados se deben desechar dentro del laboratorio y por ninguna razon salir de la
dependencia con ellos puestos y mucho menos manipular objetos ajenos al laboratorio.

Por ultimo dejaremos las instalaciones del laboratorio en perfectas condiciones de higiene y orden
utilizando los elementos necesarios, recuerden hay que dejar las cosas como deseamos volver a
encontrarlas.

CUESTIONARIO

¿Qué es bioseguridad?

Son las normas y medidas preventivas, destinadas a minimizar o evitar posibles contaminaciones
procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos; de esta manera evitamos poner nuestra integridad
o al medio ambiente en riesgo o peligro. Estas normas debemos observarlas en todas las actividades que
desarrollemos en nuestro quehacer diario y especialmente cuando manipulemos o nos expongamos a
sustancias o ambientes de alto riesgo.
¿Cuáles serían para usted las normas mínimas de bioseguridad en el laboratorio de Biología?

Ingresar al laboratorio con los elementos de protección como la bata, los guantes, los tapabocas, los
gorros entre otros. (Solo ingresa el personal autorizado y con los elementos necesarios para el buen
desarrollo de la actividad.)

 No consumir alimentos ni llevarnos elementos a la boca.

 Tener siempre presente las indicaciones de los diferentes reactivos o sustancias que
usemos.
 Darle uso adecuado a los diferentes instrumentos; recordemos que para cada necesidad
hay uno que la suple.
 Estar atento a las instrucciones de la persona encargada de dirigir las diferentes
actividades.
 No mezclar sustancias sin consultar, podríamos desencadenar reacciones con efectos
lamentables.
 Dejar los instrumentos utilizados perfectamente limpios, sin restos de sustancias,
podríamos causar accidentes a la siguiente persona que lo utilice.

¿Cómo puede usted evitar en el laboratorio daños a su salud?

Teniendo en cuenta los protocolos y normas de bioseguridad lo mismo que las indicaciones dadas por el
profesional al frente de la actividad.

¿Qué desechos se generan en el laboratorio de biología y como se descartan adecuadamente?

Los desechos que se generan en el laboratorio de biología son: Los residuos de las diferentesmezclas
realizadas, empaques de elementos estériles, los diferentes papeles utilizados, guante de protección
usados, tapabocas y otros elementos que pueden ser orgánicos, inorgánicos e inactivos; para estos
residuos existen dentro del laboratorio canecas debidamente rotuladas en donde los depositaremos, en
caso de dudas acerca del destino final del residuo debemos preguntar al profesional que está al frente de
la actividad con el fin de evitar accidentes o contaminaciones.
 BIBLIOGRAFIA

 Microsoft® Encarta® 2009. © 1993-2008 Microsoft Corporation.

 http://canal.unad.edu.co/laboratorio/index/main.html
 http://biotic-a.blogspot.com/2008/02/clasificacin-clulas.html
 http://unefabotanica.blogspot.com/2007/01/tejido-parenquimtico.html
 PRACTICA 2: MICROSCOPIA

INTRODUCCION

El microscopio es un instrumento óptico que le ha permitido al hombre realizar numerosas

investigaciones y descubrimientos, para mostrarle al mundo la realidad de mucho de los objetos y seres
microscópicos. La historia cuenta que Hacia el año 1590 Hans y Zacharias Jansen, fueron los primeros
inventores del microscopio; otros historiadores atribuyen el invento a Cornelis Drebbel, quien hacia
1610 habría construido un microscopio compuesto, e incluso a Galileo Galilei. En las primeras décadas
del siglo XVII, el óptico holandés Antoni Van Leeuwenhoek consiguió lentes que daba ampliaciones de
hasta 270 veces, Observando una gota de agua descubrió en ella la existencia de pequeños y raros
animalillos. Comprobada la utilidad del microscopio como instrumento científico, el trabajo posterior
de los ópticos se centró en el perfeccionamiento de las lentes y la consecución de una mejor calidad de
imagen y mayores ampliaciones de la misma. En 1931 los científicos alemanes Ernst Ruska y Max Knoll
inventaron el microscopio electrónico, que fue perfeccionado cinco años mas tarde por Müller.

Existen varios tipos de microscopio para una gran variedad de usos, tales como: microscopio simple,
compuesto de campo oscuro, de contraste de fase, de luz ultra violeta, de luz polarizada y el electrónico.

OBJETIVOS

Objetivo general

Reconocer cada una de las partes del microscopio y su manejo adecuado.

Objetivos específicos

 Entender los conceptos básicos de microscopia tales como el poder de resolución, poder
de aumento y campo visual en relación con las lentes utilizadas.
 Adquisición de la destreza para calcular mediciones aproximadas de las células y otras
estructuras.
 Conocer las unidades de medidas de mayor uso en microscopia y la utilice resolviendo algunos
problemas comunes en este campo
 EL MICROSCOPIO

El microscopio compuesto es un instrumento óptico que se emplea para aumentar o ampliar las imágenes
de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por
tres sistemas:

El sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes que
permiten el movimiento para el enfoque.

El sistema óptico comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el aumento de
las imágenes que se observan a través de ellas

El sistema de iluminación comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la
cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio.

En los siguientes puntos describiremos cada uno de los sistemas nombrados, a fin de tener
un conocimiento completo del microscopio.

 La parte mecánica del Microscopio

La parte mecánica del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el carro, el
tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de
iluminación, además permite los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

El pie. Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien
es rectangular

El tubo. Tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar las molestias que ocasionan
los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los oculares.

El revólver. Es una pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan los objetivos. Al girar
el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, la cual se nota
por el ruido de un piñón que lo fija.

La columna, llamada también asa o brazo, es una pieza colocada en la parte posterior del aparato.
Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie.

La platina. Es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar.
Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación.
La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir,
mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.

Carro. Es un dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la preparación con movimiento
ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a izquierda.

El tornillo macrométrico. Girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio,
deslizándose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque
rápido de la preparación.

El tornillo micrométrico. Mediante el movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o
la platina, se logra el enfoque exacto y nitido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en
divisiones de 0,001 mm que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los
objetos.

 Sistema Óptico

El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes
que lo componen. Está formado por los oculares y los objetivos.

Los oculares. Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo
corto. Los oculares generalmente más utilizados son los de: 8X, 1OX, 12.5X, 15X. La X se utiliza para
expresar en forma abreviada los aumentos.

Los objetivos. Los objetivos producen aumento de las imágenes de los objetos y organismos y, por
tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de
dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión.

Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En
la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y
otros datos. Así por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el
objetivo es plana cromático, su aumento 40 y su abertura numérica 0,65, calculada para una longitud de
tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los
aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 6X, 1OX, 20X, 45X y 60X.

El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de
este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparación, de
manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son
de 1 OOX y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Los objetivos se disponen en una pieza giratoria denominada revólver.

 Sistema de Iluminación

Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la
preparación u objeto que se va a observar en el microscopio. Comprende los siguientes elementos:

El espejo. Tiene dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La
cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para iluminación natural
(luz solar). Modernamente se prescinde del espejo en la fabricación de microscopios, ya que éstos traen
incorporada una lámpara colocada en el eje del microscopio.

