UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

ZARAGOZA

Inmunología Clínica

MÓDULO: LABORATORIO GRUPO: 2802

PRÁCTICA N°10 ELISA

Equipo: 9

Saucedo Zacarías Leticia ______________

Salazar Galicia Diana Lezlei ______________

Valenzuela Martínez Eréndira ______________

Vargas Cayente Arlet Aurora ______________

Contenido Valor Valor obtenido

Carátula

Introducción 1 punto

Objetivo y diagrama de la práctica de flujo o de otro 1 punto

tipo

Resultados 2 puntos

Análisis de resultados 3 puntos

Conclusiones 2 puntos

Referencias 1 punto

Total 10 puntos
Introducción
Esta técnica, también se conoce como ensayo de ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay).

El método se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima,

de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática. Al estar uno de los componentes antígeno/anticuerpo marcado con una
enzima e insolubilizando sobre un soporte o pocillo la reacción antígeno-anticuerpo
quedara inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de
un substrato especifico que al actuar, la enzima producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro. (1)

Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal

que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina
purificada, pueden ser solubles o estar inmóviles en un soporte sólido, son
empleados como conjugados no marcados o enzimáticos y por ultimo reaccionan
con determinante antigénico específico de un antígeno o de un anticuerpo ligando-
específico. Los antígenos se purifican o se producen con tecnología recombinante,
y al igual que los anticuerpos se utilizan como conjugados marcados o enzimáticos
y son inmóviles o solubles. Así pues, el reactivo que se forma de la unión covalente
entre enzima y antígeno o anticuerpo es el conjugado. Se conoce que es posible,
también, marcar de forma no covalente anticuerpos o enzimas con biotina y agregar
avidina. Las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean en los diversos
métodos ELISA incluyen: 1)peroxidasa de rábano y su sustrato, peróxido de
hidrógeno que en presencia de cromógeno o-fenilendiamina produce un producto
color amarillo-naranja medible; 2) galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-
Dgalactopiranósido que se transforma en un producto nitrofenolado amarillento
medible; o 3)fosfatas alcalina y su sustrato p-nitrofenilfosfato que también se
transforma en nitrofenolato. Se utiliza ácido sulfúrico para inhibir la actividad
enzimática y estabilizar el producto final de reacción que tiene color.(2)

Hay varios tipos de ELISA:

  ELISA directo: Analiza la respuesta inmune ante un antígeno.
 ELISA inversa: Determina la concentración total de anticuerpos en una muestra.
 ELISA sandwich: Se encarga de analizar muestras complejas, ya que el antígeno no
necesita ser purificado antes de su medición.
 ELISA competitiva: En casos donde solo hay un anticuerpo disponible para el
antígeno de interés.

Objetivo
Determinar las concentraciones del antígeno y las dilución del conjugado óptimas
para un sistema ELISA

Diagrama de Flujo

Diluya una solución de Realice diluciones al

IgG haciendo Tubo A: Colocar 3 mL
doble con volumenes
diluciones al doble. Marcar siete tubos de de a solución de IgG a
de 1.5 mL del
la letra A hasta la G . una concentración de
Concentración inicial amortiguador de
128 μg/mL.
de 128 μg/mL. recubrimiento.

Coloque 100 μL del

amortiguador de Los tubos B a la G, al
Realice lo mismo con recubrimiento en la fila final tosos los tubos
Mantenga por 1 hora a el resto de las filas H de la placa de con 1.5 mL de
37 0C. empezando con la fila poliestireno. volumen.
G y terminando con la
fila A. (testigo negativo del Tubo G con 3 mL.
ag)

Elimine el Desechar
sobrenadante, adicione sobrenadante, lavar 4
la solución de bloqueo veces con PBS-Tween,
(30 min) a temp. dejar actuar un min.
ambiente tirar sobrenadante.
 Realice disoluciones
al doble en PBS del Coloque en la
Usar volumenes de 1
Etiquete 11 tubos del conjugado de columna 12, 100 μL
mL para hacer las
1 al 11 peroxidasa anti-IgG de PBS (testigo de
diluciones.
humana dilución conjugado).
1:500.

Adicione 100 μL de la Llenar del tubo

solución de sustrato numero 11 la
Lve 4 veces con la Incube la placa a 37
de peroxidasa de 0C por una hora. columna11 en ese
solución PBS-Tween
rabano picante en orden hasta llegar al
cada pozo. tubo 1.

Durante 15 min. a 37 Lea a 490 nm en un

0C lector de ELISA.

Resultados
Diluciones
Del Absorbancia para diluciones del conjugado
conjugado
128 256 512 1024 2048 4096 8192 Control
µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL negativo

500 0.091 0.093 0.104 0.168 0.171 0.146 0.081

1000 0.071 0.077 0.065 0.071 0.091 0.088 0.08 0.063
2000 0.066 0.064 0.058 0.059 0.075 0.073 0.062 0.054
4000 0.068 0.068 0.055 0.059 0.076 0.075 0.06 0.063
8000 0.056 0.069 0.052 0.053 0.066 0.069 0.054 0.059
16000 0.057 0.07 0.054 0.057 0.069 0.068 0.052 0.057
32000 0.06 0.07 0.057 0.054 0.069 0.066 0.052 0.054
64000 0.06 0.066 0.06 0.054 0.067 0.066 0.054 0.063
128000 0.057 0.061 0.058 0.053 0.069 0.072 0.054 0.062
256000 0.06 0.064 0.059 0.056 0.07 0.071 0.057 0.063
512000 0.055 0.06 0.057 0.055 0.066 0.07 0.056 0.066
1024000 0.061 0.067 0.058 0.059 0.072 0.074 0.061 0.68
 0.18

0.16

0.14

0.12
128 µg/mL
Absorbancia

256 µg/mL
0.1
512 µg/mL
0.08 1024 µg/mL
2048 µg/mL
0.06 4096 µg/mL
8192 µg/mL
0.04

0.02

0
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000
Diluciones del conjugado

Gráfica 1 Dilución del conjugado vs. absorbancia

Resultados

Análisis de Resultados
Conclusión
Referencias
 Harlow E, Land D, eds. Antibodies: A Laboratory Manual. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory; 1988.
 Roitt Iván M, Delves Peter J. Inmunología. Fundamentos. 10º Edición.
Editorial Médica Panamericana. 2003.
 Murphy K, Travers P, Walport M. Inmunobiología de Janeway. 7a Ed.
México: McGraw Hill; 2009