Condensador. El condensador está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los
rayos luminosos sobre el plano de la preparación. El condensador se halla debajo de la platina. El
condensador puede deslizarse sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo que determina su
movimiento ascendente o descendente.

Diafragma. Generalmente, el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura y

controla la calidad de luz que debe pasar a través del condensador.

Trayectoria del Rayo de Luz a través del Microscopio

El haz luminoso procedente de la lámpara pasa directamente a través del diafragma al condensador.
Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación a
observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar el ocular, donde es captado
por el ojo del observador.

Propiedades del Microscopio

Poder separador. También llamado a veces poder de resolución, es una cualidad del microscopio, y se
define como la distancia mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. El ojo normal
no puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro.

En el microscopio óptico, el poder separador máximo conseguido es de 0,2 décimas de micra, y en el

microscopio electrónico, el poder separador llega hasta 10 ángstrom.
Poder de definición. Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus
contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes
utilizadas.

Aumento del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el diámetro aparente
de la imagen y el diámetro o longitud del objeto.

Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo
es 100 veces mayor que el tamaño real del objeto. Para calcular el aumento de un microscopio, basta
multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Por ejemplo, si estamos utilizando un
ocular de 10X y un objetivo de 45X, el aumento a que estamos viendo la preparación será: 1OX x 45X
= 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450 veces.

 Campo del Microscopio

Se denomina "campo del microscopio" al círculo visible que se observa a través del microscopio.
También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través del microscopio.
Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente
proporcional al aumento del microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con
cualquiera de los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el siguiente punto.

Tipos de Microscopios
Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz, y otros accesorios
utilizados para obtener las imágenes.

El microscopio compuesto u óptico utiliza lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados.
El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz visible
que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser monocular, y consta de un solo tubo. La
observación en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular cuando posee dos tubos. La observación
se hace con los dos ojos. Esto presenta ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más
cómoda la observación y se perciben con mayor nitidez los detalles.

Microscopio estereoscópico. El microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los

objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece
ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se
encuentra entre 2 y 40X o aumento total del microscopio.
Microscopio de campo oscuro. Este microscopio está provisto de un condensador paraboloide, que hace
que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la
preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre un fondo oscuro.

Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir

luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del material biológico con
flurocromos facilita la observación al microscopio.

Microscopio de contraste de fases. Se basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz,
los cuales producen contrastes notables en la preparación.
 CONCLUCIONES

 El Microscopio es: cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se utilizan para obtener
una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos.

 El microscopio simple o lente de aumento es el más sencillo de todos y consiste en realidad en

una lupa que agranda la imagen del objeto observado.

 Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos
luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sitúa cerca del objeto que se
quiere estudiar.

 El objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es real porque
los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen.

 La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que actúa sencillamente como una
lupa. El ocular está situado de modo que no forma una segunda imagen real, sino que hace
diverger los rayos luminosos, que al entrar en el ojo del observador parecen proceder de una gran
imagen invertida situada más allá del objetivo.

BIBLIOGRAFÍA

 Enciclopedia Encarta 2000. Microsoft Corporation

 Enciclopedia Hispánica Millennium. (2000). Volumen 10. Caracas.
 Mazparrote, Serafín. (2000). Biología. 9no. Grado. Editorial Biosfera. Caracas.
 Mundo Científico Nº 27-50. Editorial Fontalba. Barcelona.
 PRACTICA 3: MATERIALES Y EQUIPOS DE USO COMUN

INTRODUCCION

Reconocimiento del material de laboratorio: La seguridad del laboratorio está relacionada con la
naturaleza del material, el instrumental y la actitud del educando frente a su uso y manifestaciones.

Es muy importante que los materiales y equipos de uso común en el laboratorio se identifiquen por su
nombre correcto y uso específico que tiene cada uno, pero más importante es saber manejarlo
correctamente en el momento oportuno, teniendo en cuenta los cuidados y normas especiales para el uso
de aquellos que así lo requieran.

Los materiales de laboratorio están constituidos de materiales diversos y se clasifican de la siguiente

manera: material de laboratorio de vidrio, material de laboratorio de porcelana, material de laboratorio
de metal y material de laboratorio de madera

OBJETIVOS

Objetivo general

 Reconocer los equipos y cada una de sus partes, asi como el fundamento de su utilización.

Objetivos específicos

 Explicar en forma clara y segura el uso del material usado en el laboratorio.

 Aprender a manipular adecuadamente el material de vidrio, goma, plástico, madera, metal ó
porcelana.
 Aprender a realizar lectura de volúmenes.
 Aprender a realizar la técnica del trasvasado.
 Formar equipos de trabajo.
 MATERIALES DE LABORATORIO

Nombre y dibujo Función Tipo de material

1.- Embudo de vidrio

El embudo es un instrumento empleado para

canalizar líquidos y materiales sólidos granulares e Pude ser
n recipientes con bocas estrechas. Es usado de vidrio, plástico
principalmente en cocinas, laboratorios, .
actividades de construcción, industria, etc.

2.- Vaso precipitado

Un vaso de precipitados o vaso de precipitado es

Generalmente de
un recipiente cilíndrico de vidrio fino que se utiliza
vidrio pero
muy comúnmente en ellaboratorio, sobre todo,
también hay de
para preparar o calentar sustancias y traspasar
plástico y metal.
líquidos.

3.- Fiola

Es un recipiente de vidrio que se utiliza sobre todo

para contener y medir líquidos.
Material de
Se emplean en operaciones de análisis químico
vidrio.
cuantitativo, para preparar soluciones de
concentraciones definidas.
4.-Frasco de reactivo

Permite: guardar sustancias para almacenarlas los

hay ámbar y transparentes los de color ámbar se
utilizan para guardar sustancias que son alteradas Material de
por la acción de la luz del sol, los de color vidrio.
transparente se utilizan para guardar sustancias
que no son afectadas por la luz solar

5.- Tubo condensador en forma de hélice

Se usa para condensar los vapores que se

desprenden del matraz de destilación, por medio
De vidrio.
de un líquido refrigerante que circula por éste,
usualmente agua.

6.- Tubo condensador lineal

Su uso es similar al tubo refrigerante en forma de

De vidrio.
hélice solo que este es lineal.

7.-Probeta milimetrada

Es un instrumento volumétrico, que permite medir

volúmenes considerables con un ligero grado De vidrio.
de inexactitud. Sirve para contener líquidos.
8.- Pipeta

Es un instrumento volumétrico
de laboratorio que permite medir la alícuota de De vidrio
líquido con bastante precisión.

9.-Pera de decantación

Se emplea para separar dos líquidos inmiscibles, o

sea, para la separación de fases líquidas de De vidrio.
distinta densidad.

10.- Balón de base plana

Está diseñado para calentamiento uniforme, y se

produce con distintos grosores de vidrio para De vidrio.
diferentes usos.

11.- Mechero de alcohol o ron

Sirve para calentar sustancias con alcohol o ron. De vidrio o metal.

12.- Mechero de bunsen

Es un instrumento utilizado en laboratorios

científicos para calentar o esterilizar muestras De metal.
o reactivos químicos.

13.-Rejilla de asbesto

Es la encargada de repartir la temperatura de

manera uniforme, cuando se calienta con un
mechero. Para esto se usa un trípode de De metal.
laboratorio, ya que actúa como un sostenedor a la
hora de experimentar.

14.-Cucharilla de combustión

Se utiliza para realizar pequeñas combustiones de

sustancias, para observar el tipo de flama, De metal.
reacción, etc.

15.-Pinza de madera

Esta herramienta sirve para sujetar los tubos

de ensayos, mientras se calientan o se trabajan De madera.
con ellos.
16.- Tubo de ensayo

Es un tubo cilíndrico pequeño utilizado en la

contención de muestras líquidas y también para De vidrio.
calentarla , etc.

17.- Matraz

Recipiente de cristal donde se mezclan las

soluciones químicas, generalmente de forma
esférica y con un cuello recto y estrecho, que se De vidrio.
usa para contener líquidos; se usa en los
laboratorios.

18.-Luna de reloj

Es un instrumento de laboratorio de química que

se usa para pesar sustancias solidas o desecar De porcelana.
pequeñas cantidades en disolución.

19.-Portaobjetos

Es una fina placa de cristal sobre el cual se

De vidrio.
disponen objetos para su examen microscópico.

20.-Crisoles

El crisol de porcelana es un material de laboratorio

utilizado principalmente para calentar, fundir, De porcelana.
quemar, y calcinar sustancias.
21.-Crisol con pico

Los crisoles se usan en el laboratorio

de química para hacer experimentos o reacciones
que requieren de mucha temperatura, ya que los De porcelana.
crisoles se pueden utilizar hasta en temperaturas
de 1000°C.

22.-Mortero con pilón

Se usa para moler o reducir el tamaño de las De porcelana o

sustancias. vidrio.

23.-Gradilla

Es utilizada para sostener y almacenar gran

De plástico,
cantidad de tubos de ensayo, de todos los
madera, metal.
diámetros y formas.

Las pinzas de laboratorio son un tipo de sujeción

24.-Pinza
ajustable, generalmente de metal, que forma parte
del equipamiento de laboratorio, mediante la cual
se pueden sustentar diferentes objetos de
vidrio (embudos de laboratorio, buretas...) o
realizar montajes más elaborados (aparato de De metal.
destilación). Se sujetan mediante una doble nuez a
un pie o soporte de laboratorio o, en caso de
montajes más complejos (línea de Schlenk), a una
armadura o rejilla fija.
Metal, madera.

25.-Escobillas de cerdas
Según el diámetro se utilizan luego de
los experimentos de física, química o pruebas de
De metal.
laboratorio para lavar: tubos de ensayo, buretas,
vasos de precipitado, erlenmeyer, etc...
26.-Tripode

Se utiliza cuando no se tiene el soporte universal

para sostener objetos con firmeza. Es
ampliamente utilizado en varios experimentos. La
finalidad que cumple en el laboratorio es solo una,
ya que su principal uso es como herramienta de De metal.
sostén a fin de evitar el movimiento. Sobre la
plataforma del trípode se coloca una malla
metálica para que la llama no dé directamente
sobre el vidrio y se difunda mejor el calor.

27.-Balon con pico

Es un recipiente de vidrio de forma esférica y

cuello largo, balón con un tubo lateral de
De vidrio.
desprendimiento. Dentro del mismo, se coloca
el sistema que se desea fraccionar en fase líquida.

28.-Balon de base circular

Permite contener sustancias así también para

De vidrio.
calentar sustancias sobre un trípode.
 Equipos de laboratorio

 El espectrofotómetro

Uno de los instrumentos principales del laboratorio de biología celular es el espectrofotómetro. Este
instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda
particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto
le permite al fisiólogo realizar dos funciones:

1. Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo

midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y graficar estos valores en función del largo
de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas,
distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un arreglo
de átomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga características únicas. Al ser
expuestos a la luz del espectrofotómetro, algunos electrones de los átomos que forman las moléculas
absorben energía entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energía absorbida es
emitida en forma de fotones. Esa emisión de fotones es distinta para cada sustancia, generando un patron
particular, que varía con el largo de onda usado. Dependiendo del largo de onda, será la cantidad de
energía absorbida por una sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs l

2. Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La
concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert: a mayor cantidad de
moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones.
  Cubetas

Las cuvetas son unos viales de plástico transparente o cuarzo que dejan pasar la luz. Los mejores para
trabajos de investigación son las de cuarzo porque su interferencia al paso de la luz es mínimo. Son más
costosas inicialmente pero bien tratadas pueden ser reusables. Las de plástico vienen con distintas
características. Por lo general son desechables, aunque pueden reusarse. El tipo de cuveta plástica a usar
depende del rango de luz en el que se van a analizar las muestras. Vienen unas para luz visible, que son
las más económicas, y otras para el rango de visible a ultravioleta. Estas son más versátiles.

Ambos tipos de cuvetas deben manejarse con cuidado para evitar rallazos sobre la superficie por donde
pasa la luz. Si la cuveta está rallada, los rayos de luz que incidan en la zona se difractan y no pasan por
la muestra, por lo que puede dar lecturas de absorbancia erróneas. Esto es especialmente crítico cuando
queremos determinar concentración en una muestra. Antes de tomar una lectura, debemos observar que
la cuveta no tenga rallazos ni esté sucia. Si se ven marcas de polvo u otro tipo de sucio la cuveta debe
limpiarse con papel tisú (Kimwipes). Si la cuveta se manipula mucho, debemos sostenerla usando papel
tisú para evitar pegarle los aceites que normalmente tenemos en las manos. No debemos usar ningún
otro tipo de papel para limpiar las cuvetas, puesto que pueden soltar fibras que pudieran caer en la
muestra o rallar la superficie.

Las cuvetas viene en distintos volúmenes, desde 1 ml hasta 4 ml. El volumen a escoger depende de la
cantidad de muestra disponible. Si la muestra disponible es poca o difícil de conseguir, lo mejor es usar
una cuveta de menor volumen para perder la menor cantidad posible de la muestra. Por lo general, la
muestra utilizada para hacer la lectura se pierde, sobre todo si es una sustancia bien sensitiva, como
el ADN.
  Pipetas y pipeteadores

Usamos las pipetas para medir volúmenes de líquidos de forma más precisa que con una probeta. Y son
más versátiles, sobre todo al manejar volúmenes pequeños.

Las pipetas de bulbo son útiles para medir volúmenes que no requieren de mucha presición. Antes se
usaban pipetas "Pasteur" de cristal a las que se les aditaba un bulbo de goma que se usaba para succionar
el líquido. Ahora vienen en plástico desechable de una sola pieza y se consiguen con o sin calibración.

Las pipetas volumétricas vienen en distintos tamaños, desde 1 ml hasta 200 ml, y con distintas formas,
de acuerdo al uso que se les dé. También vienen en distintos materiales como borosilicato y plástico,
desechables o reusables, estériles o sin esterilizar. Algunas pueden ser esterilizadas en horno o autoclave.
Para llenarlas se pueden usar bulbos de caucho, bombas manuales o eléctricas, o equipos de llenado. Las
bombas eléctricas y los equipos de llenado son muy útiles si se está trabajando con múltiples muestras,
pues minimizan la fatiga del técnico.

Las micropipetas son extremadamente útiles en los laboratorios de biotecnología. Estas permiten medir
con presición volúmenes tan pequeños como 0.1 µl hasta 1 ml. Estas requieren de unos pipeteadores
especiales que deben der tratados con mucho cuidado para evitar que se descalibren. Los pipeteadores
vienen de distintos tipos. La mayoría pueden servir muestras individuales. Pero vienen los que pueden
servir muestras múltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12 muestras a la vez. Estas
son muy útiles al hacer pruebas de ELISA, donde se practican diluciones seriadas multiples, o para
preparar reacciones de varias muestras distintas a la vez. Se usan en conjunto con platos de fosas
múltiples.

Las puntas de micropipetas vienen con distintas características de acuerdo al uso que se les dé. Vienen
con punta ancha, estrecha o aplanada, con o sin filtros contra aerosoles, estériles o sin esterilizar y
pueden ser esterilizadas en autoclave.
  Aparatos de electroforesis

Estos son unas cámaras que contienen un circuito eléctrico expuesto a un líquido electrolítico, llamado
amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de moléculas grandes de acuerdo a su carga y/o su
tamaño. La técnica consiste en inocular la muestra en un medio semisólido, la fase estacionaria, que se
somete a un campo eléctrico, en una cámara donde en un extremo se encuentra un filamento que actúa
como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro filamento formando el polo negativo. Las
moléculas con cargas netas positivas se moverán hacia el polo negativo y las de carga negativa
se irán hacia el polo positivo. Luego de la muestra ser tratada apropiadamente dependiendo del tipo de
electroforesis, las moléculas que viajen hacia uno de los polos se separarán por tamaño, viajando más
en la fase estacionaria las moléculas más pequeñas. El tipo y concentración de la fase estacionaria
dependerá del tipo de moléculas que nos interesa correr.

 Centrífugas

Son muy útiles para precipitar células y moléculas. Vienen en distintos tamaños y con distintas
capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración que
obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase utilizado, separándolas del medio en que
se encuentran. Incluso, bajo ciertos métodos se puede generar un gradiente de concentraciones dentro
del mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o fases dentro del tubo. Con ayuda de
jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer del mismo sólo aquella fase donde se encuentren
las moléculas de interés.

Entre las centrífugas que usaremos durante el semestre están la centrífuga refrigerada, que nos va a
permitir separar células de los medios de cultivo. El rotor de esta centrifuga puede sostener tubos de 50
ml, pero puede ser intercambiado por rotores que sostienen botellas de cultivo.

La microcentrífuga es una versión más pequeña de la descrita anteriormente. Es compacta, se coloca

sobre la mesa y procesa muestras de hasta 2 ml. Es muy útil para precipitar ADN y otras sustancias que
se trabajan en volúmenes pequeños.

 Equipo de cromatografía

Haremos varias cromatografías al final del semestre. En una cromatografía buscamos separar uno o
varios tipos de moléculas, relativamente pequeñas, de una mezcla de sustancias o para purificar
muestras. Existen varios tipos de cromatografías. La que se utilice dependerá del tipo de moléculas que
buscamos aislar.

La cromatografía de capa fina es ideal para separar muestras pequeñas. Presenta dos componentes: una
fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria consiste de una placa de vidrio
o celulosa impregnada con polvo de silicato (vidrio molido extremadamente fino). Las muestras se
colocan a un centímetro del borde inferior y se coloca en un tanque de revelado que contiene algun tipo
de solvente en el fondo.
 CONCLUCION
 Luego de haber realizado la práctica de laboratorio y al presentar este reporte, hemos adquirido
nuevos conocimientos y pudimos experimentar y llevar a la práctica los conocimientos teóricos.

 La química es una rama amplia y profunda pero al investigar y desarrollar experimentos de

manera sistemática y paso a paso, nos resulta sumamente interesante y divertido el estudio de
esta ciencia.

 Todo a nuestro alrededor es un constante desarrollo de procesos químicos, por lo cual no

podemos ignorar ni menospreciar la importancia de esta ciencia para nosotros y para
cada persona.

BIBLIOGRAFIA

 BIBLIOTECA DE CONSULTA MICROSOFT® ENCARTA® 2003. © 1993-2002

MICROSOFT CORPORACIÓN.

 BIBLIOTECA SALVAT DE GRANDES TEMAS: La vida microscópica.

 Salvat editores, s.a. Págs. 48 – 87.

 PRACTICA 4: METODOS DE ESTERILIZACION

INTRODUCCION

La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los
microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad
dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de
materiales estériles. Entre éstos podemos destacar: La esterilización de equipos quirúrgicos y otros
materiales de uso médico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes. El
acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los
laboratorios de microbiología. La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes
propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis
microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.). En el presente trabajo se verán los
resultados obtenidos al aplicar procesos de esterilización, para lograr medios asépticos y resultados
ideales.

OBJETIVOS

Objetivos generales

 Aprender a preparar el material a esterilizarse.

 Utilizar el equipo apropiado en la esterilización de determinados materiales.

Objetivos específicos

 Esterilizar material de laboratorio (cajas de Petri y Tubos de ensayo) para ser utilizados en
prácticas futuras.
 Conocer y aplicar el procedimiento de esterilización por calor seco y húmedo, así como las
ventajas de los procedimientos.
 LA ESTERILIZACIÓN

Esta operación comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos, que se emplean para
destruir, inactivar o retener gérmenes en general y patógenos en particular. A través de esta,
los materiales de laboratorio para determinados diagnósticos y los elementos quirúrgicos y la piel del
enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria.

METODO QUIMICO Y METODO FISICO: VENTAJAS Y DESVENTAJAS.

 MÉTODOS QUÍMICOS: uso de sustancias letales para los microorganismos (óxido de etileno,
alcohol etílico, Aldehídos, gas-plasma de peróxido de hidrógeno).
 MÉTODOS FÍSICOS: depende de factores como el tiempo exposición y la temperatura (calor,
radiaciones, filtración).

Para entender mejor estos métodos anteriormente mencionados, es importante puntualizar y analizar más
detalladamente en qué consiste cada uno.

Dentro de los métodos químicos de esterilización se encuentran los procesos con:

 Óxido de etileno: agente alquilante (interrumpen la función del ADN y la muerte celular) que
destruye todo los microorganismos incluso los virus.
 Aldehídos: agentes alquilantes que atacan a las proteínas e inhiben la actividad enzimática,
destruyendo las esporas; aquí existe el Glutaraldehido y el Aldehído.
 Gas - plasma de peróxido de hidrógeno: proceso a baja temperatura, para la transmisión de
peróxido de hidrógeno en fase plasma, que destruye, neutraliza e impide la acción sobre cualquier
microorganismo dañino por medios químicos o biológicos (biocida).

También dentro de los métodos físicos de esterilización se encuentran procesos con:

 Calor Húmedo: Producen naturalización y coagulación de proteínas debido, en primer lugar a

la reactividad del agua ya que en muchas estructuras biológicas se produce por las reacciones
que eliminan agua y en segundo lugar porque el vapor de agua es más caliente que el aire en la
transferencia. En este proceso se utiliza el método de Chamberland(esterilización por el vapor
de agua a presión) y el método de la Tindalizacion (esterilización por acción discontinua del
vapor del agua). Estos dos métodos se efectúan por medio del Autoclave.
  Calor seco: producen desecación de las células debido a la transferencia de calor desde los
materiales a los microorganismos, el calor destruye proteínas y lípidos. Aquí necesita mayor
temperatura por el material seco o la baja actividad de agua. En este proceso se utilizan Estufas
Doble Cámara (aire caliente generado por una resistencia).
 Radiaciones ionizantes: producen iones y radicales que afectan los componentes esenciales para
la viabilidad de los microorganismos. Aquí intervienen los Rayos Ultravioletas (afectando las
moléculas del ADN de los microorganismos) y los Rayos Gamma (empleados sobre la energía
atómica).
 Filtración: en este proceso se utilizan membranas filtrantes; estos filtros son retienen virus ni
micro plasma. Esta filtración es para emulsiones oleosas (agua/aceite) o soluciones termolábiles
(se altera por acción del calor). Aquí existen Filtros Profundos (combinación de absorción y
retención mecánica en la matriz), Membranas Filtrantes (retienen partículas más
pequeñas), Filtros de Huella o de Nucleación (con radiación y sustancias químicas).

Para terminar a continuación veamos algunas ventajas y desventajas de los procesos dentro de su
método de esterilización:

MÉTODOS QUÍMICOS: Oxido de Etileno

VENTAJAS

 Esteriliza material termosensible, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, metal etc.

DESVENTAJAS

 Peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, ademas cancerígeno.

Aldehídos / VENTAJAS

 Método rápido y único esterilizanrte frío.

DESVENTAJAS

 No se pueden esterilizar algunos objetos con celulosa, algodón,, líquidos, humedad, madera, etc.

Gas-Plasma de Peróxido de Hidrógeno / VENTAJAS

 No deja ningún residuo toxico.

 Se convierte en agua y oxigeno al final del proceso.
Material sin aireación. Ciclo dura entre 54 y 75 min. / DESVENTAJAS

 Método mas costoso.

MÉTODOS FÍSICOS

Calor Húmedo / VENTAJAS

 Rápido calentamiento y penetración.

 Destrucción de bacterias y esporas en poco tiempo.
 No deja residuos tóxicos.
 Bajo deterioro del material expuesto.
 Económico.

DESVENTAJAS

 No se permite para emulsiones con agua.

 Es corrosivo sobre algunos metales.

Calor Seco / VENTAJAS

 No es corrosivo para metales e instrumentos.

 Permiten esterilización de sustancias en polvo y no acuosas y de viscosas no volátiles.

DESVENTAJAS

 Mayor tiempo esterilización.

 Baja penetración del calor.
 Radiaciones de acuerdo al tiempo de radiación, tiempo exposición y dosis.

Ionizantes. Rayos ultravioleta / VENTAJAS

 Esterilizan superficies.

DESVENTAJAS

 Escasamente penetrantes.

Filtración/VENTAJAS

 Esterilizarse aceites, pomadas, soluciones oftalmicas, etc.

DESVENTAJAS

 Los filtros no retienen virus ni micro plasma.

 Para concluir, es importante conocer todos y cada uno de los métodos de esterilización para su
optimo uso y aprovechamiento así prevenir, proteger y cuidar ante el riesgo biológico.

EQUIPOS:

MATERIAL DE VIDRIO:

MEDIOS DE CULTIVO:
 CONCLUCIONES

 Por medio de esta practica se logro conocer los principales métodos de esterilización para
controlar el crecimiento microbiano en los materiales utilizados comúnmente en el laboratorio
de microbiología.
 Se identificaron los materiales utilizados en el laboratorio y la manera en el cual se deben utilizar
para lograr una practica libre de microorganismos contaminantes o exógenos a la nuestra.
 Se aprendieron los pasos necesarios en el uso del autoclave, la estufa y el mechero.

BIBLIOGRAFÍA

 J. A. García Rodríguez y otros. "Microbiología Clínica". Ed. Haurcourt Brace. Barcelona. 1999.
 Royer Stanier y otros. "Microbiología" Ed. Reverté. Barcelona. 1996.
 www.microbiologia.com.ar
apuntes Facultad de Ciencias Exactas (UNLP)
 http://es.slideshare.net/anniemanjarres/riesgo-biologico-sena
 http://escuela.med.puc.cl/paginas/publicaciones/patolquir/patolquir_004.html
 http://www.webscolar.com/metodos-de-esterilizacion
 PRACTICA 5: MEDIOS DE CULTIVO: PREPARACION Y ESTERILIZACION

INTRODUCCION

Los microorganismos, como todos los otros seres vivos, son verdaderamente susceptibles a los cambios
de las condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han
distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones
extremas de tipo físico y químico.

Un medio de cultivo consiste en un gel o una solución que cuenta con los nutrientes
necesarios para permitir bajo condiciones favorables de pH y temperatura el crecimiento
de virus, microorganismos,células o incluso pequeñas plantas. Según qué se quiera hacer crecer, el
medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan en forma de polvo fino o
granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y
líquido.

OBJETIVOS

Objetivo genera

 Aprender a preparar, esterilizar y servir medios de cultivo solidos y liquidos.

Objetivos específicos

 Conocer el manejo del autoclave

 Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
 Indicar el método de esterilización apropiado.
 Medios de cultivo: Sólido y Líquido

Una forma muy útil de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el uso
de medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur (que como ya sabemos se considera el padre de
la microbiología), quien se dio cuenta que los microorganismos podían crecer en soluciones que tuvieran
azúcar y una fuente de nitrógeno.

De ese tiempo hasta acá, ha pasado mucha agua debajo del puente y actualmente existen medios muy
especializados para microorganismos muy exigentes. La forma más sencilla de clasificar los medios de
cultivo es por su consistencia…entonces aparecen los medios de cultivo sólidos y los medios de cultivo
líquidos o también llamados caldos. En ambos medios debe haber una buena cantidad de nutrientes que
faciliten el crecimiento bacteriano… y entonces cual es la diferencia?….pues la diferencia radica en la
presencia de una sustancia que se llama Agar o “Agar-Agar” y que es la encargada de darle la solidez y
consistencia al medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada Gelidium, aunque
muchos otros géneros pueden servir como fuente de este polisacárido (es decir, un azúcar grande
formado por la unión de azúcares pequeños). Y como se obtiene del alga?…Se toman sus semillas, se
lavan, se secan, se realizan procesos de extracción, filtración, purificación y desecación para que queden
hojuelas o polvo y luego si adicionarla al medio de cultivo.

Preparación de Medios de Cultivo

Fundamento

El medio de cultivo constituye el aporte de

nutrientes indispensables para el crecimiento
de los microorganismos. La composición
precisa dependerá de la especie que se quiera
cultivar, porque las necesidades nutricionales
varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes
que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos
muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas,
suero o sangre para crecer.
Metodología
Preparación y esterilización de material de vidrio

 Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final con
agua destilada.
 Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.
 En las pipetas poner un filtro de algodón en la boquilla y envolver con papel Kraft.
 Envolver las cajas de Petri y pipetas de acuerdo a las indicaciones del profesor.
 Introducir los hisopos en un tubo y tapar con algodón.
 Identificar con nombre y marcar el volumen en el papel de las pipetas.
 Envolver el equipo Millipore para esterilizar según las instrucciones del profesor.
 Introducir el material a un horno previamente calentado a 180°C, esperar a que la temperatura
se estabilice nuevamente y a partir de este momento dejar 1 hora.
 De no ser posible emplear el horno, se puede esterilizar el material de vidrio en autoclave.

Preparación de medios de cultivo (ejemplo de preparación con base en caldo)

 Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo.

 Calcular la cantidad necesaria para preparar 160mL de caldo.
 Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida para evitar
que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
 Disolver el medio en 100mL de agua y una vez disuelto completar el volumen a 160mL.
 Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.
 Colocar 10mL en 5 tubos de 16x150.
 Colocar 20mL del caldo en el matraz de 50mL y calcular la cantidad necesaria de agar-
agar para obtener un medio semisólido. (* a un litro de medio se agregan 2.0g de agar-agar).
 Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente.
 Colocar 10mL en 2 tubos de 16 x 150.
 A partir del volumen excedente, calcular la cantidad necesaria para obtener un medio sólido.
(* a un litro de medio se agregan de 15g a 20g de agar-agar).
 Tapar el matraz y calentar hasta disolución total.
 Distribuir: 20mL en 2 tubos de 22x175, 10mL en 2 tubos de 16x150 y 7mL en 4 tubos
de16x150.
 Medios sólidos

1. Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo.

2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 110mL de Agar BHI (o el medio que se requiera
preparar).

3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida para evitar que
la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Dispersar el medio en 70mL de agua destilada y una vez humectado completar el
volumen a 110mL.

5. Tapar el matraz y calentar con el mechero hasta fundir totalmente. Cuidar que el medio
no se pegue agitando suavemente de manera constante.
6. Una vez fundido dejar atemperar unos minutos y distribuir 7mL en c/u de 4 tubos de
16x150 y 20mL en c/u de 4 tubos de 22x175.
7. Tapar cada uno de los tubos con algodón y etiquetarlos.

Disposición de desechos.
1. Colocar el medio de cultivo sólido sobrante sobre un papel y envolverlo, colocar el paquete en una
bolsa de plástico y desecharlo en el contenedor de RPBI.

2. Depositar el papel de envoltura en el bote de basura correspondiente.

Control de calidad de esterilización, zona y técnica aséptica, y esterilización por filtración.

Metodología
Disposición de los medios de cultivo preparados. Solución salina isotónica (SSI)
1. Revisar los tubos de solución salina y separar aquellos que tengan tapones de algodón fuera de su
sitio. Preparar nuevamente para sustituir los tubos abiertos y esterilizar. Estos tubos de SSI deberán
guardarse en un bote cerrado en la gaveta ya que serán utilizados en prácticas posteriores.

Medios líquidos
1. Revisar los tubos de caldo BHI y separar aquellos que tengan los tapones de algodón fuera de su sitio.
En caso de que los tubos se encuentren abiertos y sin presencia de turbidez, taparlos y esterilizarlos
nuevamente. En caso de que el medio se encuentre contaminado deberá prepararse y esterilizar un
nuevo medio, deberán guardarse en un bote cerrado en la gaveta ya que serán utilizados en la práctica
de técnicas de cultivo.
2. Revisar que el matraz con caldo no se encuentre destapado y/o contaminado. Apartar para
prueba de comprobación del crecimiento y filtración.

Medios semisólidos
3. Revisar los tubos de agar semisólido y separar aquellos que tengan tapones de algodón fuera
de su sitio y sin presencia de turbidez, taparlos y esterilizarlos nuevamente. En caso de que
el medio se encuentre contaminado deberá prepararse y esterilizar un nuevo medio. Los dos tubos
deberán guardarse en un bote cerrado en la gaveta ya que serán utilizados en la práctica de técnicas de
cultivo.

Medios sólidos
1. Revisar los tubos de agar BHI y separar aquellos que tengan tapones de algodón fuera de su sitio.
Revisar que no exista la presencia de colonias y tapar nuevamente. En caso de existir contaminación
sustituir por otros tubos no contaminados.
2. Colocar los cuatro tubos de 22x175 y los cuatro tubos de 16x150 en un bote y fundir a baño María.

Comprobación de esterilidad.
1. Extraer las ampolletas con endosporas Geobacillus stearothermophylus y etiquetar cada
una de ellas sobre una charola de plástico, colocar una ampolleta sin esterilizar, e incubar a 55°C
durante 48 horas.
2. Concluida la incubación comparar las ampolletas esterilizadas de las no estelizadas.
Comprobación del área aséptica
1. Lavar y desinfectar la mesa, delimitar el área de trabajo y encender el mechero para crear
una zona aséptica.
2. Etiquetar las dos cajas de Petri con TSA o Agar nutritivo con los siguientes datos:
Comprobación de técnica aséptica
1. En condiciones de asepsia vaciar el agar BHI contenido de los tubos de 22x175 en las cuatro
cajas Petri de vidrio que se esterilizaron previamente.
2. Dejar solidificar.
Comprobación del crecimiento

1. Inocular en condiciones de asepsia una asada de Escherichia coli el matraz con caldo
BHI .
2. A partir del matraz inoculado con E. coli inocular con hisopo la superficie la caja Petri
restante con agar BHI. Etiquetar la caja con los siguientes datos:

1515-09-# de
equipo Escherichia
coli dd/mm/aa

3. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar
invertida a 37°C durante 24 horas.
4. Al finalizar la incubación revisar y guardar en la gaveta.

Matraz con
E. coli caldo BHI
Filtración

1. Etiquetar la caja con agar ENDO.

2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En condiciones de
asepsia instalar el equipo Millipore estéril. Antes de instalar el vaso y las pinzas de pato,
colocar una membrana de 0.45µm estéril sobre la base del filtro conector. Las pinzas de
punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la membrana.

3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido del matraz con caldo BHI
inoculado con E. coli.

4. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que hubo
pasado todo el medio cerrar el vacío.
5. Retirar las pinzas de pato y el vaso, este último deberá ser envuelto inmediatamente con
mucho cuidado y colocado en un bote de metal para su esterilización en autoclave.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja de Petri
con agar ENDO. Presionar ligeramente la superficie para favorecer la adherencia de la
membrana.

7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar a 37°C
durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubación revisar los resultados y guardar en refrigeración.

9. Transvasar el contenido (caldo BHI estéril) del matraz Millipore a un matraz estéril
preparado previamente.
10. Etiquetar el matraz con el filtrado.
11. Incubar el matraz a 37°C durante 24 horas.
12. Al finalizar la incubación revisar y guardar en la gaveta.
13. Lavar el matraz Millipore y el filtro conector, y entregar inmediatamente.
14. Esterilizar en autoclave el vaso del equipo Millipore y el matraz que fue inoculado.
 CONCLUCIONES

 Se aprendió y manejo la técnica empleada para la preparación de medios de cultivo.

 •Se aplico la técnica de esterilización de vapor a presión (autoclave), para medios de cultivo en
agar y caldo nutritivo.

 Se conoció el método de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los medios de cultivo.

 Se puede elaborar medios de cultivo de manera sencilla, siendo muy útil para el estudio de
microorganismos debido a que en este tipo de medio se los puede reproducir con facilidad.

 Elaborar medios de cultivo resulta eficiente para la reproducción y el posterior aislamiento de

alguna cepa de microorganismo que nos interese estudiar. Se aprendió y manejo la técnica

BIBLIOGRAFIA

 Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory

manual. 7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005
 Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory
and
 application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.
 Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th
edition.
 Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
 Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th
edition. McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005
 PRACTICA 6: METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO

INTRODUCCION

Un medio de cultivo intenta el crecimiento y reproducción in vitro de las bacterias, para observar sus
propiedades y conseguir un mejor estudio bioquímico e inmunológico, al contar con material en cantidad
suficiente. Por ello constare de lagunas propiedades (pH adecuado, sales, nutrientes, condicione de Aero
anaerobiosis, etc.), que serán las más idóneas para la bacteria que deseamos estudiar y se citan en cada
una de ellas en particular, en la bacteriología sistemática.

Los medios de cultivo se dividen por su finalidad en: medios de enriquecimiento que tratan de aumentar
el número de bacteria existentes , si consideramos que se encuentran en cantidad muy exigua, a la vez
que inhiben la flora de asociación acompañante( y de aislamiento ( que tienen por fin conseguir una
colonia o clon, es decir, grupo de bacterias procedentes de una sola, con todas sus propiedades); los dos
primeros son principalmente líquidos y los segundos, sólidos.

Los medios selectivos son aquellos que poseen algún componente que permite o no le crecimiento de
una especie bacteriana, carácter de importancias para su identificación, y los diferenciales, aquellos que
las diversas especies que hay que testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores
(sustancias que varían su coloración según el pH del medio) u otros índices de reacciones químicas
definidas.

OBJETIVOS
Objeivo general
 Con la presente practica se busca que el alumno conosca y maneje las diferentes formas
de siembra en los diferentes tipos de medios de cultivo.

Objetivos específicos
 Aprender a utilizar correctamente las diferentes herramientas de siembra.
 Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente,
determinando las diferentes morfologías de colonias que se obtienen.
 Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un
medio de cultivo en cajas de Petri.
 TUBOS DE CULTIVO Y PLACAS DE PETRI
Tubos de cultivo de vidrio y placas de Petri, de vidrio o plástico, son utilizados para el cultivo
de microorganismos. Los tubos de cultivo deben estar provistos de un cierre adecuado, como los
tapones modernos de metal o plástico que son de uso común. Las placas de Petri proveen mayor área
de cultivo y crecimiento. Normalmente contienen de 15 a 20 mL de medio, el cual se añade derretido
y se deja solidificar antes de su uso. La placa consiste en dos partes, la inferior que contiene
el medio, y la parte superior que sirve de tapa. Luego de ser inoculadas (sembradas con
Microorganismos), las placas de Petri se incuban en posición invertida, para evitar que la
Condensación que se forma en la tapa gotee en la superficie del agar solidificado.

Instrumentos de Transferencia:
Los microorganismos deben ser transferidos de un recipiente a otro, o de un cultivo stock a
diversos medios para mantenimiento y estudio. Una transferencia de dicho tipo se llama
subcultivo, y debe llevarse a cabo en condiciones estériles para evitar contaminación.

Para realizar las transferencias se utilizan agujas o asas bacteriológicas, hechas de metal inerte
como platino, e insertadas en un manubrio de metal. Son muy duraderas y esterilizables
incinerándolas en la porción azul (la más caliente) de la llama de un mechero.

Para la transferencia de medios líquidos, debe utilizarse una pipeta esterilizada.

Cámaras de Incubación:
Los microorganismos deben ser cultivados a su temperatura óptima de crecimiento. Por esta razón,
se utilizan unas cámaras llamadas incubadoras, para mantener la temperatura deseada durante todo
el proceso de crecimiento. La mayoría de las incubadoras utilizan calor seco. Se mantiene la
humedad ambiental colocando un beaker con agua durante el periodo de incubación.

Transferencia de microorganismos de un medio a otro:

Los microorganismos son transferidos de un medio a otro por subcultivo. Esta técnica es de
importancia básica y se utiliza rutinariamente para preparar y mantener cultivos stock, y en
procedimientos de tests microbiológicos.

Como los microorganismos están en todos los lugares y en todas las superficies, éstas pueden ser
fuente de contaminación externa e interferir con resultados experimentales a menos que se utilicen
las técnicas adecuadas durante el subcultivo. Los pasos esenciales para la transferencia aséptica
de microorganismos son los siguientes:

 El asa bacteriológica o la aguja inoculadora deben ser esterilizadas manteniéndolas en la

porción más caliente de la llama de un mechero (la parte azul interna), hasta que se torna roja.
Luego la parte superior se pasa rápidamente por la flama. El asa se mantiene
en la mano, sin tocar superficies, y se deja enfriar por 10 a 20 segundos. En la palma de

3. la otra mano se sostienen el tubo de cultivo y el tubo que será inoculado, asegurados con el
pulgar. Los dos tubos se separan para formar una V en la mano.

2. Se remueven las tapas de los tubos con los dedos meñique y anular de la mano que sostiene el
asa. Se sostienen en la mano mientras dure el procedimiento, sin colocarlos en la mesa, para no
comprometer el procedimiento estéril. Los cuellos de los tubos se pasan suavemente por la llama
del mechero y el inoculador se enfría tocando la superficie interna del tubo de cultivo antes de
remover parte del inóculo.

3. Se toma una muestra del inóculo tocando suavemente la superficie del medio en una parte que
muestre crecimiento, sin penetrar en el medio con el asa.

4. El asa, lleno de células, se introduce en el medio de cultivo. En un caldo de cultivo, el

inoculador se sumerge y se agita ligeramente. En un medio sólido, el inoculador se pasa
suavemente por la superficie en línea recta o zigzag. En un medio de cultivo profundo (deep tube),
la aguja de inoculación se inserta hasta el fondo del tubo en línea recta y se saca rápidamente a
lo largo de la línea de inserción.
5. Luego de la inoculación, se extrae el instrumento, se flamean de nuevo las bocas de los tubos
y se les coloca de nuevo la misma tapa a cada tubo.

6. El asa bacteriológica o aguja son flameados de nuevo para destruir organismos restantes.
 el tubo el del Sostenga los tubos en la mano separados
y el grupo Por el pulgar

Flamee la boca de los tubos

Flamee el asa o aguja hasta el pasándola por la llama del
que este al rojo vivo
mechero

el un
de arriba. tubo el tubo y

Flamee la boca de los tubos Tape de nuevo los tubos Flamee el asa hasta que este
pasándola por la llama del al rojo vivo
mechero
AISLAMIENTO DE COLONIAS DISCRETAS DE UN CULTIVO MIXTO

Las técnicas usadas para aislar colonias discretas requieren que el número de organismos
en el inóculo sea reducido, de modo que, luego de la inoculación, las células individuales
estén lo suficientemente lejanas unas de otras en la superficie del agar y se efectúa, de
dicha manera, la separación de las diferentes especies presentes. Uno de las técnicas
usadas para lograr la dilución deseada se conoce como Método de Rayado de Placas o
siembra por estrías. En este método se “unta” una cantidad del cultivo en la superficie
de un plato de agar. Vamos a describir el método de 4 cuadrantes para el rayado:
a. Coloque un asa de cultivo en el agar. Flamee el asa (inoculador) y enfríelo tocando
una porción no usada del agar cercano a la periferia del mismo, y páselo varias veces a lo
largo del área o cuadrante 1.
b. Flamee el asa de nuevo y enfríela, gire el plato de Petri 90°. Toque con el asa una
esquina el cultivo en el área 1 y arrástrelo varias veces a través del área 2. El asa no debe
entrar de nuevo al área 1.
c. Flamee el asa de nuevo y enfríela, gire el plato de Petri 90°. Repita el paso b en el
Área 3.
d. Sin flamear de nuevo, repita el paso c, comenzando en una esquina del Área 3 y
arrastrándola al Área 4. No deje que el asa toque las áreas 1 a 3.
PARTE A: TECNICAS DE TRANSFERENCIA DE CULTIVOS.
MATERIALES Y EQUIPOS:
 CULTIVOS:

 Cultivo de 24 horas en caldo y en agar inclinado (slant) de Serratia marcescens.

MEDIOS DE CULTIVO:
 Por cada grupo de trabajo: un caldo de cultivo nutritivo, un tubo inclinado de agar
nutritivo y un tubo de agar nutritivo.
EQUIPAMIENTO:
 Mechero de alcohol, asa bacteriológica, aguja de inoculación, y lápiz de marcado
de cristalería.

PROCEDIMIENTO:
1. Identifique todos los tubos de medios estériles indicando siempre:
 Nombre del microorganismo, b. Nombre del medio,
 Dilución de la muestra (si la hay), d. Nombre del grupo
 Fecha

2. Siguiendo el procedimiento descrito e ilustrado previamente, realice las

siguientes transferencias:
 S. marcescens, del caldo de cultivo a un tubo de agar nutritivo inclinado, a un tubo
de cultivo profundo (deep tube), y a un caldo nutritivo.
 S. marcescens, del tubo de agar inclinado a un tubo de agar nutritivo inclinado, a
un tubo de cultivo profundo (deep tube), y a un caldo nutritivo.
3. Incube todos los cultivos por 24 a 48 horas, a 25 °C.

PARTE B: TECNICAS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS.

MATERIALES Y EQUIPOS:
 CULTIVOS:
 Cultivos de 24 a 48 horas, en caldo nutritivo, de una mezcla compuesta por una
parte de Serratia marcescens y tres partes de Micrococcus luteus y una mezcla de
una parte de Escherichia coli y diez partes de Micrococcus luteus y una muestra
de cultivos mixtos del ambiente (superficie de una mesa, lavamanos, fuente de
agua, etc.).
MEDIOS:
 3 placas de Petri con Tripticase Soy Agar por cada grupo de trabajo, por cada
técnica de cultivo a ser realizada.
EQUIPAMIENTO:
 Mechero de alcohol, asa bacteriológica, tubos de cultivo con 1 mL de agua estéril,
marcador de cristalería, hisopos estériles.
PROCEDIMIENTO:
1. Siguiendo el procedimiento descrito de rayado de placas, prepare una inoculación de
cada cultivo de prueba en una placa de Petri debidamente identificada. Observe con
cuidado las indicaciones del profesor.
2. Prepare un cultivo mixto del ambiente:
 Humedezca un hisopo estéril con el agua estéril. Remueva el exceso de agua
presionando el hisopo contra la pared interna del tubo.
 Con el hisopo humedecido, obtenga su muestra mixta de uno de los ambientes
descritos en la sección de Cultivos.
 Coloque el hisopo contaminado de nuevo en el tubo con agua. Agite suavemente
y déjelo 5 minutos en reposo.
 Realice un rayado de placas (o una siembra por extensión) en una placa de Petri
debidamente identificada.
 Incube todas las placas en posición invertida, por 48 a 72 horas a 25 °C.

PARTE C: AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

MATERIALES
 CULTIVOS:
 Cultivo mixto, en agar nutritivo, por rayado de placas o siembra por extensión, de
S. marcenscens y M. luteus, M. Luteus y E. coli y la muestra ambiental de la parte
B.
 MEDIOS:
 4 tubos inclinados (slants) de Tripticase Soy Agar por cada grupo de trabajo.
 EQUIPOS:
 Mechero de alcohol, aguja de inoculación, marcador de cristalería.
PROCEDIMIENTO:
1. Transfiera asépticamente, tomando muestras de colonias bien aisladas, el M. luteus
amarillo, la blanca E. coli y las roja S. marcescens, y una colonia discreta de la muestra
ambiental, a los tubosinclinados de agar debidamente identificados.
 CONCLUCIONES

 Los microorganismos se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos

denominados medios de cultivo, cuyos componentes son muy variados. La
elección del medio se basa en el propósito del estudio.

 Se logró identificar e trabajar y cultivar microorganismos.

 Se lo logro la siembra de microorganismos.

 El aislamiento consiste en obtener un cultivo puro de un microorganismo a partir

de un cultivo mixto.

 La siembra de microorganismos es la incorporación a un medio de cultivo de

una muestra, con propósitos cuantitativos o cualitativos.

BIBLIOGRAFIA
 Atías, A. Parasitología Clínica. 4ª Edición. Editorial El Mediterráneo. Santiago –
Chile. 1998
 Gaitán, MA, Manual de prácticas de Bacteriología General, Facultad
de Ciencias Químicas, Universidad de Colima. 1997

 Koneman EW, et.al. Diagnóstico Microbiológico, Panamericana, quinta

edición, México. 1994

 Frazier. W.C y D.C.westhoff. 2001. Microbiología de los alimentos. Editorial

ACRIBIA, México.